DD265911A5

DD265911A5 - Verfahren zur Transformation pflanzlichen Erbgutes

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Publication number: DD265911A5
Authority: DD
Publication date: 1989-03-15

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation pflanzlichen Erbgutes mit einfachen rein chemischen Verfahrensmassnahmen sowie das nach diesem Verfahren erhaeltliche pflanzliche Material. Die Uebertragung des genetischen Materials in die pflanzliche Zelle erfolgt dabei auf direktem Weg ohne Verwendung eines natuerlichen pflanzeninfektioesen Systems wie eines Pflanzenbakteriums oder Pflanzenvirus und ohne Uebertragung durch Insekten oder phytopathogene Pilze, sondern durch gemeinsame Inkubation der zu transformierenden DNA sowie pflanzlicher Protoplasten in einem geeigneten Inkubationsmedium. Auf diese Weise lassen sich gewuenschte Gene sehr einfach und effizient auf pflanzliches Material uebertragen, wodurch Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften entstehen.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Transformation pflanzlicher Protoplasten mit einfachen rein chemischen Verfahrensmaßnahmen sowie das nach diesem Verfahren erhaltliche pflanzliche'Materlal. Durch die Einführung neuer genetischer Information in pflanzliches Material können Pflanzen mit neuen und/oder verbesserten Eigenschaften erzeugt werden. Betrachtet man beispielsweise den raschen Anstieg der Weltbevölkerung und den damit verbundenen höheren Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf, so gehört die Steigerung des Ertrags von Nutzpflanzen sowie die vermehrte Gewinnung von pflanzlichen Inhaltsstoffen, insbesondere der Fortschritt auf dem Gebiet der Nahrungs- und Heilmittel, zu den dringlichsten Aufgaben der biologischen Forschung. In diesem Zusammenhang sind z. B. folgende wesentliche Aspekte zu nennen*, eine Erhöhung der Resistenz von Nutzpflanzen gegen ungünstige Bodenverhaltnisse oder Klimabedingungen, gegen Krankheiten und Schädünge, eine gesteigerte Resistenz gegen Pflanzenschutzmittel wie Insektizide, Herbizide, Fungizide und Bakterizide, und eine günstige Veränderung des Nährstoffgehalte oder des Ernteertrags von Pflanzen. Solche wünschenswerten Effekte könnten allgemein durch Induktion odei vermehrte Bildung von Schutzstoffen, wertvollen Proteinen oder Toxinen herbeigeführt werden. Eine entsprechende Beeinflussung von pflanzlichem Erbgut kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß man ein bestimmtes l^:remdgen gezielt in Pflanzenzellen einschleust, ohne hierfür von konventionellen züchterischen Maßnahmen Gebrauch zu machen.

Charakteristik d#s bekannten Stand·· d«r Technik

Die Übertragung von DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen unter Verwendung von genetisch manipulierten Pflanzenbakterien ist aufgrund von Publikationen in der Fachliteratur, wie zum Beispiel 111 Nature, Vol.303,209-213 (1983); /3/ Nature, Vol.304, 184-187 (1983); IAI Scientific American 248(6), 50-69 (1983); /6/ EMBO-Journal 2(6), 987-995 (1983); /6/ Science 222,476-482 (1983); /71 Science 223,498-498 (1984); oder /8/ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80,4803-4807 (1983) bekennt. Bei den dort beschriebenen Verfahren werden die natürlichen pflanzeninfektiösen Eigenschaften dieser Bakterien ausgenutzt, um neues genetisches in Pflanzenzellen einzuschleusen. Zu diesem Zweck wurden bisher in erster Linie Pflanzenpathogene als Vektoren eingesetzt, wie beispielsweise Agrobacterium tumefaclens bzw. dessen Ti-Plosmid oder Cauliflower-Mosaik-Virus. In jüngster Zeit entwickelte Verfahren ermöglichen jetzt auch die direkte Einschleusung eines Gens in pflanzliche Zellen ohne den Einsau biologischer Vektoren. (/9/ Potrykus, I. et al., Plant Molec. BIoI. Rep. 3,117-128 (1985); 10/ Shillito, R.D. et al., Bio/ Technology 3,1099-1103,11985]).

Diese unter dem Schlagwort .Direkter Gentransfer" bekannt gewordenen Verfahren erlauben eine Vektor-freie Transformation pflanzlicher Zellen ohne Verwendung von pflanzeninfektiösen Systemen, wie beispielsweise pflanzenpathogenen Bakterien, Viren, Insekten oder Pilzen.

Damit entfallen auch alle Einschränkungen, welche durch die Wirtsspezifitat der Pathogene gegeben sind. Die Entwicklung der Pflanzen aus den transformierten Zellen wird durch die Anwendung der neuartigen Verfahren zur Transformation pflanzlicher ΖβΙΙβη nicht beiintrichtigt.

Ein Hauptproblem bei der Anwendung der Gentransformation liegt in der Schwierigkeit begründet, die transformierten Zellen oder Gewebe zu Identifizieren.

Je geringer bei einer Gontransformation die Transformationshfiufigkeit ist, desto schwieriger und aufwendiger ist dos Auffinden der wenigen, aus den transformierten Zellen resultierenden Zellklone unter der enormen Zahl nicht traneformierter Klone. Die Anwendung üblicher Screenlng-Methoden !st daher bei geringer Transformationshaufigkeit nahezu oder gänzlich unmöglich, es sei denn, es handelt sich um ein Gen mit selektiver Marker-Funktion (ζ. B. Resistenz gegen eine bestimmte Substanz). Geringe Transformaiionshäufigkelt erfordert also bei Genen ohne selektlonlerbare Marker-Funktlon einen enormen Aufwand. Daher lassen sich bei Transformationen mit Genen ohne Marker-Funktion die üblichen Screening-Methoden zur Sanktionierung transformierter Zellklone erst dann sinnvoll und erfolgreich einsetzen, wenn die Transformationshlufigkeit in der Größenordnung von 10"' bis 10~² liegt. Gegenwartig lassen sich diese angestrebton hohen Transformationsraten nur bei Anwendung der Elektroporation, even' uell In Verbindung mit anderen in der mikrobiologischen Forschung zur Genübertragung angewendeten Verfahren, wie beisplf «weise Poly-L-Ornlthin- oder Poly-L-Lysin-Behandlung, Liposomenfuelon, DNA-Protelnkomplexlerjng, ladungslndr rung an der Protoplastenmembran, Fusion mit mikrowellen Protoplasten oder Calclumphosphat-Coprazlpitation, und insbesondere Polyethylenglykolbehandlung und Hitzeschock-Methode (heat shock), erreichen (/10/ Shillito, et al., Bio/Technology 3,1099-1103 (1985)). Dagegen konnten bisher bei Anwendung rein chemischer Verfahrensmaßnahmen nur reproduzierbare Transformationsraten in einem Größenordnungsbereich bis 10"' erzielt werden. Bei der Elektroporation (/11/ Neumann,". et al., The EMBO Journal 7,841-845 (1982), /10/ Shillito et al., Bio/Technology 3, (1986]) werden Protopiasten in einer Mannlt/Calcium· bzw. einer Mannit/Magnesium-Lösung durch Entladen eines Kondensators über die SuspenslonsflOsslgkeit kurzzeitig mit einem Spannungsimpuls von hoher Intensität beaufschlagt.

Hierdurch v/ird eine Polarisierung der Protoplastenmembran und eine reversible öffnung von Poren in der Membran bewirkt,

wodurch der Übertritt der DNA in die Zelle erleichtert wird.

Dieses Verfahren besitzt jedoch zahlreiche Nachteile und ist bestimmten Beschränkungen unterworfen. Zum einen ist für die Durchführung der Transformation mit Hilfe der Elektroporation ein relativ großer apparativer Aufwand

nötig, der mit einem entsprechenden Kosten- und Arbeitsanfell verbunden Ist. Zum anderen ist die Anwendung dieses

Verfahrens aufgrund der hohen Empfindlichkeit der pflanzlichen Protoplasien nur innerhalb eines sehr engen Gre.izbereiches

möglich. Um die Lebensfähigkeit der transformierten Zellen zu gewehrleisten, können bestimmte Parameter wie beispielsweisedie Spannungs-, KapazitSts· und Feldstärkewerte daher nur Innerhalb dieser engen Grenzen variiert werden (z.B.

Spannungsbereich zwischen 1400-1700V (/10/ Shillito, R. D. et al., Bio/Technology 3, [1985)). Ziel dtf Erfindung Diese Nachteile können überraschenderweise im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrene mit einfachen rein chemischen Verfahrensmaßnahmen überwunden werden. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen über die Prinzipien, die für die Aufnahme und Inteoration von DNA in Pflanzenzellen verantwortlich sind, haben deutlich werden lassen, daß der Transformationsprozeß von

einer Vielzahl sich gegenseitig beeinflussender Parameter abhflnglg ist. Aufbauend auf diesen Untersuchungen kann nunmehrdie Transformationsfrequenz durch Variation und optimale Abstimmung der <ür 4ie Transformation relevanten Parameter, im

Vergleich zu herkömmlichen Verfahrer, so deutlich gesteigert werden, daß die eingangs erwähnten angestrebten Transformationsraten von 10~³ bis 10~² una i.^hr ohne weiteres erreicht werden. Mit Hilfe dieses auf rein chemischen Maßnahmen Leihenden erfindungsgemäßen Verfahrens kenn neben der Transformationsfrequenz nun überraschenderweise auch die Reproduzierbarkeit sowie die Überlebensrate der behandelten Protoplasten sehr stark erhöht werden. Während bisher mit reu chemischen Verfahren maximal Transformationsfrequenzen im Bereich von 10~* erzielt werden

konnten, ist man jetzt bei Anwendung des erflndungsgemfißen Verfahrens in der Lage, reproduzierbare

Tran8formationefrequ< nzen in einer Größenordnung bis zu wenigen Prozenten zu erreichen, vergleichbar deren der Elektroporation. Im Gegensatz zur Elektroporation handelt es sich bei dem erf indungsgemäß verbesserten Verfahren um eine Methode, die ohne

besonderen apparativen Aufwand und daher kostengünstig und weniger arbeitsintensiv durchgeführt werden kann. Ein weiterer

Vortoil im Vergleich zu Methoden, die eine Elektroporation erfordern, besteht in der neuartigen Möglichkeit, nunmehr große Mengen von pflanzlichen Protoplasten gleichzeitig transformieren zu können. Vergleichbare Beschränkungen, wie sie zuvor für das Elektroporationsverfahren im Zusammenhang mit der Überlebensrate der

behandelten Zellen diskutiert wurden, sind bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht gegeben.

Die für die erfindungsgemäße Transformation bestimmenden Parameter sind Ober einen weiten Bereich variabel und

beeinträchtigen die Transformationseffizienz und die Lebensfähigkeit der behandelten Protoplasten innerhalb dieses Bereichesnicht.

Darüber hinaus erweist sich die gesamte Protoplastenpopulation nach der Transformation unter Verwendung des

erfindungsgemäßen Verfahrens als weit weniger heterogen als im Falle einer Transformation mittels F.!ektroporatlon, sowohlwas die Lebens· wie die Tellungsfähigkeit der behandelten ProtopU iten angeht. So lassen sich bei Anwendung des

erfindungsgemäßen Verfahrens beispielsweise ohne weiteres Überlebensraten der behandelten Protoplasten von 80% undmehr erreichen, wobei gleich/eltig deren Tellungeffihlgkelt und damit die Möglichkeit zur Bildung neuer Kolonien erhalten bleibt.

Die vergleichbaren Werte bezüglich der Überlebensrate bsi Anwendung der Elektroporation liegen dagegen bei nur etwa 10%. Es hat sich nun wider Erwarten gezeigt, daß von einer Vielzahl von Parametern, die einzeln oder untereinander kombiniert, die Transformationshäufigkeit beim direkten Gentransfer in Protoplasten beeinflussen können, durch die richtige Auswahl und Kombination nur weniger dieser Parameter bzw. Maßnahmen mit geringem technischen und zeitlichen Aufwand eine optimale Transformat'onsrate erzielt werden kann. Dabei kristallisierten sich die folgenden Parameter als wesentlich heraus:

1) DNA-Probe: Form, Größe, Konzentration, Zeitpunkt der Applikation

2) Carrier DNA: Form, Konzentration, Größe

3) Mg²*: Konzentration, Zeitpunkt der Applikation 4} Platmamembran

modifizierendes Agens: Konzentration, Zeitpunkt der Applikation.

Unter den für das erfindungsgemäße Verfahren essentiellen Faktoren sind in erster Linie die Mg¹ * -Konzentration sowie die Konzentration oes die Plasmamembran modifizierenden Agens von entscheidender Bedeutung für die Steigerung der Transformationseffizienz. Dabei beobachtet man eine synergistische Interaktion zwischen diesen beiden genannten Faktoren,

was in der Folge zu einer starken Erhöhung der Transformationsfrequenz führt.

Weiterhin von Bedeutung sind der Zeitpunkt und die Reihenfolge der Applikation der Mg'*-Ionen, des modifizierenden Agens

sowie der transformierenden DNA.

Diese entscheidende Vorbesserung und Vereinfachung des Verfahrens zum direkten Gentransfer in pflanzliche Protoplasten und

letztlich zur Erzeugung genetisch veränderter Pflanzen läßt sich durch die folgenden erfindungswesentlichen Teilschritteerreichen:

— Isolierung der Protoplasten aus pflanzlichem Material und gegebenenfalls Inkubation der isolierten Protoplasten In einem geeigneten Nährmedium,

— Resuspendieren der isolierten Protoplasten in einer standardisierten Salzlösung,

— Überführung der inolierten Protoplasten aus der Salzlösung in ein für die Transformation optimiertes Inkubationsmedium, das Mg'Monen enthält,

— Zugabe der einzuschleusenden DNA sowie eines die Plasmamembran modifizierenden Agens,

— Inkubation von Protoplasten und DNA in Gegenwart einer die Plasmamembran modifilierenden Substanz über einen Zeitraum, der für eine Penetration der DNA in die Protoplasten ausreicht,

— Abtrennung der behandelten Protoplasten aus dar Inkubationslösung sowie gegebenenfalls derun Resuspendierung in einer wäßrigen CaCl_rLösung,

— Abtrennung der Protoplasten aus der CcClj-Lösung,

— Inkubation In einem für die weitete Protoplaatenentwicklung geeigneten Kulturmedium und

— sofern gewünscht, Regenerierung vollständiger transformierter Pflanzon.

Dwtogung dM Wesens der Erfindung Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Transformation pflanzlicher Protoplasten

zur Verfügung zu stellen.

Im Rarffnen der vorliegenden Erfindung gelten folgende Definitionen: Pflanzliches Material: In Kultur oder als solche lebensfähige pflanzliche Teile, wie Protoplasten, Zellen, Kallus, Gewebe,

Embryonen, Pflanzenorgane, Knospen, Samen u.a. sowie ganze Pflanzen. Gen: Strukturen mit flankierenden Expressionssignalen

Strukturgen: Proteln-kodierende DNA-Sequenz

Expresstonssignale: Promotorsignal und Terminatlonsslgnal Pflanzenwirksames

Expressionesignal: Expressionssignal, das in Pflanzen funktionsfähig ist Promotorsignal: die Transkription initiierendes Signal

Terminatlonsslgnal: die Transkription terminierendes Signal Enhancerslgnal: dieTr nskriptfon verstärkendes Signal

Replikationss!gnal: die DKA-Replikatlon ermöglichendes Signal

Integrationssignal: DNA-Sequenz, welche die Integration des Gens !;i die genomische DNA fördert Hybridgen: aus heterologen DNA-Sequenzen, d. h. DNA-Sequenzen verschiedenen Ursprungs aufgebautes Gen,

wobei es sich sowohl um natürliche, um c-DNA- als auch um synthetische DNA-Sequenzen handeln

kann

Trager-DNA: das Gen flankierende neutrale, d. h. an der Funktion des Gens nicht beteiligte DNA-Sequenz Carrier DNA: neutrale DNA ohne transformierendes Gen, welche dem transformierenden Gen beigemischt wird, um

dieses gegen Nukleasen zuschO ten

Isoliertes Gen: aus der originären DNA herausgetrennte DNA-Sequenz, welche ein einziges Protein kodiert NPT-Il-Gen: Neomycin-S'-Phosphotransferase-Gen, Typ Il von Transposon Tn 6 (/1/ Rothstdin, S. J. und W. S. Reznikoff, Cell 23,191-199, (1981)) Genomische DNA: DNA eines Pflanzengenoms (total oder Teil davon)

c-DNA: durch Reverse-Transkrlptase hergestellte Kopie einer m-DNA.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Im wesentlichen ein verbessertes Verfahren zur Transformation pflanzlicher Protoplasten und, falls gewünscht, die Erzeugung ganzer, genetisch-modifizlerter Pflanzen durch Regeneration aus besagten transformierton Protoplasten, das sich dadurch kennzeichnet, daß man

— pflanzliche Protoplasten aus beliebigen Pflanzengeweben isoliert und gegebenenfalls In einem der üblicherweise für die Kultivierung pflanzlicher Protoplasten verwendeten Nährm*dlen kultiviert;

— besagte Protoplasten vor der eigentlichen Transformation 20 Minuten bis β Stunden in einem Vorinkubationsmedium, enthaltend Erdalkali und/oder Alkallkationen, vorzugsweise Ca¹⁺-, K*- und/oder Na*-Ionen sowie eine geeignete C-Quelle, bei einer Temperatur von 4 bis 10⁹C vorlnkublert;

— die Protoplasten anschließend aus dem Vorinkubatlonamedium abtrennt und >n dem eigentlichen Transformationsmedium, enthaltend als essentiellen Bestandteil 0,1 bis 6OmM, vorzugsweise 10 bis 3^Λ M Mg'*-Ionen, in An- oder Abwesenheit von Ca'Monen, resuspondiert;

— unmittelbar danach eine DNA-Probe, enthaltend ein oder mehrere Gene u . .' Z*\ < · ntrrlle von in Pfianzen aktiven Expre*sionssignalen sowie eine Träger-DNA, der Transformatlonslösung iufügt;

— einig· Sekunden bis zu 20 Minuten, vorzugsweise 0,1 bis 10 Minuten, splter ein die Plasmamembran modifizierendes Agenz hinzufügt;

— Die Protoplasten und DNA-Probe in besagter Transformationslösung für einen Zeltraum inkubiert, der die Aufnahme der DNA In dl« Protoplnsten gewehrleistet; und

-~ sofern gewünscht, aus den transformierten Protoplasten ganze Pflanzen regeneriert.

Aus dieser Beschreibung geht klar hervor, daß die erfindungsgemäße Übertragung der neuen Gene in die Pflanzenzellen auf

direktem Weg· ohne Benutzung ein·· natürlichen pflanzenlnfektlösen Systems, wie eines Pflanzenbakteriums, eines

Pflanzenvirus oder Übertragung durch Insekten oder phytopathogene Pilze erfolgt. Zu diesem Zweck werden die zu

transformierenden Pflnnzenprotoplasten direkt mit dem zu übertragenden Gen behandelt, Indem man diese zunächst In elnogeeignete Lösung einbringt, dort für eine gewisse Zeit vorlnkublert, anschließend zusammen mit dem Fremdgen in daseigentliche Trensformntionsmedium Oberführt und dort für eine Zeitspanne, weiche für die Aufnahme des Fremdgens in die

Protoplasten ausreicht, bellet. Als pflanzliche Protoplasten werden vorzugsweise jeweils solche einer einzigen Pflanzenart oder einer der Art untergeordneten

systematischen Einheit verwendet.

Isoliert· pflanzliche Protoplasten, welche sich auch als Ausgangsmaterial für isolierte Zellen und Gewebe eignen, können von

beliebigen Teilen der Pflanze gewonnen werden, wie beispielsweise von Blattern, Keimlingen, Stengeln, Blüten, Wurzeln, Pollenoder Embryc "en. Bevorzugt werden Blattprotoplasten verwendet. Die isolierten Protoplasten können auch aus Zellkulturen

gewonnen werden. Methoden für die Isolierung von Protoplasten finden sich beispielsweise bei/12/ Potrykus, I. and Shlllito,

R.D., Methods in Enzymology 118,449-678 (1986). Als Lösungen, in welchen dio Protoplasten kultiviert werden, kommen vorzugsweise osmotisch stabilisierte Kulturmedien, wie

sie üblicherweise für Protoplastenkulturen verwendet werden, in Betracht.

Es bestehen bereits zahlreiche Kulturmedien zur Verfugung, die sich In einzelnen Medienkomponenten oder Gruppen solcher Komponenten unterscheiden. Alle Medien sind jedoch im allgemeinen nach dem folgenden Prinzip aufgebaut: sie enthalten eine Gruppe anorganischer Ionen im Konzentrationsbereich von etwa 10 mg/1 bis zu einiger. Hundert mg/1 bis zu einigen Hundert

mg/1 (sogenannte Makroelemente wie beispielsweise Nitrat, Phosphat, Sulfat, Kalium, Magnesium, Eisen), eine weitere Gruppeanorganischer Ionen In Mengen von maximal einigen mg/i (die sogenannten Mikroelemente wie beispielsweise Kobalt, Zink,

Kupfer, Mangan), ferner eine Reihe von Vitaminen (beispielsweise Inosit, Folsäure, Thiamln), eine Energie- und Kohlenstoffquelle wie beispielsweise Saccharose oder Glukose, sowie Wachstumsregulatoren in Form natürlicher oder

synthetischer Phytohormone aus den Klassen der Auxine und Cytoklnine im Konzentrationsbereich von 0,01 bis 10mfl/l. Die

Kulturmedien sind zudem osmotisch stabilisiert t/urch Zusatz von Zuckeralkoholen (beispielsweise Mannit) oder Zucker

(beispielsweise Glukose) oder Salzionen (beispielsweise CaCIi) und sind auf einen pH-Wert von 6,6 bis 6,5 eingestellt.

Eine nähere Beschreibung gangiger Kulturmedien findet sich beispielsweise in/13/ Koblitz, H., Methodische Aspekte der Zeil·

und Gewebezüchtung bei Gramineen unter besonderer Berücksichtigung der Getreide, Kulturpflanze XXII, 1974,93—11<7.

Bevor die Protoplasten In des eigentliche Transformationsmedium überführt werden, erfolgt zunähst eine VorInkubation in

einem Medium, das die Protoplasten in optimaler Weiso für die nachfolgende Transformation vorbereitet, was in einer

deutlichen Erhöhung der erzielten Transformatione- und Überlebensraten der behandelten Protoplasten zum Aurdruckkommt.

Unter gewissen Voraussetzungen Ist es auch möglich, die Transformation direkt in besagtem Vorinkubationsmedium

durchzuführen.

Es handelt sich bei besagtem Medium um eine standardisierte Salzlösung, die neben einer geeigneten C-Quelle, wie z.B. einem Zucker oder Zuckeralkohol wie Glucose oder Mannitol, verschiedene Salze, z. B. NaCI, CaCI₂, KCI, in einer Konzentration von

1 mM bis 200 mM enthalt. Der pH-Wert dieser Salzlösung liegt vorteilhafterweise bei pH-Werten von pH 6 bis pH 8.

Kurz vor der beabsichtigten Transformation werden die Protoplasten aus der Vorinkubationslösung In das eigentliche Transformationsmedium überführt. Es handelt sich dabei um eine Mannitlösung, die Mgⁿ-lonen in einer Konzentration von

0,1 mM bis 6OmM, vorzugsweise in einer Konzentration von 1OmM bis 3OmM enthält. Der pH-Wert der Inkubationslösung, liegtbei pH 6,6 bis pH 12, Insbesondere bei pH 7 bis pH 10.

Unmittelbar nach Einbringen der isolierten Protoplasten in das Inkubationsmedium erfolgt die Zugabe der DNA-Probe in einer Konzentration von 2Mg/ml bis 20μς/πηΙ, vorzugsweise in einer Konzentration von Spg/ml bis ΙΟμρ/αιΙ. Die DNA, bestehend aus einem Strukturgen und pflanzenwirksamen Expressionssignalen, wird vorteilhafterweise von neutrs len DNA-Sequenzen (Trager-DNA) flankiert, welche die Integration des Gens in die genomische DNA der Pflanzenzelle ermöglichen. Es ist vorteilhaft, das Gen In linearisierter Form zu verwenden. Als besonders geeignet erwies sich im Verlauf der durchgeführton Experimente eine TrAger-DNA Konzentration von 60 Mg/ml bis 70 pg/ml bei einer durchschnittlichen Größe zwischen 4' 'j und Es Ist weiterhin vorteilhaft, neutrale DNA wie beispielsweise tierische oder pflanzliche DNA, Lambda DNA, Plasmin 'JNA oder

jede beliebige andere DNA, die für die Durchführung des erf Indungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, im Überschuß als Carrlei-

DNA einzusetzen, um das Gen gegen den Abbau durch Nukleasen zu schützen. Einige Sekunden bis 20 Minuten, vorzugsweise 0,1 Minuten bis 10 Minuten nach der Zugabe der DNA in die Inkubationslösuno

erfolgt die Applikation von Polyethylenglykol bis zu einer Endkonzentration von 10% bis 30%. Hohe Transformationsraten erzielt>nan bei einer PEG-Konzentration von 20% bis 28%.

Neben Polyethylenglykol können aber auch andere höhere Alkohole oder alkoholartige Substanzen, die ebenfalls die Protoplastenmembran modifizieren und die beispielsweise auf dem Gebiet der Zellfuslon zum Einsatz gelangen, in dem

vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Dabei handelt es sich beispielsweise um Iflngerkettige,mehrwertige Alkohole, wie Polypropylenglykol (426 bis 4000g/Mol), Polyvinylalkohol oder mehrwertige Alkohole, deren

Hydroxygruppen teilweise oder vollständig verethert sind, sowie pflanzenverträgliche, auf dem Agrargebiet gebrAuchliche Detergentien, wie sie beispielsweise In folgenden Publikationen beschrieben werden:

/14/ »Mc Cutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" MC Publishing Corp., Rldgewood New Jersey, 1981; Stäche, H., „Tensld-Tauchenbuch", Carl Hanser Verlag, München/Wien, 1981

Sofern Polyethylenglykol selbst eingesetzt wird (wie In den Beispielen 1 und 2), verwendet man vorzugsweise solches mit einem Molekulargewicht zwischen 10OOg/Mol und 10000g/Mol, Insbesondere zwischen 3000g/Mol und 8000g/Mol. Von den vorgenannten Mitteln ist die Substanz Polyethylenylykol selbst bevorzugt, insbesondere eino Polyethylenglykollösung vom CMS-Typ, die einen relativ hohen Anteil an Ca²⁺lonen besitzt. (/15/ Negmtiu, l. et al., Theor, Appl. Gene». 72,279-286, [1986a)).

Als besonders vorteilhaft für den Verlauf der Transformation erwies sich eine Inkubationsdauer mit Polyethylenglykol zwischen 20 Minuten und 6 Stunden.

Nach der in der oben angegebenen Weise durchgeführten Behandlung v> < /,den die Protoplasten in frischem Kulturmedium resuspendiert, wobei die Zelldichte vorteilhafterweise aufwerte zwischen i' χ 10⁴und8 χ 10⁴ Protoplasten pro ml Kulturmedium eingestellt wird.

Bei der Verwendung von PEG In einer Konzentration von >20% ist es zweckmäßig, dia Protoplastvn nach erfolgter Transformation mit dom 2-10fachen Volumen einer Ca'Monen enthaltenden Lösung schrittweise zu verdünnen und so durch anschließende Sedimentation und Resuspenslon in frischem Kulturmedium vorhandene PEG-Reste auszuwaschen. Als besonders vorteilhaft für die Transformationsergebnisse erwies sich dabei eine wäßrige CaCli-Lösung, mit einer Ca²⁴ -Ionen-Konzentration von 0,1 M bis I₁OM.

Das erfindungsgemäße Verfahren Ist praktisch unbegrenzt anwendbar

In erste? Linie betrifft <lle vorliegende Erfindung Chimäre genetische Konstruktionen, die als zentralen Bestandteil ein oder

mehrere Strukturgene besitzen, die für neue nützliche und wünschenswerte Eigenschaften kodieren, und die in operabler Weisemit in pflanzlichen Zellen funktionellen Expressionssignalen verknüpft sind.

Für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind in erster Linie alle die Gene geeignet, die in der pflanzlichen Zelle exprimlert werden und die der Pflanze eine nützlich β und/oder gewünschte Eigenschaft verleihen, wie z. B. eine erhöhte Resistenz oder Toleranz gegenüber Pathogenen (2. B. p'iytophetogene Insekten, Pilze, Bakterien, Viren usw.) gegenüber Herbiziden, Insektiziden oder anderen Biozlden, gegenüber klimatischen Einflüssen und lokalen Besonderheiten (z. B. Hitze, Kalte, Wind, Trockenheit, Feuchtigkeit, besondere extreme Bodenverhältnisse, osmotischer Streß usw.) oder mit einer erhöhten Bildung von Reserve· und Lagerstoffen in Buttern, Samen, Knollen, Wurzeln, Stengeln usw. Ebenso werden von der vorliegenden Erfindung Gene umfaßt, die für pharmazeutisch akzeptable aktive Wirksubstanzen, wie

z.B. Alkaloide, Steroide, Hormone, Immunmodulatoren, und andere physiologisch aktive Substanzen kodieren.

So kann man beliebige Stnikturgene pflanzlicher Herkunft, wie beispielsweise das Zein-Gen (/18/ Wienand, U., et al., Mol. Gen. Genet. 1*2,440-444 [1981p, tierischer Herkunft, wie beispielsweise das TPA-Gen (Tissua-type plasminogen actlvator-Gen;/17/ Pennlca, D., et al., Nature MI, 214-221, [1983]), mikrobieller Herkunft, wie beispielsweise das NPT-Il-Gen, oder auch

synthetischer Herkunft, wie beispielsweise das Insulin-Gen (/18/ Stepien, P., et al., Gene 24,289-297 [1983]), in das Erbgut von

Pflanzen übertragen, unter der Voraussetzung, daß die Strukturgone von Expressionssignalen flankiert werden, die in Pflanzen

aktiv sind, wobei die Expressionsrignale pflanzlicher, tierischer, mikrobieller oder synthetischer Herkunft sein können.

Unter Expressionesignalen sind im Rahmen dieser Erfindung in erster Linie Promotor- und Terminationssequenzen zu verstehen,

darüber hinaus aber auch weitere regulatorischa Sequenzen der 5'· und der 3'-nichttranslatierten Regionen, die stromaufwärtsbzw. stromabwärts der Strukturgen-Sequenzen gelegen sind.

Die Promotorsequenzen enthalten u.a. eine Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase, an welche dieses Enzym spezifisch

bindet und so die Transkription einleitet.

Verantwortlich für die Bindungsaffinität sind dabei bestimmte DNA-Sequenzen, die in prokaryontlschen Promotoren gehäuft

vorkommen. Diese sog. „Consensus'-Sequenzen findet man in der Regel In dem Sequenz-Bereich -10 bis -30 bezogen, auf das

ATG-Start-Kodon des Strukturgens. Es handelt sich dabei um zwei Hexanukleotid-Sequonzen, die als „Pribnov-Schaller-Box"

bezeichnet werden und deren Nukleotidfolge Innerhalb dieser Sequenzen sowie ihr Abstand zueinander die Affinität der DNA-

Polymerase zum Promctor entscheidend beeinflussen. In eukaryontischen Zellen kommt in diesem Zusammenhang der sog. .TATA" Box, einem adenin· und thymi irelchen Sequenzabschnitt, der sich 20-30 Nukleotide stromaufwärts der Transkrlptlons-Initiationsstelle befindet, besondere Bedeutung Als Gene, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, kommen sowohl homologe als auch

heterologe Gen(e) oder DNA sowie synthetische Gen(e) oder DNA gemäß der im Rahmen der vorliegenden Erfindunggemachten Definition in Betracht.

Die kodierende DNA-Sequenz kann ausschließlich aus genomischer, aus cDNA bzw. synthetischer DNA konstruiert sein. Eine

andere Möglichkeit besteht In der Konstruktion einer hybriden DNA-Sequenz, bestehend sowohl aus cDNA als auch ausgenomischer DNA und/oder synthetischer DNA.

In diesem Fall kann die cDNA aus demselben Gen stammen wie die genomische DNA oder aber, sowohl die cDNA, wie auch die

genomische DNA können aus verschiedenen Genen stammen. In jedem Fall können aber, sowohl die genomischen DNAund/oder die cDNA, jede für sich, aus dem gleichen oder aus verschiedenen Genen hergestellt sein.

Wenn die DNA-Sequenz Anteile von mehr als einem Gen beinhaltet, können diese Gene entweder von ein und demselben Organismus, von mehreren Organismen, die mehr als einem Stamm, einer Varietät oder einer Spezies derselben Gattung

angehören, oder aber von Organismen, die mehr als einer Gattung derselben oder oiner tnderen taxonomlechen Einholt (Reich)angehören, abstammen.

Um die Expression besagter Strukturgene in der pflanzlichen Zolle zu gewährleisten, müssen die kodierenden oensequenzen

zunächst In operabler Weise mit In pflanzlichen Zellen funktionsfähigen Expressions-Sequenzen verknüpft werden.

Die übertragenen Gene, bestehend aus Strukturgen und flankierenden Expressionssignalen, können dabei sowohl natürlich

vorkommende Gene als auch Hybridgene sein. Bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren diejenigen Gene eingesetzt,deren Expressionseignale tierischer oder Insbesondere pflanzlicher oder synthetischer Herkunft »Ind. Beispiele für derartigeGene sind:

a) vollständige Gene aus Pflanzen, bestehend aus dem Strukturgen mit "einen natürlichen Expressionssignalen;

b) vollsynthetische Gene, bestehend aus einem Strukturgen synthetischer Herkunft, flankiert von Expressionssignalen synthetischer Herkunft;

c) Strukturgene pflanzlicher Herkunft, flankiert von pflanzenwirksamen Expressionssignalen, wobei Strukturgen und Expressionsslgnale von verschiedenen Pflanzenarten stammen;

d) Strukturgene pflanzlicher Herkunft, flankiert von Expresslonssigneie synthetischer Herkunft;

e) Strukturgene tierischer, mikrobieller oder synthetischer Herkunft, flankiert von Expressionssignelen pflanzlicher Herkunft; oder

f) Strukturgene tierittcher oder mikrobieller Herkunft, flankiert von Expressionssignalen synthetischer Herkunft.

Die hybriden Genkonstruktionen Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthalten somit neben dem (den) Strukturgen(en) Expressions-Signale, die sowohl Promoter- und Terminator-Sequenzen als auch weitere reguletorische Sequonzen der 3' und 5' nicht translatiarte Regionen mit einschließen.

Ganz besonders bevorzugt sind Strukturgene bakterieller Herkunft, flankiert von Expressionssignalen pflanzlicher Herkunft, insbesondere solchen mit Ursprung auf Pflanzenviren.

Dabei kann jeder Promotor und jeder Terminator, der In der Lage ist, eine Induktion der Expression einer kodierenden DNA-Sequenz (Strukturgen) zu bewirken, als Bestandteil der hybriden Gensequenz verwendet werden. Beispiele geeigneter Promotoren und Terminatoren sind z. B. solche der Nopalin-Synthase-Gene (nos), der Octopln-Synthase-Gene (ocs) sowie der Cauliflower Mosaik Virus G«ne (CaMV).

Bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind die 35S und 195 Expressions-Signale des CaMV Genoms, dia mit Hilfo molekularbiologischer Methoden, wie ale ζ. B. bei /19/ Maniatis et al., 1982 beschrieben sind, aus besagtem Genom IsgIImI und mit der kodierenden DNA-Sequenz verknüpft werden können.

Als Ausgangsmaterial für die 35S-Tran8kriptionskontroll-Sequenzen kann jrfindungsgemöß z. B. das Sea Ι· Fragment des CaMV Stammes .S", das die Nukleotide 6808-7632 der Genkarte umfaßt (/20/ Frank G et al., 1980), verwendet werden. Die 19S Promoter- und 5' nlcht-transletlerte Region befindet eir.h aufeinem Genomfragment zwischen dei Pst) Stel'e (Position

6386) und der Hind HI-Steile (Position 6860) der CaMV Genkarte (/21 / Hohn et al., 1982).

Die entsprechende Terminator- und 3' nlchttranslat/erte Region liegt auf einem EcoRV/8g Ill-Fragmont zwischen Position V 342

und 7643 des CaMV Genoms.

Bei der 196 Promotor-Region handelt es eich um einen typisch eukaryont/schen Promotor, der der kodierenden Region de ι CaMV Gens Vl vorgelagert ist und für die Expression des Gen Vl-Produktes (Virue-Hüllenprotein) verantwortlich ist. Ein weiterer wirksamer Vertreter eines in der pflanzlichen Zelle funktionellen Promotors, der Verwendung finden kann, ist ein

überproduzierender Pflanzcnpromotor. Diese Art von Promotoren sollte, sofern sie in operabler Weise mit der Gensequenz,welche für ein gewünschtes Genprodukt kodiert verknüpft ist, in der Lage tein, die Expression besagter Gensequenz mvermitteln.

Überproduzierende Pflanzenpromotoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommen können,

schließen den Promotor der kleinen Untereinheit (email subunit; se) der Ribuloso-1,6-bis-phosphat-Carboxyl.ise aus

Sojabohnen/22/ (Berry-Lowe et al,, J. Mol. and Appl. Gen«., 1:483-498 (1892)) sowie den Promotor des Chlorophyll-a/b- Bindungsproteins ein. Dies« beiden Promotoren sind dafür bekannt, daß sie in eukaryontischen Pflanzenzellen durch Licht

induziert werden (siehe z. B./23/ Genetic hnglnMring of Plant·, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, New York1883, Seite 29-38; /24/ Coriini G. at al., The Journal of Biological Chemistry, 288:1399 (1983) und /26/ Dunsnvuir, P. at til.,

Journal of Molecular and Applied Genetic·, 2: 285 (1983]). Für cine Anwendung gemäß vorliegender Erfindung haben sich die Exprossionssignale des Gene Vl des Cauliflower-Moialk- Virus als besonders vorteilhaft erwiesen. Besondere bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind die Expressionssignale des CaMV-Stammee CM1841, dessen komplette DNA-Sequenz bei /26/ Gardner et al., 1981 beschrieben ist. Die Hybridgene werden nach an sich bekannten mikrobiologischen Verfahren hergestellt, wobei das Leseraster der Kodierung

für die von der Pflanzenzelle zu produzierenden Proteine beibehalten wird. Deriirtige Methoden sind bekannt und wordenbeispielsweise in folgenden Publikationen beschrieben: /27/ ,Molecular Cloning", Maniatis, T., Fritsnh, E.F. und J.Sambrook,

Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, und /20/ ,Recombinant DNA Techniques", Rodriguez, R. L. und R. C. TaIt, Addlson-Wetley Publishing Comp., London, Amsterdam, Don Mills. Ontario, Sydney, Tokyo, 1983. Für die Integration des Fremdgens In die genomische DNA der Pflanzenzelle Ist t» vorteilhaft, wenn das Gen, bestehend aus Strukturgen und pflanzenwirkscmen Expressionssignelen, von neutralen DNA-S'equenzen (Träger-DNA) flankiert wird. Die Träger-DNA kann dabei aus zwei linearen DNA-Strflngen bestehen, so daß die In die Pflanzenzelle einzuschleusende Konstruktion ein lineares DNA-Molekül ist. Die zur Genübertragung hergestellte iDNA-Sequenz kann aber such eine ringförmige Struktur (Plasmidstruktur) haben. Solche Plasmide bestehen aus einem DNA-Stmng, in den das Fremdgen mit den ExnresBionsslgnalen Integriert ist. Die Trlger-DNA kann synthetischen Ursprung ι sein oder durch Behandlung mit geeigneten Reotriktioneenzymen aus natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen gewonnen werden. So sind beispielsweise als Träger-DMA

natürlich vorkommende Plasmlde geeignet, die mit einem selektiven Restriktionsenzym geöffnet worden sind.

Ein bolsplel für ein darartiges Plasmld Ist das frei erhältliche Plaemid pUC8 (beschrieben in /28/ Mussing, J. und J. Vlera, Gere

19,269-276,1982). Wolter sind als Trager-DNA auch Bruchstücke natürlich vorkommender Plasmide verwendbar.

Beispielsweise Ist als Tragor-DNA die Deletlonsmutante für Gen Vl des Coullflower-Mosaik-Virus einsetzbar. Die Wahrscheinlichkeit der genetischen Transformation einer Pflanzenzelle kann durch verschiedene Faktoren erhöht werden. So steigt, wie man aus Versuchen mli Hefe weiß, daß Anzahl der erfolgreichen stabilen Gentransformationen DmIi: steigender Anzahl von Kopien der neuen Gene pro Zelle,

2) bei Kombination eines Replikationssignals mit dem neuen Gen, sowie

3) bei Kombination von Integrationssequenzen mit dem neuen Gen.

Somit ist das erfindungggemäße Verfahren besonders vorteilhaft anzuwenden, wenn das übertragene Gen mit in Pflanzenzellen

wirksamen Replikations- und/oder Integrationssequenzen kombiniert ist.

Die Expression eines Gens in einer Pflanzenzelle Ist abhängig von des Tranek'iptionshäufigkeit des Gens in eine Messenger-RNS- Sequenz. Es ist daher ebenfalls von Vorteil, wenn das neue Gen mit einem diese Transkription verstärkenden Enhancerslgnal

kombiniert ist. Insbesondere sind diejenigen Verfahren hervorzuheben, bal denen ein Gen übertragen wird, das mit in

Pflanzenzellen wirksamen Replikations·, Integrations- und Enhancereignalen kombiniert ist. Weiterhin ist es von großem verfahrenstechnischem Vorteil, wenn das übertragene Gen eine selektive Merkerfunktion besitzt,

d.h., daß die transformierten Pflanzenzellen von den nicht-transformierten Pflanzenzellen durch eine gezielte SeleWoniarunggetrennt werden können. Eine derartige Markerfunktion erlaubt eine rationelle Arbeitsweise dadurch, daß nur diejenigen

Pflanzenzellen durch übliche mikrobiologische Maßnahmen zu KaIIi oder vollständigen Pflanzen regeneriert werden müssen, in

deren Erbgut ein zur Expression gelangendes Gen vorhanden ist, welches Marker-spezifische Selektionierungemaßnahmengestattet.

Während als Pflanzenzellen, die als Auegangsmaterlalien für eine Transformation in Butracht zu ziehen sind, Protoplasten, Zellkulturzellen, Zellen in i^flanzongeweben, Pollen, Pollenschläuche, Eizellen, Embryosäcke oder Zygoten und Embryonen In

unterschiedlichen Entwicklungsstadien zu nennen sind, sind Protoplasten wegen der direkten Einsatzmöglichkeit ohne weitere

Vorbehandlungen bevorzugt. Ein weiterer Gegenstnnd der vorliegenden Erfindung betrifft daher die aus dem erfindiingsgemäßen Verfahren resultierenden

transformierten Protoplasten sowie die aus diesen hervorgegangenen Pflanzenzellen, Zellaggregate, Embryonen, Pflanzen und

Samen, sowie deren Nachkommen, die die durch die Transformation erhaltenen neuen Gene besitzen und die daraus

resultierenden vorteilhaften Eigenschaften aufweisen.

Weiterhin umfaßt sind alle Kreuzungs- und Fusionsprodukte von erfindungsgemäß transformiertem Pflanzenmaterial, die die

durch dia Transformation erhaltenen neuen Gene besitzen und die daraus resultierenden vorteilhaften Eigenschaftenaufweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Transformation aller Pflanzen, insbesondere solchen der systematischen Gruppen Angiosperm«· und Gymnosperm··.

Unter den Gymnosperme· sind von besonderem Interesse die Pflanzen der Klasse Conifer··.

Unter den Angiosperm·· sind neben den Laubbäumen und Sträuchern von besonderem Interesse Pflanzen der Familien

Solanacoae, CrucHwM, Composite«, UH*cm·, VHaceae, Chenopodiacea·, Rutaceae, Alllecea·, Amaryllidac···, Atparagaceae,

Orchldaaea·, Palm··, Bromeliac···, Rublaceae, Theacea·, Musaceae oder Gramineae und der Ordnung Legumlnosae und hier vor allem der Familie Papllionaceae. Bevorzugt sind Vertreter der Familien Solaneceae, Cruclferae und Gramlnaae. Besonders erwähnenswert sind Pflanzen der Gattungen Nieotinna, Petunia, Hyoscyamus, Brasslca und Lollum, wie beispielsweise Nicotians tabacum, Nteotiana plumbagenifolla, Petunia hybride, Hyoscyamus mutlcus, Brasslca napus, Brasslca rapa und Lollum niurtiflorum.

Die Kulturpflanzen mit großen Ernteerträgen wie Mais, Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer oder Hirse sind in erster Linie Objekt der Anstrengungen auf dem Gebiet der Transformation von Pflanzenzellen.

Alle Pflanzen, die durch Regeneration aus Protoplasten erzeugt werden können, lassen sich auch unter Anwendung des errindtinpsgemäßen Verfahrens transformieren. Vertreter der Familie Gramineae (Gräser), welche auch Getreide umfaßt, konnten bisher nicht genetiroh manipuliert werden. Es wurde nunmehr nachgewiesen, daß mit der vo-stehend beschriebenen Methodii der direkten Gentransformation auch Gramineenprotoplasten, also auch Getreidezollen, genetisch transformiert werden können. In gleicher Weise ist elna Trensformation der Kulturpflanzen der Gattungen Solanum, Nlcotiana, Brastiica, Beta,Pisum, Phasaolus, Glycin·, Hellanthus, Alllum. Avena, Hordeum, Oryzoe, Setarla, Seeale, Sorghum, Trrtlcum, Zea, Muua, Cocos,Cydonla,, Pyru·, Malus, Phoenix. Elaals, Rubus, Fragariu, Prunus, Arachls, Seeale, Panlcum, Sacchnrum, Coffee, Canaille, Muse,Ananas, VWe oder Citrus möglich und erwünscht, wenn auch die Gesamterträge und -anbauflächen hierfür weltweit geiinger

Die Regeneration von in Kultur gehaltenen Protoplasten zu ganzer· Pflanzen ist bei /29/ Evans, et al., .Protoplast Isolation and Culture", in Handbook of Plant (Ml Culture, 1:124-176 (MacMillan Publishing Co. New York 1983); /30/ MR Davey, „Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts, 1983—Lecture Proceedings, Seite 19-29, (BirkMuser, Basel 1982»; /31/ PJ Dale, „Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", in Protoplasts 1983—Lecture Proceedings, Seite 31-41, (Blrkhäuser, Basel 1983); und /32/ H Binding, „Regeneration of Plants", in Plant Pn.toplaste, Seite 21-37, (CRC Press, Boca Raton 1985) und bei /32/ Potrykus I and Shilllto RD, MVhods In Enzymology, Vol.118, Plant Molecular Biology, eds. A. and H. Weißbach, Academic Press, Orlando, 1986, beschrieben.

Oie Rege nerationsverfahren unterscheiden sich von Pflanzenspezies zu Pflanzenspezies. Im allgemeinen aber wird zunächst eine Suspens lon von transformierten Protoplaster., Zellen oder von Gewebe, die zahlreiche Kopien der eingeschleusten Gene enthalten/ hergestellt. Ausgehend von diesen Suspensionen kann anschließend die Induktion der Embryobildung erfolgen. Man laßt die !Entwicklung der Embryonen bis zum Stadii der Reife und Keimung fortschreiten, wie dies auch bei natürlicherweise vorkommenden Embryonen der Fall Ist. In der Regel werden aber die Protoplasten In einem der bekannten Kulturmedien zur Teilung und Zellwandbildung angeregt. Es entstehen schließlich Kalluskulturen, welche durch Behandlung mit bestimmten Wirkstoffen, wie z. B. Auxinen und Cytokinlnen zur Wurzel· bzw. Sproßbildung induziert werden können. Neben diesen Wuchsstoffen enthalten die Kulturmedien In der Regel verschiedene Aminosäuren. Es erweist sich dabei als vorteilhaft, dem Medium Glutaminsäure und Prolin zuzugeben, insbesondere bei Spezlos wie Mais und Alfalfa. Die Sproß- und Wurzelbildung erfolgt im ellgemeinen simultan.

Die auf iliese Weise gewonnenen Pfiänzchen können anschließend in Erde übertragen und In gleicher Weise wie normale Sämlinge weiterkultiviert werden.

Eine effttlente Regeneration hängt In erster Linie vom Medium, vom Genotyp und von der Vorgeschichte der Kultur ab. Werden diese drill Variablen hinreichend kontrolliert, dann ist die Regeneration vollständig reproduzier- und wiederholbar.

Aufgrund neuer Entwicklungen auf dem Gebiet der In vitro Kultivierung von Pflanzen, vornehmlich im Bereich der Pflanzen regeneration, Ist es Inzwischen möglich, auch bei Vertretern aus der Familie der Gramin···, ausgehend von pflanzlichen Promptesten, ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispiele von erfolgreich durchgeführten Regeneratlonsexperimen^n bei Graminiien sind u.a. bei /33/ Abdullah, R., «t al., Bto/Tcchnology, 4:1087-1090./34/ Fujimura, T., et al., Plant Tissue Culture Lett,2:74-76,1985/35/ Torlyama, K., «t al., Tm»r Appi Qmurt, 73:16-19,198β,/36/ Yamada, Y., et al.. Plant Cell Rep, 8: 85-88,1986 (Reis) sowie in der hängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 056,506, die am 24. Juni 1987 unter dem Titel „Regeneration of Ζ·· mays plants from protoplast" eingereicht wurde, beschrieben.

Es können Im Rahmen der vorliegenden Erfindung daher auch die folgenden Pflanzen verwendet werden: Lolium, Z-M, Trrtlcum, 8orghurn, 8aceharum, Bromus, Oryza«, Avena, Hordeum, S»cal· und Seiaria.

Der Nachweis transformierter Gene kann auf an sich bekannte Weise erfolgen, beispielsweise durch Kreuzungsanalysen und molekulirbiologleche Untersuchungen, zu denen besonders die „Southern blot'-Analyse und Enzymaktivitätetests gehören.

Im Rahmen der Kreuzungsanalyse werden die reifen Pflanzen, die aus transformierten Pflanzenzellon herangezogen wurden, zunächst zur Samenproduktion mit sich selbst gekreuzt. Einige der Garnen enthalten die eingeschleusten Gene, die für eine neue und wünschenswerte Eigenschaft kodieren, In elr&m Verhältnis, das genau den etablierten Gesotzen der Vererbung gehorcht.

Diese Samen können zur Produktion von Pflanzen mit neuen und gewünschten Eigenschaftori verwendet werden.

Homozyjote Linien können durch wiederholte Selbstfertilisatlon und Herstellung von lnzuchtlir>.<en gewonnen werden. Dies'./ Inzucht! nlen können dann wiederum zur Entwicklung von Hybriden verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine Inzuchtlinie mit einer nnderen Inzuchtlinie gekreuzt.

Teile, dh von regenerierten Pflanzen erhalten werden können, wie z. B. Blüten, Samen, Blätter, Zweige, früchte u. a. sind ebenfall» Bestandteil der vorliegenden Erfindung, sofern diese Teile transformierte Zellen beinhalten. Nachkommen (einschließlich hybrider Nachkommen), Varietäten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls Bestandteil dieser Erfindung

Die „Southern blot'-Analyse kann beispielsweise folgendermaßen durchgeführt werden: Die den transformierten Zellen oder Protoplaiten entnommene DNA wird nach Behandlung mit Restriktionsenzymen einer Elektrophorese in 1%igem Agarose-Gel unterworfen, auf eine Nitrozellulosemembran (/37/ Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98,503-517 [1975)) transferiert und mit der nachzuweisenden DNA, welche einer Nlck-Translation (/38/ Rigby, W..I., Dieckmann, M., Rhodes, C. und P. Berg, J. Mol. Biol.

113,237-261, (1977]) unterworfen wurde (DNA-spezifische Aktivität von 6 χ 10* bis 10 χ ΙΟ'αρ.Γη./μρ), hybridisiert. Die Filter

werden dreimal je eine Stunde lang mit einer wäßrigen Lösung von 0,03 M Natriumeitrat und 0,3 M Natriumchlorid bei 65⁰C gewasche >. Die hybridisierte DNA wird durch Schwärzung eines Röntgenfilms während 24 bis 48 Stunden sichtbar gemacht. Eine Untersuchung auf Enzymaktivität läßt sich — naher erläutert am Test auf Aminoglykosidphosphotransferase (Enzym für Kanamycin spezifische Phosphorylierung) — beispielsweise folgendermaßen durchführen: Kallus- oder Blattstücke (100 bis 200mg) werden in 20μΙ Extraktionspuffer In einem Eppendorf-Zentrifugenröhrchen homogenisiert. Der Puffer ist eine Modifikation des von /5/ Herrera-Estrella, L., DeBlock, M., Messens, E., Hernalsteens, J.-P., Van Montagu, M. und J. Schell, EMBO J. 2,987-995 (1983) verwendeten Puffers, in welchem Albumin aus Rinderblut weggelassen und 0,1 M Sucroas hinzugefügt worden sind. Di« ^c^.i «Kit. verden 5 Minuten lang bei 12000g zentrifugiert und die überstehende Phase mit Bromphenolblau bis zu einer Endkonzertration von 0,004% versetzt. Durch Elektrophorese in einem 10%igen, nicht denaturierenden rOlyacrylamid-GeI werden die Proteine aus 35μΙ der überstehenden Phase separiert. Das Gel wird mit einem Kanamycin und Y-^-markiorte ATP enthaltenden Agarose-Gel überschichtet, inkubiert, und die phosphorylierten Reaktionsprodukte werden auf Whaimanp81-Phosphozellulose-Papier übertragen. Das Papier wird sechsmal mit deionisiertem Wasser von 90 ^CC gewaschen und dann autoradiografiert.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Illustration der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch einzuschränken. Sie beschreiben die Konstruktion eines Hybridgens und dessen Einbau in Träger-DNA-Sequenzen mit cyclischem Charakter, die Übertragung dieses Hybridgens in Pflanxenzellen, die Selektionierung der transformierten Pflanzenzellen und die Regeneration von vollständigen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzollen sowie deren kreuzungsgeqetische und molekularbiologische Analyse.

Ausfuhranflstoisptole

In dun nachfolgend aufgeführten Aueführungsbeispielen werden dlo folgenden Abkürzungen verwendet:

Medien:

HeNa/F (10mMHepes,pH7,1, SmMCaCI₂,16OmM NaCI, 0.2M Mannit,/39/Fromm, M, et al., I1985J)

K₃ (0,1 mg/l2,4D,1,0mg/INAA,0,2mg/IBAP;/40/Shillito,R.D.etal. (1981]; MI/Nagy.J.l.andMaliga.P., (19761)

KA₁AO (/42/ Installe, P. et al., [1985J)

LS (/43/Linsmaler, E. M., S¹IOOk, F., Physiologie Plantarum 18,100-127,119651)

MaCa (0,4 M Mannit, 15mM CaCI₂ x 2 H₂O, pH 6,6)

MaMg (0,4-0,5 M Mannit, 16mM MgCI₂,0,1 % MES, pH 5,6)

M (/42/ Installe, P. et al., (1985])

MAP₁AO (/42/ Installe, P. et al., (1985])

MDs (/44/Negrutiu,l.etal.,(1983))

RP (/42/Installe, P. et al., (1985])

R'SA (/42/ Inetalle, P. et el., (1985])

T (/45/ Nltsch, J. P. et C. Nitsch, (1969])

W₆ (154mMNaCI,125mMCaCI₂x2H₂O,5mMKCI,5mMGIucose,pH5,6-6,U;/46/Menczeletal.,(1981l)

Chemikalien:

BAP Benzylaminopurin

2.4 D (2.4-Dichlorophenoxy)essig8äure

NAA Napthyleselg'iäure

EDTA Ethylendiam!n-N,N,N',N'-tetraessigsäure

PEG CMS Polyethylenijlykol vom CMS-Typ (/15/Nogrutiu, I. el el. (1986 a))

PEG 6R Polyethylenglykol vom R-Typ (/10/Shillito, R. D. et al., (1985])

Tris-HCl a.a.a-Tris-fhydroxymethyD-methylamin-Hydrochlorld

NPT-Il-Gen Neomycin-3'-PhosphotransferaseGen,Typ Il

Tabellen:

ATF Absolute Transformationsfrequenz

GPPL Gasamt-ProtoplaetenzaM

RTF Relative Tranetormatlonsf tequenz

UE Überlebende Protoplasten nach erfolgter Transformationsbehandlung

ZT Zahldei Trensformanten

Bei den in den nachfolgenden Ausführungsbelspielen gemachten Prozentangaben handelt es sich um Gewicht/Volumen-Angaben (w/v; volumetrisches Gewicht)

KuntMSChreibung der Abbildungen

Abbildung 1 zeigt die Konstruktion der das NPT-II- Strukturen enthaltenden Plasmidvektoren pABD I und pABD II. Abbildung 2 demonstriert den Einfluß der MgCI₂-Konzentration (A) sowie der MgCI^PEC-lnteraktion (B) auf die Transformationsraten bei Nicotiana taöacum o.v. Petit Havanna SR₁(A u. B) sowie bei Nlcotlana plubaglntfolla (A). Abb.A Kurvea: N.tabaeumSRt

Kurve b: N. plumbaginrfolia

Zu beachten ist die semilogarithmische Skaleneinteilung der MgCI₂-Konzentration (Abszisse). Die PEG-Konzentratlon liegt in diesem Fall bei 20% (w/v)

Abb. B Kurve a: IQmMMgCI₂

Kurve b: 3OmMMgCI₂

-11- 265

Beispiel 1: Konstruktion de· Plasmids pABDI

Man zerschneidet die frei zugänglichen Pla3mide pkm21 und pkm24* (/47/Beck, E., et al., Gene 19,327-336 (1982]) mit der Restriktions-Endonuclease Psti. Die Fragmonte der Plasmide, welche für die Rekombination verwendet werden, werden durch Elektrophorese in 0,8%igem Agarose-Gel gereinigt. Dad aus der Verbindung der Bruchstücke erhaltene Plasmid pkm21244 enthalt eine Kombination der 6'· und 3'-Bal31-Deletionen des NPT-Il-Genu, wie von/47/ Beck et al. in G J<ie 10,327-336 (1982) beschrieben. Um das Promotersignal des Cauliflower-Mosaik Virus mit dem Hindlll-Fregment des Plasmide pkm21244 ?u verbinden, wird das Xupplungsplasmid pJPAX konstruiert. Das Kupplung plasmid ρ JPAX wird aus den Plasmiden pUCO und pUC9 (/28/Messing, J, and J. Vieira, Gene 19,269-276 [1982]) erhalten. 10 Basenpaare von der Kupplungssequenz des Plasmids pUC9 werden durch Zerschneiden bei der Hindlll- und der Sall-Position und nachfolgendem Auffüllen der haftfähigen Enden mit dem Polymerase-I-Klenow-Fragment (/48/Jacobsun, K., et al., Eu- J. Blechern. 46,623, [1974]) und Verbinde*, der Polynukleotidkette, wodurch die Hindlll-Position wieder hergestellt wird, herausgetrennt. Ein synthetisches Kupplungsglied von 8 Basenpaaren (Xhol) wird an der Smal-Position dieser abgetrennten Kupplungssequenz eingefügt. Die Rekombination der geeigneten Xorl- und Hindlll-Fragmente des Plasmids pUC8 und des modifizierten Plasmids pUC9 ergibt das Plasmid pJPAX mit einer teilweise asymmetrischen Kupplungssequenz mit den aufeinander folgenden Restriktionsstellen: EcORI, SMaI, BamHI, Sail, Pstl, Hindlll, BamHI, X»·.. ! und EcoRI. Die CaMV-Gen-VI-Promotor-Pagion, die mit dem NPT-Il-Struktur-Gen verknüpft wird, stammt aus dem Genom d.. JaMV-Stammes CM4184, einer Variante des CaMV Stammes CM1841, dessen vollständige Nuklsotld-Sequenz bei/26/ Gardner KC et al., 1981 beschrieben ist. Die CaMV-Promotor-Rogion wird in dem 6kb umfassenden Cosmid pHC79, einem Abkömmling des E. coil Plasmids pBR322 (/49/Hohns B. and Collins J., 1980) kloniert, wobei das CaMV Genom sowie des Cosid pHC79 mit B3t Il geschnitten und die resultierenden Bruchstücke miteinander verknüpft werden. Die Verbindung des b'-Expressionssignals des Cauliflower-Mosaik-Virus-Gens Vl und des Hindlll-Fragmente des NPT-Il-Gens wird beim Plasmid pJPAX durch (Einfügung der Promoterregion des Cauliflower-Mosaik-Virus-Gens Vl zwischen die Pstl- und di J Hind-Ill-Position bewirkt. Das so erhaltene Plasmid wird an der einzigen Hindlll-Position aufgeschnitten und das Hindlll-Fragment des Plasmids pkm21244 wird in diese Schnittstelle in beiden Orientierungsrichtungen eingebaut, wobei man die Plasmide pJPAX Cakm⁺ und pJPAX Cakm" erhält. Um eine EcoRV-Sequenz in der Nähe dos 3'Terminationssignals des NPT-Il-Hybridgens zu schaffen, wird ein BamHI-Fragment des Plasmids pJPAX Cakm⁴ in die BamHI-Position des Plasmids pBR327 (/60/Soberon, X. et al., Gene 9,287-306 [1980]) eingebaut. Man erhält des Plasmid pBR327 Cakm. Das EcoRV-Fragment des Plasmids pBR327 Cakm, das die neue DNA-Konstruktion enthält, wird verwendet, um die EcoRV-Region des Cauliflower-Mosaik-Virus-Gens Vl zu ersetzen, welches en der Seil-Position Im Plasmid pUC8 Moniert Ist, wodurch man die Protein-kodlerende DNA-Sequenz des NPT-Il-Gens unter die Kontrolle der 6'- und 3'-Expressionssignale des Cauliflower-Mosaik-Gons Vl stellt. Die so hergestellten Plasmide tragen die Bezeichnung pABDI und pABDII (vgl. Abbildung 1).

Beispiel 2: Transformation von Protopletten von Nkotiana tebacum c.v. Petit havanna SRI durch Übertragung des NPT-Il-Gens als Tall de« Plasmide pABDI :nH Hilfe darf Mg²VPEG Behandlung.

Tabakprotoplasten von Nicotians tabacum c.v. Petit Havanna werden nach herkömmlichen Verfahren ausgehend von einer Tabak-Suspensionkultur hergestellt (/12/Potrykus I und Shillito RD, Methods in Enzymology, Vo1118, Plant Molecular Biology, ede. A und H., Weissbach, Academic Press, Orlando, 1986) vollständig entfaltete Blätter von β Wochen alten Sproß-Kulturen werden unter sterilen Bedingungen entfernt und mit einer Enzym-Lösung der folgenden Zusammensetzung gründlich benetzt:

Enzymlösung: H₂O 70ml

Sucrose 13 g

MacerozymeRIO Ig

Cellulaee 2 g

,Onozuka' R10 (Yakult Co. Ltd.. Japan) Drisallase (Chemische Fabrik Schweizerholle, Schweiz 0,13g

2(n-Morpholin)-ethansulfonsäure (MES) 0,5 ml

pH 6,0

Man zerschneidet Blätter anschließend in 1-2 cm große Quadrate und läßt sie auf der oben genannten tnzymlösung aufschwimmen. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei einer Temperatur von 26 C im Dunkeln. Dieser Ansatz wird anschließend leicht geschwenkt und für weiter? 30 min bis zur vollständigen Verdauung inkubiert.

Diese Suspension wird dann durch ein Stshlsleb mit einer Maschenweite von 100Mm filtriert, mit 0,6M Sucrose (MES, pH 5,6) durchgespült und anschließend 10 Minuten bei 4 COO-5000 rpm zentrifugiert. Die Protoplauten sammeln sich auf der Oberfläche des Mediums, das dann unter den Protoplasten abgezogen wild,». B. unter Verwendung e' wr sterilisierten Injektionsspritze. Die Protoplasten weiden in einem K3A-Medium (Sucrose [102,96g/l; Xyioa?! IO,25g/l); 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure D [0,10mg/l|; I-Naphtylessigsflure [1,00mg/1]; 6-Benzylsminopurin [0,20mg/1]; pH 6,8» (/12/Potrykus I and Shillito, R. D. et al. 1981) resuspendiert, das 0,4 M Sucrose enthält.

Zur Durchführung der Transformationsexperimente werden die Protoplasten zunächst gewaschen, gezählt und anschließend in einem We-Medium (154 mM NaCI, 126mM CaCI₂ 2H₂0,5mM KCI, SmM Glucose, pH 5,6,/46/Menciel, L. et al. [1981]), das eine hohe Überlebensrate dor isolierten Protoplasten gewährleistet, in einer Zelldichte von 1-2,5 χ 10* Zellen pro ml resuspendiert. Pie Protoplasten werden anschließend nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 6 bis 8°C für dia Transformationsexperimente verwondet.

Ku. 7 vor der «!gentlichen Transformation der isolierten Protoplasten wird das W₆-Medium durch das eigentliche Traneformationsmedium ersetzt. Es handelt sich dabei um eine Mannit/Magnesium-Lösung (MaMg-Lsg: 0,4-0,5mM Mannit, 0,1 % MES [Morpholinethansulfonsäure], pH 5,6) mit einer Mg²⁺-Konzentration von 12 bis 16mM. Dazu «verden die Protoplasten zunächst aus der W_s-Lösung durch Sminütige Zentrifugation bei 100g abgetrennt und in dem MaMg-Medinm resuspendiert (0,3ml). Zu dieser Suspension werden dann 66 μΙ einer wäßrigen DNA-Lösung, enthaltend 5-1 Opg des Plasmids pABDI und 50 μς Kalbsthymus-Carrier DNA, zugesetzt. Bei letzterer handelt es sich um eine neutrale Carrier-DNA ohne transformierendes Insort, die zum Schutz vor einer Nukleasevordauung der zu transformierenden DNA zu diesem Ansatz im Überschuß hinzugegeben

wird. Nach einer Zeitspanne von etwa 0,1 bis 10 Minuten nach der DNA-Zugabe erfolgt die Applikation einer wäßrigen 40%igen Polyethylenglykollösung (w/v), bis eine Endkonzentration von 24 bis 28% (w/v) erreicht ist. Als besonders vorteilhaft erweist sich die Verwendung von PEG vor.. CMS-Typ. Dabei handelt es sich um eine Ca^2>haltige (0,1 M Ca [NO₃I₂ 4H₃O) 0,4N Mannitlö' <ng, die PEG vom Molekulargewicht etwa 1000 bis etwa 6000 in einer Endkonzentration von 40% (w/v) enthält. Der pH-Wert dieser Lösung liegt bei pH 7 bis 9 (/16/Neprutiu, I. et al. P986aj)

Im Falle von Nicotian· tabacum c.v. Petit Havanna SRI verwandet man vorzugsweise PEG CMS 4000. Der pH-Wert des Transformationsmediums wird anschließend auf einen Wert von pH 7 eingestellt. Diese Mischung wird unter gelegentlichem Umschwenken für 30 Minuten bei 26⁰C inkubiert.

Bei Verwendung von hohen PEG-Konzentrationen von >20% ist eine stufenweise Verdünnung mit dem 3· bis 5fachen Volumen einer 0,2 M CaClj-Lösung vorteilhaft. Anschließend werden die in der eingegebenen Weise behandelten Protoplasten abzentrifugiert (5 Minuten bei 100g) und in frischem K₃-Mediurr resuspeniMert (0,3ml Protnplastenlösung in 10-ml frisches K₃-M9dium). Die weitere Inkubiition erfolgt in 1OmI-Pc rtionen in Petri-Schalen von 10cm Durchmesser bei 24 "C und Dunkelheit, wobei die Populationsdichte 4 bis 8 χ 1f/ Protoplasten pro ml beträgt. Nach 3 Tagen wird das Kulturmedium pro Schale mit 0,3 VoTumenteilen frischem K₃Medlum verdünnt und für weitern 4 Tage bei 24⁰C und 3000 lux künstlicher Beleuchtung inkubiert. Nacli insgesamt 7 Togen werden die aus den Protoplasten entwickelten Klone in mit 1 % Agarose verfestigtem, 50 mg/l Kanamycin enthaltendem Nährmedium eingebettet und nach der .bead type'-Kulturmethode (/51 /Shillito, R. D. et al.. Plant Cell Reports, 2,244-247 (1983)) bei 24°C unter Dunk< Iheit kultiviert. Das Nährmedium wird alle 5 Tage durch frische gleich artige Nährlösung ersetzt.

Beispiel 3: Regeneration Kanamydn-resirtenter N. tabecum c. v. Petit Havana SR1

Nach 3 bis4 Wochen fortgesetzter Kultivierung in Ktinamycin-haltigem Nährmedium werden die resistenten KaIIi von 2 bis 3mm Durchmesser auf mit Agar verfestigtes LS-Kulturmedium (/43/ ünsmaier, E. M. and Skook, F., Physiol. Plant 18,100-127 [ 1965)), enthaltend 0,05mg/l 2,4-DlChIOrPhOnOXyCSsIgSaUr?, 2mg/l I-Naphthylessigsäure, 0,1 mg/l 6-Benzylaminopurin, 0,1 mg/l Kinetin und 76 mg/l Kanamycin, verpflanzt. Durch Sproßinduktion auf LS-Medium, enthaltend 150 mg/l Kanamycin und 0,2 mg/l 6-Benzylaminopurln, und anschließender Wurzelbildung auf T-Medium (/45/ Nitsch, Y. P. und C. Nitsch, Science 163,85-87 (196dl) erhält man Kunemycin-resistente Nicotiana tabacum-Pflanzen der Sorte Petit Havanna SRI.

Beispiel 4: Transformation von Protoplasten von Nicotiana plumbaginHolia durch Übertragung de» NPT-ti-Gens eis Teil des Ptasmids pABDI mit HlH* der Mg^/PEQ-Behandlung.

Die Isolierung der Protoplaston sowie die Vorinkubation der für die eigentlichen Transformationsexperimente vorgesehenen Protoplasten orfolgt in genau analoger Weise zu dem für Nicotiana tabacum 8R1 beschriebenen Verfahren. Die eigentliche Transformation der in der angegebenen Weise vorbehnndelten N. plumbaginHolla-Protoplasten wird in einer Mannit/Magneslum-Löeung (MaMgUg: 0,4 bis O₁SmM Mannit, 0,1 % MES (Morpholinethansulfonsäurel, pH 5,6) mit einer Mg¹⁺-lonen-Konzentratlon von 22 bis 27 mM durchgeführt. Nach der Zugabe einer wäßrigen DNA-Lösung (65 μΙ), enthaltend 5

bis 10Mg des Pla*mlds pABDI sowie 50Mg Kalbsthymus-Carrler-DNA, erfolgt die Applikation einer wäßrigen 40%iyen

Poiyethylenglykollösung (w/v), bis aine Endkonzentration von 18 bis 22 % (w/v) erreicht ist. Die Zeitspanne zwischen DNA-Zugabe und PEG-Applikation beträgt in der Regel nur etwa 0,1 bis 10 Minuten. Auch im halle von Nicotiana plumbaglnrfolia erweist sich die Verwendung von PEG CMS 4000 als besonders vorteilhaft für die Erzielung hoher · Trnnsforr.iationsraten. Der pH-Wert des Transformationsmediums wird anschließend auf einen Wert von pH 7 eingestellt. Es

folgt eine etwa 30-minutlge Inkubation dieser Tran»formationslösung boi einer Temperatur von 26⁰C unter gelegentlichem

Umschwenken des Gemischt i. Dia Isolierten Protoplasten wurden zunächst für einen Zeitraum von 4 bin 12 Tagen in einem Medium mit hoher Hormonkonzentration ((ΚΑ,ΑΟ-Medium, /42/ Insteile, P. et al., J. Plant, Phyeiol. 119,443-454, (1985)) in einer ZeHdichte von 2 bis

3 χ 10* Protoplasten/ml kultiviert.

Nach der Ausbildung von Zellaggregaten werden die überlebenden Kolonien ausgelesen, gezählt und in starker Verdünnung (0,6

bis 2 χ 10' Kolonien/ml in einem MDs-Medlum) /44/ Negrutiu, I. et al., Theor. Appl. Genet. 6», 341-347, (1983)) oder einemΜΑΡ,ΑΟ-Medlum ,'42/ Instelfe, P. et al., (19S5J) mit niedrigem Hormonflehalt, enthaltend 20 bis 40mg/l Kanamycin-Sulphat,suspendiert. Anschließend werden die Kolonien in Agar (1 % Agarose) eingebettet und nach der ,bead-type' /61 / Shillito, R. D. etal., 11983]) Kultivierungsmethode bsi einer Temperatur von 24⁰C und In Dunkelheit kultiviert. Das Nährmedium wird dabei alle 5

Tage durch frische gleichartige Kulturlösung ersetzt. Beispiel B: Regeneration Kiinamycin-rtelttenUHr N. plumbsgintfollu-Pflanzen Nach einer Kultivierungedauer von 3 bis 4 Wochen werden die resistenten KaIIi, dio einen Durchmesser von 2-5 mm erreicht

haben, ausgelesen und auf festen Medien, enthaltend 60mg/l Kanamycin, weitere 3 bis 5 Wochen kultiviert.

Die Regeneration ganzer Pflanzen erfolgt dabei entsprechend den Angaben bei /42/ Insole, P. et al. (1985) durch Transfer der

reslstenten KaIIi von einem RP-Medium auf ein R'SA und/oder ein M-Medium.

Beispiel β: Nachweis des NfT-H-Gtns im Pflanzenerbgut

0,5g Kallus der transformierten Zellkultur^ oder Blattgewebe der daraus regenerierten Pflanzen werden bei O⁰C in 15%iger Saccharoselösung, enthaltend 60mMol/l l:thylondiamin-N,N,N,N'-tetra-esslg-säure, EDTA, 0,25Mol/l Natriumchlorid und 60mMol/l a.a.a-Trls-lhydroxyrnethyO-methylamln-Hydrochlorid (TRIS-HCI) bei pH 8,0 homogenisiert. Durch Zentrifugieren des Homogenitatt für 6 Minuten bei 1000g trennt man grob die Zellkerne ab. Die Zellkerne werden in 16%iger Saccharoselösung, enthaltend 50mMol/l EDTA und 50mMol/l TRIS-HCI, bei pH8,0 resuspendiert, mit Natrium-dodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,2% \ ersetzt und für 10 Minuten auf 7O⁰C erhitzt. Nach Abkühlung auf 20 bis 25⁰C wird der Mischung Kaliumacetat bis zu einer Konzentration von 0,5Mol/l zugesetzt. Dieses Gemisch wird für 1 Stunde bei O⁰C inkubiert. Der ausgefallene Niederschlag wird durch Zentrifugieren (16 Minuten bei 4⁰C in oiner Mlkrozentrifuge) abgetrennt. Aus der überstehenden Flüssigkeit wird durch Versetzen mit dem 2,6fachen Volumen Äthanol bei 20 bis 25X die DNA ausgefällt. Die abgetrennte DNA wird in einer Lösung von 1OmMoI TRIS-HCI, enthaltend 10Mg/ml Ribonuolease A, gelöst, für 10 Minuten bei 37*C inkubiert, mit ProMlnase K bis zu einer Konzentration von 260Mg/ml versetzt und für eine weitere Stunde bei 37 ⁰C inkubiert. Die Protainaee K w'rd durch Phenol- und Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen entfernt. Aus der wäßrigen Phase wird die

DNA durch Zusatz von 0,6 Volumenteilen 0,6molarer isopropanolischer Natriumacetat-Lösung ausgefällt und in 50 μΙ einer Lösung, enthaltend 1OmMoIZI TRIS-HCI und 5mMol/l EDTA, bei pH7,5 gelöst. Durch diese Präparation erhält man DNA-Sequenzen, die vorwiegend mehr als 50000 Basenpaare enthalten. Restriktion dioeer DNA mit EcoRV-Endonuclease, Hybridisierung der Fragmente mit radioaktiv markierten Hindlll-Bruchetücken des NPT-Il-Qens und Vergleich mit dem P'asmid pABDI zeigt in einer .Southern Blof-Analyso die Artwesenheit des NPT-Il-Gens in der Zellkern-DNA der transformierten Nicotiana tabacum- sowie der Nicotiana ptumbaginifolia-Zellen

Ereebnlsteil

Im folgenden wurden die erzielten Transformatlonserpp'onisse In Zusammenhang mit verschiedenen Transformationsparametern diskutiert.

Dabei werden die erreichten Transformationsraten in Form von .Relativen Transformationsfrequenzen" (RTF) bzw. von „Absoluten Transformationsfrequenzen" (ATF) wiedergegeben.

Bei den „Relativen Traneformatioiipfrequenzen" handelt es sich um das Verhältnis zwischen der Anzahl der Transformaten und der überlebenden Fraktion (die in der Lage ist. Kolonien auszubilden) einer unselektiert kultivierten Protoplastenpopulation. Die „Absolute Transformationsfrequenz" dagegen ist definiert als das Verhältnis zwischen derselben Anzahl an Transformanien und der ursprünglichen Zahl von Protoplasten, die vor der Transformation als lebend charakterisiert worden waren. Ein Vergleich zwischen den ATF- und RTF-Werten vermittelt ein gutes Bild der Überlebensrate der Protoplasten nach Durchführung der einzelnen Transformatione- und Selektioniecungsschritte.

Einfluß von Struktur und Konzentration der verwendeten DNA auf die TransformatlonsrtteTabitlla 1: Einfluß der DNA-Struktur sowie des Konzcntrationbverhältnisses zwischen Plasmid DNA (pABDI) und Carrier-DNA auf die Tiansformationsraten (RTF und ATF) bei Nicotiana plumbagtnrfotla Protoplasten.

Die Transformationsexperimente wurden in eine MaCa-Lösung bei einer PEG CMS4-Konzentration von 13% durchgeführt.

DNA-Konzentration	GPPL	UE	ZT	RTF	ATF
[ug/ml)	x10·	x10⁴		XiO"⁴	XiO"⁴
Lineares pABDI
10+20	2	45	4	0,085	0,02
10 + 50	2	49,6	23	0,464	0,12
50+10	2	46,4	1	0,022	0,005
Zirkuläres pABDI
10 + 50	2	45,4	0	<0.01	< 0,005
50+10	2	46,1	0	<0,01	< 0,005

Der Einfluß der DNA-Struktur auf die Transformationsraten läßt sich am Beispiel von Nicotiana plumbaglnrfolia demonstrieren

Es zeigt sich im Verlauf der durchgeführten Transformationsexperimente, daß sich bei Verwendung von linearer DNA deutlich höhere Transformationsfrequenzen erzielen lassen im Vergleich zu einer zirkulären DNA. Die erreichten Transformationsraten liegen dabei im Fall der linearen DNA um bis zu zwei Zehnerpotenzen höher als die entsprechenden Werte bei Verwendung einer zirkulären DNA.

Tabelle 1 macht deutlich, daß nicht nur die DNA-Struktur, sondern auch das Verhältnis zwischen Plasmid DNA und zugesetzter Carrier-DNA eine Rolle für die erreichbaren Transformationsfrequenzen spielen.

Die besten Rosultato erreicht man, wenn die Carrier-DNA deutlich Im Überschuß vorliegt im Verhältnis zur Plasmld-DNA, wobei ein Verhältnis von 10:60 (Plasmid DNA:Carrier-DNA) besondere vorteilhaft ist.

Mit den hler erzielten Resultaten werden Ergebnisse bestätigt, die zuvor bereits für das Tabak-System ermittelt werden konnten /10/ Shilllto, R.D. et al., Bio/Technologie 3, [1985]).

2. EinfluB dar PEG-Konzentratton auf die Transformationsrate

Tabelle 2: Einfluß der PEG-Konzentration auf die Transformationsraten (RTF und ATF) von Nlcotlana plumbaginrfolia und N. tabacum c. v. Pettt Havanna SR1 (C. S.) Protoplasten. Die Transformator tsexperimente wurden in einer Ws-Selzlösung bei einem DNA-Konzentrationsverhältnis zwischen Plasmld- und Carrier-DNA von 1 :S durchgeführt.

PEG-Konzentratlont%,w/v) GPPL S ZT RTF ATF PEG CMS 4 N.plumbaginifolia

8% 0,72 — 2 0,13 0,03

(±0,02) 13% 1,05 — 7 0,26 0,063

(±0,035) 20% 0,90 — 22 1,45 0,25

« (±0,06)

24% 1,0 — 32 2,0 0,32

(±0.07)

27% 1,0 — 46 3,1 0,46 (±0.05)

N. tabacum, SRi PEG CMS β 13% 0,33 — 14 — 0,28

(±0,16) 20% 0,33 — 30 — 0,90

(±0,05) 26% 0,33 — 40 — 1,2

(±0,08)

Tabelle 2 verdeutlicht den Einfluß unterschiedlicher PEG-Konzentrationen auf die erreichbaren Transformationsfrequenzen bei N. tabacum 8ft 1 und N. plumbaginrfolia. In beiden Fallen laßt sich ein eindeutiger Zusammenhang zwischen beiden Parametern feststellen. Mit der Zunahme der PEG-Konzertratlon von 8% auf 27% im Falle von N. plumbaginrfolia bzw. von 13% auf 26% bei N. tabteum SRI geht ein Anstieg bei den erzielten Transformationsfrequenzen einher, die von 0,03 χ 10⁴ auf 0,28 χ 10~⁴,bzw. von 0,46 x 1(T⁴ auf 1,2 χ 10~⁴aneteigen.

3. BnfluederMgCtrKoniemrationaufdteTranafotmatiorisrate

Tabelle 3: Einfluß der MgClj-Konzentratlon, d>»e Applikationszeltpunktes, der verwendeten PEG-Lösung sowto, bei hohen PEG-Konzentrationen (> 25%), der Waschbed'ngungen auf die Traneformationerate von N. tabaeum 8R1 Protopiasten. Für die Transformationsexperimente werden sowohl PEG CMS4 als auch PEG CMS6 Lösungen mit einer Endkonzentration von 20% verwendet (Autnahmen sind In der Tabelle gesondert angegeben).

Transformation GPPL χ 10» ZT ATFx 10'» I.Kontrollen

W^kOInMg²⁺ 0,69 77 0,13 ±0,03

He Na/F, kein Mg¹⁺ 0,26 265 1,0 ±0,38 MaMg12mM,8%PSG6R,

1600V,3Pulse,1 Ki)JOnF 0,28 324 1,3 ±0,26

MaMgSmM, kein PEG 0,33 0 Wie oben,+ 0,1 M MgCI,

nach Zugabe von DNA 0,33 0

2. MgClrZugabe unmlttelbs. vor Transformation

W,+ MaMg(1.1,MgCMmM) 0,37 1033 2,7 ±0,46 W₅ + MnMg(1:1, MgCl₁SmM) 0,33 1087 3,3 ±0,48

MaMgSmM 0,50 2045 4,1 ±0,51

MaMg 12m M 0,50 2056 4,1 ±0,86

3. MgClrZugabe 2 h vor Transformation

MaMgCmM 0,33 382 1,2 ±0,30

4. PEG-Zusammenseüung (MaMg 12mM)

PEOCMS4(24%) 0,32 693 2,2 ±0,56

PEGR6(24%) 0,32 474 1,6 ±0 34

6. Watchbedlngungen (MaMg 12mM; 25 % PEG)

CaCI₁-2H₂O 0.2M 0,32 1127 3,6 ±0,66

Wj OM βββ 2,1 ±0,42

* MaMg... mM gibt dlo MgCIrKonztotration In einer MaMq-Lösung an.

a) ApplMurtlomzeitpunkt: Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, lassen aich die betten Ergebniste mit einer Transformationerate von4,1 χ 10"' erzielen, wenn die Zugabe von MgCI* in Transformationemedium unmittelbar vor der eigentlichen Transformationerfolgt.

Wird die Transformation dagegen erst 2 Stunden nach der erfolgten MgCIr Applikation durchgeführt, liegen die Transformationsraten our noch bei Werten von 1,2 χ 10"'.

Auch eine Kombination einer Mannlt/MgClj-Lösung (MaMg-Lösung) mit einer Wg-Salzlösung In einem Mischungsverhältnis von 1:1 führt zu einer mehr oder weniger starken Abnahme der Transformationsfrequenz in Abhängigkeit von der molaren MgClj-Konzentration. Halbiert man beispielsweise die MgCLj-Konzentrdtion der MaMg-Lösung, so führt dies zu einem Rückgang der Transformationsrate um annähernd 20%.

Vergleicht man dagegen die Ergebnisse der Kontroüexperimente, die nur In Anwesenheit geeigneter Pufferlösungen (We· odsr

HeNa/F-Lösung) ("> Fromm, M. ti al, Proc. Natl. Acad. ScI. U8A 82,5842-5848, (1985]) durchgeführt werden, aber In Abwesenheit von Mg² '-Ionen, so erkennt man, daß In diesen Fällen die Transformationsfrequenzen um mehr al* eine Zehnerpotenz niedriger liegen. Selbst bei Anwendung der Elektroparatlon lassen sich die zuvor diskutierten hohen Transformatione; aten nicht erreichen.

PEG/Mo" Synergismus: Die synergistische Wirkung beigleichzeitiger Applikation von Mgⁿ-lonen und PEQ zeigt sich sehr deutlich bei einem Vergleich der Transformationsergebnibse der Kontrollversuche, die in Anwesenheit von MgCI₁ (6mM) aber ohne Zusatz von PEQ durchgeführt werden, sowie der eigentlichen Ausführungsbeispiele, bei denen MgCI₁ und PEG gemeinsam zur Anwendung kommen (Tab. 3).

Öle Kontrollexperimente in Gegenwart von MgCI₂ in einer Konzentration von 6mM aber ohne Zusatz von PEG führen in keinem Fall zu nachweisbaren Transformationsereignlesen.

Dagegen lassen sich bei Applikation von PEG (bei einer Endkonzentration von 20 %, w/-! unmittelbar nach (0,1 bis 10min) der DNA-Zugabe In das MgCI enthaltende Transformationsmedium die oben bereits erwähnten hohen Transformatloneraten von 4,1 x 10"'erreichen.

Diese Transformationsraten liegen damit auch um mehr als eine Zehnerpotenz höher als die vergleichbarer, Resultate bei alleiniger Anwendung von PEG ohne MgCI₂-Zusatz (vgl. Tab. 2).

Im Gegensatz zum Tabak, bei dem maximale Transformationsraten in einem Konzentrationeberelch von 12 bis 15 mM MgCI₂ bei einer gleichzeitigen PEG CMS-Konzentration von 28% erreicht werden (Abb. 2 B), ist der Opthnumsberelch bei N. plumbaglnKolia zu höW,en MgCI₂-Werten hin verschoben (·. Abb. 2A).

Maximale Transformationsraten werden in diesem Fell bei MgClj-Konzentratlonen In einem Bereich zwischen 20 bis 30 mM und einer PEG-Konzentration von 20% erreicht. Es lassen eich dabei Transformatlonsraten von 3,9 χ 10~⁴ erreichen.

PEQ-Zusammensetzung: Neben den bereue erwähnten Parametern hat auch die Zusammensetzung der verwendeten PEG-Lösung einen Einfluß auf die erreichbaren Transformationsfrequenzen. Bei Anwendung von PEG CMS /16/ Negrutiu, I. et al., (1986a) und PEG 6R /10/ Shillito, R. D. et al., (1985) unter ansonston gleichen Versuchsbedingungen (PEG — Konzentration 24%, MgClj-Konzentration 12 mM) lassen sich Im enteren Fall deutlich höhere Transformationsraten erzielen, die um den Faktor 1,4 höher liegen.

Bei Anwendung hoher PEG-Konzentrationen von 24% (20% im Falle von N. plumbaginffol)·) orwelst sich als vorteilhaft, die behandelten Protoplasten mit einer 0,2 M CaCI₂ χ 2HjOhaitigen Lösung nachzuwaschen.

Durch diese Maßnahme kenn die Transformationsrete im Vergleich zu sinei Behandlung mit einer einfachen Salzlösung (We-Lösung) um den Faktor 1,7 gesteigert werden.

4. Nachweis des Übertragung der transformierten Gens auf die sexuellen Nachkommenschaften sowie seiner Vertfbung alsnormales Pflaniwngen

Umfangreiche genetische Kreuzungsenalysen und ausführliche molekularbiologische Studien (beispielsweise .Southern blot'-Analyse der DNA des Pflanzenf/enoms; Untersuchung der Enzymaktivität der ΑΓηΙηοςΙν^βΙορηοβρη<ΜΓβηβίθΓββθ, d. h„ dem Enzym für die Kenamycin-spezitfsche Phosphorylierung) mit den genetisch verändertet < Pflanzen (erste Generation und Nachkommenschaften) haben folgende Ergebnisse erbracht:

1. Das bakterielle Gen ist stabil in das Pflanzengenom eingebaut;

2. Es wird in der Regel unverändert und regelmäßig auf Kreuzungsnachkommenschaften übertragen;

3. Sein Erbgang entspricht dem eines natürlichen, einfachen, dominanten Pflanzengens;

4. Die molekulare Analyse mittels DNA-Hybrldislerung und Enzymtest bestätigt die Ergebnisse der genetischen Kreuzungsanalyse:

6. Die genetisch veränderten Pflanzen haben ihren normalen, natürlichen Phänotyp während der Behandlung beibehalten; es sind also keine unerwünschten Veränderungen festgestellt worden.

Diese Erge^'.se zeigen, daß mit dom erfindungsgemäßen Verfahren des direkten Gentransfers in Protoplasten der beste Weg für die gezielte genetische Veränderung von pflanzlichem Material aufgefunden worden ist. Die genetische Veränderung ist stabil, und unerwünschte Änderungen des Genotyps der Pflanze treten nicht auf.

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Claims

1. Verfahren zur Transformation pflanzlichen Erbgutes, dadurch gekennzeichnet, daß man

— pflanzliche Protoplasten aus beliebigen Pflanzengeweben isoliert und in einem der üblicherweise für die Kultivierung pflanzlicher Protoplasten verwendeten Nährmedien kultiviert;

— besagte Protoplasten vor der eigentlichen Transformation 20 Minuten bis 6 Stunden in einem Vorinkubationsmedium, enthaltend Ca²⁺-, K⁺- und Nationen itowie eine geeignete C-Quelle, bei einer Temperatur von 4 bit) 1O⁰C vorinkubiert;

— die Protoplasten anschließend aus dem Vorinkubationsmedium abtrennt und in dem

₄, eigentlichen Transformationsmedium, enthaltend als essentiellen Bestandteil 0,1 bis 6OmM Mg²⁺-lonen in An- oder Abwesenheit von Ca²⁺-lonen, resuspendiert;

— unmittelbar danach eine DNA-Probe, enthaltend ein oder mehrere Gene unter der Kontrolle von in Pflanzen aktiven Expreusionssignalen sowie eine Träger-DNA, in die Transformationslösung hinein gibt;

— 0,1 bis 10min später ein die Plasmamembran modifzierendes Agens hinzufügt und

— Protoplasten und DNA-Probe besagter Transformaticnslösung für einen Zeitraum inkubiert, der für die Aufnahme der DNA in die Protoplasten ausreicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Transformationslösung Mg²⁺-lonen in einer Konzentration von 10 bis 3OmM enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem die Plasmamembran modifizierenden Agens um Polyothylenglykol handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration für Polyethylenglykol in besagtem Inkubationsmedium bei 10% bis 30% liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration für Polyethylenglykol bei 20% bis 28% liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Inkubationslösung bei pH 5,6 bis pH 12 Hegt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Inkubationslösung bei pH 7 bis pH 10 liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der DNA-Probe enthaltend ein oder mehrere Gern» beliebigen Ursprungs unter der Kontrolle von in Pflanzen aktiven Expressionssignalen sowie eine Träger-DNA 2 bis 20pg/ml beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration besagter DNA-Probe

5 bis 10 Mg/ml beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Transformationslösung zusätzlich neutrale DNA ohne transformierendes Gen als Carrier DNA im Überschuß zugesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter neutraler DNA um tierische DNA, pflanzliche DNA,A-iDNA,Plasmid-DNA oder jede beliebige fürdie Durchführung des Verfahrene geeignete DNA handelt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter neutraler DNA um Kalbsthymus-Carrier-DNA handelt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Carrier-DNA 50 bis 70 Mg/ml beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, daduceh gekennzeichnet, daß die Vorinkubation der Protoplasten über einen Zeitraum von 20 Minuten bis 1 Stunde erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gemeinsame Inkubation von Protoplasten und DNA in Gegenwart eines die Plasmamembran modifizierenden Agens im eigentlichen Transformationerm/dlum, enthaltend als essentielle Bestandteile 0,1 bis 6OmM Mg²⁺-lonen in An- oder Abwesenheit von Ca²⁺-lonen, übor einen Zeitraum von 10 Minuten bis

6 Stunden erfolgt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ah transformierendes Gen ein Gen verwendet, dossen Strukturteil pflanzlicher, tierischer, mikrobieller, viraler oder synthetischer Herkunft lot und dessen Expreesionssignale pflanzlicher, tierischer oder synthetischer Herkunft sind.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes transformierendes Gen entweder aus genomischer ONA aus einer cDNA oder aus synthetischer DNA besteht.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes transformierendes Gen sowohl aus genomischer DNA als auch aus cDNA und/oder synthetischer DNA zusammengesetzt ist.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das transformierende Gen aus Genfragmenten von mehreren Organismen, die verschiedenen Gattungen angehörer., zusammengesetzt ist.

20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das transformierende Gen aus Genfragmenten von mehr als einem Stamm, einer Varietät oder einer Spezies des gleichen Organismus zusammengesetzt ist.

21. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das transformierende Gen aus Anteilen von mehr als einem Gen desselben Organismus zusammengesetzt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes transformierendes Gen einen Strukturteil besitzt, der der transformierenden Pflanze eine nützliche und wünschenswerte Eigenschaft verleiht.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Strukturgen der Pflanze eine erhöhte Resistenz oder Toleranz gegenüber Pathogenen, Herbiziden, Insektiziden und/oder anderen Bioziden verleiht.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Strukturgen die Bildung und Qualität von Reserve- und Lagerstoffen in Blättern, Samen, Knollen, Wurzeln und Stengeln verbessert.

25. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Strukturgen für pharmazeutisch akzeptable aktive Wirksubstanzen kodiert.

26. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Expressionssignale aus Genen von Pflanzen oder Pflanzenviren stammen.

27. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Expressionssignale aus einem pflanzlichen Gen stammen, das für die kleine Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase oder das Chlorophyle a/b Bindungsprotein kodiert.

28. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Expressionssignale aus Genen von Pflanzenviren stammen.

29. Verfahren nac*- Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) handelt.

30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die 35S-Expressionssignale des CaMV-Genoms handelt.

31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die 19S-Expressionseignale des CaMV-Genoms handelt.

32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliche Protoplasten solche einer einzigen Pflanzenart oder einer der Art untergeordneten systematischen Einheit verwendet werden.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß als besagte Protoplasten aus Blättern, Keimlingen, Stengeln, Blüten, Wurzeln, Pollen oder Embryonen gewonnen werden.

34. Verfahren nacrt Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Blattprotoplasten handelt.

35. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß als besagte Protoplasten aus Zellkulturen gewonnen werden.

36. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Protoplasten von Pflanzen der Familien Solanaceae, Crucifarae, Composttae, Liliaceae, Vrtaceae, Chenopodiaceae, Rutaceae, Alliaceae, Aaparagaceae, Orchldaceae, Palmae, Bromeliaceae, Rubiaceae, Theaceae, Musaceae oder Gramineae oder der Ordnung Legumlnosae handelt.

37. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Protoplasten der Familien Solanaceae, Cructferae und Qramlneae handelt.

38. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Protoplasten von Mais, Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer oder Hirse handelt.

39. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Protoplasten der Gattungen Solanum, Nicotiana, Brsssica. Beta, Pisum, Phaseolu*, Glycine, Hellanthus, Allium, Avena, Hordeum, Oryzae, Setarla, Seeale, Sorghum, Triticum, Zea, Musa, Cocos, Cydonia, Pyrus, Malus, Phoenix, Elauit, Rubus, Fragaria, Prunu», Arachis, Seeale, Panlcum, Saccharum, Coffee, Camellia,

. Musa, Ananas, VItIe oder Citrus handelt.

40. Verfahren nach Anspruch 1 zur Transformation von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Protoplasten regenerierbar sind.

41. Verfahren nach Anspruch 1 zur Transformation von Pflanzen der Gruppe Nicotlana tabacum, Nicotiana plumbagenifolia, Petunia hybrida, Hyosyamus muticus und Brassica napus mittels Übertragung des NPT-Il-Gens, dadurch gekennzeichnet, daß man das NPT-Il-Gen mit Promoter- und Terminationssitjnalen des CaMV-Gens Vl versieht, dieses in das pCU8-Plasmid einbaut und das erhaltene chimäre Plasmid durch Mg³VPolyethylenglykolbehandlung in isolierte Promptesten von Pflanzen der vorstehend genannten Gruppe überträgt.