CZ284828B6 - Způsob selekce geneticky transformovaných buněk a sloučeniny pro použití v tomto způsobu - Google Patents

Způsob selekce geneticky transformovaných buněk a sloučeniny pro použití v tomto způsobu Download PDF

Info

Publication number
CZ284828B6
CZ284828B6 CZ94444A CZ44494A CZ284828B6 CZ 284828 B6 CZ284828 B6 CZ 284828B6 CZ 94444 A CZ94444 A CZ 94444A CZ 44494 A CZ44494 A CZ 44494A CZ 284828 B6 CZ284828 B6 CZ 284828B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
beta
cells
glucuronidase
nucleotide sequence
compound
Prior art date
Application number
CZ94444A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ44494A3 (en
Inventor
Finn T. Okkels
Robert J. Whenham
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8105710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ284828(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ44494A3 publication Critical patent/CZ44494A3/cs
Publication of CZ284828B6 publication Critical patent/CZ284828B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)

Abstract

Způsob selekce geneticky transformovaných buněk, do kterých byla zavedena požadovaná nukleotidová sekvence, z populace buněk, kde v transformovaných buňkách požadovaná nukleotidová sekvence nebo kointrodukovaná nukleotidová sekvence vyvolává nebo zvyšuje pozitní účinek sloučeniny či živiny dodávané populaci buněk, a tím umožňuje identifikaci nebo selekci transformovaných buněk z netransformovaných buněk, například pro vytvoření geneticky transformovaných rostlin neobsahujících jako selekční marker nepřirozenou nukleotidovou sekvenci kódující rezistenci vůči toxinu, antibiotiku nebo herbicidu. Popisují se též nové glukoronidové sloučeniny, včetně cytokinin-glukoronidů, pro použití v tomto způsobu.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu selekce geneticky transformovaných buněk, do nichž byla včleněna požadovaná nukleotidová sekvence, který se vyznačuje tím, že se transformovaným buňkám poskytne selekční výhoda aniž se poškodí netransformované buňky, a též nových sloučenin pro použití v tomto způsobu.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že při zavádění nového genetického materiálu do populace buněk pomocí transformace transformuje se úspěšně pouze určitý počet buněk, tj. pouze tento určitý počet buněk obdrží nový genetický materiál. Poté je nutné identifikovat geneticky transformované buňky, aby mohly být v populaci tyto buňky odděleny od netransformovaných buněk. Identifikace a separace transformovaných buněk se tradičně provádí za použití způsobu, který lze nazvat negativní selekce, jinými slovy za použití způsobu, kdy jsou transformované buňky schopny přežít a růst, zatímco u netransformovaných buněk dochází k inhibici růstu nebo přímo usmrcení látkou, kterou jsou transformované buňky schopny tolerovat.
Například pokud je genetické transformaci podrobena populace rostlinných buněk, probíhá selekce transformovaných buněk typicky za použití selekčního genu, který kóduje rezistenci vůči antibiotiku nebo herbicidu. Selekční gen - kteiý sám o sobě obecně nemá užitečnou funkci v geneticky transformované rostlině, a může být ve skutečnosti v rostlině nežádoucí-je spojen nebo kointrodukován s genem, který má být včleněn do dané rostliny, tak, že jsou oba geny včleněny do populace buněk, nebo spíše do některých buněk v populaci, protože v praxi není možné transformovat všechny nebo i jen většinu buněk. Buňky jsou poté kultivovány na nebo v médiu obsahujícím antibiotikum nebo herbicid, vůči kterému jsou geneticky transformované buňky díky selekčnímu genu rezistentní, což umožňuje identifikaci transformovaných buněk, jelikož u netransformovaných buněk - které neobsahují daný gen rezistence vůči antibiotiku nebo herbicidu - dochází k inhibici růstu nebo usmrcení.
Tyto způsoby negativní selekce mají však určité nevýhody. Za prvé, netransformované buňky mohou odumřít kvůli přítomnosti například antibiotik v růstovém médiu. To má za následek nesporné riziko, že mohou, v případě že je populací buněk koherentní tkáň, odumřít nejen netransformované buňky, ale též transformované buňky, díky skutečnosti, že smrt netransformovaných buněk může zamezit zásobování transformovaných buněk živinami, nebo proto, že poškozené nebo odumírající netransformované buňky mohou vylučovat toxické látky.
Další podstatnou nevýhodou negativní selekce je, že může být nežádoucí přítomnost nadbytečného genu pro rezistenci například vůči antibiotiku. V organizacích pro ochranu přírody a vládních úřadech se například diskutuje o tom, zda je bezpečné zavádění genů kódujících rezistenci vůči antibiotikům do rostlin a mikroorganismů. Toto hledisko je významné zejména u potravinářských plodin a u mikroorganismů, které nejsou vytvářeny pro použití v uzavřeném prostředí (například mikroorganismů pro použití v zemědělství), stejně jako u mikroorganismů, které jsou vytvářeny pro použití v uzavřeném prostředí, ale mohou být z uzavřeného prostředí náhodně uvolněny. I když se tyto obavy mohou ukázat jako neopodstatněné, mohou přesto vést k vládním omezením použití genů rezistence vůči antibiotikům například u rostlin, a je proto žádoucí vyvinout nové způsoby selekce geneticky transformovaných buněk, které nejsou závislé na těchto genech.
- 1 CZ 284828 B6
Další nevýhodou negativní selekce je, že se rostlinné tkáně nebo buňky ošetřené toxickými látkami stávají citlivějšími vůči bakteriální infekci. To je problém při použití Agrobacteria jako transformačního vektoru, protože jsou ošetřené tkáně nebo buňky někdy přerůstány bakteriemi, ačkoli jsou pro zabránění růstu bakterií použita antibiotika.
Kromě toho vyžaduje selekce buněk nebo tkání za použití negativní selekce velmi přesné načasování exprese introdukovaných genů ve vztahu k selekčnímu postupu. Pokud jsou transgenické buňky ošetřeny toxickou látkou dříve než je exprimován detoxifikační gen nebo než se vytvoří dostatečné množství produktu genu pro potlačení účinku toxické látky, dochází k usmrcení transgenických buněk společně s netransgenickými buňkami. Pokud se selekce provede příliš pozdě, může selekci transgenických buněk nebo tkání bránit například tvorba prýtů z netransgenických buněk nebo tkání.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nevýhody jsou eliminovány způsobem podle vynálezu (označeným pozitivní selekce), který poprvé umožňuje identifikovat a izolovat geneticky transformované buňky bez poškození nebo usmrcení netransformovaných buněk v populaci a bez kointrodukce genů rezistence vůči antibiotikům či herbicidům. Kromě toho, že je eliminována potřeba genů rezistence vůči antibiotikům nebo herbicidům, ukázalo se, že jsou způsoby pozitivní selekce podle vynálezu často mnohem účinnější než tradiční negativní selekce. Jak je popsáno níže v Příkladech provedení vynálezu, je počet transgenických prýtů získaných z listových terčíků tabáku za použití pozitivní selekce asi třicetkrát vyšší než počet prýtů získaných za použití tradičního negativního selekčního systému založeného na kanamycinu, a při kombinaci pozitivní a negativní selekce činila selekční frekvence transgenických prýtů asi desetinásobek ve srovnání s použitím pouze negativní selekce (viz Příklad 11). Dále poskytuje použití pozitivní selekce tu výhodu, že může být jako reportérový gen a selekční gen použit jediný gen, což má za následek zjednodušení konstrukce vektorů, větší stabilitu konstruktů a stoprocentní korelaci mezi expresí reportérového a selekčního genu. Pozitivní selekce též eliminuje výše uvedené problémy týkající se načasování, jelikož jsou sloučeniny, které mají za následek selekci, vždy produkovány jako důsledek exprese genu. Selekční sloučenina se tedy akumuluje pokud je exprimován selekční gen, a selekční účinek se projevuje když se vytvoří dostatečné množství selekční sloučeniny.
Jedním aspektem, kterého se vynález týká, je způsob selekce geneticky transformovaných buněk, do kterých byla introdukována požadovaná nukleotidová sekvence, z populace buněk, při kterém požadovaná nukleotidová sekvence nebo kointrodukovaná nukleotidová sekvence v transformovaných buňkách vyvolává nebo zvyšuje pozitivní účinek sloučeniny či živiny dodávané populaci buněk, a tím umožňuje identifikaci nebo selekci transformovaných buněk z netransformovaných buněk.
Podle jednoho provedení se tento způsob provádí kultivací populace buněk na nebo v médiu obsahujícím alespoň jednu neaktivní sloučeninu nebo živinu, která je přímo či nepřímo aktivována v buňkách obsahujících kointrodukovanou nukleotidovou sekvenci nebo požadovanou nukleotidovou sekvenci, přičemž je tato sloučenina či živina neaktivní v netransformovaných buňkách nebo méně aktivní v netransformovaných buňkách než v transformovaných buňkách, takže je transformovaným buňkám poskytována selekční výhoda, která umožňuje jejich selekci z populace buněk.
Podle jiného provedení se tento způsob provádí kultivací populace buněk na nebo v médiu obsahujícím alespoň jednu sloučeninu nebo živinu, která je dostupná pro transformované buňky díky expresi nebo transkripci kointrodukované nukleotidové sekvence či požadované nukleotidové sekvence, přičemž tato sloučenina nebo živina není dostupná pro netransformované buňky nebo je pro netransformované buňky méně dostupná než pro transformované buňky, takže
-2CZ 284828 B6 je transformovaným buňkám poskytována selekční výhoda, která umožňuje jejich selekci z populace buněk.
Podle dalšího provedení vede exprese kointrodukované nukleotidové sekvence ke zvýšení aktivity enzymu, kteiý se nachází endogenně v populaci buněk, takže aktivita enzymu v transformovaných buňkách je vyšší než aktivita enzymu v netransformovaných buňkách.
Podle ještě dalšího provedení má exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence nebo požadované nukleotidové sekvence za následek blokování metabolismu sloučeniny dodávané populaci buněk nebo blokování syntézy sloučeniny v transformovaných buňkách, což umožňuje identifikaci nebo selekci transformovaných buněk z netransformovaných buněk.
Druhým aspektem, kterého se vynález týká, jsou nové sloučeniny, které jsou vhodné pro použití ve výše uvedeném způsobu. Tento aspekt se týká sloučeniny obecného vzorce I
NH-R6
R3 R9 ve kterém
R2 představuje atom vodíku, methylovou skupinu, methylthioskupinu, methylsulfonylovou skupinu, benzylthioskupinu, merkaptoskupinu, hydroxylovou skupinu, atom chloru, či skupinu vzorce -S-R10, -NH-R10 nebo -O-R10, kde
R10 znamená beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu (jejíž struktura je zřejmá ze zde uvedených příkladů provedení) nebo její sůl nebo její esterový nebo amidový derivát na karboxylové skupině,
R6 představuje benzylovou skupinu, která může být na fenylovém kruhu substituována hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, atomem halogenu, alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupinou či trifluormethylovou skupinou, nebo skupinou vzorce -O-R10, -S-R10, nebo -NH-R10, kde má symbol R10 výše definovaný význam, alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku či alkenylovou skupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, která může být substituována 1 až 3 hydroxylovými skupinami, glukosyloxyskupinami či alkoxylovými skupinami obsahujícími 1 až 6 atomů uhlíku, fenylovou skupinou, nebo/a skupinou vzorce -O-R10, S-R10, nebo -NH-R10, kde má symbol R10 výše definovaný význam, esterifikovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkenylovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, furfurylovou skupinu, nebo cyklohexylureidoskupinu, fenylureidoskupinu či tolylureidoskupinu; a buď i) každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které společně tvoří vazbu, ii) jeden ze symbolů R3 a R9 znamená atom vodíku nebo skupinu R10, jak je definována výše, a druhý představuje polovinu vazby, která společně s polovinou vazby představovanou symbolem X tvoří vazbu, nebo R9 znamená ribosylovou skupinu, 5-fosforibosylovou skupinu, glukosylovou skupinu nebo skupinu vzorce -CH2CH(NH2)COOH aR3 znamená
-3 CZ 284828 B6 polovinu vazby, která společně s polovinou vazby představovanou symbolem X tvoří vazbu, a iii) R8 znamená atom vodíku, methylovou skupinu, methylthioskupinu, methylsulfonylovou skupinu, benzylthioskupinu, merkaptoskupinu, hydroxylovou skupinu, atom chloru, či skupinu vzorce -S-R10, -NH-R10 nebo -O-R10, kde má symbol R10 shora definovaný význam, nebo iv)R7 znamená ribosylovou skupinu, 5'-fosforibosylovou skupinu nebo glukosylovou skupinu. R8 představuje atom vodíku, každý ze symbolů R9 a Y znamená polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, a R3 znamená polovinu vazby, která společně s polovinou vazby představovanou symbolem X tvoří vazbu;
s tou podmínkou, že jeden ze symbolů R2, R3, R6, R8 a R9 představuje nebo obsahuje beta-Dglukopyranuronosylovou skupinu, nebo její sůl nebo její esterový nebo amidový derivát na karboxylové skupině.
Dalším aspektem, kterého se vynález týká, jsou další sloučeniny, které mohou být použity ve výše uvedeném způsobu. Vynález se tedy též týká sloučenin obecného vzorce II
ve kterém
R1 představuje skupinu vzorce cis-CH=CH-COOH, její sůl nebo její esterový derivát na karboxylové skupině, nebo amidový derivát skupiny cis- nebo/a trans—CH=CH-COOH, a
R10 má shora definovaný význam.
Kromě toho se vynález týká geneticky transformovaných buněk, které byly vyselektovány v souladu svýše uvedeným způsobem, zejména rostlinných buněk, stejně jako rostlin, jejich potomstva a semen, získaných z těchto geneticky transformovaných rostlinných buněk.
Podrobný popis vynálezu
Termín buňky v kontextu tohoto vynálezu označuje libovolný typ buněk, ze kterých mohou být identifikovány a izolovány za použití způsobu podle vynálezu jednotlivé geneticky transformované buňky, včetně rostlinných buněk, živočišných buněk a mikroorganismů, jako jsou bakterie, houby, kvasinky atd. Dále termín buňky též zahrnuje protoplasty, tj. protoplazmu buněk uzavřenou v membráně, ale bez buněčné stěny. Ačkoli se předpokládá, že obecný princip vynálezu může být použit pro libovolný typ buněk, bylo zjištěno, že je tento způsob zejména vhodný pro selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk.
Termín populace buněk označuje libovolnou skupinu buněk, která byla podrobena genetické transformaci a ve které je žádoucí identifikovat ty buňky, které byly geneticky transformovány a izolovat geneticky transformované buňky od negeneticky transformovaných buněk. Populací může být například tkáň, orgán nebo jeho část, populace jednotlivých buněk v nebo na substrátu,
-4CZ 284828 B6 jako je kultura buněk mikroorganismů, například populace buněk v roztoku nebo suspenzi, nebo celý organismus, například úplná rostlina.
Termín selekce označuje postup identifikace nebo/a izolace geneticky transformovaných buněk od negeneticky transformovaných buněk za použití zde popsaného způsobu.
Požadovaná nukleotidová sekvence může být libovolná nukleotidová sekvence, která má být včleněna do daných buněk, za účelem vytvoření geneticky transformovaných buněk. Introdukce nukleotidových sekvencí do rostlin, mikroorganismů a zvířat je široce používána, a neexistují žádná omezení ohledně nukleotidových sekvencí, jejichž přítomnost může být zjišťována za použití zde popsaného způsobu pozitivní selekce. Za použití tohoto způsobu může být stanovena přítomnost požadované nukleotidové sekvence v geneticky transformovaných buňkách bez výše zmíněných nevýhod spojených s tradičními systémy negativní selekce.
Spojení, že nukleotidová sekvence je kointrodukována s požadovanou nukleotidovou sekvencí označuje skutečnost, že jsou dvě nukleotidové sekvence spolu spojeny nebo jinak společně introdukovány takovým způsobem, že přítomnost kointrodukované nukleotidové sekvence v buňce svědčí o tom, že do buňky byla introdukována požadovaná nukleotidová sekvence, tj. pokud se ukáže, že jedna z nukleotidových sekvencí byla introdukována, je podstatně zvýšená pravděpodobnost, že byla introdukována též druhá nukleotidová sekvence. Tyto dvě nukleotidové sekvence jsou tedy typicky, ačkoli ne bezpodmínečně, částí stejného genetického konstruktu, a jsou například introdukovány pomocí stejného vektoru.
Zde popsané způsoby mohou být též použity pokud jsou kointrodukovaná nukleotidová sekvence a požadovaná nukleotidová sekvence introdukovány nezávisle. To může být provedeno například za použití stejné bakterie pro inkorporaci obou genů a inkorporací relativně velkého počtu kopií požadované nukleotidové sekvence do buněk, díky čemuž je relativně vysoká pravděpodobnost, že buňky, u kterých se ukáže, že exprimují kointrodukovanou nukleotidovou sekvenci, budou též obsahovat a exprimovat požadovanou nukleotidovou sekvenci. Obecně se očekává, že nezávislá introdukce dvou nebo více genů mající za následek společnou expresi genů ve stejné buňce má nízkou pravděpodobnost, a očekává se tedy, že zlepšené selekční frekvence dosažené způsobem pozitivní selekce jsou zejména výhodné v takových systémech.
Jelikož je nutné, aby byly introdukované nukleotidové sekvence v transformovaných buňkách exprimovány, bude genetický konstrukt obsahující tyto dvě nukleotidové sekvence typicky, nikoli však bezpodmínečně, obsahovat regulační sekvence umožňující expresi nukleotidových sekvencí, například známé promotory a transkripční terminátory. Kointrodukovaná nukleotidová sekvence bude tedy typicky spojena s promotorem, kterým může být buď konstitutivní nebo regulovatelný promotor, a požadovaná nukleotidová sekvence bude typicky též spojena s konstitutivním nebo regulovatelným promotorem.
Jak již bylo uvedeno výše, je popisovaný způsob zejména vhodný pro selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk, kdy umožňuje identifikaci a izolaci takových buněk bez použití selekčních genů kódujících rezistenci vůči antibiotiku nebo herbicidu. Jako u tradičních způsobů negativní selekce, může být zde popsaný způsob pozitivní selekce použit pro selekci buněk in vitro. Způsob pozitivní selekce může však být použit též in vivo. Použití způsobu pozitivní selekce in vivo je zejména významné například ve spojení s genetickou transformací prováděnou na celých rostlinách nebo rostlinných částech, kdy rostliny nebo rostlinné části obsahují jak transformované tak netransformované buňky, jelikož se selekce transformovaných buněk dosáhne bez přímého poškození sousedících netransformovaných buněk. Transformované buňky tedy mají selekční výhodu ve srovnání s netransformovanými buňkami (například schopnost tvorby prýtů), ale netransformované buňky netrpí žádnou vážnou nevýhodou, ve smyslu jejich poškození nebo usmrcení, k čemuž dochází v případě negativní selekce používající antibiotik nebo herbicidů.
-5CZ 284828 B6
Neaktivní sloučenina nebo živina může být libovolná sloučenina nebo živina v neaktivní formě nebo ve formě prekurzoru, tedy taková, která je v případě, že nedochází k expresi kointrodukované nukleotidové sekvence, ve formě která jev podstatě biologicky neaktivní vzhledem k daným buňkám, ale která je v případě, že dochází k expresi nebo transkripci kointrodukované nukleotidové sekvence, hydrolyzována nebo jinak aktivována či metabolizována, takže je geneticky transformovaným buňkám obsahujícím požadovanou nukleotidovou sekvenci poskytována selekční výhoda, která umožňuje jejich identifikaci a izolaci. Neaktivní sloučeninou nebo živinou může tedy být například neaktivní růstový regulátor rostlin, například inaktivovaný cytokinin, auxin nebo giberelin, vitamin, například inaktivovaný thiamin, glycidy (například manosa, pokud kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje manosa-6-fosfát-isomerasu, nebo galaktosa či galaktosu obsahující sloučenina, pokud kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje UDP-galaktosa-4-epimerasu), sloučenina obsahující dusík (například opin, pokud kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje enzym pro metabolismus nebo transport opinů), škrob, protein, nebo jiná živina v neaktivní formě, či sloučenina, která hraje podstatnou úlohu během diferenciace a dediferenciace buněk a tkání. Společně s odpovídajícími neaktivními sloučeninami může být též použito ošetření buněk a tkání sloučeninami indukujícími závislost na dodatečném přidání esenciálních sloučenin. Tento přístup může být použit například v případě, že je inhibována syntéza sterolu nebo saponinu a jsou přidány neaktivní steroly nebo saponiny. Neaktivní sloučeninou může být dále například minerální látka, která je chelatována atak učiněna dostupnou pro geneticky transformované buňky.
V protikladu k tradiční negativní selekci, ve které jsou netransformované buňky poškozeny nebo usmrceny vlivem přítomnosti antibiotika, herbicidu nebo toxinu v substrátu, nemají neaktivní sloučeniny nebo živiny používané ve způsobu pozitivní selekce podle vynálezu žádný přímý nepříznivý vliv na netransformované buňky. Místo toho je transformovaným buňkám poskytována fyziologická výhoda, která umožňuje jejich identifikaci a izolaci, zatímco netransformované buňky jsou neovlivněny jako takové nebo méně ovlivněny přítomností neaktivní sloučeniny nebo živiny používané pro selekční účely.
Tradiční způsoby negativní selekce jsou tedy charakterizovány použitím selekčního genu, který snižuje negativní účinek přidané sloučeniny na transformované buňky. Naproti tomu termín pozitivní selekce, jak je používán v kontextu tohoto vynálezu, označuje použití selekčního genu, který způsobuje nebo zvyšuje pozitivní účinek přidané sloučeniny na transformované buňky.
Sloučenina používaná pro selekční účely může mít mimoto jak pozitivní tak negativní účinek. Například manosa je toxická pro většinu rostlinných buněk, ale v buňkách obsahujících manosa6-fosfát-isomerasu je negativní účinek eliminován a buňky navíc získají užitek tím, že jsou schopny využít manosu jako glycidový zdroj. V tomto případě jsou jediná sloučenina a jediný gen složkami kombinovaného pozitivního a negativního selekčního systému, ačkoli takový kombinovaný pozitivní a negativní systém může být též vytvořen za použití dvou nebo více genů, které jsou společně odpovědné za inhibici negativních účinků sloučeniny a projevení se pozitivních účinků sloučeniny v transformovaných buňkách.
Neaktivní sloučenina nebo živina používaná ve způsobu pozitivní selekce nemusí být aktivována přímo polypeptidem kódovaným kointrodukovanou nukleotidovou sekvencí. Může jít též o neaktivní sloučeninu nebo živinu, která je aktivována nepřímo, tj. tak, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence má nepřímý účinek na neaktivní sloučeninu nebo živinu v geneticky transformovaných buňkách, ale nikoli v netransformovaných buňkách. Tak může tato kointrodukovaná nukleotidová sekvence po expresi v transformovaných buňkách například nepřímo zvyšovat aktivitu enzymu, který je pro populaci buněk endogenní, což způsobuje vyšší aktivitu enzymu a aktivaci dané neaktivní sloučeniny nebo živiny v geneticky transformovaných buňkách.
-6CZ 284828 B6
Kointrodukovaná nukleotidová sekvence může též například kódovat permeasu nebo jiný transportní faktor, který umožňuje dané sloučenině nebo živině projít přes buněčnou membránu a dostat se do transformovaných buněk nebo projít přes jinou (organelovou) membránu, takže aktivace neaktivní sloučeniny nebo živiny v tomto případě spočívá v selektivním příjmu sloučeniny nebo živiny transformovanými buňkami, zatímco příjem sloučeniny nebo živiny netransformovanými buňkami není možný nebo probíhá v menším rozsahu. Místo usnadňování příjmu sloučeniny do buňky, může kointrodukovaná nukleotidová sekvence alternativně řídit svůj produkt do kompartmentu, kde je lokalizována neaktivní sloučenina, například mimo plazmatickou membránu nebo do vakuoly či endoplazmatického retikula.
Selekce se při použití tohoto přístupu tedy dosáhne tím, že se sloučenina zpřístupní transformovaným buňkám, zatímco není dostupná nebo je méně dostupná pro netransformované buňky. Daná sloučenina nebo živina, která v tomto případě nemusí být neaktivní jako taková (tj. může jít o takovou sloučeninu nebo živinu, jejíž aktivita se uplatní po proniknutí do transformovaných buněk, aniž by musela být v buňkách bezpodmínečně podrobena například hydrolýze), může být stejného typu jako libovolná z výše zmíněných sloučenin nebo živin, s tím rozdílem, že sloučenina nebo živina je v tomto případě transportována do transformovaných buněk místo (nebo kromě) její aktivace v transformovaných buňkách.
Příklady sloučenin, které mohou uplatnit fyziologické účinky po proniknutí do buňky, které však nejsou do buňky nebo buněčného kompartmentu snadno přijímány, zahrnují silně hydrofilní nebo hydrofobní sloučeniny, zejména sloučeniny nesoucí náboj, velké molekuly jako jsou polymery, zejména proteiny, peptidy, oligo- a polysacharidy, včetně rostlinných hormonů, fosforylované metabolity jako jsou fosforylované glycidy, fosforylované vitaminy, fosforylované nukleosidy, včetně cytokininů, a sloučeniny, které jsou konjugované s aminokyselinami nebo glycidy obsahujícími karboxylovou skupinu, včetně konjugátů rostlinných hormonů.
Také se počítá s tím, že základní způsob podle vynálezu může být modifikován tak, že místo aktivace neaktivní sloučeniny nebo živiny v transformovaných buňkách může být selekce prováděna blokováním metabolické syntézy sloučeniny v těchto buňkách. Například metabolismus cytokininů přidaného k substrátu může být blokován v transformovaných buňkách protipůsobícím mechanismem. Vynálezci tak zjistili, že v případě, že je inhibována glykosylace zeatinu, snižuje se optimální koncentrace indukující tvorbu piýtů 5- až 100-násobně. Inhibováním metabolismu zeatinu je tedy možné dosáhnout tvorby prýtů z listových terčíků tabáku při koncentracích zeatinu, které nejsou schopny indukovat tvorbu prýtů u netransformovaných listových terčíků, které mají normální metabolismus zeatinu. Bylo též zjištěno, že účinky indoloctové kyseliny (IAA, indole acetic acid) mohou být zvýšeny, pokud je inhibován metabolismus této sloučeniny. Tak v případě, že byl metabolismus IAA částečně inhibován, bylo zjištěno, že byl účinek indoloctové kyseliny na růst kalusu zvýšen 5- až 100-násobně. Podobně může inhibice metabolismu glycidu a polysacharidu ovlivnit využití přidaného glycidu a poskytnout další možnosti pro pozitivní selekci tímto způsobem.
Selekční výhoda transformovaných buněk může být libovolná odlišnost nebo výhoda vzhledem k netransformovaným buňkám, která umožňuje snadnou identifikaci a izolaci transformovaných buněk z netransformovaných buněk. Typicky jde o odlišnost nebo výhodu, která umožňuje identifikaci transformovaných buněk jednoduchým vizuálním způsobem, tj. bez použití zvláštního testu pro stanovení přítomnosti markerového genu.
Pokud polypeptid kódovaný kointrodukovanou nukleotidovou sekvencí nebo požadovanou nukleotidovou sekvencí v transformovaných buňkách přímo aktivuje neaktivní sloučeninu nebo živinu, mohou netransformované buňky v některých případech obsahovat nebo produkovat určité množství daného polypeptidu. Například v případě, že je aktivačním polypeptidem enzym, mohou netransformované buňky vykazovat určitou přirozenou enzymovou aktivitu, kdy je přirozený enzym stejného typu jako introdukovaný aktivační enzym. V těchto případech nemusí
-7CZ 284828 B6 být neaktivní sloučenina nebo živina v netransformovaných buňkách nutně zcela neaktivní, jelikož může být postačující, je-li tato sloučenina nebo živina pouze podstatně méně aktivní v netransformovaných buňkách než v transformovaných buňkách. Jinými slovy, v některých případech může být pro selekční účely postačující kvalitativní rozdíl mezi transformovanými buňkami a netransformovanými buňkami ohledně aktivace původně neaktivní sloučeniny nebo živiny. V takových případech mohou být přidány inhibitory nebo substráty soutěžící s přirozenými enzymy. Zejména vhodné jsou inhibitory aktivované přirozenými enzymy, které mají za následek spontánní katalytickou tvorbu aktivního inhibitoru v množství, při kterém je přirozený enzym v podstatě úplně inhibován.
Aktivační polypeptid kódovaný kointrodukovanou nebo požadovanou nukleotidovou sekvencí není omezen na žádný konkrétní polypeptid a jedná se pochopitelně o takový polypeptid, který je aktivní, bud přímo nebo nepřímo, ve vztahu ke konkrétní sloučenině nebo živině, která má být v geneticky transformovaných buňkách aktivována. Tímto polypeptidem je zejména často enzym.
Jedním z enzymů, o kterém bylo zjištěno, že je vhodný pro selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk je beta-glukuronidasa (GUS), přičemž selekce se provádí za použití glukuronidové sloučeniny obsahující rostlinný růstový regulátor, která je štěpená betaglukuronidasou, například za použití cytokinin-glukuronidu (jak je zřejmý ze zde uvedených příkladů). Je překvapující, že může být za použití genu GUS dosaženo selekce geneticky transformovaných rostlinných buněk, jelikož bylo ve spojení s vynálezem zjištěno, že vyšší rostliny vykazují přirozenou aktivitu GUS. Toto zjištění je v protikladu s tím, co bylo uváděno dříve. Tak vGB2 197 653-A se uvádí, že vyšší rostliny nevykazují detekovatelnou betaglukuronidasovou aktivitu a z toho se vyvozuje, že vzhledem ktomu, že ve vyšších rostlinách nebyla zjištěna aktivita GUS, je relativně snadné sledovat expresi zkoumaného genového konstruktu za použití genu GUS. Avšak, jak je vysvětleno níže (viz Příklady provedení vynálezu), není tomu tak, a použití genu GUS pro sledování přítomnosti zkoumaného genu není vůbec jednoduché, díky tomu, že vyšší rostliny ve skutečnosti vykazují podstatnou vnitřní (jako pozadí) aktivitu beta-glukuronidasy.
Pro selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk může být tedy populace buněk kultivována na nebo v médiu obsahujícím cytokinin-glukuronid, který je v transformovaných buňkách štěpen beta-glukuronidasou, čímž se uvolňuje volný cytokinin a vede to v transformovaných buňkách k indukci prýtů nebo/a kalusu.
Pro účely vynálezu bylo vyvinuto mnoho nových cytokinin-glukuronidů. Příprava těchto sloučenin, stejně jako jejich použití pro pozitivní selekci geneticky transformovaných buněk, je podrobně popsána níže.
V některých případech může být žádoucí modifikovat zde popsaný základní způsob, například kvůli dosažení větší efektivity selekce nebo kvůli zjednodušení selekčního procesu. Pokud je neaktivní sloučeninou použitou pro proces pozitivní selekce sloučenina, která je štěpená betaglukuronidasou, může být základní způsob různě modifikován k získání lepších výsledků. Jednou z možností modifikace je použití určitých sterol-glukuronidů, například cholesteryl-beta-Dglukuronidu nebo beta-sitosteryl-beta-D-glukuronidu, společně se sloučeninou inhibující syntézu sterolů, jako je tridemorf (4-tridecyl-2,6-dimethylmorfolin). Použití takových sloučenin popisují níže uvedené příklady 5 a 6. Má se za to, že při použití inhibitoru syntézy sterolů společně se sterol-glukuronidy, které po hydrolýze beta-glukuronidasou působí proti účinku inhibitoru syntézy sterolů, lze během selekčního procesu zabránit tzv. cross-feedingu (tj. difusi aktivované sloučeniny z buňky, ve které je aktivována do jiné buňky), jelikož u sterolů nedochází k difúzi z buňky do buňky, pokud je odštěpen hydrofilní glukuronidový zbytek. Tak se dosáhne přesněji lokalizovaného účinku. Podobných výsledků může být dosaženo s velkým množstvím jiných glukuronidů, které obsahují hydrofobní aglykon.
-8CZ 284828 B6
Jak je vysvětleno výše, bylo v protikladu s tím, co bylo uváděno dříve, zjištěno, že vyšší rostliny ve skutečnosti vykazují přirozenou aktivitu GUS. Z tohoto důvodu nemusí být pouhé zavedení genu GUS do rostliny bezpodmínečně postačující pro dosažení požadované selekce geneticky transformovaných buněk, a může být nutné nebo žádoucí omezit v populaci buněk jakoukoli přirozenou beta-glukuronidasovou aktivitu. Jelikož zavedená beta-glukuronidasa může mít odlišné vlastnosti než přirozená beta-glukuronidasa, může být snížení libovolné přirozené betaglukuronidasové aktivity provedeno různými způsoby, například přidáním sloučeniny inhibující beta-glukuronidasu, která má vyšší inhibiční účinek na přirozenou beta-glukuronidasu než na beta-glukuronidasu kódovanou nukleotidovou sekvencí nebo její subsekvencí, do kultivačního média. Jedním takovým typem sloučeniny je amonná sůl.
Přirozená beta-glukuronidasová aktivita v populaci buněk může být též podstatně snížena tím, že se do kultivačního média přidá sloučenina, která po hydrolýze dává produkt, který inhibuje aktivitu přirozené beta-glukuronidasy, a který s výhodou inhibuje aktivitu přirozené betaglukuronidasy více než je inhibována aktivita zavedené beta-glukuronidasy. To může probíhat autoregulovaným nebo lokalizovaným způsobem, například lokalizací do specifických kompartmentů, kde je lokalizován nebo není lokalizován zavedený gen GUS. Příkladem produktu hydrolýzy, který inhibuje přirozenou beta-glukuronidasu, je glukuronová kyselina, která vzniká například hydrolýzou glyccyrrhizové kyseliny nebo sterol-glukuronidů.
Přirozená beta-glukuronidasová aktivita může být v populaci buněk dále snížena tím, že se do kultivačního média přidá inhibitor beta-glukuronidasy, zejména beta-glukuronid, který v buňkách bez zavedeného genu beta-glukuronidasy inhibuje beta-glukuronidasovou aktivitu více než v buňkách se zavedeným genem beta-glukuronidasy. Může to být například špatný beta-glukuronidasový substrát (glukuronid), který má vyšší afinitu k přirozené betaglukuronidase než k zavedené beta-glukuronidase.
Beta-glukuronidasa kódovaná zavedeným beta-glukuronidasovým genem používaná pro účely tohoto vynálezu je aktivní v relativně širokém rozmezí pH, zatímco přirozená betaglukuronidasa nacházející se v řadě různých rostlinných druhů je aktivní pouze v relativně úzkém rozmezí hodnot pH, typicky okolo pH 4 až 5 (viz Příklad 3 níže). Přirozená betaglukuronidasová aktivita může být tudíž v tomto případě snížena tím, že se do kultivačního média přidá glukuronid, který může být hydrolyzován přirozenou beta-glukuronidasou a který po hydrolýze způsobuje zvýšení pH, například o-kumaryl-glukuronid.
Jelikož bylo zjištěno, že beta-glukuronidasa vyskytující se přirozeně v rostlinách je obecně aktivní při pH okolo 4 až 5, může být přirozená beta-glukuronidasová aktivita snížena též tím, že se do kultivačního media přidá sloučenina regulující pH, která upravuje pH kultivačního média na hodnotu mezi přibližně 5,5 a 8,5, výhodně mezi přibližně 6,0 a 8,0, například mezi přibližně 6,5 a 7,5, nebo sloučenina regulující pH, která zvyšuje pH v buňkách nebo v kompartmentech buněk na pH v těchto rozmezích. Při těchto hodnotách pHje betaglukuronidasa kódovaná zavedeným genem GUS aktivní, ale přirozená beta-glukuronidasa je v podstatě neaktivní. Příkladem sloučeniny regulující pH, která může být použita, je amonná sůl, nebo sloučenina uvolňující amoniak, například dusičnan amonný.
Konečně může být přirozená beta-glukuronidasová aktivita snížena nebo podstatně eliminována fyzikálním ošetřením, jako je ošetření teplem, například použitím teploty v rozmezí 50 až 65 °C formou krátkých tepelných impulzů přibližně 1 až 2 dny před přenesením na selekční substrát nebo/a použitím teploty v rozmezí 30 až 45 °C během selekce (viz Příklad 10).
Genetická transformace rostlinných buněk se často provádí za použití kmenů Agrobacteria, zejména kmenů Agrobacterium tumefaciens. Bylo zjištěno, že některé odzbrojené kmeny Agrobacteria indukují tvorbu prýtů díky tvorbě látek indukujících prýty během kokultivace, a pokud má být pro účely selekce geneticky transformovaných buněk použito hydrolýzy
-9CZ 284828 B6 cytokinin-glukuronidů pomocí GUS, je těmto kmenům normálně třeba se vyhnout. Genetická transformace buněk za použití cytokinin-glukoronidu jako neaktivní sloučeniny se tedy výhodně provádí za použití kmenu Agrobacteria, který netvoří cytokininy či jiné sloučeniny, které indukují prýty (růst), nebo kteiý tvoří pouze nepodstatná množství těchto látek, čímž se eliminuje nebo podstatně snižuje indukce růstu prýtů díky přítomnosti živých bakterií na nebo v buňkách.
V některých případech, například pokud je vyžadována zlepšená selekční frekvence, může být výhodné, aby byla požadovaná nukleotidová sekvence kointrodukována s alespoň dvěma odlišnými selekčními geny. Dalším selekčním genem může být další gen kódující enzym (nebo jiný protein nebo polypeptid) vhodný pro pozitivní selekci podle vynálezu, nebojím může být gen kódující enzym (nebo jiný protein či polypeptid) vhodný pro tradiční negativní selekci, například kódující rezistenci vůči toxinu, antibiotiku nebo herbicidu. Selekce geneticky transformovaných buněk tedy může probíhat za použití kombinace pozitivní selekce a negativní selekce, přičemž je požadovaná nukleotidová sekvence v geneticky transformovaných buňkách dále kointrodukována se subsekvencí kódující rezistenci vůči alespoň jednomu toxinu, antibiotiku nebo herbicidu, a médium obsahuje alespoň jeden toxin, antibiotikum nebo herbicid, vůči kterému jsou transformované buňky rezistentní.
Jak bylo uvedeno výše, vynález se podle jednoho provedení týká geneticky transformovaných buněk, které byly vyselektovány podle výše uvedeného způsobu, zejména rostlinných buněk, jejich potomstva nebo semen získaných z těchto geneticky transformovaných rostlinných buněk. Výhodou je často zejména to, že tyto buňky jsou geneticky transformované rostlinné buňky, jejichž genom neobsahuje jako selekční markér zavedenou (tj. nepřirozenou) nukleotidovou sekvenci kódující rezistenci vůči toxinu, antibiotiku nebo herbicidu. Jak bylo vysvětleno výše, vyskytují se obavy, zdali je bezpečné začleňovat geny kódující například rezistenci vůči antibiotiku do například potravinářských plodin. Z tohoto hlediska jsou tedy geneticky transformované rostlinné buňky vyselektované způsobem podle vynálezu, které neobsahují selekční geny například pro rezistenci vůči antibiotiku, stejně jako rostliny, jejich potomstvo a semena získaná z těchto buněk, jasně výhodné.
Syntéza sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu
Pro syntézu cytokinin-glukoronidů zahrnutých obecným vzorcem I jsou k dispozici různé postupy, které jsou více či méně obecné, a dva z těchto postupů, které jsou považovány za nejlepší, jsou popsány v následujícím textu.
A) Oxidace odpovídajícího cytokinin D-glukosidu
V tomto případě je za vhodných podmínek oxidována hydroxymethylová skupina, navázaná na pyranosový kruh beta-D-glukosidu odpovídajícího danému glukuronidu, na karboxylovou skupinu. Pravděpodobně nejlepším způsobem, jak dosáhnout této oxidační reakce jednoduše a vysoce selektivně je provedení katalytické oxidace kyslíkem, vhodně za použití platinové černi nebo platiny na uhlí jako katalyzátoru, a použití slabě zásaditého (pH 8 až 10) vodného nebo vodně alkoholického (jako je vodně ethanolického) reakčního prostředí, reakce může být s výhodou prováděna při teplotě v rozmezí 60 až 100 °C po dobu 2 až 24 hodin. Oxidace (obecně nekatalytická) běžnými oxidačními činidly jinými než kyslíkem může být též použitelná, ale předpokládá se, že výsledné oxidační reakce obecně poskytnou nižší výtěžky a budou vykazovat nižší specifícitu (tj. vytvoří se směsi oxidačních produktů - zejména pokud nejsou přijata opatření k ochraně jiných oxidovatelných skupin glukosidu jako výchozího materiálu zavedením vhodných chránících skupin, jak je popsáno níže).
Příklad postupu katalytické oxidace je uveden ve Způsobu 1 v Příkladu 1C přihlášky, ve kterém je N6-benzyladenin-9-beta-D-glukopyranosid (BA9G) oxidován na N6-benzyladenin-9-beta
- 10CZ 284828 B6
D-glukopyranuronovou kyselinu (která je následně izolována jako sodná sůl) za použití oxidace kyslíkem v přítomnosti platinové černi.
Má se za to, že tento způsob je značně obecně použitelný pro syntézu cytokinin-9-glukuronidů zodpovídajících 9-glukosidů. Ukázal se též jako uspokojivý pro syntézu například zeatin-Oglukuronidu (viz zde uvedený Příklad 1G) zodpovídajícího zeatin-O-glukosidu. Zeatin-Oglukuronid je příkladem sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu, ve které je glukuronidový zbytek substituentem na zbytku R6 - jak je zde definován - typu alkenylové skupiny obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, a má se za to, že daný způsob je dostatečně široce aplikovatelný pro ostatní cytokinin-glukuronidy podle vynálezu, ve kterých je O-glukuronidový zbytek umístěn jako substituent na skupině označené symbolem R6, který představuje jeden z následujících významů, jak jsou definovány v souvislosti s obecným vzorcem I: benzylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku nebo substituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku či alkenylovou skupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku nebo substituovanou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku.
Zdá se však, že tento postup není obecně použitelný, například pro syntézu cytokinin-3glukuronidů.
Jak již bylo naznačeno, je jasné, že při použití postupu zahrnujícího oxidaci cytokininglukosidu, musí být libovolné jiné oxidovatelné funkční skupiny (za daných oxidačních podmínek), které mohou být přítomné ve výchozím cytokinin-glukosidu a které mají zůstat nezměněné ve výsledném glukuronidu obecného vzorce I, chráněny předchozím zavedením vhodné chránící skupiny. Příklady potenciálně oxidovatelných skupin, které mohou být přítomny ve sloučeninách odpovídajících definici obecného vzorce I jsou (s ohledem na jejich umístění, jak je specifikováno v souvislosti s obecným vzorcem I (viz výše)): merkaptoskupina, která může být přítomna jako skupina R2 nebo/a R8, hydroxylová skupina nebo glukosyloxyskupina, které mohou být přítomny jako substituenty na skupině R6, pokud představuje substituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku či substituovanou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, a ribosylová, 5'-fosforibosylová nebo glukosylová skupina, které mohou být přítomny jako skupiny R9 nebo R7. Pokud je například nutné chránit alifatické (alkoholické) hydroxylové skupiny, jako jsou hydroxylové skupiny na sekundárních atomech ribosylové, 5'-fosforibosylové nebo glukosylové skupiny, jsou vhodnými chránícími skupinami například acetylové skupiny, které mohou být zavedeny o sobě známými způsoby, a které mohou být po oxidačním procesu odstraněny alkalickou hydrolýzou.
Za použití postupu mírné katalytické oxidace, jak je popsán výše, jsou však hydroxylové skupiny na primárních alifatických atomech uhlíku obecně citlivé k oxidaci, zatímco hydroxylové skupiny na sekundárních (a terciárních) atomech uhlíku obecně nejsou, takže při oxidaci zbytku vzorce -CH2OH v poloze 5 glukopyranosového kruhu cytokinin-beta-D-glukosidu tímto způsobem hydroxylové skupiny v polohách 2, 3 a 4 glukopyranosového kruhu obecně nevyžadují chránění. Merkaptoskupina, která má být přítomna jako skupina R2 nebo R8 však během této katalytické oxidace obecně vyžaduje chránění, a tato merkaptoskupina může být vhodně chráněna jako benzylový derivát (viz níže ve spojení s níže popsaným způsobem B).
Komerčně je dostupná řada vhodných cytokinin-glukosidů, kterých lze použít jako výchozích materiálů v tomto způsobu, například jich lze široký sortiment získat od firmy Apex Organics Ltd., Leicester, Velká Británie, a některé cytokinin-9-glukosidy lze získat od firmy Sigma Chemical Company, poštovní přihrádka 14508, St. Louis. MO 63178, USA. Cytokininglukosidy lze též připravit známými způsoby uvedenými v literatuře. Například syntézu řady vhodných cytokinin-9-glukosidů, jejichž skupina R6má význam zahrnutý ve zde uvedené definici tohoto symbolu, lze provést snadným rozšířením způsobu, který uvedli Cowley a kol. (Aust. J. Chem. 31 (1978) 1095) pro syntézu 9-beta-D-glukopyranosidů zeatinu aN6benzyladeninu.
- 11 CZ 284828 B6
B) Syntézy typu Koenigs-Knorr
Tento postup, který je založen na způsobu, který původně popsali W. Koenigs a E. Knorr (Chem. Ber. 34 (1901) 957), zahrnuje reakci methyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu (zkratka MBTG, vhodný způsob jeho přípravy popsali Bollenback a kol., J. Amer. Chem. Soc. 77 (1955) 3310) s alkoholickou nebo fenolickou hydroxylovou skupinou, merkaptoskupinou (-SH) nebo kruhovým atomem dusíku v aromatickém nebo nenasyceném heterocyklickém zbytku.
Tento postup poskytuje pravděpodobně nej obecněji použitelný způsob syntézy cytokininglukuronidů podle vynálezu (nebo glukuronidů prekurzorů, které mohou být následně snadno převedeny na požadované cytokinin-glukuronidy), přičemž se vychází od příslušných cytokininů (nebo prekurzorů cytokininů, viz níže) a má se za to, že je velmi široce použitelný při přípravě sloučenin zahrnutých pod obecným vzorcem I.
Obecný postup je následující: příslušný cytokinin nebo prekurzor cytokininů (viz níže), rozpuštěný v rozpouštědle jako je Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), chinolin, propylen-karbonát, methanol nebo diethylether, se nechá reagovat s 1,25 až 2 molámími ekvivalenty methyl(2,3,4tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu (MBTG) při teplotě v rozmezí 25 až 100 °C po dobu 3 až 96 hodin, s výhodou v přítomnosti přidané látky vázající halogenidové (bromidové) ionty, jako je oxid stříbrný nebo uhličitan stříbrný (při použití, například. DMF jako rozpouštědla, rozpouštědlo samo často působí adekvátně jako látka vázající halogenidové ionty, a v takovém případě není přidání další látky vázající halogenidové ionty nutné). Touto reakcí se získá methylester intermediámího peracetylovaného glukuronidu, který se obecně izoluje apurifikuje, což lze vhodně provést například (i) odpařením rozpouštědla, následnou extrakcí odparku rozpouštědlem jako je chloroform, odstraněním posledně uvedeného rozpouštědla z extraktu a purifikací výsledného surového intermediámího produktu pomocí rekrystalizace nebo/a běžných technik sloupcové chromatografie, nebo například (ii) oddělením intermediárního produktu z reakční směsi běžnou sloupcovou chromatografíí prováděnou přímo na reakční směsi, následným odstraněním elučního rozpouštědla z vymyté frakce nebo frakcí, které jsou předmětem zájmu, a rekrystalizací surového produktu.
V případech, kdy má mít požadovaný konečný produkt obecného vzorce I glukuronidový zbytek v amidické (glukumoamidické) formě, provádí se v této fázi vhodně konverze peracetylované methylesterové formy glukuronidového zbytku na amidickou formu, což lze obecně provést ošetřením peracetylovaného methylesteru (s výhodou purifikovaného, například shora uvedeným způsobem) roztokem bezvodého amoniaku v bezvodém methanolu při nízké teplotě, například při teplotě mezi 0 °C a-10°C, nebo-což je alternativní možnost - koncentrovaným (vhodně nasyceným) vodným roztokem amoniaku přibližně při teplotě místnosti, po dobu 0,5 až 4 hodin. Glukuronamid může být poté izolován odpařením roztoku amoniaku, například ve vakuu, a rekrystalizací z vhodného rozpouštědla nebo rozpouštědlové směsi, jako je 90 % vodný ethanol. Příklad konverze je zde uveden v příkladu 18, ve kterém je zodpovídajícího methylesteru připraven N6-benzyladenin-3-glukuronamid (BA3GNamid).
Dále, v případě postupů začínajících určitými typy prekurzorů cytokininů, může být, než se přikročí k uvolnění volného glukuronidu, provedena nejprve chemická transformace na methylester, která je nutná pro přeměnu zbytku tvořeného prekurzorem cytokininů na zbytek tvořený příslušným cytokininem. Jako příklad, může být syntéza cytokinin-9-glukuronidu (jehož syntéza postupem katalytické oxidace již byla popsána výše) normálně uspokojivě provedena počínaje od substituovaného nebo nesubstituovaného purinu, který má v poloze 6 atom chloru. Posledně zmíněná sloučenina, obsahující v poloze 6 atom chloru, může být obecně přeměněna na methylester odpovídajícího peracetylovaného 9-glukuronidu pomocí výše popsaného obecného postupu za použití MBTG, a skupina 6-chlor může být poté vhodně přeměněna na požadovaný zbytek vzorce -NH-R6 tak, že se produkt posledně uvedené reakce nechá reagovat s odpovídají- 12CZ 284828 B6 cím aminem (R6-NH2), který může být obecně vhodně vyráběn in šitu z amin-hydrochloridu (R6-NH2.HC1) a nadbytku (s výhodou 2 až 4 násobného molámího nadbytku) vhodné báze, například terciárního alifatického aminu, jako je triethylamin, ve vhodném polárním rozpouštědle, jako je alifatický alkohol obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, při teplotě v rozmezí 65 5 až 120 °C. Tento postup je zde demonstrován ve Způsobu 2 Příkladu IC, ve kterém je popsána syntéza N6-benzyladenin-9-glukuronidu (BA9GN) (jako jeho sodné soli) tímto způsobem.
Acetylové skupiny na glukuronidovém zbytku jsou poté odstraněny zásaditou hydrolýzou za použití báze jako je vodný hydroxid sodný, vodné methanolický nebo ethanolický hydroxid to sodný, nebo methanolický amoniak při teplotě v rozmezí 0 až 25 °C po dobu 0, 5 až 6 hodin. Za použití báze, jako je jeden z výše zmíněných vodných nebo alkoholických roztoků hydroxidu sodného, tento postup poskytuje - po neutralizaci nadbytku báze - sůl odpovídajícího cytokininglukuronidu, zatímco použití reaktantu jako je methanolický amoniak a následné odstranění nadbytku amoniaku odpařením poskytuje amidickou formu glukuronidu. Posledně zmíněná 15 sloučenina je vhodně purifikována běžnými způsoby, jako je chromatografíe, zejména chromatografie na reverzní fázi, nebo/a rekrystalizace z vhodného rozpouštědla, jako je vodně organické rozpouštědlo, například 80až 90 % vodný ethanol.
Je jasné, že v případě, že výchozí cytokinin nebo prekurzor cytokininu obsahuje jednu nebo několik funkčních skupin, které jsou schopny za daných reakčních podmínek reagovat s MBTG, a které mají být přítomny nezměněné ve výsledném flukuronidu obecného vzorce I, musí být takové funkční skupiny chráněny předchozím zavedením vhodných chránících skupin. Mezi příklady takových reaktivních funkčních skupin, které mohou být přítomny ve výchozích cytokininech poskytujících sloučeniny v rozsahu definice obecného vzorce I, patří (s ohledem na jejich umístění jak je specifikováno v souvislosti s obecným vzorcem I (viz výše)): hydroxylová skupina nebo merkaptoskupina přítomná jako skupina R2, hydroxylová skupina nebo merkaptoskupina přítomná jako skupina R8, hydroxylová skupina nebo aminoskupina přítomná jako substituent na fenylovém kruhu skupiny označené symbolem R6, pokud představuje substituovanou benzylovou skupinu, hydroxylové skupiny nebo glukosyloxyskupiny přítomné 30 jako substituent nebo substituenty na skupině označené symbolem R6, pokud představuje substituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku nebo substituovanou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, ribosylová skupina, 5'-fosforibosylová nebo glukosylová skupina, která může být přítomna jako skupina R9 nebo R7, a aminoskupiny ve skupině vzorce -CH2CH(NH2)COOH přítomné jako skupina R9.
Dále jsou uvedeny chránící skupiny vhodné pro chránění výše uvedených příkladů reaktivních funkčních skupin, které mohou být přítomny ve výchozích cytokininech. Hydroxylová skupina může být obecně vhodně chráněna zavedením acetylové skupiny (viz výše ve spojení s osidativním způsobem přípravy sloučenin obecného vzorce I), čímž se vytvoří odpovídající 40 acetoxyskupina (-OOCCH3). Merkaptoskupina může být obecně velmi vhodně chráněna jako benzylthioetherový derivát (-SCH2C6H5) zavedením benzylové skupiny (například reakcí s benzylchloridem podobným způsobem, jako je podrobněji popsán níže ve spojení s prekurzoiy cytokininů, které obsahují, alespoň formálně, oxoskupinu (=0) nebo thioxoskupinu (=S) v poloze 2, a oxoskupinu v poloze 6 (viz níže)). Aminoskupina může být obecně vhodně 45 chráněna následovnou přeměnou na ftalimidoskupinu: cytokinin nebo prekurzor cytokininu se zahřeje s přebytkem ftalanhydridu v relativně inertním rozpouštědle, jako je chloroform nebo 1,2-dimethoxyethan, při teplotě v rozmezí 70 až 100 °C po dobu několika hodin, často vhodně okolo 4 hodin. Aminoskupina může být po provedení reakce typu Koenigs-Knorr následně regenerována ošetřením vodně alkoholickým (jako je vodně ethanolickým) roztokem hydrazinu.
Skupinou prekurzorů cytokininů, které jsou zejména vhodné pro použití při syntéze cytokininglukuronidů podle vynálezu majících glukuronidový zbytek (odpovídající symbolu R10 v obecném vzorci I) navázaný jako skupinu -O-R10 nebo -S-R10 v poloze 2 purinového kruhu, jsou prekurzory cytokininů, které obsahují, alespoň formálně, oxoskupinu (=0) nebo
- 13CZ 284828 B6 thioxoskupinu (=S) v poloze 2 a oxoskupinu v poloze 6. Zde je třeba uvést, že sloučeniny daných typů, mající 2-oxoskupiny a 2-thioxoskupiny, budou, alespoň v roztoku, obecně přítomny vtautomemí rovnováze s odpovídajícími sloučeninami obsahujícími 2-hydroxyskupiny a 2-merkaptoskupiny (přičemž 6-oxoskupina je pak přítomna jako 6-hydroxylová skupina), a posledně zmíněné tautomemí formy budou obecně tvořit podstatnou součást.
Posledně uvedená hydroxylová skupina nebo merkaptoskupina v poloze 2 se v závěrečné fázi celého procesu syntézy přemění pomocí postupu typu Koenigs-Knorr na odpovídající skupinu vzorce -O-R10 respektive -S-R10. Před provedením reakce typu Koenigs-Knorr je vhodné přeměnit 6-hydroxylovou skupinu přes intermediámí 6-halogenderivát (s výhodnou 6-chlorderivát) na zbytek vzorce -NH-R6, uvedený v obecném vzorci I, což obecně vyžaduje, aby byla během tohoto procesu hydroxylová skupina nebo merkaptoskupina v poloze 2 chráněna vhodnou chránící skupinou. Pro obě tyto skupiny je vhodnou chránící skupinou benzylová skupina, která může být normálně zavedena snadno reakcí zahrnující postupné přidání mírného nadbytku benzylchloridu k míchanému roztoku suspenze daného prekurzoru cytokininu ve vodné bázi (pH je typicky okolo 12 až 13), jako je vodný hydroxid sodný nebo draselný, přibližně při teplotě místnosti. Po míchání, se kterým se pokračuje po dobu typicky 1 až 2 hodin, se reakční směs neutralizuje přidáním například ledové kyseliny octové, a nerozpustný produkt, obsahující chránící benzylovou skupinu, se izoluje filtrací.
6-hydroxylová skupina výsledného 2-benzyloxy nebo 2-benzylthio-6-purinolderivátu se poté přemění na 6-chlorskupinu, vhodně za použití nadbytku chloračního Činidla jako je oxychlorid fosforečný v přítomnosti organické báze, jako je Ν,Ν-diethylanilin. Posledně uvedená reakce se normálně vhodně provádí za varu pod zpětným chladičem po dobu od asi 10 minut do přibližně 3 hodin.
6-chlorskupina může být poté vhodně přeměněna na požadovaný zbytek vzorce -NH-R6 tak, že se nechá produkt posledně uvedené reakce reagovat s odpovídajícím aminem vzorce R6-NH2, který může být obecně vhodně vytvářen in šitu z amin-hydrochloridu (R6-NH2.HC1) a nadbytku (vhodně 2 až 4 násobného molámího nadbytku) vhodné báze, například terciárního alifatického aminu, jako je triethylamin, ve vhodném polárním rozpouštědle, jako je alifatický alkohol obsahující 1 až 4 atomy uhlíku (například 1-butanol), při teplotě v rozmezí 65 až 120 °C.
Po izolaci produktu se chránící skupina odstraní, aby se tak regenerovala volná 2-hydroxylová skupina nebo 2-merkaptoskupina. V případě, že je chránící skupinou benzylová skupina, lze to vhodně provést například ošetřením produktu nadbytkem sodíku v kapalném amoniaku.
V případě produktů, které mají v této fázi 2-merkaptoskupinu, se má za to že je obecně výhodné, předtím než se přistoupí k zavedení glukuronidového zbytku pomocí výše popsaného postupu typu Koenigs-Knorr, přeměnit 2-merkaptoskupinu do formy soli (—S'), například na draselnou sůl. Příklad postupu vhodného pro tento účel je popsán v kroku 4 zde uvedeného Příkladu 1E, a má se za to, že popsané podmínky jsou značně široce aplikovatelné. V některých případech však může být možné provést reakci typu Koenigs-Knorr sMBTG (viz níže) přímo bez předchozí přeměny 2-merkaptoskupiny do formy soli.
Na závěr je zaveden glukuronidový zbytek reakcí s MBTG, jak je popsáno výše v souvislosti s postupem typu Koenigs-Knorr.
Příklad dokumentující postup výše popsané syntézy je uveden v Příkladu 1E pro syntézu sodné soli N6-(2'-isopentenyl)adenin-2-thioglukuronidu (IP2SGN), kde je výchozí látkou 2thioxanthin, a má se za to, že tamtéž uvedené další informace týkající se výběru rozpouštědel pro rekrystalizaci a extrakci, výběru koncentrací a množství reaktantů, atd., jsou obecněji použitelné při provádění výše popsané posloupnosti reakcí, ve kterých je výchozí látkou prekurzor
- 14CZ 284828 B6 cytokininu, který má 2-thioxoskupinu (tj. 2-merkaptoskupinu) a 6-oxoskupinu (tj. 6hydroxylovou skupinu).
Podobně tvoří skupinu prekurzorů cytokininů, které jsou zejména vhodné pro použití při syntéze cytokinin-glukuronidů podle vynálezu majících glukuronidový zbytek (odpovídající symbolu R10 v obecném vzorci I) navázaný jako skupinu vzorce -O-R10 nebo -S-R10 v poloze 8 purinového kruhu, prekurzory cytokininů, které obsahují, alespoň formálně (z podobných důvodů jako jsou popsány výše ve spojení s prekurzory cytokininů obsahujícími formální 2-oxoskupinu nebo 2-thioxoskupinu a formální 6-oxoskupinu), oxoskupinu (=O) nebo thioxoskupinu (=S) v poloze 8, a které dále obsahují hydroxylovou skupinu v poloze 6. Tyto prekurzory cytokininů mohou být obecně převedeny na požadovaný konečný produkt obecného vzorce I za použití posloupnosti reakcí (zavedení chránících skupin, zavedení 6-chlorskupiny, zavedení zbytku vzorce -N-R6, odštěpení chránících skupin, a konečně reakce s MBTG), které jsou analogické s reakcemi popsanými výše pro cytokonin-glukuronidy mající glukuronidový zbytek navázaný jako skupinu vzorce -O-R10 nebo -S-R10 v poloze 2 purinového kruhu. Tento postup je dokumentován zde uvedeným Příkladem 1F popisujícím syntézu N6-(2'-isopentenyl)adenin-8-thioglukuronidu (jako jeho sodné soli).
Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých je glukuronidový zbytek ve formě karboxylové kyseliny, mohou být obecně připraveny zodpovídající soli, například sodné soli (připravené způsobem, který již byl uveden výše) okyselením míchaného roztoku nebo roztoku/suspenze soli ve vhodném rozpouštědle (například vodném alkoholu, jako vodném ethanolu), s výhodou při teplotě nižší než 25 °C, minerální kyselinou, jako je kyselina chlorovodíková, na pH přibližně 2,5. Po míchání po dobu několika minut se rozpouštědlo odstraní ve vakuu. Surový odparek může být s výhodou podroben chromatografii za účelem odstranění anorganických solí (viz například zde uvedený Přikladli uvádějící podrobnosti typického postupu a vhodný chromatografický substrát pro tento účel), a poté může být produkt rekrystalován z vhodného rozpouštědla, typicky polárního rozpouštědla, jako je methanol nebo ethanol.
Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých je glukuronidový zbytek ve formě methylesteru nebo ethylesteru, mohou být obecně velmi vhodně připraveny, s vysokým výtěžkem, reakcí odpovídajícího cytokinin-glukuronidu ve formě karboxylové kyseliny (připraveného například jak je popsáno výše) s diazomethanem respektive diazoethanem, za použití reakčních podmínek normálních pro tento typ reakce, které jsou v oboru dobře známé.
Komerčně je dostupná řada cytokininů a prekurzorů cytokininů vhodných pro použití jako výchozích materiálů ve spojení s výše popsaným způsobem B), zatímco další lze syntetizovat známými způsoby uvedenými v literatuře. Například syntéza mnoha vhodných ^-substituovaných adeninů majících skupinu označenou symbolem R6 v rámci zde uvedené definice tohoto symbolu může být provedena v literatuře uvedeným způsobem, který popsali Iwamura a kol. (Phytochemistry 19 (1980) 1309) a řada N6-(2'-isopentenyl)adeninů substituovaných v poloze 2, 8 a 2, 8 majících skupiny označené symboly R2 nebo/a R8 v rámci zde uvedených definic těchto symbolů může být připravena jak popsali Dammann a kol. (Phytochemistry 13 (1974)329).
Výhodnými sloučeninami obecného vzorce I jsou následující sloučeniny:
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R3 znamená beta-Dglukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, každý ze symbolů R9 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená benzylovou skupinu, každý ze symbolů R7 aY představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu aR8 znamená atom vodíku;
- 15CZ 284828 B6 sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R3 znamená amidový derivát beta-D-glukopyranuronosylové skupiny na karboxylové skupině, každý ze symbolů R9 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená benzylovou skupinu, každý ze symbolů R7 aY představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu aRs 5 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R9 znamená beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, R6 znamená benzylovou skupinu, 10 každý ze symbolů R7 aY představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu aR8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R3 znamená beta-Dglukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, každý ze symbolů R9 a X 15 představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená 2-isopentenylovou skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje -S-beta-D-glukopyranuronosylovou 20 skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině. R9 znamená atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená 2-isopentenylovou skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R9 znamená atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená 2-isopentenylovou skupinu, každý ze symbolů R7 aY představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená -S-beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině; a sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R9 znamená atom vodíku, R6 představuje skupinu vzorce
nebo její sůl, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku.
Syntéza sloučenin obecného vzorce Π podle vynálezu
Sloučeniny obecného vzorce II podle vynálezu lze snadno připravit za použití lehce připravitelného methylesteru kyseliny o-kumarové (tj. kyseliny 3-(2-hydroxyfenyl)-2-propenové) jako
- 16CZ 284828 B6 výchozího materiálu. Posledně uvedený ester může být připraven zahříváním volné kyseliny (získané například od firmy Aldrich Chemical Company, Gillingham, Dorset, Velká Británie, pod katalogovým číslem H2,280-9) v methanolu v přítomnosti kyseliny sírové k varu pod zpětným chladičem. Je nutno uvést, že se získá směs cis- a trans- forem (vzhledem k ethylenické dvojné vazbě). Má se za to, že zpočátku je obecně převládající forma trans-, bez ohledu na způsob přípravy. To však nevadí, jelikož bylo zjištěno, že jak cis (kumarinyl-) tak trans (kumaryl-) glukuronidy jsou po hydrolýze GUS nakonec přeměněny na kumarin, díky skutečnosti, že kumarová kyselina se pomalu v průběhu několika dnů přemění (neenzymaticky, převážně díky katalýze světlem) na kumarin.
Vhodné postupy pro syntézu sloučenin obecného vzorce Π, ve kterém (a) R1 a R10 jsou ve formě karboxylové skupiny a (b) R1 a R10 jsou v amidové formě, jsou podrobně popsány ve zde uvedených Příkladech 1H respektive II. Sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém je jak R1 tak R10 ve formě sodné soli, mohou být vhodně získány zásaditou hydrolýzou methylesteru peracetylovaného glukuronidu (připraveného (z methyl-o-kumarátu) a izolovaného jak je popsáno v první části postupu syntézy v Příkladu II) za použití methanolického hydroxidu sodného, způsobem popsaným na počátku druhé části postupu syntézy v Příkladu II; místo upravení pH hydrolyzátu kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu přibližně 2,5, jak je popsáno v Příkladu II, se směs kyselinou chlorovodíkovou pouze neutralizuje (na pH přibližně 7). Sodná sůl se s výhodou izoluje ze směsi pomocí chromatografie, například na neionogenní pryskyřici Amberlite XAD-2, přičemž se sloupec promyje vodou kvůli odstranění neorganických solí a poté se provede eluce, typicky methanolem. Surová sodná sůl glukuronidu získaná odstraněním methanolu se může poté vhodně rekrystalovat, například z absolutního methanolu. Úzce analogickým postupem lze samozřejmě připravit též draselnou sůl za použití, například, methanolického hydroxidu draselného v procesu hydrolýzy.
Sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém jsou symboly Rl a R10 buď oba ve formě methylesteru nebo oba ve formě ethylesteru, mohou být připraveny reakcí mezi diazomethanem respektive diazoethanem, a sloučeninou obecného vzorce II, ve kterém jsou oba ze symbolů R1 a R10 ve formě karboxylové kyseliny. Reakční podmínky jsou s výhodou takové, jako jsou popsány výše pro analogickou přípravu methylesterové nebo ethylesterové formy cytokinin-glukuronidů.
Výhodnými sloučeninami obecného vzorce II jsou následující sloučeniny:
sloučenina obecného vzorce II, ve kterém R1 představuje cis- nebo/a trans-2-amidoethenylovou skupinu (cis nebo/a transCH=CHCONH2), a R10 znamená amidový derivát beta-D-glukopyranuronosylové skupiny na její karboxylové funkci (2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranuronamid); a sloučenina obecného vzorce II, ve kterém R1 představuje cis-2-karboxyethenylovou skupinu (cis-CH=CHCOOH), aR10 znamená beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu (2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranuronová kyselina).
Níže uvedené příklady ilustrují obecné principy vynálezu v rostlinách, zejména použití betaglukuronidasy jako selekčního genu a použití nových glukuronidových substrátů, které mohou být tímto genem hydrolyzovány. Na základě této práce se předpokládá, že geny jako je gen betaglukuronidasy mohou být použity pro řadu souvisejících cílů. Tak může být gen betaglukuronidasy použit v postupu pro dosažení lokalizovaného nebo tkáňově specifického účinku regulujícího růst rostliny v části rostliny nebo rostlinné tkáni, která exprimuje zavedený gen beta-glukuronidasy ve vyšším množství než ostatní části nebo tkáně ve stejné rostlině, kterýžto postup zahrnuje poskytnutí sloučeniny, která může být hydrolyzována zavedeným genem betaglukuronidasy, rostlině, takže je tato sloučenina hydrolyzována v té části nebo tkáni rostliny, která obsahuje zavedený gen beta-glukuronidasy, čímž se uvolní sloučenina regulující růst a vede to k regulaci růstu pouze v této části nebo tkáni rostliny, neboje regulace růstu v této části
- 17CZ 284828 B6 nebo tkáni větší než účinek dosažený v jiných částech nebo tkáních rostliny. Předpokládá se též, že může být výhodné použít regulátory růstu rostlin, jako jsou cytokininy, ve formě glukuronidů nebo derivátů glukuronidů, spíše než jako volné cytokininy, například proto, aby se využila výhoda, že budou pravděpodobně v rostlinách odlišně transportovány a distribuovány ve srovnání například s odpovídajícími volnými nebo ribosylovanými cytokininy.
Podobně naznačují níže uvedené Příklady některé další způsoby využití beta-glukuronidasy. Jedním z nich je způsob pro in vitro vyhledávání a identifikaci cytokinin-glukuronidů (nebo glukuronidových sloučenin jiných regulátorů růstu rostlin), které mohou být hydro lyžovány in vivo pomocí zavedeného genu beta-glukuronidasy. Beta-glukuronidasa může být též využita při vyhledávání sloučenin, které jsou vhodné pro použití jako selekční činidla ve zde popsaném způsobu pozitivní selekce (viz Příklad 2). V příkladech 3 a 12 jsou popsány systémy, které mohou být použity pro vyhledávání sloučenin, které selektivně inhibují přirozený enzym betaglukuronidasu v rostlinných buňkách aniž by podstatně ovlivňovaly aktivitu enzymu kódovaného zavedeným genem beta-glukuronidasy.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza glukuronidů
Níže je popsána syntéza řady nových glukuronidů.
Příklad 1A
Sodná sůl 3-beta-D-glukopyranuronosyl-6-benzylaminopurinu
Synonyma: sodná sůl N6-benzyladenin-N3-beta-D-glukopyran uronové kyseliny sodná sůl N6-benzyladenin-N3-glukuronidu
Zkratka: sodná sůl BA3GN
- 18CZ 284828 B6
Kondenzace N6-benzyladeninu (BA) a methyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranuronosylbromid)uronátu (MBTG)
12,6 mmol N6-benzyladeninu a 15,1 mmol methyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu (Bollenback a kol., 1955, J. Amer. Chem. Soc., svazek 77, str. 3310 - 3315) se převede do suspenze v 50 ml bezvodého Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) a zahřívá se na 100 °C po dobu přibližně 10 hodin. Většina Ν,Ν-dimethylformamidu se odstraní ve vakuu, surový produkt se rozpustí v 300 ml chloroformu a roztřepe se s 3 x 300 ml vody. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým se chloroformový extrakt odpaří ve vakuu a tmavý sirupovitý zbytek se překrystaluje z ethanolu. Surový produkt (směs N6-benzyladeninu. BA9GN a BA3GN ve formě peracetylovaných methylesterů) se vyčistí na sloupci 100 g silikagelu připraveného v chloroformu promýváním za použití gradientu 0 až 4 % ethanolu v chloroformu. Surový methylester peracetylovaného BA3GN se překrystaluje z ethanolu. Výtěžek: 280 mg bezbarvé amorfní pevné látky.
Methylester peracetylovaného BA3GN se hydrolyzuje za použití 5 % hydroxidu sodného v 50 % vodném ethanolu při teplotě místnosti. Reakční směs se pět minut poté, co se pevná látka rozpustí, opatrně neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou za chlazení na ledu. Po vysušení ve vakuu se surová sodná sůl BA3GN vyčistí chromatografií na reverzní fázi (na sloupci 100 g Cl8silikagelu) pomocí eluce 1 1 vody a následně 20 % vodným methanolem a poté se překrystaluje z ethanolu. Získá se 150 mg čisté sodné soli BA3GN ve formě bezbarvé, mikrokrystlické pevné látky, která se vysuší na konstantní hmotnost nad chloridem vápenatým ve vakuu.
Analýza
UV: ethanol ethanol/kyselina octová ethanol/amoniak
A max
A max
A max
297 nm
291 nm
297 nm
Tyto hodnoty jsou identické s hodnotami uváděnými v literatuře pro N6-benzyladenin-3-betaD-glukopyranosid a N3,N6-disubstituovaný adenin (N. J. Leonard. K. L. Carraway a J. P. Helgeson. J. Heterocyclic Chem. 1965, 2, 291 -297).
Kapalinová chromatografie s vysokou rozlišovací schopností (HPLC):
HPLC se provádí za použití sloupce 10x0,46 cm C18-silikagelu, promývaného isokraticky methanolem (60%) obsahujícím kyselinu octovou (10%), s průtokem 1 ml/min. Provádí se detekce UV zářením při 290 nm.
Sodná sůl BA3GN má čistotu více než 95 % a obsah volného N6-benzyladeninu se odhaduje na méně než 0,05 %. Hydrolýza pomocí beta-glukuronidasy (GUS)
500 pg sodné soli BA3GN v 500 μΐ 50 mM natriumfosfátového pufru o pH 7,0 se inkubuje s 2500 jednotkami Sigma Fishman beta-glukuronidasy (GUS, Sigma typ G7896) po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C. HPLC (za výše uvedených podmínek) ukáže v podstatě úplné odstranění píku BA3GN a vytvoření píku, který se při chromatografií ve směsi 1:1 chová shodně jako autentický N6-benzyladenin, což potvrzuje identitu produktu jako konjugátu N6benzyladeninu a beta-D-glukuronové kyseliny.
Následující analýza se získá za použití jiné části sodné soli BA3GN připravené jak je popsáno výše:
-19CZ 284828 B6
UV:
ethanol A max 297 nm
HPLC:
Sloupec 15 x 0,46 cm C18-silikagelu, promývaný za použití gradientově eluce směsí methanol (20 až 60 %) - kyselina octová (10 %) po dobu 30 minut při průtoku 1 ml/min. Čistota stanovená pomocí HPLC činí 99,5 %. Obsah volného N6-benzyladeninu je nižší než 0,05 %.
TLC:
Desky se silikagelem vyvíjené soustavou 1-butanol/kyselina octová/voda (12/3/5). Čistota stanovená pomocí TLC činí 99,5 %. Obsah volného N6-benzyladeninu je nižší než 0,05 %.
Hydrolýza pomocí beta-glukuronidasy (GUS)
500 pg sodné soli BA3GN v 500 μΐ 50 mM natriumfosfátového pufru o pH 7,0 se inkubuje s 2500 jednotkami Sigma Fishman beta-glukuronidasy (GUS, Sigma typ G7896) po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C. HPLC a TLC ukáže v podstatě úplné (více než 99%) odstranění BA3GN za vzniku sloučeniny která se při chromatografii ve směsi 1:1 chová shodně jako autentický N6-benzyladenin.
Příklad IB
3-beta-D-glukopyranuronamido-6-benzylaminopurin
Synonyma: N6-benzyladenin-N3-beta-D-glukopyranuronamid N6-benzyladenin-3-glukuronamid
Zkratka: BA3GNamid nh-ch2-^ ---N • w HOx----{ OH
Syntéza
1,5 g překrystalovaného methylesteru peracetylovaného BA3GN připraveného v Příkladu 1A se převede do suspenze v 200 ml bezvodého methanolu a ochladí se na 0 °C. Přidá se dalších
400 ml bezvodého methanolu nasyceného bezvodým amoniakem při -10 °C a směs se míchá na ledu. Přidává se další bezvodý methanol o teplotě ledu, dokud se pevná látka zcela nerozpustí a reakční směs se míchá na ledu po dobu dalších 3 hodin. Nadbytek amoniaku a methanolu se
-20CZ 284828 B6 odstraní ve vakuu a produkt se důkladně trituruje horkým ethanolem. Získá se 1,3 g bezbarvé pevné látky.
BA3GNamid je, jako ostatní adenin-3-glykosidy, pouze omezeně rozpustný ve vodě nebo alkoholu, ale rozpouští se v množství 2,4 mg/ml v 50 % vodném methanolu obsahujícím kyselinu octovou (25 %).
Analýza
TLC (silikagel - chloroform/methanol/ledová kyselina octová, 50/50/5):
Při nanesení 50 pg látky se vUV světle zjistí jediná skvrna (Rf 0,36) a žádné detekovatelné nečistoty. Čistota činí více než 98 %. Methylester peracetylovaného BA3GN (Rf 0,89) i BA3GN (Rf 0,02) jsou přítomny v nezdetekovatelném množství (méně než 1 %)
TLC (silikagel - chloroform/methanol, 9/1):
Používá se pro zjištění obsahu N6-benzyladeninu. Při nanesení 192 pg BA3GNamidu se nezjistí detekovatelné množství 6-benzyladeninu. Obsah N6-benzyladeninu tedy činí méně než 0,2 %.
Příklad 1C
Sodná sůl 9-beta-D-glukopyranuronosyl-6-benzylaminopurinu
Synonyma: sodná sůl N6-benzyladenin-N9-beta-D-glukopyran uranové kyseliny sodná sůl N6-benzyladenin-9-glukuronidu
Zkratka: sodná sůl BA9GN
Syntéza
Způsob 1
Katalytická oxidace N6-benzyladenin-9-beta-D-glukopyranosidu (BA9G)
-21 CZ 284828 B6 mg BA9G se převede do suspenze ve 25 ml 50 mM hydrogenuhličitanu sodného s 200 mg platinové černě. Směs se zahřívá na 80 °C na vodní lázni, během čehož se nechá silně probublávat kyslík. Po 4 hodinách se přidá dalších 100 ml platiny jako katalyzátoru. Po 20 hodinách se přemění přibližně 95 nebo více % BA9G na odpovídající 9-beta-Dglukopyranuronovou kyselinu a určité množství N6-benzyladeninu. Směs se neutralizuje a získaná sodná sůl BA9GN se vyčistí pomocí chromatografie na reverzní fázi (na sloupci 20 g C18-silikagelu) elucí 200 ml vody a následně 20 % methanolem.
Čistá sodná sůl BA9GN, bez glukosidu a N6-benzyladeninu se vysuší nad chloridem vápenatým ve vakuu, čímž se získá bezbarvá pevná látka.
Způsob 2
Kondenzace 6-chlorpurinu a methyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu (MBTG)
1,13 g 6-chlorpurinu (vysušeného nad oxidem fosforečným), 3,87 g methyl(2,3,4-tri-O-acetylalfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu al,5g čerstvě vysušeného uhličitanu draselného se míchá v 30 ml bezvodého propylen-karbonátu při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Tmavá směs se zfiltruje a vyčistí sloupcovou chromatografií na sloupci 100 g silikagelu tak, že se promyje za použití gradientu 0 až 80 % ethylacetátu v chloroformu. Hlavní frakce (jiná než nezreagovaný 6-chlorpurin) se vysuší a překrystaluje z vařícího ethanolu, čímž se získá 450 mg methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-0-acetyl-beta-D-glukopyranuronátu) jako světle žluté pevné látky, která se vysuší nad oxidem fosforečným ve vakuu. Čistota stanovená pomocí HPLC činí více než 95 %.
312 mg methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-O-acetyl-beta-D-glukopyranuronátu) a 171 μΐ benzylaminu se společně zahřívá ve 13,5 ml 1-butanolu na 100 °C po dobu 1 hodiny. Pevná látka se snadno rozpouští a vzniká čirý žlutý roztok. Většina butanolu se odstraní ve vakuu a získá se bělavá pevná látka, která se třepe po dobu 1 až 2 hodin při teplotě místnosti s 5 % hydroxidem sodným v 50 % vodném ethanolu (25ml). Po neutralizaci se produkt vysuší ve vakuu, aby se odstranily stopy butanolu, a sodná sůl BA9GN se vyčistí chromatografií na reverzní fázi jako ve Způsobu 1.
Surový produkt se vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým a oxidem fosforečným, a získá se 210 mg bezbarvé pevné látky, která se při chromatografii chová shodně jako BA9GN připravený pomocí katalytické oxidace.
Analýza sodné soli BA9GN připravené pomocí kondenzační reakce, Způsob 2
UV:
95 % ethanol A max 270 nm (17400)
95 % ethanol / 0,lM HC1 A max 270 nm (16200)
95 % ethanol / 0,lM NaOH A max 270 nm (17400)
Tyto výsledky souhlasí se strukturou N6,N9-disubstituovaného adeninu. Extinkční koeficienty jsou prakticky stejné jako u čistého BA9GN, což svědčí o nepřítomnosti znečisťujících látek neabsorbujících UV záření. Čistota stanovená analýzou pomocí UV světla činí více než 95 %.
HPLC:
Sloupec C18-silikagelu 10x0,46 cm, detekce UV zářením při 270 nm. Isokratická (směs methanol (50 %) - kyselina octová (0,2M), průtok 2 ml/min) a gradientová HPLC (směs methanol (0 - 60 %)- kyselina octová (0,2M), průtok 2 ml/min) ukazují ostrý, symetrický pík
-22CZ 284828 B6 pro BA9GN, který se vymyje těsně před odpovídajícím glukosidem. BA9GN připravený pomocí kondenzační reakce se při chromatografii ve směsi 1:1 při HPLC (gradientově a isokratické) chová shodně jako BA9GN připravený pomocí katalytické oxidace, což potvrzuje, že BA9GN připravený pomocí kondenzační reakce je beta-D-glukopyranosylový isomer. BA9GN obsahuje nezdetekovatelné množství (méně než 2 %) alfa-anomeru nebo jiných nečistot, včetně N6-benzyladeninu. Čistota BA9GN stanovená pomocí HPLC činí více než 98 %.
TLC (silikagel - chloroform / methanol, 9/1):
TLC se použije pro stanovení kontaminace BA9GN N6-benzyladeninem. BA9GN zůstane v tomto rozpouštědlovém systému na startu. Minimální detekovatelné množství N6-benzyladeninu činí 200 ng. Při naneseni 200 pg BA9GN se nezjistí detekovatelné množství N6benzyladeninu ani jiných znečisťujících látek. Čistota stanovená pomocí TLC činí více než 98 %. Obsah N6-benzyladeninu je nižší než 0,1 %.
Kyselá hydrolýza
Minerální kyseliny přeměňují cytokinin-glukosidy na odpovídající volné bazické cytokininy. Ošetření sodné soli BA9GN (1 mg/ml) 1M kyselinou chlorovodíkovou při teplotě 100 °C přes noc způsobí vytvoření jediné skvrny zjištěné pomocí TLC, která se při chromatografii chová shodně jako autentický N6-benzyladenin. Tento test potvrzuje, že BA9GN je konjugátem N6-benzyladeninu nestabilním v kyselém prostředí.
Enzymatická hydrolýza
500 pg sodné soli BA9GN v 500 pl 50 mM natriumfosfátového pufru o pH 7,0 se inkubuje s 2500 jednotkami Fishman beta-glukuronidasy Sigma (GUS, typ G7896) po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C. Nedochází k tvorbě N6-benzyladeninu v množství detekovatelném pomocí HPLC a TLC a ani další inkubace při teplotě místnosti po dobu 3 dnů nevykazuje žádnou hydrolýzu. BA9GN tedy není citlivý k hydrolýze pomocí beta-glukuronidasy.
Příklad ID
Sodná sůl 3-beta-D-glukopyranuronosyl-6-(3-methylbut-2-enylamino)purinu
Synonyma: sodná sůl N6-(2'-isopentenyl)adenin-N3-beta-D-glukopyranuronové kyseliny sodná sůl N6-(2'-isopentenyl)adenin-3-glukuronidu
Zkratka: sodná sůl IP3GN
-23CZ 284828 B6
Syntéza
9,48 g N6-(2-isopentenyl)adeninu a 22,1 g methyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu se zahřívá ve 170 ml bezvodého Ν,Ν-dimethylformamidu na 100 °C po dobu 12 hodin. Většina Ν,Ν-dimethylformamidu se odstraní ve vakuu na vařiči vodní lázni a ochlazený syrupovitý zbytek se vyjme 500 ml chloroformu. Chloroformový roztok se extrahuje vodou (3 x 500 ml) a organický extrakt se vysuší nad bezvodým síranem sodným. Většina chloroformu se odstraní ve vakuu a sirupovitý zbytek se chromatograficky vyčistí na silikagelu za použití gradientu 0 až 3,75 % methanolu v chloroformu. Surový methylester peracetylovaného IP3GN se překrystaluje z methanolu za odbarvení aktivním uhlím, a získá se tak 3,2 g čistého bezbarvého methylesteru peracetylovaného IP3GN, který se vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým. Část methylesteru peracetylovaného IP3GN o hmotnosti 1,2 g se hydrolyzuje rozpuštěním v přibližně 11 75 % vodného methanolu obsahujícího hydroxid sodný (5 %) a mícháním směsi po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Směs se ochladí v ledu, opatrně neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou ave vakuu se sníží její objem, takže vznikne syrupovitý produkt. Tento surový produkt se vyčistí postupnou chromatografií na pryskyřici XAD-2 a Cl8silikagelu, čímž se získá sodná sůl IP3GN jako bezbarvá, mikrokrystalická pevná látka, která se vysuší nad chloridem vápenatým (810 mg).
Sodná sůl IP3GN je rozpustná ve vodě v množství 2 mg/ml.
Analýza
TLC (silikagel - 1-butanol/ledová kyselina octová/voda, 12/3/5):
Při nanesení 100 pg sodné soli IP3GN se zjistí jediná, ostrá skvrna (Rf = 0,32) a nezjistí se detekovatelné množství N6-(2-isopentenyl)adeninu (IP) (Rf = 0,66) ani jiných znečisťujících látek. Stanovená čistota činí více než 99,5 %.
Hydrolýza pomocí beta-glukuronidasy (GUS)
500 pg sodné soli IP3GN v 500 pl 50 mM natriumfosfátového pufru o pH 7,0 se inkubuje s 2500 jednotkami Sigma Fishman beta-glukuronidasy (GUS, Sigma typ G7896) po dobu 12 hodin při teplotě 37 °C. Při TLC se projeví zmizení skvrny odpovídající IP3GN zjištěné v UV světle a vznik nové skvrny zjištěné v UV světle, která se při chromatografíi chová shodně jako autentický N6-(2-isopentenyl)adenin.
-24CZ 284828 B6
Příklad 1E
Sodná sůl 6-(3-methylbut-2-enylamino)purin-2-yl-l-thio-beta-D-glukopyranuronové kyseliny
Synonyma: sodná sůl N6-(2-isopentenyl)adenin-2-thioglykopyranuronové kyseliny sodná sůl N6-(2'-isopentenyl)adenin-2-thioglukuronidu
Zkratka: sodná sůl IP2SGN
Syntéza:
1. 2-benzylthio-6-purinol
1,4 ml benzyl-chloridu se přidá po kapkách za intenzivního míchání k roztoku 2 g 2thioxanthinu ve 12 ml 1M hydroxidu sodného, naředěnému vodou na objem 140 ml. Po přidání 20 veškerého benzyl-chloridu se vytvoří krémově zbarvená sraženina. Reakční směs se míchá další hodinu při teplotě místnosti a poté se zfiltruje. Pevná látka se promyje pečlivě vodou a vysuší se přes noc ve vakuu nad chloridem vápenatým a na konstantní hmotnost nad oxidem fosforečným. Surový produkt (2 g) se použije v následujícím kroku přímo bez překrystalování.
2. 2-benzylthio-6-chlorpurin
2g 2-benzylthio-6-purinolu se přelijí směsí 20 ml oxychloridu fosforečného a 2 ml diethylanilinu. Směs se za míchání zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny, ochladí se a nalije na 100 g ledu. Vytvoří se žlutá sraženina, která se zfiltruje, pečlivě promyje 30 vodou a vysuší ve vakuu. Surový produkt se překrystaluje zmethanolu, a získá se 1,2 g světle krémově zbarvené pevné látky, která se vysuší na konstantní hmotnost nad oxidem fosforečným.
3. 2-benzylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin
Směs 1,2 g 2-benzylthio-6-chlorpurinu a 1,04 g isopentenylamin-hydrochloridu ve 25 ml
1-butanolu obsahujících 2,2 ml triethylaminu se zahřívá v uzavřených zkumavkách na teplotu
110 °C po dobu 2 hodin. Butanol se odstraní ve vakuu a směs se třepe se 100 ml ledové vody.
Produkt se zfiltruje, překrystaluje z ethanolu za odbarvení aktivním uhlím a vysuší ve vakuu oxidem fosforečným. Výtěžek činí 0,64 g 2-benzylthio-N6-(2-isopentenyl)adeninu jako bezbarvé pevné látky. Surový produkt se použije přímo v následujícím kroku.
-25CZ 284828 B6
4. 2-thio-N6-(2-isopentenyl)adenin
0,64 g 2-benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adeninu se rozpustí v 62,5 ml kapalného amoniaku, čímž se získá čirý žlutý roztok. Přidává se přibližně 200 g sodíku po malých částech, až modré zbarvení vydrží po dobu 10 minut. Opatrně se přidá malé množství pevného chloridu amonného, aby se odstranil nadbytek sodíku a amoniak se nechá odpařit na malý objem. Přidá se 65,5 ml diethyletheru a etherový extrakt se extrahuje 62,5 ml vody, pH vodného extraktu se upraví na hodnotu mezi 4 a 5 kyselinou octovou, až se vysráží krémově zbarvená pevná látka. Po ochlazení se produkt zfiltruje a vysuší ve vakuu nad oxidem fosforečným. Výtěžek činí 340 mg.
Surový 2-thio-N6-(2-isopentenyl)adenin se přemění na draselnou sůl převedením do suspenze ve vodě a přidáním ekvimolámího množství hydroxidu draselného společně s dostatkem alkoholu pro vytvoření roztoku. Roztok se vysuší ve vakuu a nad oxidem fosforečným.
5. N6-(2-isopentenyl)adenin-2-thioglukopyranuronid
2,89 mmol draselné soli 2-thio-N6-(2-isopentenyl) adeninu se rozpustí v bezvodém methanolu a přidá se 5 mmol methyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu. Směs se míchá po dobu 24 hodin při teplotě místnosti a během této doby se vytvoří krémově bílá pevná látka. Reakční směs se vysuší ve vakuu a hydrolyzuje při teplotě místnosti přidáním 50 ml 5 % vodného hydroxidu sodného, čímž se získá volný glukopyranuronid ve formě sodné soli. Směs se neutralizuje opatrným přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové za vnějšího chlazení, a získá se bezbarvá sraženina surové sodné soli IP2SGN.
Surový produkt se vyčistí pomocí chromatografie na reverzní fázi, překrystaluje z ethanolu a vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým, a získá se tak 150 mg bezbarvé, amorfní pevné látky. Produkt je omezeně rozpustný v 50 % vodném alkoholu.
Analýza
UV:
voda, pH 1 A max 284,241,206 nm voda, pH 7 278, 230 (rameno) nm voda, pH 14 283, 227 nm
Sodná sůl IP2SGN vykazuje charakteristické UV spektrum 2-thio-substituovaných cytokininů a toto její spektrum je velmi podobné spektru autentického 2-methylthio-N6-(2-isopentenyl) adeninu. Analýza pomocí UV záření potvrzuje, že produkt je 2-,N6-disubstituovaný adenin.
HPLC:
HPLC se provede za použití sloupce C18-silikagelu 15x0,46 cm. Promývá se za použití gradientově eluce 0 až 60 % methanolem obsahujícím kyselinu octovou (0,2M) po dobu 30 minut při průtoku 1 ml/min. Provádí se detekce UV zářením při 270 nm.
Sodná sůl IP2SGN vykazuje čistotu více než 98 % a obsahuje nezdetekovatelné množství (méně než 0,1 %) volného 2-thio-N6-(2-isopentenyl)adeninu.
Hydro lýza pomocí beta-glukuronidasy (GUS)
500 pg sodné soli IP2SGN v 500 μΐ 50 mM natriumfosfátového pufřu o pH 7,0 se inkubuje s 2500 jednotkami Sigma Fishman beta-glukuronidasy (GUS, Sigma typ G7896) po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C. HPLC (za výše uvedených podmínek) ukazuje částečné odstranění (65 %) IP2SGN za vytvoření píku, který se při chromatografii ve směsi 1:1 chová shodně jako
-26CZ 284828 B6
2-thio-N6-(2-isopentenyl)adenin. Tento test potvrzuje identitu sodné soli IP2SGN jako konjugátu 2-thio-N6-(2-isopentenyl)adeninu a beta-D-glukuronové kyseliny, který je částečně citlivý k hydrolýze pomocí GUS.
Příklad 1F
Sodná sůl 6-(3-methylbut-2-enylamino)purin-8-yl-l-thio-beta-D-glukopyranuronové kyseliny
Synonyma: sodná sůl N6-(2'-isopentenyl)adenin-8-thioglukopyranuronové kyseliny sodná sůl N6-(2'-isopentenyl)adenin-8-thioglukuronidu
Zkratka:
Reakce 1
6-hydroxy-8-thiopurin g 4,5-diamino-6-hydroxypyrimidin-sulfátu a 100 g thiomočoviny se společně rozetře a zahřívá na olejové lázni na teplotu 200 °C po dobu 30 minut. Ochlazený produkt ve formě pevné látky se rozpustí v 500 ml horkého 1M hydroxidu sodného, vaří se s aktivním uhlím a zfiltruje. Horký filtrát se okyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a horký roztok se zfiltruje, čímž se získá červená pevná látka, která se znovu vysráží z horkého zásaditého roztoku, promyje důkladně vodou a vysuší ve vakuu při teplotě 80 °C. Výtěžek činí 5,28 g.
Analýza
UV:
A max, pH 1 pH 11
236, 292 nm (literatura udává 234,290 nm)
234, 292 nm (literatura udává 234,290 nm)
-27CZ 284828 B6
Reakce 2
6-hydroxy-8-benzylthiopurin
5,28 g 6-hydroxy-8-thiopurinu se převede do suspenze v 78,5 ml 1M hydroxidu sodného a naředí na objem 400 ml vodou. Přidá se 3,7 ml benzyl-chloridu a reakční směs se intenzivně míchá po dobu 3 hodin při teplotě místnosti. Poté se upraví její pH na hodnotu 5 ledovou kyselinou octovou a směs se zfiltruje. Produkt se důkladně promyje vodou a vysuší se přes noc ve vakuu při teplotě 80 °C, čímž se získá 7,33 g lososově růžové pevné látky, která se použije bez dalšího čištění.
Reakce 3
6-chlor-8-benzylthiopurin
Ke směsi 70 ml oxychloridu fosforečného a 7,5 ml Ν,Ν-diethylanilinu se přidá 7,33 g 6hydroxy-8-benzylthiopurinu, a směs se zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, čímž se získá tmavě červený produkt. Směs se koncentruje ve vakuu a výsledná sirupovitá směs se za míchání pomalu vylije na 400 g ledu. Směs se nechá stát po dobu 15 minut a poté se silně alkalizuje studeným koncentrovaným hydroxidem draselným. Směs se důkladně trituruje, aby se rozpustila většina sirupovitého zbytku a poté se okyselí na pH 1 pomalým přidáním studené koncentrované kyseliny chlorovodíkové, přičemž je stále přítomen nadbytek ledu.
Po stání po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti se produkt odfiltruje, důkladně promyje vodou a suší ve vakuu při teplotě 80 °C po dobu 2 hodin, čímž se získá 7,8 g produktu.
Reakce 4
8-benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adenin
Směs 3,9 g 6-chlor-8-benzylthiopurinu a 3,42 g isopentenylamin-hydrochloridu v 1-butanolu (100 ml) obsahujícím 7,5 ml triethylaminu se zahřívá kvaru pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Většina 1-butanolu se odstraní ve vakuu, reakční směs se ochladí na ledu a třepe s 400 ml vody.
Po chlazení přes noc se směs zfiltruje, čímž se získá surový produkt, který se vyčistí pomocí chromatografie na 100 g silikagelu za eluce gradientem 0 až 2,5 % methanolu v chloroformu. Chromatograficky vyčištěný produkt se překrystaluje z methanolu, a získá se 1,18 g bezbarvé, amorgní pevné látky.
Analýza
TLC (silikagel - 2,5 % methanol/chloroform):
Čistota činí více než 98 %. Nezjistí se detekovatelné množství nečistot.
UV:
% ethanol/kyselina chlorovodíková % ethanol % ethanol/amoniak
307 nm
291 nm
298 nm
-28CZ 284828 B6
Reakce 5
8-thio-N6-(2'-isopentenyl)adenin
1,18 g 8-benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adeninu se rozpustí ve 125 ml kapalného amoniaku, čímž se získá jasně žlutý roztok. Po malých částech se přidává sodík, až modré zbarvení vydrží po dobu 15 minut. Poté se opatrně přidá malé množství pevného chloridu amonného, aby se odstranil nadbytek sodíku. Amoniak se odpaří na malý objem a ke zbytku se přidá 125 ml etheru.
Poté co se uvolní většina zbylého amoniaku, extrahuje se etherový extrakt 2 x 65 ml vody. Vodný extrakt (o pH 12 až 13) se ochladí na ledu a pH se upraví na hodnotu 5 ledovou kyselinou octovou. Vysráží se krémově bílá pevná látka, která se zfiltruje, důkladně promyje vodou a vysuší přes noc nad chloridem vápenatým, čímž se získá v podstatě bílý, velmi lehký prášek. Výtěžek činí 760 mg.
Poznámka: 8-thio-N6-(2'-Ísopentenyl)adenin je snadno oxidován v alkalickém roztoku.
Analýza
HPLC (15 cm C18-silikagelu, methanol (0 až 80 %)/ledová kyselina octová (0,2M), po dobu 30 minut, průtok 1 ml/min, detekce UV zářením při 300 nm):
Ostrý, symetrický pík bez detekovatelných nečistot. Čistota činí více než 98 %.
UV:
% ethanol/HCl 245, 307 (rameno), 315 nm % ethanol 241, 305, 313 nm
Reakce 6
Sodná sůl IP8SGN
600 mg 8-thio-N6-(2'-isopentenyl)adeninu se převede do suspenze ve 102 ml 50 mM hydroxidu draselného obsahujících 1 % 2-merkaptoethanolu jako antioxidačního činidla. Přidá se dostatečné množství ethanolu, aby se pevná látka rozpustila. Roztok se vysuší ve vakuu na chloridem vápenatým a poté oxidem fosforečným. Suchý produkt se rozpustí ve 100 ml bezvodého methanolu obsahujících 50 μΐ 2-merkaptoethanolu a přidají se 2 g methyl(2,3,4-triO-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu. Směs se míchá po dobu 24 hodin při teplotě místnosti a poté se vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým a oxidem fosforečným. Chráněný ester se nechá hydrolyzovat po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti v 50 ml 5 % hydroxidu sodného.
Po neutralizaci koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou se surový produkt vyčistí pomocí chromatografíe na reverzní fázi a chromatografie na normální fázi, čímž se získá bezbarvá pevná látka, která se vysuší na konstantní hmotnost nad chloridem vápenatým. Výtěžek činí 190 mg.
Analýza sodné soli IP8SGN
UV:
A max ethanol/pH 1 ethanol/pH neutrální ethanol/pH 12
300 nm
285 (výrazné rameno), 291, 301 nm
283 (rameno), 290, 300 nm
-29CZ 284828 B6
TLC (silikagel - chloroform/methanol, 1/1):
Při nanesení 34, 68, 102 a 134 pg sodné soli IP8SGN se zjistí jediná, ostrá skvrna a žádné detekovatelné znečisťující látky. Čistota činí více než 99,5 %. Obsah volné cytokininové báze 8-thio-N6-(2-isopentenyl)adeninu je nižší než 0,1 %.
HPLC (15 cm C18-silikagelu, methanol (0 až 80 %)/ledová kyselina octová (0,2M), 30 minut, 1 ml, 300 nm):
Zjistí se jediný, široký pík, retenční čas 18,2 minut. Nezjistí se detekovatelné množství znečisťujících látek. Čistota činí více než 99,5 %.
Hydrolýza pomocí GUS
Sodná sůl IP8SGN v množství 1 mg/ml se inkubuje s 2500 jednotkami GUS (Sigma) v 50 mM fosfátovém pufru, o pH 7, při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. TLC (1/1, methanol/chloroform) ukazuje úplnou (přesahující 95 %) přeměnu sodné soli IP8SGN na sloučeninu, která se při chromatografii chová shodně jako 8-thio(2’-isopentenyl)adenin. Sodná sůl IP8SGN je tudíž citlivá k hydrolýze pomocí GUS.
Příklad 1G
Sodná sůl O-beta-D-glukopyranuronosylzeatinu
Synonyma:
sodná sůl zeatin-O-beta-D-glukopyranuronové kyseliny, sodná sůl zeatin-O-glukuronidu
Zkratka:
sodná sůl ZOGN
Syntéza
Methylester kyseliny trans-2-methyl-4-ftalimidobut-2-enyl(2',3',4,-tri-0-acetyl-beta-Dglukopyranuronové)
1,87 g trans-l-hydroxy-2-methyl—4-ftalimidobut-2-enu (Corse aKuhnle, 1972, Synthesis, str.
618-619) a9g čerstvě aktivovaného uhličitanu stříbrného se převede do suspenze v 300 ml bezvodého etheru obsahujících molekulární síto (9 g). Po míchání po dobu 30 minut při teplotě místnosti se přidá 3,24 g methyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu a směs se míchá ve tmě po dobu 2 dnů při teplotě místnosti. Poté se přidá další dávka (1,62 g) methyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid)uronátu a směs se míchá po dobu
-30CZ 284828 B6 dalších 2 dnů. Reakční směs se zfiltruje, vysuší ve vakuu, čímž se získá bezbarvý sirupovitý zbytek, který se dále vysuší ve vakuu nad chloridem sodným a získá se bezbarvý pěnovitý produkt. Ze surového produktu se odstraní znečisťující cukry pomocí chromatografie na 200 g silikagelu, eluce se provádí chloroformem. Výtěžek čistého produktu činí 2,45 g (55,4 %).
trans-2-methyl—4-aminobut-2-enyl-beta-D-glukopyranosyluronamid
2,45 g methyl-trans-2-methyl-4-ftalimidobut-2-enyl(2',3',4'-tri-0-acetyl)-beta-D-glukopyranuronátu se rozpustí ve 150 ml bezvodého methanolu, ochladí na ledu a po dobu 6 hodin se nechá roztokem o teplotě ledu probublávat kyslík. Po odstranění methanolu ve vakuu se surový produkt vyčistí pomocí chromatografie na 200 g celulosy a vyvine soustavou butanol -ethanol kyselina octová-voda (8:2: 1:3, objem/objem). Eluát se vysuší ve vakuu a získá se tak hnědý sirupovitý zbytek, který se použije v kondenzační reakci bez dalšího čištění.
Sodná sůl zeatin-O-beta-E>-glukuronové kyseliny
Sirupovitý zbytek z předchozího kroku se zahřívá v uzavřené zkumavce s 0,8 g 6-chlorpurinu a 1,5 ml triethylaminu v 25 ml methanolu na 90 °C po dobu 4 hodin, aby se vytvořil amid. Pro převedení amidu na kyselinu se methanol odstraní ve vakuu a přidá se 25 ml 5 % vodného hydroxidu sodného. Po míchání při teplotě místnosti po dobu 6 hodin se směs opatrně neutralizuje 2M kyselinou chlorovodíkovou a vyčistí pomocí chromatografie na reverzní fázi na 100 g silikagelu, eluce se provádí vodou. Surová sodná sůl ZOGN obsahující nezreagovaný 6-chlorpurin se vysuší ve vakuu a vyčistí pomocí chromatografie na 50 g silikagelu, eluce se provádí gradientem 0 až 100 % methanolu v chloroformu. Po odstranění rozpouštědla se produkt, jako amorfní pevná látka, vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým. Výtěžek činí 158 mg.
Analýza
UV:
A max vodný ethanol vodný ethanol/HCl vodný ethanol/amoniak
276 nm, 270 nm (rameno), 283 nm (rameno)
279 nm
276 nm, 270 nm (rameno), 283 nm (rameno)
TLC (silikagel - 1-butanol /ledová kyselina octová/voda, 12/3/5):
Při nanesení 50 pg sodné soli ZOGN se zjistí jediná skvrna (Rf0,16) a žádné detekovatelné nečistoty. Ani zeatin (Rf 0,66) ani 6-chlorpurin (Rf0,70) nejsou přítomny v detekovatelném množství. Celková čistota činí více než 98 %.
HPLC (sloupec 15 x 0,46 cm C18-silikagelu, detekce UV záření při 270 nm):
Gradientová eluce (0 až 100 % methanol, po dobu 30 minut, při průtoku 1 ml /min):
Sodná sůl ZOGN se vymývá jako dosti široký pík (retenční čas 10,0 min) s malým množství, anorganické nečistoty přítomné spolu s pikem rozpouštědla. Celková čistota činí více než 97 %.
Isokratická eluce (50 % vodný methanol, průtok 1 ml/min):
Isokratická eluce se použije pro stanovení obsahu zeatinu. Sodná sůl ZOGN má retenční čas (tR) 1,1 minutu, ve srovnání s retenčním časem autentického trans-zeatinu, který je 2,2 minut. Pomocí HPLC až 96 pg sodné soli ZOGN se zjistí nepřítomnost detekovatelného množství zeatinu. Obsah zeatinu je tudíž nižší než 0,1 %, což se potvrdí pomocí TLC na silikagelu v soustavě chloroform/methanol (9/1). Sodná sůl ZOGN zůstane v tomto rozpouštědlovém
-31 CZ 284828 B6 systému na startu, avšak jakýkoli znečisťující zeatin se zřetelně oddělí sRfO,39. Při chromatografii 200 pg sodné soli ZOGN není detekován žádný zeatin. Detekční limit pro transzeatin při TLC je 200 ng, ukazuje se tedy, že znečištění trans-zeatinem je menší než 0,1 %.
Enzymatická hydrolýza
Vzorek sodné soli ZOGN se inkubuje s beta-glukuronidasou (Sigma G9387) v 50 mM natriumfosfátovém pufru, o pH 7,0, při teplotě 37 °C. HPLC (50 % isokratický methanol) ukazuje prakticky úplnou přeměnu na trans-zeatin. Identita trans-zeatinu v enzymovém hydrolyzátu se potvrdí tím, že se při chromatografii pomocí tří odlišných chromatografických systémů chová hydrolyzát ve směsi 1:1 shodně jako autentický trans-zeatin.
Příklad 1H
2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranuronamid
Synonyma: o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronamid o-kumaryl-glukuronamid
Zkratka: CouGNamid
Syntéza g methyl-o-kumarátu a 16,8 g methyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid) uronátu se rozetře společně s 25 ml chinolinu, aby se vytvořila homogenní pasta. Za intenzivního míchání se po částech přidá 10,7 g oxidu stříbrného, během čehož se směs chladí na ledu. Poté se reakční směs nechá stát při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Směs se extrahuje 1 1 etheru a etherový extrakt se promyje 1 1 vody. Etherový extrakt se vysuší nad bezvodým síranem sodným a poté ve vakuu, až vznikne červený sirupovitý zbytek. Surový sirupovitý zbytek se extrahuje 300 ml petroletheru, aby se odstranil nezreagovaný methyl-o-kumarát a poté se vysuší ve vakuu, čímž se odstraní stopy petroletheru. Surový produkt se překrystaluje z ethanolu za odbarvení aktivním uhlím, a získá se 3,5 g čistého peracetylovaného methyl-2-hydroxycinnamyl-O-beta-D-glukopyranuronátu.
3,5 g peracetylovaného methylesteru se rozpustí v 250 ml bezvodého methanolu a hydrolyzuje se pomocí míchání po dobu 3 hodin při teplotě 0 °C s dalšími 250 ml bezvodého methanolu nasyceného suchým amoniakem při -10 °C. Amoniak a methanol se odstraní ve vakuu a surový
-32CZ 284828 B6 produkt se překrystaluje z ethanolu a vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým, čímž se získá 1,7 g čistého CouGNamidu jako bezbarvé chmýřité pevné látky.
Analýza
TLC (silikagel - chloroform/methanol, 1/1):
Zjistí se jediná, ostrá skvrna (Rf 0,63). Při nanesení až 50 pg látky se nezdetekují žádné znečisťující látky, čistota činí více než 98 %. Obsah nečistot je méně než 0,5 % methyl-okumarátu, nebo kumarinu.
TLC (silikagel - chloroform/methanol/ledová kyselina octová, 50 /50 /5):
Zjistí se jediná, ostrá skvrna (Rf 0,68). Čistota činí více než 98 %. o-kumarová kyselina (Rf 0,80) je přítomna v nezdetekovatelném množství (méně než 0,5 %).
Příklad II
2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranuronová kyselina
Synonyma: o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronová kyselina o-kumaiyl-glukuronid
Zkratka: CouGN
Syntéza
17,8 g methyl-o-kumarátu a20g methyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranosylbromid) uronátu se rozetře společně s 20 ml chinolinu na stejnoměrnou pastu. Za intenzivního míchání se po částech přidá 13 g oxidu stříbrného, během čehož se směs chladí na ledu. Poté se reakční směs nechá stát při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Směs se extrahuje 1 1 etheru a etherový extrakt se promyje 1 1 vody. Etherový extrakt se vysuší nad bezvodým síranem sodným a poté ve vakuu, až vznikne červený sirupovitý zbytek. Surový sirupovitý zbytek se extrahuje 300 ml petroletheru, aby se odstranil nezreagovaný methyl-o-kumarát a poté se vysuší ve vakuu, čímž se odstraní stopy petroletheru. Surový produkt se překrystaluje z ethanolu za odbarvení aktivním uhlím, a získá se 2,9 g čistého peracetylovaného methyl-CouGN.
-33CZ 284828 B6
2,9 g peracetylovaného methylesteru se převede do suspenze v 250 ml methanolu a za míchání se přidá 250 ml 2M hydroxidu sodného, během čehož se reakční směs chladí na ledu. Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny apH se upraví na hodnotu 2,5 kyselinou chlorovodíkovou. Methanol se odstraní ve vakuu a surový produkt se vyčistí chromatografií (XAD-2). Chromatografícká pryskyřice se nejprve promyje vodou, aby se odstranily anorganické soli, a produkt se vymyje methanolem. Po vysušení ve vakuu se produkt překrystaluje z ethanolu a vysuší ve vakuu nad chloridem vápenatým, čímž se získá 1,5 g čisté CouGN jako bezbarvé, amorfní pevné látky.
CouGN je rozpustná v množství 5 mg/ml ve vodném pufru, pH 7, a v 50 % vodném alkoholu. Získá se čirý, bezbarvý roztok.
Analýza
TLC (silikagel - chloroform/methanol/ledová kyselina octová, 50/50/1):
Zjistí se hlavní skvrna s Rf 0,12 a menší množství nečistoty s Rf 0,24. Čistota činí více než 90 %. Kumarin (Rf 0,90), methyl-o-kumarát (Rf 0,91) či kyselina o-kumarová (Rf 0,80) jsou přítomny v nezdetekovatelném množství (méně než 1 %). Hlavní produkt se při chromatografii chová shodně jako autentická CouGN připravená pomocí katalytické oxidace 2-hydroxycinnamyl-Obeta-D-glukopyranosidu.
Hydrolýza pomocí GUS mg CouGN se rozpustí v 1 ml 50 mM natriumfosfátového purfu o pH 7,0 a inkubuje se s GUS (1000 jednotek Sigma typ G5897) po dobu 12 hodin při teplotě 37 °C. TLC ukazuje z 93,4 % přeměnu na sloučeninu, která se při chromatografii chová shodně jako o-kumarová kyselina, o-kumarová kyselina se v průběhu několika dnů pomalu přeměňuje (neenzymaticky) na kumarin.
Příklad 2
Hydrolýza cytokinin-glukuronidů pomocí beta-glukuronidasy za uvolnění nemodifikovaných cytokininů
Byl vyvinut test pro identifikaci těch cytokinin-glukuronidů, které mohou být hydrolyzovány pomocí beta-glukuronidasy z Escherichia coli. (Různé charakteristiky enzymu beta-glukuronidasy a jeho genu jsou popsány například v následujících pracech: Blonco aNemoz, Biochimie 69, str. 157- 161,1987; Jefferson a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 83, str. 8447 - 8451,1986; Lewy aMarsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, str. 381 -428, US 4 721 671).
Sloučenina, která má být testována, se inkubuje v 50 mM natriumfosfátovém pufru, o pH 7,0 (obecně 500 pg sloučeniny v 500 μΐ pufru) s beta-glukuronidasou (obecně Sigma typ G7896,2500 jednotek Sigma Fishman) po dobu 12 až 24 hodin při teplotě 37 °C. Přítomnost produktů hydrolýzy se poté stanoví za použití HPLC a TLC.
Tabulka 1 znázorňuje výsledky výše popsaného testu prováděného s řadou cytokinin-beta-Dglukuronidů a jedním cytokinin-beta-D-glukuronamidem.
-34CZ 284828 B6
Tabulka 1
Cytokinin-beta-D-glukuronidy (a cytokinin-beta-D-glukuronamid) jako substráty betaglukuronidasy z Escherichia coli
Hydrolýza Sloučenina
+ sodná sůl BA3GN
- BA3GNamid
- sodná sůl BA9GN
+ sodná sůl ZOGN
+ sodná sůl IP3GN
+ sodná sůl IP2SGN
+ sodná sůl IP8SGN
Vzhledem ktomu, že jako substrátů pro testování enzymu GUS z Escherichia coli vtransgenických organismech se používalo pouze O-glukuronidů, a že bylo dříve uváděno (Jefferson, The GUS reportér gene systém, Nátuře, sv. 342, str. 837 - 838, 1989), že substráty betaglukuronidasy sestávají z D-glukuronové kyseliny spojené beta-O-glykosidickou vazbou s aglykonem, je překvapivé, že bylo zjištěno, že některé N-glukuronidy a S-glukuronidy jsou též dobrými substráty tohoto enzymu. Předpokládá se tudíž také, že těchto N- a S-glukuronidů lze použít při testování enzymu beta-glukuronidasy z Escherichia coli a rostlin, například podobným způsobem jako je test X-gluc, uvedený níže.
V GB 2 197 653 A je uvedeno, že za použití beta-glukuronidasového systému a nových substrátů je možná pozitivní a negativní selekce využívající aktivity GUS. Tato hypotéza však nikdy nebyla zkoumána, a enzymatická hydrolýza těchto sloučenin se nikdy neukázala jako pravděpodobná ani na základě teoretických úvah týkajících se chemických charakteristik substrátů pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli. Jak je zde prokázáno, ne všechny glukuronidy jsou substráty pro enzym beta-glukuronidasu z Escherichia coli, a neočekává se, že by většina glukuronidů byla substráty pro enzym GUS.
Jako způsobu pro zhodnocení, zda mohou být určité glukuronidy (včetně prekurzorů rostlinných hormonů) hydrolyzovány enzymem beta-glukuronidasou z Escherichia coli in vivo, byly použito zkoumání odpovědí v rostlinných tkáních exprimujících gen beta-glukuronidasy z Escherichia coli (Jefferson, The GUS gene fusion systém as aversatile tool for agricultural molecular biology, abstrakt z kongresu Intemational Congress on Genetic Manipulation in Plant Breeding, konaného vElsinoru, Dánsko, 11. - 16.září 1988). Tento postup však bohužel není proveditelný díky přítomnosti silné endogenní aktivity beta-glukuronidasy v rostlinných tkáních (viz například níže uvedený Příklad 3, stejně jako článek Hodal a kol., Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants, určen k tisku v Plant Science). Přítomnost této endogenní beta-glukuronidasové aktivity též znamená, že při použití postupu, který popsal Jefferson, není možné stanovit, zda se účinky vyvolané glukuronidem ve skutečnosti projevují díky hydrolýze sloučeniny, nebo zda je lze vysvětlit skutečností, že je aktivní sám glukuronid. Aby byla sloučenina vhodná pro selekční účely, musí být aktivována enzymem GUS a musí být ve formě glukuronidu bez podstatné aktivity.
Výše popsaný test může být použit pro vyhledávání cytokinin-glukuronidů, které mohou být hydrolyzovány daným enzymem beta-glukuronidasou. Jako příklad tohoto enzymu je zde uveden enzym beta-glukuronidasa z Escherichia coli.
Za použití HPLC a TLC bylo dále stanoveno, že produktem hydrolýzy pomocí GUS jsou nemodifikované aktivní cytokininy (viz výše uvedené příklady týkající se přípravy a analýzy
-35CZ 284828 B6 nových cytokinin-glukuronidů). Tak bylo například zjištěno, že hydrolýza sodné soli BA3GN beta-glukuronidasou z Escherichia coli měla za následek prakticky úplné (z více než 99 %) odstranění sodné soli BA3GN za vzniku sloučeniny, která se při chromatografii ve směsi 1:1 chová shodně jako autentický N6—benzyladenin. Podobně, při inkubaci sodné soli ZOGN s betaglukuronidasou z Escherichia coli došlo k prakticky úplné přeměně na trans-zeatin, jak bylo stanoveno pomocí HPLC (za použití 50 % isokratického methanolu), a v případě inkubace sodné soli IP8SGN s beta glukuronidasou po dobu 24 hodin bylo zjištěno pomocí TLC (1:1, methanol/chloroform), že došlo k téměř úplné (z více než z 95 %) přeměně IP8SGN na sloučeninu, která se při chromatografii chová shodně jako 8-thio-(2-isopentenyl)adenin.
Podobně může být testována možnost hydrolýzy dalších typů glukuronidů danou betaglukuronidasou. Například, při stanovení pomocí TLC bylo zjištěno, že při inkubaci 5 mg okumaryl-beta-D-glukuronidu v 1 ml pufru po dobu 12 hodin s beta-glukuronidasou (Sigma typ G5897, 1000 jednotek) došlo z 93,4% k přeměně na sloučeninu, která se při chromatografii chová shodně jako o-kumarová kyselina. Inkubací dalších sloučenin uvedených v Tabulce 1 (s výjimkou dvou sloučenin, které se nechovaly jako substráty pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli) bylo dosaženo podobných výsledků, tj. vznikly produkty hydrolýzy odpovídající očekávaným výsledkům po hydrolýze beta-glukuronidasou (viz výše uvedené příklady týkající se přípravy různých glukuronidů). Na druhou stranu. BA9GN, který není substrátem pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli, jak je uvedeno výše v Tabulce 1, a který vykazuje po inkubaci s beta-glukuronidasou po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C nezdetekovatelnou (tj. méně než z 1 %) tvorbu N6-benzyladeninu, neindukuje tvorbu prýtů v listových terčících tabáku (viz Tabulka 2 níže).
Příklad 3
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy pomocí cytokinin-glukuronidů
Byly prováděny pokusy s cílem stanovit, zda jsou cytokinin-glukuronidy (stejně jako cytokininglukuronamid) schopny indukovat tvorbu prýtů in vivo v rostlinném materiálu obsahujícím, respektive neobsahujícím zavedený gen beta-glukuronidasy.
Semena z GUS-negativní a GUS-pozitivní rostliny tabáku (Nicotiana tabacum Wisconsin 38) se nechala vyklíčit na substrátu MSO (substrát Murashige a Skoog bez hormonů, jak ho popsali Murashige a Skoog, Phisiol. Plant. 15:473 - 497, 1962, který lze obdržet od firmy Sigma, USA). GUS-pozitivní rostlinný materiál obsahoval zavedený gen beta-glukuronidasy z Escherichia coli (uidA), řízený promotorem 35S z viru mozaiky květáku, jak popsali například Jefferson a kol., The EMBO Joumal, sv. 6, č. 13, str. 3901 -3907, 1987. Původní transgenické GUS-pozitivní rostliny byly získány za použití tradičního systému negativní selekce založeného na kanamycinu, jak popsali například Burow a kol., Plant Molecular Biology Reportér, sv. 8 (2), str. 124 - 139, 1990. GUS-pozitivní semenáčky byly identifikovány za použití testu X-gluc, jakje popsán níže v tomto příkladu.
Po 4 až 5 týdnech byly vrcholové části rostlin nebo prýtů přeneseny na nový substrát MSO a tento postup se v případě nutnosti opakoval. Tímto způsobem byl rostlinný materiál (jak GUSpozitivní tak GUS-negativní) udržován ve formě sterilních kultur prýtů (viz Burow a kol., Plant
Molecular Biology Reportér, sv. 8 (2), str. 124- 139, 1990). Z největších listů (3 až 5 týdnů starých) byly vyříznuty terčíky a ty byly přeneseny na níže uvedené substráty (viz Tabulka 2).
Základním použitým substrátem byl MSO, s přídavkem různých testovaných sloučenin v několika koncentracích až do 250 μΜ. Byly použity malé Petriho misky (o průměru 5 cm)
-36CZ 284828 B6 obsahující přibližně 6 ml substrátu, přičemž byly na každé Petriho misce umístěny tři listové terčíky. Každé testovaná varianta byla opakována alespoň ve třech opakováních.
Za použití popsaného postupu bylo zjištěno, že některé cytokinin-glukuronidy indukují v rostlinných tkáních obsahujících beta-glukuronidasu tvorbu prýtů. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:
Tabulka 2
Tvorba prýtů indukovaná cytokinin-beta-D-glukuronidy (a cytokinin-glukuronamidem) na listových terčících tabáku s (GUS+) nebo bez (GUS-) zavedeného genu beta-glukuronidasy
GUS- GUS+ Sloučenina
- - Žádná (kontrola)
+ + N6-benzyladenin (kontrola)
+ + Zeatin (kontrola)
- - Kyselina glukuronová (kontrola)
+ + Sodná sůl BA3GN
+ + BA3GNamid
- - Sodná sůl BA9GN
+ + Sodná sůl ZOGN
+ + Sodná sůl IP3GN
+ + Sodná sůl IP2SGN
+ + Sodná sůl IP8SGN
Legenda:
+ označuje tvorbu prýtů při koncentracích pod 250 μΜ
- znamená, že při koncentracích pod 250 μΜ nedochází k tvorbě prýtů (250 μΜ odpovídá přibližně 100 mg/ml)
Z výše uvedené tabulky je vidět, že všechny cytokinin-glukuronidy, které při koncentraci pod 250 μΜ indukovaly tvorbu prýtů u listových terčíků tabáku obsahujících zavedený gen betaglukuronidasy byly za použití podobné koncentrace též schopné indukovat tvorbu prýtů u odpovídajících listových terčíků neobsahujících zavedený gen beta-glukuronidasy. Na druhou stranu, cytokinin-glukuronid BA9GN, o kterém bylo zjištěno, že nepůsobí jako substrát pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli (viz Příklad 2), nezpůsoboval tvorbu prýtů u listových terčíků jak obsahujících tak neobsahujících zavedený gen beta-glukuronidasy. Cytokininglukuronamid BA3GNamid, který, jak bylo zjištěno v Příkladu 2, nepůsobí jako substrát pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli, však indukoval tvorbu prýtů jak u GUS-pozitivních tak u GUS-negativních listových terčíků, což svědčí o tom, že cytokinin-glukuronamidy jsou v rostlinné tkáni přeměňovány na odpovídající cytokinin-glukuronové kyseliny. Zdá se tedy, že prekurzory cytokinin-glukuronidů mohou invivo působit stejným způsobem jako samotné cytokinin-glukuronidy.
Uvedené výsledky svědčí o tom, že vyšší rostliny, v tomto případě tabák, vykazují endogenní beta-glukuronidasovou aktivitu. Toto zjištění je v souladu s tím, co v poslední době uvedli Hu a kol. (Plant Cell Reports 9, str. 1 -5, 1990), kteří zkoumali výskyt aktivity podobné GUS u 52 druhů semenných rostlin, as tím, co zjistili Hodal a kol. (určeno k tisku v Plant Science). Hu a kol. zjistili, že druhy exprimující pozitivní aktivitu podobnou GUS jsou přítomny ve všech klíčových skupinách krytosemenných stejně jako u některých nahosemenných. (Hu a kol. nezdetekovali aktivitu GUS v tabáku, tento výsledek však lze vysvětlit skutečností, že jejich test
-37CZ 284828 B6 byl prováděn in vitro při pH 7. Jak je uvedeno níže, zdá se, že enzym odpovědný za přirozenou aktivitu GUS v tabáku není aktivní při pH 7, bylo však zjištěno, že je aktivní při pH 4 až 5).
Tato zjištění jsou v protikladu s tím, co je uvedeno v GB 2 197 653 A, kde se uvádí, že vyšší rostliny, včetně tabáku, nevykazují detekovatelnou aktivitu beta-glukuronidasy. GB 2 197 653 A, který se týká mimo jiné způsobu sledování exprese zajímavého genu za použití genu GUS, uvádí, že přítomnost aktivity GUS vyjadřuje přítomnost zajímavého genu atak se předpokládá, že vzhledem k tomu, že ve vyšších rostlinách nebyla zjištěna aktivita GUS, je relativně snadné sledování exprese zajímavého genu za použití genu GUS. Zvýše uvedených výsledků však vyplývá, že tomu tak není, a že použití genu GUS pro sledování přítomnosti zajímavého genu není vůbec jednoduché nebo snadné, vzhledem ktomu, že vyšší rostliny ve skutečnosti vykazují podstatnou vnitřní (jako pozadí) aktivitu beta-glukuronidasy.
Z důvodů studia podstaty pozorované aktivity GUS v rostlinném materiálu s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy, byla stanovena závislost aktivity GUS na pH pomocí standardního histochemického testu GUS za použití X-gluc (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-glukuronidu).
Při provádění testu X-gluc se nejprve připraví testovací médium tak, že se rozpustí 50 mg X-gluc v roztoku obsahujícím 25 ml 0,2M fosfátového pufru, typicky o pH 7,0, 24 ml destilované vody, 0,25 ml 0,lM K3(Fe(CN)6), 0,25 ml 0,lM K4(Fe(CN)6) a 0,5 ml l,0M sodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové, přičemž se provádí míchání až do rozpuštění (přibližně 30 minut). Čerstvě nařezané nebo formaldehydem fixované řezy (tloušťka méně než 0,5 mm) či tkáně se poté inkubují v médiu X-gluk při teplotě 37 °C po dobu několika minut až 24 hodin. Po inkubaci se řezy promyjí v natriumfosfátovém pufru nebo ve vodě a zkoumají se mikroskopem. Aktivita GUS se pozoruje jako modré zabarvení ošetřeného rostlinného materiálu v místě aktivity enzymu (Jefferson. Plant Molecular Biology Reportér, sv. 5, č. 4, str. 387-405, 1987). Pro účely vynálezu byla typicky používána doba inkubace 20 hodin. Po inkubaci byly terčíky ošetřeny 96 % ethanolem, aby se odstranil chlorofyl
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka 3
Závislost aktivity GUS v listových terčících tabáku s (+) a bez (-) zavedeného genu GUS na pH
PH 3 4 5 6 7 8
GUS (-) 0 + + 0 0 0
GUS (+) 0 + + + + +
Legenda:
žádná reakce v testu X-gluc + modré zbarvení v testu X-gluc
Je vidět, že enzym odpovědný za beta-glukuronidasovou aktivitu projevující se jako pozadí v listových terčících tabáku bez zavedeného genu beta-glukuronidasy je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH, které odpovídá vnitřnímu pH rostlin (okolo pH 5), zatímco beta-glukuronidasa exprimovaná zavedeným genem je aktivní v širokém rozmezí pH od hodnoty 4 do hodnoty 8.
Tato závislost na pH vysvětluje, proč byly předchozí snahy detekovat aktivitu GUS v rostlinách převážně neúspěšné a vedly k nesprávným závěrům (například v GB 2 197 653 A), že rostliny nemají vnitřní aktivitu GUS.
-38CZ 284828 B6
Skutečnost, že beta-glukuronidasová aktivita zjištěná výše pro rostlinný materiál ze zavedeného genu GUS je výsledkem hydrolýzy cytokinin-glukuronidu jako substrátu beta-glukuronidasou, a nikoli výsledkem nespecifické reakce, která štěpí substrát, například neenzymatické kyselé hydrolýzy glukuronidů (o kterých je známo, že jsou štěpeny při nízkých hodnotách pH), byla prokázána testováním účinku inhibitorů různých enzymů při pH 5 v negeneticky transformovaném rostlinném materiálu (tj. rostlinném materiálu vykazujícím pouze přirozenou aktivitu GUS). Testování bylo prováděno za použití výše popsaného testu X-gluc při pH 5,0 po dobu 20 hodin.
Tabulka 4
Test inhibitorů při pH = 5,0 u netransformovaného materiálu
0 Koncentrace (mM) 0,1 1 10 50
sacharo-1,4-lakton + + 0 0 0
glukonolakton + + + + +
UDP-glukuronid + + + + +
kyselina glukuronová + + + 0 0
galaktosa + + + + +
methylumbelliferyl-glukuronid + + + + 0
kyselina ethylendiamintetraoctová + + + + +
Legenda:
žádná reakce, tj. zcela bílý listový terčík + modré zbarvení s X-gluc
Šest testovaných inhibitorů mělo následující uvedené účinky:
Sacharo-l,4-lakton je inhibitor, který je specifický pro beta-glukuronidasy (jinými slovy, inhibuje pouze beta-glukuronidasy a inhibuje všechny beta-glukuronidasy). Obecně je uznáváno, že aktivita GUS, která může být inhibována touto sloučeninou, je následkem působení enzymu beta-glukuronidasy.
Glukonolakton je inhibitorem beta-glukosidas. Odpovídá sacharo-l,4—laktonu, stím rozdílem, zeje specifický pro beta-glukosidasy.
UDP-glukuronid je substrátem pro UDP-glukuronid-transferasy.
Kyselina glukuronová je produktem každé reakce způsobené beta-glukuronidasou a tudíž je produktem inhibujícím beta-glukuronidasy a jiné enzymy tvořící kyselinu glukuronovou.
Galaktosa je inhibitorem reakcí závislých na UDP-glukuronid-transferase.
Methylumbelliferyl-glukuronid je substrátem pro všechny dosud prozkoumané beta-glukuronidasy a je tedy kompetitivním inhibitorem enzymů GUS.
Jelikož bylo též zjištěno, že kyselina ethylendiamintetraoctová (která inhibuje UDP-glukuronidtransferasy) nemá žádný vliv, je nepravděpodobné, že by se tyto transferasy podílely na pozorované aktivitě GUS. Výše uvedená tabulka znázorňuje, že sloučeniny, které by měly inhibovat enzym transferasu neměly žádný účinek ani při velmi vysokých koncentracích. Dále je
-39CZ 284828 B6 z tabulky možno vidět, že glukonolakton neměl žádný inhibiční účinek, a je tedy nepravděpodobné, že by aktivita GUS měla vztah k beta-glukosidasové aktivitě.
Dále je možno vidět, že inhibitor specifický pro GUS sacharo-1,4-lakton je silným inhibitorem, že kyselina glukuronová (produkt inhibující beta-glukuronidasu) je středně silným inhibitorem a že methylumbelliferyl-glukuronid (substrát GUS, a tudíž kompetitivní substrát s X-gluc, pokud je za hydrolýzu X-gluc odpovědný enzym beta-glukuronidasa) je slabým inhibitorem. Aktivita GUS v tabáku tedy splňuje všechna nutná kriteria, aby byla klasifikována jako důsledek enzymu beta-glukuronidasy. Může být tudíž učiněn závěr, že rostliny obsahují enzym betaglukuronidasu.
Byla prováděna odpovídající řada pokusů s účelem stanovit, zda byl účinek inhibitorů dostatečně rychlý pro umožnění inhibice enzymu. V těchto pokusech byl rostlinný materiál preinkubován v testovaných sloučeninách (inhibitorech) po dobu 24 hodin před tím, než byl proveden test Xgluc se stejnými testovanými sloučeninami. Získané výsledky byly shodné s výsledky získanými bez preinkubace, což svědčí o tom, že inhibitory pronikají do rostlinné tkáně dostatečně rychle, aby způsobovaly inhibici v testu X-gluc předtím, než může dojít k modrému zbarvení.
Podobné výsledky jako jsou popsány výše byly získány při dalším výzkumu výskytu aktivity GUS v rostlinách. V tomto případě byla zkoumána závislost histologické reakce GUS na pH u mnoha rostlinných druhů při hodnotách pH mezi 3 a 8 jak bez tak s inhibitorem specifickým pro GUS sacharo-1,4-laktonem.
Používaným testem byl výše popsaný test X-gluc, který byl prováděn při teplotě 37 °C po dobu 20 hodin. Listy byly rozřezány (sterilními žiletkami), takže byl každý z listů testován při několika odlišných hodnotách pH.
Jak je znázorněno v níže uvedené tabulce, tento výzkum potvrdil, že rostliny skutečně vlastní přirozenou aktivitu GUS, že tato aktivita je výsledkem enzymatické reakce (v přítomnosti inhibitoru specifického pro GUS nedocházelo k žádné reakci) a že je tento enzym primárně aktivní při hodnotách pH okolo 4 až 5.
Tabulka 5
Histologická reakce GUS při různých hodnotách pH
pH během testu 3 4 5 6 7 8 3-8
sacharo-1,4-lakton (mM) 0 0 0 0 0 0 10
Rostlinný druh Cukrová řepa, divoký typ + + + + (+) 0 0
Cukrová řepa, transgenická 1) + + + + + + (+)
Cukrová řepa, transgenická 2) + + + + (+) 0 0
Pšenice 0 + + + 0 0 0
Pšenice (albino) 0 + + + 0 0 0
Řepka olejka + + + (+) (+) 0 0
Tabák 0 + + 0 0 0 0
Tabák, transgenický 1) 0 + + + + + 0
Tabák, transgenický 2) 0 + + 0 0 0 0
Smrk sitka 0 + + 0 0 0 0
Reveň 3) n n + + + + 0
Hrách 3) 0 + + 0 0 0 0
Oxalis 3) n n n n (+) n 0
Pyl Chenopodium quinoa (merlík) n n n 0 + n n
-40CZ 284828 B6
Legenda:
1) listová tkáň exprimující gen GUS z Escherichia coli
2) transgenická listová tkáň obsahující pouze gen rezistence vůči kanamycinu (NPT), bez zavedeného genu GUS
3) tkáň stonku nebo řapíku
4) tkáň embiyogenního kalusu + modré zbarvení (+) nízká frekvence aktivity GUS (slabé modré zbarvení) žádná reakce n nestanoveno
Skutečnost, že rostliny mají obecnou vnitřní aktivitu GUS, umožňuje použití genu kódujícího glukuronid-permeasu jako genu pro pozitivní selekci bez použití libovolného dalšího selekčního genu, jelikož se tak poskytne výhoda zvýšeného příjmu glukuronidu transformovanými buňkami. Bylo například zjištěno, že glukuronidy nejsou do rostlinných buněk snadno přijímány přes plazmatické membrány. Pokud je však do buňky zaveden gen glukuronid-permeasy, mohou glukuronidy snadněji přejít plazmatickou membránu a proniknout do buňky. Glukuronidy jsou poté v transformovaných buňkách dostupné pro štěpení pomocí vnitřního enzymu GUS. Naproti tomu nebude daný glukuronid dostupný pro netransformované buňky, čímž se dosáhne účinku pozitivní selekce. Podobně může být pozitivní selekce prováděna za použití dalších permeas a dalších typů sloučenin, které jsou bud aktivovány v transformovaných buňkách vnitřním enzymem, nebo jsou jinak biologicky účinné v transformovaných buňkách, do kterých jsou transportovány.
Příklad 4
Cytokinin-glukuronidy jsou stabilní a neaktivní
Účinek sodné soli cytokinin-glukuronidu BA3GN je blokován, pokud je v rostlinné tkáni obsahující tento cytokinin-glukuronid inhibována aktivita GUS. Jinými slovy, samotný cytokinin-glukuronid je neaktivní. Dále se ukázalo, že je tento cytokinin-glukuronid stabilní v růstovém médiu stejně jako v rostlinné tkáni, pokud není přítomna beta-glukuronidasa, což je doloženo skutečností, že specifický inhibitor GUS, sacharo-1,4-lakton (SL), silně inhibuje tvorbu prýtů indukovanou sodnou solí cytokinin-glukuronidu BA3GN, ale pouze slabě inhibuje tvorbu prýtů indukovanou volným cytokininem N6-benzyladeninem (za použití základního postupu popsaného výše v Příkladu 3):
Tabulka 6
Inhibice tvorby prýtů indukované N6-benzyladeninem (0,5 mg/1) a sodnou solí BA3GN (15 mg/1) pomocí sacharo-1,4-laktonu (SL)
Ošetření Počet a relativní poměr regenerovaných prýtů na listový terčík
SL (mM)BA sodná sůl BA3GN
4,3 100% 5,6 100%
3,6 84%1,4 25%
Ze srovnání výsledků ve výše uvedené tabulce s výsledky v Tabulce 2 je vidět, že sodná sůl BA3GN, která indukuje tvorbu prýtů jak u GUS-pozitivních tak u GUS-negativních listových terčíků, neindukuje tvorbu prýtů u odpovídajících listových terčíků v přítomnosti inhibitoru specifického pro beta-glukuronidasu sacharo-1,4-laktonu.
-41 CZ 284828 B6
Sacharo-1,4-lakton není při pH používaném v tomto příkladu stabilní sloučeninou, vytváří se rovnováha mezi sacharo-1, 4-laktonem a kyselinou cukrovou (SA). Této rovnováhy se dosahuje pomalu, a přeměna sacharo-1,4-laktonu na kyselinu cukrovou je provázena poklesem pH. pH se proto musí během jednotýdenního období před použitím sacharo-1,4-laktonu několikrát upravovat, až se pH v substrátu obsahujícím sacharo-1,4-lakton stabilizuje.
Skutečnost, že jsou cytokinin-glukuronidy stabilní a neaktivní, pokud nejsou v přítomnosti betaglukuronidasy, je dále doložena tím, že BA9GN, který nemůže být hydrolyzován betaglukuronidasou, nemůže indukovat tvorbu prýtů v rostlinném materiálu vykazujícím betaglukuronidasovou aktivitu (viz Příklady 2 a 3).
Je důležité, že cytokinin-glukuronidy jsou neaktivní a stabilní v substrátech, které neobsahují enzym beta-glukuronidasu, jelikož je tato stabilita nezbytným předpokladem pro správné fungování systému pozitivní selekce, který jich využívá.
Ne u všech derivátů glukuronové kyseliny však může být očekávána stabilita. Například glukuronidy v esterové formě nebudou stabilní v rostlinné tkáni, která obsahuje nespecifické esterasy. To znamená, že cytokinin-glukuronidy připravené a používané podle vynálezu (betaD-glukuronidy spojené s aglykonem přes glykosidický atom kyslíku, síry nebo dusíku) splňují předpoklad pro stabilitu. Na druhou stranu, u sloučenin majících jiné typy glukuronidových vazeb, například u beta-D-glukuronidů v amidové nebo esterové formě, se neočekává jejich selektivní hydrolýza pomocí beta-glukuronidas, díky výskytu nespecifických esteras a amidas v rostlinách.
V souvislosti s výše uvedeným Příkladem 3 bylo tedy zjištěno, že jsou testované cytokininglukuronidy, které jak je uvedeno v tomto příkladu samy osobě nevykazují cytokininovou aktivitu, in vivo štěpeny účinkem beta-glukuronidasy - buď ve formě endogenní betaglukuronidasy působící jako pozadí nebo v důsledku zavedeného genu beta-glukuronidasy přičemž se uvolňuje volný cytokinin.
Příklad 5
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně obsahující zavedený gen beta-glukuronidasy za použití sterol-glukuronidů
I o dalších glukuronidech, včetně glukuronidů sterolů, glycyrrhizové kyseliny a hydroxychinolinu, bylo zjištěno, že jsou hydrolyzovány beta-glukuronidasou a mají za následek tvorbu prýtů na modifikovaných substrátech na kterých jsou produkty hydrolýzy nezbytné pro tvorbu prýtů, což je uvedeno v Příkladech 5 a 6.
Byly prováděny pokusy pro stanovení účinku dvou sterol-gukuronidů, beta-sitosteryl-beta-Dglukuronidu (SG) a cholesteryl-beta-D-glukuronidu (CG) na indukci tvorbu prýtů, pokud je ve tkáních inhibována syntéza sterolů. Základní použité postupy v podstatě odpovídají postupům popsaným výše v Příkladu 3. Kromě jednoho nebo obou výše zmíněných sterol-glukuronidů však substrát obsahoval tridemorf (0,1 mM) a 5 mg/1 sodné soli BA3GN. Počet prýtů byl zjišťován po 30 dnech.
Tridemorf (4-tridecyl-2,6-dimethylmorfolin) je fungicid, který inhibuje syntézu sterolů a podobných sloučenin. Pokud nejsou rostlinné tkáni dodávány steroly, má tridemorf inhibiční účinek na regeneraci prýtů (ačkoli nemá smrtící účinek na explantáty). V nepřítomnosti volných sterolů je tedy účinně zabráněno tvorbě prýtů.
-42CZ 284828 B6
Cholesteryl-beta-D-glukuronid (CG) byl získán od firmy Sigma. USA, a beta-sitosteryl-betaD-glukuronid (SG) byl syntetizován podle postupu, který popsali Ando a kol. v J. Antibiotics 73, str. 408, 1970.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka 7
Počet regenerovaných prýtů na listový terčík tabáku na substrátu doplněném tridemorfem (0,1 mM) a sodnou solí BA3GN (5 mM)
Sloučenina Koncentrace (mg/1)
Sitosteryl-beta-D-glukuronid 0 0 12,5 12,5
Cholesteiyl-beta-D-glukuronid 0 50 0 50
Prýtů na listový terčík 0,3 0,3 2,8 4,0
Z výše uvedené tabulky vyplývá, že sitosteryl-beta-D-glukuronid je schopen působit proti inhibičnímu účinku tridemorfú na tvorbu prýtů a že kombinace sitosteryl-beta-Dglukuronidu a cholesteryl-beta-D-glukuronidu způsobuje větší tvorbu prýtů. Tak je pozitivní selekce podle vynálezu pomocí zavedeného genu beta-glukuronidasy možná za použití například jednoho nebo obou výše uvedených sterol-glukuronidů společně se sloučeninou inhibující tvorbu prýtů, jako je tridemorf. Tyto výsledky svědčí o tom, že pro pozitivní selekci z tkáně obsahující zavedený gen beta-glukuronidasy mohou být použity též další steroly a sterolům podobné sloučeniny.
Výhodou použití těchto velmi málo rozpustných sloučenin pro pozitivní selekci je skutečnost, že jejich účinek bude pravděpodobně velmi lokální, jelikož tyto sloučeniny nedifúndují z buňky do buňky po odštěpení hydrofilního glukuronidového zbytku enzymem beta-glukuronidasou. Jinými slovy, těchto sloučenin může být použito pro zabránění cross feedingu během selekčního procesu.
Tento pokus dále naznačuje, že proti inhibičnímu účinku tridemorfú, a tudíž také ostatních sloučenin které inhibují syntézu sterolů, na tvorbu prýtů, lze působit přidáním sterolů a derivátů sterolů k substrátu, čímž může být vytvořen selekční systém s výše zmíněnými výhodami, založený na poskytování sterolů a sterolům podobných sloučenin transgenickým buňkám.
Příklad 6
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy za použití sitosteryl-beta-D-glukuronidu
Podobný pokus jako byl popsán v Příkladu 5 byl proveden jak na transformovaných tak na netransformovaných listových terčících tabáku za použití sitosteryl-beta-D-glukuronidu a buď N6-benzyladeninu nebo sodné soli BA3GN.
Použité postupy byly v podstatě takové, jako jsou popsány výše v Příkladu 5. V tomto pokusu byl tridemorf přidán k substrátu v koncentraci 0,1 mM a sitosteryl-beta-D-glukuronid byl přidán v koncentraci 121 mg/1. Kromě toho substrát obsahoval buď 1,88 mg/1 sodné soli BA3GN nebo 0,1 mg/1 N6-benzyladeninu. Počet prýtů byl zjišťován po 40 dnech.
Bylo získáno následující množství prýtů:
-43 CZ 284828 B6
Počet regenerovaných prýtů na listový terčík
N6-benzyladenin Sodná sůl BA3GN
Sloučenina GUS+ GUS- GUS+ GUS--
Sitosteryl-beta-D-glukuronid 2,4 1,9 2,4 0,1
Je vidět, že, jak bylo podstatou výše uvedeného Příkladu 5, působí přítomnost sitosteryl-beta-D5 glukuronidu proti inhibičnímu účinku tridemorfú na tvorbu prýtů. Dále, pokud byl sitosterylbeta-D-glukuronid a tridemorf použit společně se sodnou solí BA3GN, bylo dosaženo selektivní tvorby prýtů u GUS-pozitivních listových terčíků, zatímco u GUS-negativních listových terčíků na substrátu obsahujícím sodnou sůl BA3GN v podstatě nedocházelo k tvorbě prýtů.
Tyto výsledky svědčí též o tom, že použití kombinace odlišných glukuronidů (zde BA3GN a sitosteryl-beta-D-glukuronidu místo N6-benzyladeninu a sitosteryl-beta-D-glukuronidu) může zlepšit selektivní odpověď u transgenických tkání.
Jelikož steroly a steroidy jsou též důležitými regulátory růstu v živočišných buňkách, mohou být 15 odpovídající selekční postupy použity též pro selekci živočišných buněk, které exprimují betaglukuronidasu.
Příklad 7
Odzbrojené kmeny Agrobacteria produkují cytokininy
Bylo zjištěno, že některé kmeny Agrobacteria indukují tvorbu prýtů díky produkci látek indukujících tvorbu prýtů během kokultivace. Těmto kmenům je v případě, že má být použita 25 hydrolýza cytokinin-glukuronidů pomocí GUS pro účely selekce geneticky transformovaných buněk, normálně potřeba se vyhnout, jelikož tyto kmeny mohou samy indukovat tvorbu prýtů a tím překážet selekčnímu procesu.
Jako příklad jsou v níže uvedené tabulce znázorněny výsledky pokusu s dvěma odlišnými kmeny 30 Agrobacteria, z nichž jeden indukuje tvorbu prýtů u listových terčíků tabáku po kokultivaci.
Použité postupy odpovídají v podstatě postupům popsaným v Příkladu 13, ale po kokultivaci byly listové terčíky přeneseny na substrát MSO bez hormonů obsahující 300 mg/1 cefotaximu a 300 mg/1 karbenicillinu.
Počet regenerovaných piýtů byl zjišťován 4 týdny po kokultivaci.
Tabulka 8
Indukce tvorby prýtů na listových terčících tabáku na substrátu bez hormonů po kokultivaci s odzbrojeným Agrobacteriem
kmen Agrobacteria Plazmid Geny v T-DNA Počet prýtů na listový terčík
1.C58X T37 GUSaNPT 9,3
2. LBA4404X PAL4404 GUSaNPT 0
3.C58Y T37 Žádný 4,8
4. LBA4404Y PAL4404 Žádný 0
5. Žádný - - 0
-44CZ 284828 B6
Je vidět, že schopnosti některých kmenů Agrobacteria indukovat tvorbu prýtů nezávisí na genech obsažených v T-DNA. To znamená, že za indukci tvorby prýtů jsou odpovědné geny vně oblasti T-DNA.
Gen vně oblasti T-DNA odpovědný za tvorbu cytokininů byl pojmenován tzs (Morris, R. O., Ann. Rev. Plant Physiol. 37, str. 509 - 538, 1986). Kmen C58 obsahuje gen tzs, nepřenosný gen, který kóduje syntézu zeatinu během kokultivace. Kmen LBA4404 neobsahuje gen tzs. Skutečnost, že kmeny indukující tvorbu piýtů obsahují plazmid obsahující gen tzs svědčí o tom, že tento gen může být odpovědný za schopnost indukovat tvorbu prýtů, která byla pozorována v těchto pokusech, a že je kmenům Agrobacteria obsahujícím gen tzs potřeba se vyhnout v případě selekčních systémů založených na cytokininů. Normálně je potřeba vyhnout se též libovolným dalším kmenům Agrobacteria, které indukují tvorbu prýtů.
Příklad 8
Pozitivní selekce transgenických prýtů za použití cytokinin-glukuronidu sodné soli BA3GN
Za použití cytokinin-glukuronidů mohou být vybírány geneticky transformované prýty.
Byla prováděna řada pokusů testujících efektivitu systému pozitivní selekce za použití cytokinin-glukuronidu sodné soli BA3GN v koncentracích 7,5 a 15 mg/1. Pokusy byly prováděny na listových terčících divokého typu tabáku za použití dvou odlišných kmenů Agrobacteria, stejně jako různých kokultivačních substrátů. Byl použit způsob transformace jako je popsán níže v Příkladu 13, stou výjimkou, že byl místo MSO použit substrát Gamborg B5 (Gamborg a kol., Exp. Cell Res. 50: 151 - 158, 1968, lze jej obdržet od firmy Sigma, USA). Níže uvedené výsledky jsou uváděny jako průměrné hodnoty získané ze dvou nezávislých pokusů, přičemž v obou z nich byl každý typ ošetření prováděn na 27 listových terčících.
Tabulka 9
Pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití cytokinin-glukuronidu sodné soli BA3GN
7,5 mg/1 sodné soli BA3GN
Kmen Agrobacteria Kokultivační substrát GUS+ prýtů na listový terčík % GUS+ prýtů z celkového počtu prýtů
BS10 B5 0,1 6,6
BS10 B5 + ammon. 0,02 0,7
BS10 B5 + ammon. + SL 0,3 6,1
BS10 průměr 0,1 4,4
LDH1 B5 0,2 7,8
LDH1 B5 + ammon. 0,2 5,3
LDH1 B5 + ammon. + SL 0,2 4,7
LDH1 průměr 0,2 5,9
Oba průměr 0,2 5,1
-45CZ 284828 B6
Tabulka 9 - pokračování
Kmen Agrobacteria Kokultivační substrát GUS+ prýtů na listový terčík % GUS+ prýtů z celkového počtu piýtů
BS10 B5 0,3 6,0
BS10 B5 + ammon. 0,4 8,7
BS10 B5 + ammon. + SL 0,3 5,5
BS10 průměr 0,3 6,7
LDH1 B5 0,4 9,0
LDH1 B5 + ammon. 0,3 7,6
LDH1 B5 + ammon. + SL 0,3 7,7
LDH1 průměr 0,3 8,1
Oba průměr 0,3 7,4
Legenda:
B5 Substrát Gamborg B5, pH 5,4
Ammon. Kokultivační substrát s dusičnanem amonným (75 mM)
SL Kokultivační substrát s kyselinou cukrovou (25 mM) + sacharo-l,4-laktonem (25 mM) ze stabilizovaného roztoku
GUS+ Prýty exprimující aktivitu GUS při zkoumání při pH 7, jak je popsáno v Příkladu 3
Kmen BS10 zavádí gen GUS řízený modifikovaným promotorem 35S, který není aktivní v Agrobacteriu, jak popsali Janssen aGardner vPlant Molecular biology, 14, str. 6172, 1989. Kmen LDH1 zavádí gen GUS řízený nemodifikovaným promotorem 35S.
Výsledky uvedené v Tabulce 9 ukazují, že pozitivní selekce transgenických prýtů exprimujících zavedený gen beta-glukuronidasy za použití sodné soli BA3GN je možná. Tyto výsledky jsou velmi významné, a byly neočekávané, jelikož bylo zjištěno, jak je popsáno v Příkladu 3, že cytokinin-glukuronidy byly schopné indukovat tvorbu prýtů u listových terčíků, které neobsahují zavedený gen beta-glukuronidasy. Zdá se, že odlišná ošetření během kokultivace nemají na selekci podstatný vliv.
Výše uvedené výsledky svědčí rovněž o tom, že použití kmenu Agrobacteria s aktivním genem beta-glukuronidasy (kmen LDH1 exprimuje v bakteriích aktivitu GUS) neovlivňuje v porovnání s kmenem, který nemá aktivní gen beta-glukuronidasy (kmen BS10 neexprimuje v bakteriích aktivitu GUS), transformační systém.
Příklad 9
Selekce geneticky transformovaných prýtů za použití cytokinin-glukuronidu kyseliny zeatin-Obeta-glukuronové
Za použití v podstatě stejného postupu, jako je popsán v Příkladu 113, byly připraveny a selektovány transgenické prýty tabáku za použití cytokinin-glukuronidu kyseliny zeatin-Obeta-glukuronové (ZOGN) jako činidla pozitivní selekce.
Kokultivace byla prováděna po dobu 3 dnů, hustota inokula odpovídala hodnotě OD 1,5 při 660 nm. Substrátem použitým po kokultivaci byl substrát MSO obsahující 300 mg/1 karbenicillinu, 300 mg/1 cefotaximu a 0,1 mg/1 kyseliny indoloctové (LAA). Po třech týdnech byla provedena subkultivace do stejného substrátu, ale bez kyseliny indoloctové, pH používané u všech substrátů bylo 8,0. Pro každé ošetření bylo použito 18 listových terčíků.
-46CZ 284828 B6
Pět týdnů po kokultivaci byly prýty přeneseny na substrát MSO obsahující 200 mg/1 kanamycinsulfátu, 32 mM kyseliny cukrové, 300 mg/1 cefotaximu a 300 mg/1 karbenicillinu, pH 8,0. Kyselina cukrová, inhibitor enzymů beta-glukuronidas, byla přidána, aby zastavila další přeměnu zeatin-glukuronidu na zeatin. Společně s genem beta-glukuronidasy byl přenesen gen NPT způsobující rezistenci vůči kanamycinu. Netransformované prýty (negativní kontroly) přežily, ale růst těchto prýtů byl na tomto substrátu zpomalen, zatímco všechny transformované prýty (pozitivní kontroly) obsahující aktivní gen NPT přežily bez jakéhokoli zpomalení růstu.
týdny po poslední subkultivaci (8 týdnů po kokultivaci) byl zjištěn počet prýtů a podíl GUSpozitivních piýtů v celkovém počtu prýtů byl stanoven pomocí testu X-gluc (Příklad 3). Výsledky jsou uvedeny níže:
Tabulka 10
Pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití sodné soli ZOGN
ZOGN mg/1 GUS-pozitivních prýtů na listový terčík % GUS-pozitivních prýtů z celkového počtu prýtů
0,07 0,3 18,5
1,0 2,6 40,3
15,0 0,2 5,1
0,07 + SL * 0 0
Legenda:
* SL sacharo-l,4-lakton (2 mM)
Výsledky ve výše uvedené tabulce ukazují, že bylo dosaženo úspěšné pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití ZOGN. Indukce tvorby transgenických prýtů byla inhibována v případě, že byl do substrátu přidán specifický inhibitor beta-glukuronidas sacharo-l,4-lakton, což svědčí o tom, že růst transgenických prýtů a tedy úspěšnost pozitivní selekce je závislá na přeměně ZOGN na zeatin, která je katalyzována beta-glukuronidasou.
Příklad 10
Selekce geneticky transformovaných prýtů za použití kyseliny zeatin-O-beta-D-glukuronové při různých teplotách
Závislost systému pozitivní selekce používajícího cytokinin-glukuronidů na teplotě byla zkoumána za použití kyseliny zeatin-O-beta-glukuronové (ZOGN) jako činidla pozitivní selekce při teplotách 25 °C, 30 °C a 35 °C.
Transgenické prýty tabáku byly připraveny za použití v podstatě stejného postupu jako je popsán níže v Příkladu 13. Kokultivace byla prováděna po dobu 3 dnů, hustota inokula odpovídala hodnotě OD 1,5 při 660 nm. Substrátem použitým po kokultivaci byl substrát MSO obsahující 10 mg/12-(2-hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurinu(9-met), 350 mg/1 karbenicillinu, 350 mg/1 cefotaximu a 0,1 mg/1 kyseliny indoloctové (IAA) a sodnou sůl ZOGN v uvedeném množství. 9-met (získaný od Apex Organics Ltd., Velká Británie) byl přidán, aby inhiboval glykosylaci zeatinu a derivátů zeatinu. Pro každé ošetření bylo použito 18 listových terčíků.
-47CZ 284828 B6
Sedm týdnů po kokultivaci byly prýty přeneseny na substrát MSO obsahující 300 mg/1 kanamycin-sulfátu, 350 mg/1 cefotaximu, 350 mg/1 karbenicillinu, 0,1 mg/1 kyseliny indoloctové a 10 mg/1 6-(m-hydroxybenzylamino)purinu (OH-BA) a umístěny do teploty 25 °C. 6-(mhydroxybenzylamino)purin může být připraven jak popsali Kamínek a kol. (Plant Growth Reg. 6, str. 113 - 120, 1987).
Po šesti týdnech byl na substrátu obsahujícím kanamycin zjištěn počet zelených prýtů. Rezistence vůči kanamycinu svědčí o tom, že je prýt transgenický, neboť společně s genem betaglukuronidasy byl přenesen gen NPT způsobující rezistenci vůči kanamycinu. Na daném substrátu nepřežily žádné netransformované prýty (negativní kontroly), zatímco všechny transformované prýty (pozitivní kontroly), obsahující aktivní gen NPT, přežily.
Procento prýtů rezistentních vůči kanamycinu z celkového počtu regenerovaných prýtů bylo vypočítáno dělením počtu zelených výhonků, které přežily na substrátu obsahujícím kanamycin, počtem prýtů přenesených na substrát obsahující kanamycin. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka 11
Pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití sodné soli ZOGN při různých teplotách
T°C ZOGN mg/1 Počet kanamycin-rezistentních prýtů na listový terčík % kanamycin-rezistentních prýtů z celkového počtu prýtů
25 1 0,3 4,3
30 1 1,3 14,8
35 1 0,2 26,7
25 15 0 0
30 15 2,4 26,2
35 15 0,2 18,2
Test popsaný v tomto příkladu byl proveden se spojeným společně přeneseným genem. To znamená, že pro selekci je používán gen beta-glukuronidasy, zatímco je testována rezistence, která je následkem zavedení společně přeneseného genu NPT (genu rezistence vůči kanamycinu).
Výše uvedené výsledky ukazují, že je, pokud je prováděna selekce za použití genu betaglukuronidasy, kromě genu beta-glukuronidasy exprimován též společně přenesený gen. Kromě toho je vidět, že selekce při zvýšených teplotách (tj. okolo 30 až 35 °C) zvyšuje počet vybraných prýtů na listový terčík a též podíl transgenických prýtů z celkového počtu regenerovaných prýtů.
Při provádění testu X-gluc při různých teplotách bylo v souvislosti s vynálezem pozorováno, že je aktivita vnitřní beta-glukuronidasy vyskytující se v rostlinách inhibována při vysokých teplotách, zatímco aktivita zavedené beta-glukuronidasy není ovlivněna. Bylo tak zjištěno, že se aktivita vnitřní beta-glukuronidasy postupně snižuje se zvyšující teplotou až do přibližně 60 °C, a při této teplotě nebyla pozorována v podstatě žádná aktivita vnitřní beta-glukuronidasy (jak bylo stanoveno pomocí testu X-gluc). To může vysvětlit lepší výsledky selekčního procesu při zvýšených teplotách.
-48CZ 284828 B6
Přikladli
Pozitivní selekce v porovnání a v kombinaci s negativní selekcí
Bylo předvedeno, že zde popsaný systém pozitivní selekce je velmi účinný a výhodný ve srovnání s tradiční negativní selekcí založenou na kanamycinu. Dobrých výsledků lze však též dosáhnout pokud se systém pozitivní selekce použije společně s tradiční negativní selekcí.
Níže uvedená tabulka tedy znázorňuje výsledky, vyjádřené jako počet GUS-pozitivních prýtů tabáku na listový terčík a procento GUS-pozitivních piýtů z celkového počtu prýtů, získané při pozitivní selekci za použití sodné soli BA3GN, tradiční negativní selekci za použití kanamycinu a N6—benzyladeninu (BA), stejně jako při kombinaci pozitivní selekce a negativní selekce. Kromě toho byla do pokusu zařazena i selekce za použití sodné soli BA3GN společně se sacharo-l,4-laktonem (SL) (silným specifickým inhibitorem zavedené beta-glukuronidasy).
Byly používány v podstatě tytéž postupy, jako jsou popsány níže v Příkladu 13, ale místo substrátu MSO byl použit substrát Gamborg B5.
Tabulka 12
Pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí
Selekční substrát Konc. ** Konc. ** kanamycinu GUS+ prýtů na listový terčík GUS+ prýtů z celkového počtu prýtů
Počet Ve srovnání s BA + kanamycin % Ve srovnání s BA + kanamycin
BA 1 300 0,01 lx 4,3 lx
BA3GN* 15 300 0,1 lOx 47,1 llx
BA3GN* 15 100 0,2 20x 3,2 0,7x
BA3GN* 15 33 0,4 40x 4,7 l,lx
BA3GN* 15 0 0,3 30x 7,4 l,7x
BA3GN* + 15 0 0,02 2x 0,9 0,2x
SL(10mM)
Legenda:
* sodná sůl ** koncentrace v mg/1
Pokus s N6-benzyladeninem společně s kanamycinem, který představuje tradiční systém negativní selekce, byl prováděn ve dvou nezávislých opakováních, přičemž v každém opakování bylo použito 54 listových terčíků. V celkovém počtu 23 vybraných prýtů byl nalezen jediný GUS-pozitivní prýt. Výsledky pokusů používajících sodnou sůl BA3GN byly získány za použití 324 listových terčíků. Pokus se sacharo-l,4-laktonem byl prováděn jednou za použití celkového počtu 162 listových terčíků.
Výše uvedená tabulka ukazuje, že pomocí pozitivní selekce za použití 15 mg/1 sodné soli BA3GN (bez kanamycinu) bylo získáno třicetkrát více GUS-pozitivních prýtů na listový terčík ve srovnání s tradičním systémem negativní selekce za použití 1 mg/1 N6-benzyladeninu a 300 mg/1 kanamycin-sulfátu. Při použití pozitivní selekce bylo dále vyšší procento GUSpozitivních prýtů z celkového počtu prýtů (7,4 %) než při použití negativní selekce (4,3 %).
Výhodných výsledků bylo též dosaženo při použití kombinace pozitivní a negativní selekce, tj. při nahrazení cytokininu v tradičním systému negativní selekce, založeném na kanamycinu,
-49CZ 284828 B6 cytokinin-glukuronidem (sodnou solí BA3GN). Tak v případě, že bylo 15mg/l sodné soli BA3GN kombinováno s 300 mg/1 kanamycin-sulfátu, bylo procento získaných GUS-pozitivních piýtů jedenáctkrát vyšší než při použití N6-benzyladeninu a kanamycinu, a v případě, že bylo 15 mg/1 sodné soli BA3GN kombinováno s 33 mg/1 kanamycin-sulfátu, byl počet získaných GUS-pozitivních prýtů na listový terčík čtyřicetkrát vyšší než při použití N6-benzyladeninu a kanamycinu.
Při použití 15 mg/1 sodné soli BA3GN v kombinaci s inhibitorem GUS sacharo-l,4-laktonem (10 mM) byl ve srovnání s použitím samotné sodné soli BA3GN (15 mg/1) několikanásobně snížen jak počet GUS-pozitivních piýtů na listový terčík tak procento GUS-pozitivních prýtů. Tato skutečnost svědčí o tom, že zavedený gen GUS je odpovědný za výhodné výsledky získané při použití systému pozitivní selekce, jelikož přidání sacharo-l,4-laktonu do růstového média silně inhibuje v buňkách pěstovaných na tomto substrátu přeměnu neaktivního cytokininglukuronidu (sodné soli BA3GN) na aktivní cytokinin katalýzo vanou beta-glukuronidasou, což vede k pozorovanému snížení počtu indukovaných prýtů. Systém pozitivní selekce tedy funguje jak se předpokládalo, tj. tak, že se využije zavedená beta-glukuronidasa k rozštěpení cytokininglukuronidu v geneticky transformovaných buňkách, čímž se v těchto buňkách uvolní volný cytokinin, což vede k tvorbě prýtů.
Příklad 12
Modifikace systému pozitivní selekce pro zlepšení selekčního účinku cytokinin-glukuronidů
Bylo již uvedeno (viz Tabulka 3, Příklad 3), že beta-glukuronidasa přirozeně se vyskytující v rostlinách je neaktivní při relativně vysokých hodnotách pH, tj. při pH okolo 6 nebo více, zatímco zavedena beta-glukuronidasa je aktivní až do pH 8. Přidáním sloučeniny, která může zvýšit vnitřní pH buněk, například dusičnanu amonného, do růstového média, se může dále zlepšit selektivita tvorby prýtů z GUS-pozitivních buněk, jelikož se tím umožní blokovat jakoukoli beta-glukuronidasovou aktivitu projevující se jako pozadí, která je důsledkem přirozeně se vyskytující beta-glukuronidasy v netransformovaných buňkách.
Níže uvedená tabulka uvádí počet prýtů získaných z GUS-pozitivních a GUS-negativních listových terčíků tabáku za použití různých koncentrací sodné soli BA3GN a dusičnanu amonného. Byly použity stejné postupy jako jsou popsány v Příkladu 3, s tou výjimkou, že místo substrátu MSO byl použit substrát Gamborg B5.
Tabulka 13
Účinek dusičnanu amonného na selektivitu tvorby prýtů z listových terčíků ošetřených sodnou solí BA3GN(pH = 7)
-50CZ 284828 B6
Tvorba prýtů (počet prýtů a faktor selektivity*) z GUS+ a GUS- listových terčíků__________
7,5 mg/1 s;;;odné soli 15 mg/1 sodné soli 30 mg/1 sodné soli ______________BA3GN____________BA3GN___________BA3GN Koncentrace
dusičnanu amonného (mM) GUS+ GUS- faktor selektivity* GUS+ GUS- faktor selektivity* GUS+ GUS- faktor selektivity*
4 0 více než 4x 33 2 17x 73 36 2x
6 1 6x 50 7 7x 73 39 2x
♦5 0 0 - 20 6 3x 57 27 2x
55 14 0 více než 34 0 více než 37 11 3x
14x 34x
65 2 0 více než 2x 8 2 4x 25 45 lx
Průměr 26 1 26x 145 17 9x 265 158 2x
Legenda:
* Faktor selektivity je poměr počtu GUS-pozitivních prýtů a počtu GUS-negativních prýtů, a je tedy známkou selektivity daného ošetření
Je vidět, že použití sodné soli BA3GN a dusičnanu amonného ve vhodných koncentracích má za následek selektivní tvorbu prýtů z GUS-pozitivních listových terčíků. Například při kombinaci 15 mg/1 sodné soli BA3GN a 55 mM dusičnanu amonného bylo získáno z GUSpozitivních listových terčíků 34 prýtů, zatímco na odpovídajících GUS-negativních listových terčících podrobených stejnému ošetření se nevytvořily žádné prýty.
Další možností pro zlepšení selektivity systému pozitivní selekce za použití cytokininglukuronidů je přidání substrátu, který po rozštěpení beta-glukuronidasou způsobuje zvýšení pH, do růstového média, čímž se v netransformovaných buňkách inhibuje hydrolýza cytokininglukuronidů, aniž by byl inhibován účinek volných cytokininů.
Tento princip byl doložen pokusem zkoumajícím účinek různých koncentrací kyseliny okumaryl-beta-D-glukuronové (CouGN) na tvorbu prýtů z GUS-negativních listových terčíků tabáku za indukce pomocí sodné soli BA3GN nebo N6-benzyladeninu. Při štěpení kyseliny okumaryl-beta-D-glukopyranuronové působením beta-glukuronidasy je uvolňována kyselina okumarová. Jak je uvedeno výše (viz Příklad II), kyselina o-kumarová se spontánně přeměňuje na kumarin. Tento proces zahrnuje odstranění karboxylové skupiny (viz níže), čímž se zvyšuje pH na hodnotu, při které, jak se předpokládá, je snížena aktivita přirozené rostlinné betaglukuronidasy.
-51 CZ 284828 B6
Byl proveden pokus za použití N6-benzyladeninu (BA) v koncentraci 0,5 mg/1 a sodné soli BA3GN v koncentraci 10,0 mg/1. Pro každé ošetření bylo použito 12 terčíků, a počet prýtů byl zaznamenán po 19 dnech. Výsledky jsou uvedeny níže.
Tabulka 14
Účinek o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové kyseliny (CouGN) na tvorbu prýtů indukovanou N6—benzyladeninem (BA) nebo sodnou solí BA3GN
Koncentrace CouGN (mM) Počet regenerovaných prýtů Poměr relativních % pro BA a sodnou sůl BA3GN
BA relativně % sodná sůl BA3GN relativně %
0 71 100 77 100 1
0,0625 66 93 78 101 0,9
0,125 71 100 63 82 1,2
0,25 56 79 79 103 0,8
0,5 71 100 56 73 1,4
1,0 70 99 4 5 19,8
2,0 65 92 6 8 11,5
3,0 37 49 0 0 více než 49
4,0 36 47 0 0 více než 47
5,0 16 21 0 0 více než 21
6,0 12 16 0 0 více než 16
7,0 13 17 0 0 více než 17
Výše uvedená tabulka ukazuje, že přítomnost o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové kyseliny v růstovém médiu inhibuje regeneraci prýtů indukovanou pomocí sodné soli BA3GN, ale nikoli při indukci pomocí N6-benzyladeninu. Nej lepších výsledků bylo v tomto pokusu dosaženo při použití o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové kyseliny v koncentraci okolo 3-4 mM, Na omezení tvorby piýtů indukované pomocí BA3GN se může podílet několik mechanismů, včetně následujících: 1) zvýšení pHdíky uvolnění o-kumarové kyseliny, jak je vysvětleno výše, 2) substrátová kompetice mezi CouGN aBA3GN, mající za následek nižší frekvenci hydrolýzy BA3GN, a 3) snížený transport BA3GN do buněk. Ačkoli nebyl stanoven přesný mechanismus
-52CZ 284828 B6 způsobující pozorované omezení tvorby prýtů v přítomnosti CouGN, předpokládá se, že je za to pravděpodobně alespoň částečně odpovědné zvýšení pH. V každém případě tento pokus svědčí o tom, že selektivita systému pozitivní selekce může být zlepšena použitím zavedeného genu beta-glukuronidasy pro vytvoření samoregulačního mechanismu, který může podstatně snížit účinek libovolného enzymu projevujícího se jako pozadí.
Příklad 13
Příprava geneticky transformovaných rostlin
V tomto příkladu je uveden obecný způsob, který může být použit pro přípravu geneticky transformovaných rostlin.
Rostlinný materiál
Listy (Nicotiana tabacum Wisconsin 38) se získají z rostlin pěstovaných in vitro nebo in vivo.
V posledně uvedeném případě se listy před transformací sterilizují. Sterilizace může být prováděna umístěním listů na dobu 20 minut do roztoku 5 % chlornanu vápenatého obsahujícího 0,1 ml povrchově aktivního činidla Tween 80 na 1, a následným pětinásobným promytím ve sterilní vodě. Rostliny pěstované in vitro se pěstují v nádobách na substrátu 1/2 MSO (substrát 1/2 MSO je stejný substrát jako MSO v 50 % koncentraci s výjimkou agaru, cukru a vitaminů).
Listy se po jednom umístí do Petriho misek o průměru 14 cm. Poté se nařežou na části o ploše přibližně 1 cm2 neobsahující hlavní žilky tak, aby okraje částí byly tvořeny oříznutou tkání. Všechna řezaná tkáň, která byla odbarvena sterilizací pomocí chlornanu, se odstraní.
Kultivace bakterií
Jeden den před transformací se založí kultura bakterií přidáním 2 až 3 ml bakterií do 200 ml média LB v Erlenmeyerově baňce. Bakterie se pěstují při teplotě 28 °C za míchání (300 otáček za minutu).
Transformace
Kultura bakterií se bezprostředně před transformací naředí padesátkrát nebo na hodnotu OD 0,1 (při 660 nm) médiem 1/2 MSO. Přibližně 10 ml naředěné suspenze bakterií se nalije na Petriho misku o průměru 9 cm, a do této suspenze se ponoří přibližně na 15 minut části listů. Části listů se poté vyjmou a nadbytek suspenze bakterií se odstraní za použití sterilního filtračního papíru.
Kokultivace
Den před transformací se na kokultivační misky (typicky obsahující substrát MSO) umístí sterilní filtrační papír a části listů, které byly ponořeny do suspenze bakterií se umístí vrchní stranou dolů na filtrační papír. Listové části se inkubují v růstové komoře po dobu dvou dnů za světelného cyklu 12 hodin světla a 12 hodin tmy.
Selekce a regenerace
Listové části se přenesou na Petriho misky obsahující cytokinin-glukuronidy v uvedeném množství a buď 350 mg/l karbenicillinu + 350 mg/1 cefotaximu nebo pouze 800 mg/1 karbenicillinu, v některých případech v kombinaci s kanamycin-sulfátem. Listové části se po třech týdnech subkultivují na stejné médium, které však neobsahuje cytokinin-glukuronidy.
-53 CZ 284828 B6
Test
Regenerované prýty se přenesou do nádob obsahujících substrát 1/2 MSO. Přibližně po dvou týdnech se na zelených piýtech provede test X-gluc. Prýty se subkultivují jak je potřeba.
Výsadba
Geneticky transformované prýty, které vytvořily kořeny (a které jsou GUS-pozitivní) se vysází do růstové komory. Prýty se zasadí do vhodného růstového média, například rašeliníku. Poté se přikryjí umělohmotovými sáčky a pěstují se přibližně po dobu jednoho týdne, a poté se odstřihnou dva rohy umělohmotových sáčků. Po dalším týdnu se umělohmotové sáčky odstraní.
Příklad 14
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy za použití sterolů a di-beta-D-glukuronidu
Na GUS-pozitivních a GUS-negativních listových terčících tabáku byly prováděny podobné testy, jako jsou popsány v Příkladech 5 a 6, za použití substrátů obsahujících 100mg/l betasitosterolu, 100mg/l cholesterolu, 10mg/l kampesterolu, 1,88 mg/1 sodné soli BA3GN a různé koncentrace kyseliny di-beta-D-glukuronid-glycyrrhizové ve formě diamoniové soli. Kromě toho polovina substrátů obsahovala tridemorf (0,1 mM). Počet prýtů byl zjištěn po 17 dnech.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
Tabulka 15
Počet regenerovaných prýtů na listový terčík
Diamoniová sůl kyseliny glycyrrhizové Bez tridemorfu S tridemorfem (0,1 mM)
Koncentrace (mM) GUS+ GUS- GUS+ GUS
0,00125 1,6 0 0,4 0
0,0125 1,1 0 2,3 0
0,125 1,3 0,1 7,7 0,4
1,25 0 0 0 0
6,25 0 0 0 0
Je vidět, že kombinace sterolů a diamoniové soli kyseliny glycyrrhizové má za následek selektivní tvorbu prýtů v listových terčících obsahujících zavedený gen beta-glukuronidasy. (Jak je uvedeno výše (viz Příklad 5), tridemorf inhibuje syntézu sterolů a tudíž má inhibiční účinek na regeneraci prýtů, pokud nejsou rostlinné tkáni dodávány steroly). Ačkoli lze selektivní indukci tvorby prýtů pozorovat za použití substrátů jak obsahujících, tak neobsahujících tridemorf, získá se větší počet prýtů při použití substrátů obsahujících tridemorf, a zejména při koncentraci diamoniové soli kyseliny glycyrrhizové 0,125 mM.
Příklad 15
Selektivní inhibice tvorby prýtů z listových terčíků divokého typu tabáku (GUS-) indukované BA3GN.
-54CZ 284828 B6
Byly prováděny pokusy jak je popsáno v Příkladu 3 za použití odrůdy tabáku Burley místo odrůdy Wisconsin 38. Do substrátu byl přidáván v různých koncentracích methyl-beta-Dglukuronid (MG), kteiý je pomocí GUS hydrolyzován na methanol a kyselinu glukuronovou, a to společně buď s 1 mg/1 N6-benzyladeninu (BA) nebo s 15 mg/1 sodné soli BA3GN. Bylo zjištěno, že methanol inhibuje přirozený enzym GUS, aniž by příliš ovlivňoval zavedený gen získaný z Escherichia coli (Kosugi a kol., 1990, Plant Sci., 133 - 120), zatímco kyselina glukuronová, která se uvolňuje z methyl-beta-D-glukuronidu je produktem inhibujícím enzymy GUS. Pokud se místo nezávislého přidání těchto dvou sloučenin přidá methyl-beta-D-glukuronid, jsou produkty hydrolýzy vytvářeny lokálně a jsou koncentrovány v kompartmentu, kde je lokalizován enzym. Získané výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 16.
Tabulka 16
Sloučenina Koncentrace Prýtů na listový terčík Poměr
mg/1 BA BA3GN BA/BA3GN
Methyl-beta-glukuronid 0 1,00 0,50 2,0
1000 1,91 1,00 1,9
3300 2,25 0 -
Kyselina glukuronová 0 1,00 0,50 2,0
1000 0,33 0,08 4,1
3300 0,83 0 -
10000 0,42 0 -
Legenda k Tabulce 16: koncentrace BA je 1 mg/1 koncentrace BA3GN je 15 mg/1
Výše uvedené výsledky ukazují, že přidání buďto methyl-beta-D-glukuronidu nebo kyseliny glukuronové má za následek snížení počtu prýtů získaných na substrátu obsahujícím BA3GN ve srovnání s počtem prýtů získaných na substrátu obsahujícím N6-benzyladenin. Pomocí ošetření tkáně methyl-beta-D-glukuronidem před expresí zavedeného enzymu GUS může být tedy možné selektivně odstranit nebo snížit aktivitu či účinky přirozeného enzymu GUS během selekčního procesu. Za účinky methyl-beta-D-glukuronidu ajiných sloučenin, které mají podobný účinek na tkáně divokého typu ošetřené glukuronidy, mohou být též odpovědné rozdíly mezi zavedeným a přirozeným enzymem GUS týkající se inhibice pomocí substrátové kompetice, senzitivity vůči substrátové inhibici, množství (aktivity) enzymu, a senzitivity vůči inhibici produktem.
Je též možné, že methyl-beta-D-glukuronid působí pomocí kompetice s příjmem jiných glukuronidů, jako je BA3GN. Pokud tomu tak je, mohl by být methyl-beta-D-glukuronid použit pro snížení nebo eliminaci příjmu ostatních glukuronidů do buněk divokého typu. Zavedení genu kódujícího enzym GUS, kteiý je vylučován, nebo genu kódujícího glukuronid-permeasu, může být v případě, že je příjem inhibován například přidáním methyl-beta-D-glukuronidu do substrátu, použito pro selekci transgenických buněk. V případě glukuronid-permeasy budou přijímat glukuronid (například BA3GN) pouze transgenické buňky a díky obecné přítomnosti přirozeného enzymu v rostlinách (viz Příklad 3) bude sloučenina aktivována uvnitř buněk exprimujících permeasu (nebo jiný protein, který usnadňuje příjem glukuronidů).
Je též zajímavé, že samotná glukuronová kyselina je schopna selektivně inhibovat účinek BA3GN, pravděpodobně pomocí blokování účinku N6-benzyladeninu uvolňovaného štěpením BA3GN pomocí GUS.
-55 CZ 284828 B6
Příklad 16
Použití pozitivní selekce a kombinace pozitivní a negativní selekce pro zlepšení účinnosti selekce transgenických buněk, tkání nebo prýtů u rekalcitrantních druhů
Cukrová řepa je vzhledem k produkci transgenických rostlin velmi rekalcitrantním druhem.
V běžných transformačních systémech se za podmínek, které vyvolávají vznik transgenických prýtů, vybere mnoho netransformovaných prýtů. Totéž bylo zjištěno v případě provádění pokusů s pozitivní selekcí (bez přidání kanamycinu) za použití 5 až, 15 mg/1 sodné soli BA3GN za podmínek popsaných v následujícím textu.
V Příkladu 11 (viz Tabulka 12) bylo zjištěno, že kombinace pozitivní a negativní selekce redukuje počet vybraných netransformovaných prýtů. Kombinace pozitivní a negativní selekce byla proto testována na cukrové řepě, a bylo zjištěno, že poskytuje výhodné výsledky.
Transformace byla prováděna za použití děložních explantátů, jak je popsáno níže.
Semena se nechala klíčit po dobu 4 dnů v temnu na substrátu obsahujícím 0,7 g/1 agarosy a 2 g/1 sacharosy. Semenáčky byly poté přeneseny do nádoby (Nunc) obsahující substrát 1/2 x MSO a pěstovány po dobu 3 dnů na světle. Ze semenáčků byly odstraněny dělohy a děložní explantáty byly poté na řapíku odřeny malým kartáčkem obsahujícím suspenzi Agrobacteria, které obsahovalo 35S—NPTII a35S-GUS (OD 660 = 0,1). Dělohy byly poté kokultivovány po dobu 4 dnů na substrátu obsahujícím substrát 1/10 MSO a 200 μΜ acetosyringonu. Transformované explantáty byly přeneseny na substrát MSO doplněný 0,25 mg/1 BA nebo 15 mg/1 sodné soli BA3GN (místo BAP), 0,025 mg/1 kyseliny naftyloctové, 400 mg/1 kanamycinu, 800 mg/1 karbenicillinu a 25 mg/ml vancomycinu, a explantáty byly na tomto substrátu inkubovány po dobu 21 dnů. Regenerované prýty byly poté přeneseny do nádob obsahujících stejný substrát. Po 52 dnech na tomto substrátu byly všechny prýty přeneseny na substrát MSO doplněný 800 mg/1 karbenicillinu, 25 mg/1 vancomycinu a 0,1 mg/1 N6-benzyIadeninu. Po 14 dnech byly na vyselekto váném rostlinném materiálu provedeny testy GUS, jak je popsáno v Příkladu 3.
Výsledky jsou uvedeny níže v tabulce.
Tabulka 17
Transformace cukrové řepy
Kombinace pozitivní a negativní selekce
Počet explantátů GUS+ prýty % GUS+ piýtů
Pozitivní a negativní selekce 177 4 2,3 %
Negativní selekce 100 0 0%
Legenda k Tabulce 17:
Negativní selekce: 400 mg/1 kanamycin-sulfátu + 1 mg/1 BAP
Pozitivní a negativní selekce: 400 mg/1 kanamycin-sulfátu + 15 mg/1 BA3GN
Je vidět, že při kombinaci pozitivní a negativní selekce jsou vytvářeny transgenické prýty za podmínek, za kterých při použití tradičního systému negativní selekce žádné transgenické prýty vytvářeny nejsou, což svědčí o tom, že použití systému pozitivní selekce je u cukrové řepy velmi výhodné ve srovnání s použitím samotných systémů negativní selekce.
-56CZ 284828 B6
Tato skutečnost dále znamená, že použití pozitivní selekce (samotné v kombinaci s negativní selekcí) může umožnit vytváření transgenických rostlin u ostatních rekalcitrantních druhů, u kterých je dosahováno pouze nízkých transformačních a selekčních frekvencí, nebo u kterých není za použití systémů negativní selekce vůbec možno vyselektovat transgenické rostliny.
Příklad 17
Systémy pozitivní selekce založené na použití neaktivních zdrojů dusíku, které jsou učiněny dostupnými pomocí zavedení metabolizujících genů
Byly prováděny pokusy, jak jsou popsány v Příkladu 3, s tím, že normální obsah dusíku substrátu MSO byl snížen na nulu. Místo toho byly přidány dusíkaté sloučeniny uvedené v Tabulce 18. Substrát obsahoval 1 mg/1 N6-benzyladeninu. Jako pozitivních kontrol bylo použito substrátů obsahujících dusičnan amonný.
Tyto pokusy byly prováděny kvůli zjištění, zda jsou opiny neaktivní, nebo zda mohou být rostlinnými buňkami využity jako zdroje dusíku na substrátech neobsahujících žádný další zdroj dusíku. Jelikož jsou geny kódující enzymy, které metabolizují opiny, dobře známé, je hlavním předpokladem pro použití opinů v systému pozitivní selekce identifikace opinů, které nemohou být použity jako zdroje dusíku pro rostlinné tkáně a buňky, které neobsahují zavedené geny umožňující rostlinným buňkám využít dané opiny. Výsledky jsou uvedeny níže.
Tabulka 18
Účinek opinů na tvorbu prýtů z listových terčíků tabáku na substrátech bez dusíku (počet prýtů na 9 listových terčíků)
Sloučenina Koncentrace (mM)
0 10 20 40 80
Octopin 13 11 15 15 6
Mannopin 13 >50 >50 >50 >50
Nopalin 13 18 19 11 8
Dusičnan amonný (kontrola) 13 >50 >50 >50 >50
Na testovaných substrátech neobsahujících žádný dusík bylo regenerováno několik prýtů, což je možné, protože dusík může být mobilizován z tkáně explantátu. Úplně se vyhnout tvorbě prýtů v pokusech s nulovým obsahem dusíku je možné, pokud se explantáty nechají trpět nedostatkem dusíku pomocí pěstování rodičovských kultur před použitím na substrátech bez dusíku, nebo pokud se explantáty předběžně ošetří na substrátu bez dusíku, například bez hormonů indukujících tvorbu prýtů.
Překvapivě bylo zjištěno, že octopin a nopalin nemohou podporovat tvorbu prýtů, zatímco mannopin může sloužit jako dobrý zdroj dusíku a podporovat tvorbu prýtů z listových terčíků.
Je pravděpodobné, že důvodem, proč nopalin a octopin nemohou sloužit jako zdroje dusíku je, že tyto sloučeniny nejsou přijímány, metabolizovány nebo hydro lyžovány na využitelné sloučeniny. Je dobře známo, že organismy obsahující geny podílející se na transportu a metabolismu opinů, například Agrobacterium, jsou schopné využít opinů jako zdroje dusíku, zatímco kmeny Agrobacteria nebo jiných bakterií neobsahující geny kódující metabolismus opinů nejsou schopny růstu na substrátech obsahujících jako zdroj dusíku pouze opiny.
-57CZ 284828 B6
Na základě těchto výsledků mohou být systémy pozitivní selekce vytvořeny pomocí zavedení jednoho nebo více genů metabolismu nebo transportu opinů do transgenických rostlinných buněk za použití selekčních substrátů, které neobsahují nebo mají snížený obsah jiných zdrojů dusíku než je například nopalin nebo octopin. Identifikace nebo izolace genů či genetického materiálu poskytujícího příjemci schopnost využít octopin a nopalin je popsána v literatuře: viz například C. Beaulieu a kol., 1988, Can. J. Microbiol., 38: 843 -49, P. M. Klapwijk a kol., 1976, J. Gen. Microbiol., 96: 155 - 163; C. L. Schardl a C. I. Kado, 1983, Mol. Gen. Genet., 191: 10 - 16; nebo H. Wabiko a kol., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97- 103. Po izolaci genetického materiálu kódujícího metabolismus opinů mohou být transformovány eukaryotické organismy pomocí standardních postupů popsaných v literatuře za použití vhodných sekvencí nutných pro fungování genů pro metabolismus opinů.
Na základě výše uvedených výsledků je pravděpodobné, že podobným způsobem mohou být použity další opiny a odpovídající katabolizující geny, a dále se zdá pravděpodobné, že mohou být podobně použity další neaktivní zdroje dusíku identifikované podobným způsobem a jim odpovídající geny, například amidy v kombinaci samidasami, peptidy v kombinaci se specifickými peptidasami, atd.
Příklad 18
Tvorba transgenického kalusu z rekalcitrantních druhů za použití pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí
S určitými modifikacemi byly prováděny pokusy, jak jsou popsány v Příkladu 11. Použitými rostlinnými druhy byly velmi rekalcitrantní linie V486 ozimé řepky olejky a S487 jarní řepky olejky. Semena byla sterilizována a nechána klíčit jak je popsáno v Příkladu 16. Jako explantátů bylo použito hypokotylů, které byly inokulovány a kokultivovány jak je popsáno v Příkladu 11. Po kokultivaci byly explantáty přeneseny na substrát MSO obsahující 0,1 mg/1 kyseliny nafiyloctové, 0,01 mg/1 kyseliny gibberellové (GA3), 500 mg/1 karbenicillinu, 50 mg/1 kanamycin-sulfátu a 6,0 g/1 agarosy. Substrát kromě toho obsahoval buď 1 mg/1 N6benzyladeninu nebo 3,75, 7,5 či 15,0 mg/1 sodné soli BA3GN. pH bylo upraveno na hodnotu 5,8. Použité Agrobacterium obsahovalo ve své T-DNA gen GUS a gen neomycinfosfotransferasy 11 řízené promotory 35S. Testy GUS byly provedeny po 8 týdnech a kalus, který vykazoval intenzivní modré zbarvení ve většině kalusových buněk, byl shledán GUS+.
Tabulka 19
Tvorba transgenického kalusu z řepky olejky za použití pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí
Řepka olejka, ozimý typ V486
3,75 BA3GN (mg/1) 7,5 15 BA (mg/1) 1
Explantátů s kalusem 19,0 % 23,0 % 30,6 % 0%
GUS+ kalusů na explantát 1,4% 1,4 % 2,3 % 0%
GUS+ kalusů na kalus 7,1 % 5,9 % 7,5 % 0%
-58CZ 284828 B6
Řepka olejka, jarní typ S487
3,75 BA3GN (mg/1) 7,5 15 BA (mg/1) 1
Explantátů s kalusem 5,2 % 9,2 % 6,3 % 0%
GUS+ kalusů na explantát 1,7% 2,3 % 0,9 % 0%
GUS+ kalusů na kalus 33,3 % 25,0 % 14,2 % 0%
Tyto pokusy ukazují, že v případě těchto velmi rekalcitrantních typů řepky olejky pouze pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí umožňuje selekci transgenického kalusu, jelikož za použití tradiční negativní selekce (substráty s N4 * 6-benzyladeninem místo sodné soli BA3GN) nebyl získán žádný GUS-pozitivní kalus.
Tato skutečnost svědčí o tom, že zavedení systémů pozitivní selekce je též v kalusových systémech velmi výhodné ve srovnání se samotnými systémy negativní selekce. Svědčí též o tom, že použití pozitivní selekce (samotné nebo v kombinaci s negativní selekcí) může umožňovat -vytvoření transgenických rostlin u dalších rekalcitrantních druhů, u kterých je dosahováno pouze nízkých transformačních a selekčních frekvencí, nebo u kterých není za použití systémů negativní selekce vůbec možno vyselektovat transgenické rostliny.
Poté co byl transgenický kalus vybrán, může být regenerován do transgenických prýtů, například na substrátu obsahujícím cytokinin v kombinaci s nízkou koncentrací auxinů. Během tohoto procesu není nutná žádná selekce.

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Způsob selekce geneticky transformovaných rostlinných buněk z populace buněk, vyznačující se tím, že se do rostlinných buněk při transformaci introdukuje společně s požadovanou nukleotidovou sekvencí další nukleotidová sekvence, dále označovaná jako kointrodukovaná nukleotidová sekvence, kterážto kointrodukovaná nukleotidová sekvence vyvolává nebo zvyšuje pozitivní účinek vybrané živiny či sloučeniny dodávané populaci buněk vzniklé transformací, která obsahuje transformované a netransformované buňky, a poskytuje tak transformovaným buňkám pozitivní výhodu proti netransformovaným buňkám, a takto transformované buňky se identifikují a izolují od netransformovaných buněk.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučeninou nebo živinou dodávanou buňkám je inaktivovaný cytokinin, auxin nebo giberelin, vitamin, glycid, opin, protein, sterol nebo saponin.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence exprimuje nepřirozenou beta-glukuronidasu.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že sloučeninou nebo živinou dodávanou buňkám je cytokinin-glukuronid, který je v transformovaných buňkách štěpen betaglukuronidasou, čímž se uvolňuje volný cytokinin a v transformovaných buňkách dochází k indukci tvorby prýtů.
-59CZ 284828 B6
5. Způsob podle nároku3, vyznačující se tím, že dodávanou sloučeninou nebo živinou je inhibitor beta-glukuronidasy, který inhibuje přirozenou beta-glukuronidasovou aktivitu více než aktivitu kointrodukované nukleotidové sekvence kódující beta-glukuronidasu.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence exprimuje beta-glukuronidasu, přičemž jakákoli přirozená beta-glukuronidasová aktivita se sníží přidáním glukuronidu který může být hydrolyzován přirozenou betaglukuronidasou a který po hydrolýze způsobuje zvýšení pH, do kultivačního média.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se populace buněk kultivuje na nebo v médiu obsahujícím alespoň jednu sloučeninu nebo živinu která je zpřístupněná transformovaným buňkám transkripcí požadované nukleotidové sekvence, přičemž tato sloučenina nebo živina není dostupná nebo je méně dostupná pro netransformované buňky než pro transformované buňky.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence exprimuje permeasu.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje identifikační a izolační funkci.
10. Způsob podle nároku2, vyznačující se tím, že uvedenou sloučeninou nebo živinou je opin, který nefunguje nebo pouze nedostatečně funguje jako zdroj dusíku pro netransformované buňky, a kointrodukovaná nukleotidová sekvence obsahuje gen pro metabolismus nebo transport opinů, který po expresi umožňuje fungování opinu jako zdroje aminokyselin, dusíku nebo/a glycidů v transformovaných buňkách.
11. Způsob podle libovolného z nároků laž3, vyznačující se tím, že exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence způsobuje zvýšení aktivity enzymu, který se nachází endogenně v populaci buněk, takže je aktivita enzymu v transformovaných buňkách větší než aktivita enzymu v netransformovaných buňkách, nebo že exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence způsobuje blokování metabolismu sloučeniny dodávané populaci buněk nebo blokování syntézy sloučeniny v transformovaných buňkách.
12. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že přirozená beta-glukuronidasová aktivita se sníží dodáním sloučeniny regulující pH do kultivačního média, kterážto sloučenina regulující pH upravuje pH kultivačního média, buněk nebo částí buněk na hodnotu mezi 5,5 a 8,5.
13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence exprimuje beta-glukuronidasu, přičemž přirozená beta-glukuronidasová aktivita se sníží nebo odstraní ošetřením teplem za použití teploty v rozmezí 50 až 65 °C formou krátkých tepelných impulzů před přenesením na selekční substrát nebo/a použitím teploty v rozmezí 30 až 45 °C během selekce.
14. Způsob podle nároku2, vyznačující se tím, že uvedenou sloučeninou nebo živinou je manosa a kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje manosa-6-fosfátisomerasu, nebo je uvedenou sloučeninou nebo živinou galaktosa nebo sloučenina obsahující galaktosu a kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje UDP-galaktosa-4-epimerasu.
15. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že inhibitorem beta-glukuronidasy je buďto beta-glukuronid nebo produkt hydrolýzy vytvořený hydrolýzou sloučeniny nebo živiny
-60CZ 284828 B6 dodávané buňkám, přičemž uvedený beta-glukuronid nebo produkt hydrolýzy inhibuje aktivitu přirozené beta-glukuronidasy více než aktivitu kointrodukované nukleotidové sekvence kódující beta-glukuronidasu.
5 16. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence exprimuje glukuronid-permeasu.
CZ94444A 1991-08-28 1992-08-27 Způsob selekce geneticky transformovaných buněk a sloučeniny pro použití v tomto způsobu CZ284828B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK911522A DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
PCT/DK1992/000252 WO1993005163A1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ44494A3 CZ44494A3 (en) 1994-06-15
CZ284828B6 true CZ284828B6 (cs) 1999-03-17

Family

ID=8105710

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ94444A CZ284828B6 (cs) 1991-08-28 1992-08-27 Způsob selekce geneticky transformovaných buněk a sloučeniny pro použití v tomto způsobu
CZ19973624A CZ292882B6 (cs) 1991-08-28 1997-11-14 Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19973624A CZ292882B6 (cs) 1991-08-28 1997-11-14 Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují

Country Status (16)

Country Link
EP (3) EP0601092B2 (cs)
JP (1) JPH06511146A (cs)
AT (2) ATE181963T1 (cs)
AU (1) AU664200B2 (cs)
CA (1) CA2110401C (cs)
CY (1) CY2217B1 (cs)
CZ (2) CZ284828B6 (cs)
DE (2) DE69233771D1 (cs)
DK (2) DK152291D0 (cs)
ES (1) ES2135415T5 (cs)
GR (1) GR3031279T3 (cs)
HU (1) HU227979B1 (cs)
NZ (1) NZ244135A (cs)
RU (1) RU2126834C1 (cs)
SK (1) SK280639B6 (cs)
WO (1) WO1993005163A1 (cs)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9304200D0 (en) † 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) * 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
DE4305295B4 (de) * 1992-03-04 2006-05-18 Volkswagen Ag Kraftfahrzeug mit einem Sitz, der zumindest eine zwischen einer Ruhestellung und einer Betriebsstellung bewegbare Seitenwange besitzt
US5608147A (en) * 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
CN1155713C (zh) * 1995-04-06 2004-06-30 塞迷尼思蔬菜种子公司 选择转基因植物细胞的方法
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
ATE226255T1 (de) * 1997-07-07 2002-11-15 Pioneer Hi Bred Int Fumonisinentgiftungszusammensetzungen und verfahren
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
US7026526B2 (en) 2000-02-11 2006-04-11 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
ATE373098T1 (de) 2000-04-21 2007-09-15 Martek Biosciences Corp Trophische umwandlung von obligat phototropischen algen durch metabolische manipulation
WO2001096383A2 (en) 2000-06-16 2001-12-20 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
EP1334181B1 (en) 2000-11-17 2010-03-17 Metabolix, Inc. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
WO2002081696A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Syngenta Participations Ag Oryza sativa nuclear cap binding protein 80
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
EP1527183B1 (de) 2002-07-26 2008-08-20 BASF Plant Science GmbH Neue selektionsverfahren
US20060253917A1 (en) 2002-12-26 2006-11-09 Bret Cooper Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
CN101001951B (zh) 2004-08-02 2011-06-15 巴斯福植物科学有限公司 分离转录终止序列的方法
EP2163632A1 (en) 2004-10-05 2010-03-17 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP2072620B1 (en) 2004-12-08 2013-05-08 SunGene GmbH Expression casstettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
WO2006084868A2 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
ATE541043T1 (de) 2005-03-08 2012-01-15 Basf Plant Science Gmbh Expressionsverstärkende intron-sequenz
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
WO2006111512A1 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Basf Plant Science Gmbh Improved methods controlling gene expression
US8034994B2 (en) 2005-04-19 2011-10-11 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US7994399B2 (en) 2005-06-23 2011-08-09 Basf Plant Science Gmbh Methods for the production of stably transformed, fertile Zea mays plants
CN101268194A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 巴斯福植物科学有限公司 使用ta-siRNA调控基因表达的方法
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
AU2010270309A1 (en) 2009-07-10 2012-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
EP2275564A1 (en) 2009-07-17 2011-01-19 Freie Universität Berlin Means and method for the production of transgenic plants that are resistant to clubroot
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
CA2781835A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
BR112012012747A2 (pt) 2009-11-27 2015-09-29 Basf Plant Science Co Gmbh "endonuclease quimérica, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, vetor célula hospedeira ou organismo não humano, método para fornecer a endonuclease quimérica, método para a recombinação homóloga dos polinucleotídeos e método para mutação direcionada de polinucleotídeos"
CA2782014C (en) 2009-11-27 2021-08-31 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
CN102782141A (zh) 2009-12-03 2012-11-14 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚-特异性表达的表达盒
US9598473B2 (en) 2011-06-10 2017-03-21 Keygene N.V. Trichome-specific transcription factor modulating terpene biosynthesis
WO2013014585A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Basf Plant Science Company Gmbh Plant transformation method
EP2768952A2 (en) 2011-10-19 2014-08-27 Keygene N.V. Methods for producing cinnamolide and/or drimendiol
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
CA2881787A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
CN104531656B (zh) * 2015-01-05 2018-02-09 安徽省农业科学院水稻研究所 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
US20190338302A1 (en) 2016-02-04 2019-11-07 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
WO2018156686A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
CA3111368A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield rna
CN114829612A (zh) 2019-12-16 2022-07-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用配对切口酶的改进的基因组编辑
CA3161725A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Timothy James Golds Precise introduction of dna or mutations into the genome of wheat
AU2021267373A1 (en) 2020-05-06 2022-12-08 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as JAK2 inhibitors
AU2022388555A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ajax Therapeutics, Inc. 6-he tero aryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
GB8725402D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Jefferson R A Gene fusion
GB8626862D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Jefferson R A Gene fusion
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase

Also Published As

Publication number Publication date
ATE443771T1 (de) 2009-10-15
DE69229556T3 (de) 2007-09-20
CA2110401C (en) 2006-02-21
JPH06511146A (ja) 1994-12-15
EP0601092A1 (en) 1994-06-15
EP0896063B1 (en) 2009-09-23
DK152291D0 (da) 1991-08-28
EP0601092B2 (en) 2006-11-15
EP0601092B1 (en) 1999-07-07
CZ292882B6 (cs) 2003-12-17
SK280639B6 (sk) 2000-05-16
SK22294A3 (en) 1994-07-06
WO1993005163A1 (en) 1993-03-18
HUT69606A (en) 1995-09-28
CY2217B1 (en) 2003-04-18
CZ44494A3 (en) 1994-06-15
EP0896063B9 (en) 2010-05-26
DK0601092T4 (da) 2007-02-26
DE69229556T2 (de) 1999-11-11
NZ244135A (en) 1995-04-27
HU227979B1 (en) 2012-07-30
DK0601092T3 (da) 2000-02-07
HU9400570D0 (en) 1994-05-30
GR3031279T3 (en) 1999-12-31
EP0896063A2 (en) 1999-02-10
DE69233771D1 (de) 2009-11-05
EP0896063A3 (en) 2000-02-09
CA2110401A1 (en) 1993-03-18
ES2135415T3 (es) 1999-11-01
RU2126834C1 (ru) 1999-02-27
ES2135415T5 (es) 2007-06-01
DE69229556D1 (de) 1999-08-12
ATE181963T1 (de) 1999-07-15
AU664200B2 (en) 1995-11-09
EP0530129A1 (en) 1993-03-03
AU2556792A (en) 1993-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0601092B1 (en) Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method
US5994629A (en) Positive selection
Fontana et al. Genetic transformation in the grain legume Cicer arietinum L.(chickpea)
JP3698722B2 (ja) マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択
Chowdhury et al. Stably transformed herbicide resistant callus of sugarcane via microprojectile bombardment of cell suspension cultures and electroporation of protoplasts
JPH11511116A (ja) 新規な植物ホルモンである５−ブロモインドール−３−酢酸を用いる植物組織およびトランスジェニック植物組織の両方の再生
WO2007079538A1 (en) Method of producing transgenic graminaceous cells and plants
Al-Shafeay et al. Establishment of regeneration and transformation system in Egyptian sesame (Sesamum indicum L.) cv Sohag 1
DE4013099A1 (de) Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
US6815205B2 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
BRPI0202855B1 (pt) método de transformação de células de planta de palma oleaginosa com material genético, e método de produção de planta de palma oleaginosa geneticamente modificada
DE602004010682T2 (de) Verfahren zur entgiftung von mykotoxinen
WO1997020034A9 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
WO1997020034A1 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
Oliveira et al. Genetic transformation in Actinidia deliciosa (Kiwifruit)
Lim et al. Agrobacterium mediated transformation of Rehmannia glutinosa L. with glutathione S-transferase gene (Gh-5)
Australia GENETIC TRANSFORMATION OF WHEAT
JP2000501395A (ja) インドール―３―酢酸のオーキシンアナログ

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20120827