CZ292882B6 - Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují - Google Patents

Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují Download PDF

Info

Publication number
CZ292882B6
CZ292882B6 CZ19973624A CZ362497A CZ292882B6 CZ 292882 B6 CZ292882 B6 CZ 292882B6 CZ 19973624 A CZ19973624 A CZ 19973624A CZ 362497 A CZ362497 A CZ 362497A CZ 292882 B6 CZ292882 B6 CZ 292882B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
beta
gus
gene
glucuronidase
Prior art date
Application number
CZ19973624A
Other languages
English (en)
Inventor
Finn T. Okkels
Robert J. Whenham
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8105710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ292882(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of CZ292882B6 publication Critical patent/CZ292882B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)

Abstract

Řešení poskytuje geneticky transformované rostlinné buňky, které obsahují kromě požadované nenativní nukleotidové sekvence další nenativní sekvenci, která slouží jako reportérový a selekční gen, a označuje se jako kointrodukovaná sekvence, přičemž produkt exprese kointrodukované nukleotidové sekvence vyvolává nebo zvyšuje pozitivní účinek vybrané živiny nebo sloučeniny dodávané populaci buněk, a tím poskytuje transformovaným buňkám pozitivní výhodu ve srovnání s netransformovanými buňkami, takže geneticky transformované buňky mohou být selektovány z populace rostlinných buněk, přičemž sloučenina není antibiotikum, toxin ani herbicid. Dále poskytuje geneticky transfomované rostliny, které tyto rostlinné buňky obsahují, a dále také potomstvo uvedených rostlin a semena z takových rostlin získaná.ŕ

Description

Vynález se týká geneticky transformovaných rostlinných buněk a geneticky transformovaných rostlin, které tyto buňky obsahují. Selekci těchto buněk lze provádět pomocí pozitivní selekce, při které se transformovaným buňkám poskytne selekční výhoda aniž se poškodí netransformované buňky.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že při zavádění nového genetického materiálu do populace buněk pomocí transformace se transformuje úspěšně pouze určitý počet buněk, tj. pouze tento určitý počet buněk obdrží nový genetický materiál. Poté je nutné identifikovat geneticky transformované buňky, aby mohly být v populaci tyto buňky odděleny od netransformovaných buněk. Identifikace a separace transformovaných buněk se tradičně provádí za použití způsobu, který lze nazvat „negativní selekce“, jinými slovy za použití způsobu, kdy jsou transformované buňky schopny přežít a růst, zatímco u netransformovaných buněk dochází k inhibici růstu nebo přímo usmrcení látkou, kterou jsou transformované buňky schopny tolerovat.
Například pokud je genetické transformaci podrobena populace rostlinných buněk, probíhá selekce transformovaných buněk typicky za použití selekčního genu, který kóduje rezistenci vůči antibiotiku nebo herbicidu. Selekční gen - který sám o sobě obecně nemá užitečnou funkci v geneticky transformované rostlině, a může být ve skutečnosti v rostlině nežádoucí - je spojen nebo kointrodukován s genem, který má být včleněn do dané rostliny, tak, že jsou oba geny včleněny do populace buněk, nebo spíše do některých buněk v populaci, protože v praxi není možné transformovat všechny nebo i jen většinu buněk. Buňky jsou poté kultivovány na nebo v médiu obsahujícím antibiotikum nebo herbicid, vůči kterému jsou geneticky transformované buňky díky selekčnímu genu rezistentní, což umožňuje identifikaci transformovaných buněk, jelikož u netransformovaných buněk - které neobsahují daný gen rezistence vůči antibiotiku nebo herbicidu - dochází k inhibici růstu nebo usmrcení.
Tyto způsoby negativní selekce mají však určité nevýhody. Za prvé, netransformované buňky mohou odumřít kvůli přítomnosti například antibiotik v růstovém médiu. To má za následek nesporné riziko, že mohou, v případě že je populací buněk koherentní tkáň, odumřít nejen netransformované buňky, ale též transformované buňky, díky skutečnosti, že smrt netransformovaných buněk může zamezit zásobování transformovaných buněk může zamezit zásobování transformovaných buněk živinami, nebo proto, že poškozené nebo odumírající netransformované buňky mohou vylučovat toxické látky.
Další podstatnou nevýhodou negativní selekce je, že může být nežádoucí přítomnost nadbytečného genu pro rezistenci například vůči antibiotiku. V organizacích pro ochranu přírody a vládních úřadech se například diskutuje o tom, zdaje bezpečné zavádění genů kódujících rezistenci vůči antibiotikům do rostlin a mikroorganizmů. Toto hledisko je významné zejména u potravinářských plodin a u mikroorganizmů, které nejsou vytvářeny pro použití v uzavřeném prostředí (například mikroorganizmů pro použití v zemědělství), stejně jako u mikroorganizmů, které jsou vytvářeny pro použití v uzavřeném prostředí, ale mohou být z uzavřeného prostředí náhodně uvolněny. I když se tyto obavy mohou ukázat jako neopodstatněné, mohou přesto vést k vládním omezením u rostlin, a je proto žádoucí vyvinout nové způsoby selekce geneticky transformovaných buněk, které nejsou závislé na těchto genech.
Další nevýhodou negativní selekce je, že se rostlinné tkáně nebo buňky ošetřené toxickými látkami stávají citlivějšími vůči bakteriální infekci. To je problém při použití Agrobacteria jako
-1 CZ 292882 B6 transformačního vektoru, protože jsou ošetřené tkáně nebo buňky někdy přerůstány bakteriemi, ačkoli jsou pro zabránění růstu bakterií použita antibiotika.
Kromě toho vyžaduje selekce buněk nebo tkání za použití negativní selekce velmi přesné načasování exprese introdukovaných genů ve vztahu k selekčnímu postupu. Pokud jsou transgenické buňky ošetřeny toxickou látkou dříve než je exprimován detoxifikační gen nebo než se vytvoří dostatečné množství produktu genu pro potlačení účinku toxické látky, dochází k usmrcení transgenických buněk společně s netransgenickými buňkami. Pokud se selekce provede společně s netransgenickými buňkami. Pokud se selekce provede příliš pozdě, může selekci transgenických buněk nebo tkání bránit například tvorba prýtů z netransgenických buněk nebo tkání.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou geneticky transformované rostlinné buňky, které obsahují kromě požadované nukleotidové sekvence exogenní pro uvedenou rostlinnou buňku další exogenní nukleotidovou sekvenci (zde dále označovanou jako kointrodukovaná nukleotidová sekvence), produkt jejíž exprese je schopen metabolizovat sloučeninu nebo živinu dodávanou uvedené rostlinné buňce, takže je transformovaným buňkám poskytnuta fyziologická výhoda ve srovnání s netransformovanými buňkami, přičemž uvedenou sloučeninou není antibiotikum, toxin nebo herbicid. Uvedená sloučenina je výhodně vybrána ze skupiny zahrnující cytokininy, auxiny, gibereliny, vitaminy, glycidy, opiny, proteiny, steroly a saponiny.
Požadovaný exogenní DNA-fragment výhodně nekóduje rezistenci vůči toxinu, antibiotiku nebo herbicidu.
Kointrodukovaná nukleotidová sekvence výhodně kóduje manóza-6-fosfát-izomeru, UDPgalaktóza-4-epimerasu, permeasu nebo obsahuje gen pro metabolizmus nebo transport opinů.
Transformované buňky mohou obsahovat další introdukovanou sekvenci.
Kointrodukovaná nukleotidová sekvence výhodně kóduje nepřirozenou (nenativní) beta-glukoronidasu, nebo kointrodukovaná nukleotidová sekvence výhodně obsahuje gen pro metabolizmus nebo transport opinů, který po expresi umožňuje, že opin působí v transformovaných buňkách jako zdroj aminokyselin(y), dusíku nebo/a glycidů.
Podle dalšího výhodného provedení vede exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence ke zvýšení aktivity enzymu, který se endogenně nachází v populaci buněk, takže aktivita tohoto enzymu v transformovaných buňkách je vyšší než aktivita tohoto enzymu v netransformovaných buňkách, nebo má exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence za následek blokování metabolizmu sloučeniny dodávané populaci buněk nebo blokování syntézy určité sloučeniny v transformovaných buňkách.
Dále se vynález týká geneticky transformovaných rostlin obsahujících transformované rostliny buňky podle vynálezu, včetně jejich potomstva a semen.
Selekci transformovaných rostlinných buněk podle vynálezu lze provádět způsobem eliminujícím nevýhody selekčních způsobů popsaných v dosavadním stavu techniky (označeným „pozitivní selekce“), kteiý poprvé umožňuje identifikovat a izolovat geneticky transformované buňky bez poškození nebo usmrcení netransformovaných buněk v populaci a bez kointrodukce genů rezistence vůči antibiotikům či herbicidům. Kromě toho, že je eliminována potřeba genů rezistence vůči antibiotikům nebo herbicidům, ukázalo se, že jsou způsoby pozitivní selekce často mnohem účinnější než tradiční negativní selekce. Jak je popsáno níže v příkladech provedení vynálezu, je počet transgenických prýtů získaných z listových terčíků tabáku za použití pozitivní selekce asi třicetkrát vyšší než počet prýtů získaných za použití tradičního negativního selekčního
-2CZ 292882 B6 systému založeného na kanamycinu, a při kombinaci pozitivní a negativní selekce činidla selekční frekvence transgenických prýtů asi desetinásobek ve srovnání s použitím pouze negativní selekce (viz příklad 10). Dále poskytuje použití pozitivní selekce tu výhodu, že může být jako reportérový gen a selekční gen použit jediný gen, což má za následek zjednodušení konstrukce vektorů, větší stabilitu konstruktu a stoprocentní korelaci mezi expresí reportérového a selekčního genu. Pozitivní selekce též eliminuje výše uvedené problémy týkající se načasování, jelikož jsou sloučeniny, které mají za následek selekci, vždy produkovány jako důsledek exprese genu. Selekční sloučenina se tedy akumuluje pokud je exprimován selekční gen, a selekční účinek se projevuje když se vytvoří dostatečné množství selekční sloučeniny.
Tímto způsobem lze provádět selekci geneticky transformovaných buněk, do kterých byla introdukována požadovaná nukleotidová sekvence, z populace buněk, při kterém požadovaná nukleotidová sekvence nebo kointrodukovaná nukleotidová sekvence v transformovaných buňkách vyvolává nebo zvyšuje pozitivní účinek sloučeniny či živiny dodávané populaci buněk, a tím umožňuje identifikaci nebo selekci transformovaných buněk z netransformovaných buněk.
Tento způsob lze provádět kultivací populace buněk na médiu nebo v médiu obsahujících alespoň jednu neaktivní sloučeninu nebo živinu, která je přímo či nepřímo aktivována v buňkách obsahujících kointrodukovanou nukleotidovou sekvenci nebo požadovanou nukleotidovou sekvenci, přičemž je tato sloučenina či živina neaktivní v netransformovaných buňkách nebo méně aktivní v netransformovaných buňkách než v transformovaných buňkách, takže je transformovaným buňkám poskytována selekční výhoda, která umožňuje jejich selekci z populace buněk.
Tento způsob lze rovněž provádět kultivací populace buněk na médiu nebo v médiu obsahujícím alespoň jednu sloučeninu nebo živinu, která je dostupná pro transformované buňky díky expresi nebo transkripci kointrodukované nukleotidová sekvenci či požadované nukleotidové sekvence, přičemž tato sloučenina nebo živina není dostupná pro netransformované buňky nebo je pro netransformované buňky méně dostupná než pro transformované buňky, takže je transformovaným buňkám poskytována selekční výhoda, která umožňuje jejich selekci z populace buněk.
Exprese kointrodukované nukleotidové sekvence může rovněž vést ke zvýšení aktivity enzymu, který se nachází endogenně v populaci buněk, takže aktivita enzymu v transformovaných buňkách je vyšší než aktivita enzymu v netransformovaných buňkách.
Exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence nebo požadované nukleotidové sekvence může mít rovněž za následek blokování metabolizmu sloučeniny dodávané populaci buněk nebo blokování syntézy sloučeniny v transformovaných buňkách, což umožňuje identifikaci nebo selekci transformovaných buněk z netransformovaných buněk.
Mezi sloučeniny, které jsou vhodné pro použití ve výše uvedeném způsobu, patří nové sloučeniny obecného vzorce I
NH-R6
R3 R9 ve kterém
R2 představuje atom vodíku, methylovou skupinu, methylthioskupinu, methylsulfonylovou skupinu, benzylthioskupinu, merkaptoskupinu, hydroxylovou skupinu, atom chloru, či skupinu vzorce -S-R10, -NH-R10 nebo -O-R10, kde
-3CZ 292882 B6
R10 znamená beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl nebo její esterový nebo amidový derivát na karboxylové skupině,
R6 představuje benzylovou skupinu, která může být na feny lovem kruhu substituována hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, atomem halogenu, alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupinou či trifluormethylovou skupinou, nebo skupinou vzorce -O-R10, -S-R10, nebo -NH-R10, kde má symbol R10 výše definovaný význam alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku či alkenylovou skupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, která může být substituována 1 až 3 hydroxylovými skupinami, glykosyloxyskupinami či alkoxylovými skupinami obsahujícími 1 až 6 atomů uhlíku, fenylovou skupinou, nebo/a skupinou vzorce -O-R10, -S-R10, nebo -NH-R10, kde má symbol R10 výše definovaný význam; esterifikovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkenylovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku; furfurylovou skupinu; nebo cyklohexylureidoskupinu, fenylureidoskupinu či tolylureindoskupinu; a buď i) každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které společně tvoří vazbu, ii) jeden ze symbolů R3 a R9 znamená atom vodíku, nebo skupinu R10, jak je definována výše, a druhý představuje polovinu vazby, která společně s polovinou vazby představuje symbolem X tvoří vazbu, nebo R9 znamená ribosylovou skupinu, 5'-fosforibosylovou skupinu, glukosylovou skupinu nebo skupinu vzorce -CH2CH(NH2)COOH a R3 znamená polovinu vazby, která společně s polovinou vazby představovanou symbolem X tvoří vazbu, a iii) R8 znamená atom vodíku, methylovou skupinu, methylthioskupinu, methylsulfonylovou skupinu, benzylthioskupinu, merkaptoskupinu, hydroxylovou skupinu, atom chloru, či skupinu vzorce -S-R10, -NH-R10 nebo -O-R10, kde má symbol R10 shora definovaný význam, nebo iv) R7 znamená ribosylovou skupinu, R8 představuje atom vodíku, každý ze symbolů R9 a Y znamená polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, a R3 znamená polovinu vazby, která společně s polovinou vazby představuje symbolem X tvoří vazbu;
stou podmínku, že jeden ze symbolů R2, R3, R6, R8 a R9 přestavuje nebo obsahuje beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu, nebo její sůl nebo její esterový nebo amidový derivát na karboxylové skupině.
Dalšími sloučeninami, které mohou být použity ve výše uvedeném způsobu, jsou sloučeniny
obecného vzorce II 0 R1
^0 (II)
1 RtO
ve kterém:
R1 přestavuje skupinu vzorce cis--CH=CH-COOH, její sůl nebo její esterový derivát na karboxylové skupině, nebo amidový derivát skupiny cis- nebo/a trans- -CH=CH-COOH,a R10 má shora definovaný význam.
Způsob přípravy těchto sloučenin jsou podrobně popsány v našem souvisejícím patentu 284 828.
-4CZ 292882 B6
Podrobný popis vynálezu
Termín „buňky“ v kontextu tohoto vynálezu označuje libovolný typ buněk, ze kterých mohou být identifikovány a izolovány za použití způsobu podle vynálezu jednotlivé geneticky transformované buňky. Dále termín „buňky“ též zahrnuje protoplasty, tj. protoplazmu buněk uzavřenou v membráně, ale bez buněčné stěny.
Termín „populace buněk“ označuje libovolnou skupinu buněk, která byla podrobena genetické transformaci a ve které je žádoucí identifikovat ty buňky, které byly geneticky transformovány a izolovat geneticky transformované buňky od negeneticky transformovaných buněk. Populací může být například tkáň, orgán nebo jeho část, populace jednotlivých buněk v nebo na substrátu, jako je kultura buněk mikroorganizmů, například populace buněk v roztoku nebo suspenzi, nebo celý organizmus, například úplná rostlina.
Termín „selekce“ označuje postup identifikace nebo/a izolace geneticky transformovaných buněk od negeneticky transformovaných buněk za použití zde popsaného způsobu.
„Požadovaná nukleotidová sekvence“ může být libovolná nukleotidová sekvence, která má být včleněna do daných buněk, za účelem vytvoření geneticky transformovaných buněk. Introdukce nukleotidových sekvencí je široce používána, a neexistují žádná omezení ohledně nukleotidových sekvencí, jejichž přítomnost může být zjišťována za použití zde popsaného způsobu pozitivní selekce. Za použití tohoto způsobu může být stanovena přítomnost požadované nukleotidové sekvence v geneticky transformovaných buňkách bez výše zmíněných nevýhod spojených s tradičními systémy negativní selekce.
Spojení, že nukleotidová sekvence je „kointrodukována s“ požadovanou nukleotidovou sekvencí označuje skutečnost, že jsou dvě nukleotidové sekvence spolu spojeny nebo jinak společně introdukovány takovým způsobem, že přítomnost kointrodukované nukleotidové sekvence v buňce svědčí o tom, že do buňky byla introdukována požadovaná nukleotidová sekvence, tj. pokud se ukáže, že jedna z nukleotidových sekvencí byla introdukována, je podstatně zvýšená pravděpodobnost, že byla introdukována, je podstatně zvýšená pravděpodobnost, že byla introdukována též druhá nukleotidová sekvence. Tyto dvě nukleotidové sekvence jsou tety typicky, ačkoli ne bezpodmínečně, částí stejného genetického konstruktu, a jsou například introdukovány pomocí stejného vektoru.
Zde popsané způsoby mohou být též použity pokud jsou kointrodukovaná nukleotidová sekvence a požadovaná nukleotidová sekvence introdukovány nezávisle. To může být provedeno například za použití stejné bakterie pro inkorporaci obou genů a inkorporací relativně velkého počtu kopií požadované nukleotidové sekvence do buněk, díky čemuž je relativně vysoká pravděpodobnost, že buňky, u kterých se ukáže, že exprimují kointrodukovanou nukleotidovou sekvenci, budou též obsahovat a exprimovat požadovanou nukleotidovou sekvenci. Obecně se očekává, že nezávislá introdukce dvou nebo více genů mající za následek společnou expresi genů ve stejné buňce má nízkou pravděpodobnost, a očekává se tedy, že zlepšené selekční frekvence dosažené způsobem pozitivní selekce jsou zejména výhodně v takových systémech.
Jelikož je nutné, aby byly introdukované nukleotidové sekvence v transformovaných buňkách exprimovány, bude genetický konstrukt obsahující tyto dvě nukleotidové sekvence typicky, nikoli však bezpodmínečně, obsahovat regulační sekvence umožňující expresi nukleotidových sekvencí, například známé promotory a transkripční terminátory. Kointrodukovaná nukleotidová sekvence bude tedy typicky spojena s promotorem, který může být buď konstitutivní, nebo regulovatelný promotor, a požadovaná nukleotidová sekvence bude typicky též spojena s konstitutivním nebo regulovatelným promotorem.
-5CZ 292882 B6
Jak již bylo uvedeno výše, lze selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk podle vynálezu provádět způsobem, při kterém se identifikace a izolace transformovaných buněk provádí bez použití selekčních genů kódujících rezistenci vůči antibiotiku nebo herbicidu. Jako u tradičních způsobů negativní selekce, může být zde popsaný způsob pozitivní selekce použit pro selekci buněk in vitro. Způsob pozitivní selekce může však být použit též in vivo. Použití způsobu pozitivní selekce in vivo je zejména významné například ve spojení s genetickou transformací prováděnou na celých rostlinách nebo rostlinných částech, kde rostliny nebo rostlinné části obsahují jak transformované, tak netransformované buňky, jelikož se selekce transformovaných buněk dosáhne bez přímého poškození sousedících netransformovaných buněk. Transformované buňky tedy mají selekční „výhodu“ ve srovnání s netransformovanými buňkami (například schopnost tvorby prýtů), ale netransformované buňky netrpí žádnou vážnou nevýhodou, ve smyslu jejich poškození nebo usmrcení, k čemuž dochází v případě negativní selekce používající antibiotik nebo herbicidů.
„Neaktivní sloučenina nebo živina“ může být libovolná sloučenina nebo živina v neaktivní formě nebo ve formě prekurzoru, tedy taková, která je v případě, že nedochází k expresi kointrodukované nukleotidové sekvence, ve formě která je v podstatě biologicky neaktivní vzhledem k daným buňkám, ale která je v případě, že dochází k expresi nebo transkripci kointrodukované nukleotidové sekvence, hydrolyzována nebo jinak aktivována či metabolizována, takže je geneticky transformovaným buňkám obsahujícím požadovanou nukleotidovou sekvenci poskytována selekční výhoda, která umožňuje jejich identifikaci a izolaci. Neaktivní sloučeninou nebo živinou může tedy být například neaktivní růstový regulátor rostlin, například inaktivovaný cytokinin, auxin nebo giberelin, vitamin, například inaktivovaný thiamin, glycidy (například manóza, pokud kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje manóza-6-fosfát-izomeru, nebo galaktóza či galaktózu obsahující sloučenina, pokud kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje UDP-galaktóza-4-epimerasu), sloučenina obsahující dusík (například opin, pokud kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje enzym pro metabolizmus nebo transport opinů), škrob, protein, nebo jiná živina v neaktivní formě, či sloučenina, která hraje podstatnou úlohu během diferenciace a dediferenciace buněk a tkání. Společně s odpovídajícími neaktivními sloučeninami může být též použito ošetření buněk a tkání sloučeninami indukujícími závislost na dodatečném přidání esenciálních sloučenin. Tento přístup může být použit například v případě, že je inhibována syntéza sterolu nebo saponinu a jsou přidány neaktivní steroly nebo saponiny. Neaktivní sloučeninou může být dále například minerální látka, která je chelatována a tak učiněna dostupnou pro geneticky transformované buňky.
V protikladu k tradiční negativní selekci, ve které jsou netransformované buňky poškozeny nebo usmrceny vlivem přítomnosti antibiotika, herbicidu nebo toxinu v substrátu, nemají neaktivní sloučeniny nebo živiny používané ve způsobu pozitivní selekce podle vynálezu žádný přímý nepříznivý vliv na netransformované buňky. Místo toho je transformovaným buňkách poskytována fyziologická výhoda, která umožňuje jejich identifikaci a izolaci, zatímco netransformované buňky jsou neovlivněny jako takové nebo méně ovlivněny přítomností neaktivní sloučeniny nebo živiny používané pro selekční účely.
Tradiční způsoby „negativní selekce“ jsou tedy charakterizovány použitím selekčního genu, který snižuje negativní účinek přidané sloučeniny na transformované buňky. Naproti tomu termín „pozitivní selekce“, jak je používán v kontextu tohoto vynálezu, označuje použití selekčního genu, který způsobuje nebo zvyšuje pozitivní účinek přidané sloučeniny na transformované buňky.
Sloučeniny používaná pro selekční účely může jít mimoto jak pozitivní, tak negativní účinek. Například manóza je toxická pro většinu rostlinných buněk, ale v buňkách obsahujících manóza6-fosfát-izomerasu je negativní účinek eliminován a buňky navíc získají užitek tím, že jsou schopny využít manózu nebo glycidový zdroj. V tomto případě jsou jediná sloučenina a jediný gen složkami kombinovaného pozitivního a negativního selekčního systému, ačkoli takový kombinovaný pozitivní a negativní systém může být též vytvořen za použití dvou nebo více genů,
-6CZ 292882 B6 které jsou společně odpovědné za inhibici negativních účinků sloučeniny a projevení se pozitivních účinků sloučeniny v transformovaných buňkách.
Neaktivní sloučenina nebo živina používaná ve způsobu pozitivní selekce nemusí být aktivována přímo polypeptidem kódovaným kointrodukovanou nukleotidovou sekvencí. Může jít též o neaktivní sloučeninu nebo živinu, která je aktivována nepřímo, tj. tak, že kointrodukovaná nukleotidová sekvence má nepřímý účinek na neaktivní sloučeninu nebo živinu v geneticky transformovaných buňkách, ale nikoli v netransformovaných buňkách. Tak může tato kointrodukovaná nukleotidová sekvence po expresi v transformovaných buňkách například nepřímo zvyšovat aktivitu enzymu, který je pro populaci buněk endogenní, což způsobuje vyšší aktivitu enzymu a aktivaci dané neaktivní sloučeniny nebo živiny v geneticky transformovaných buňkách.
Kointrodukovaná nukleotidová sekvence může též například kódovat permeasu nebo jiný transportní faktor, který umožňuje dané sloučenině nebo živině projít před buněčnou membránu a dostat se do transformovaných buněk nebo projít přes jinou (orgánelovou ) membránu, takže „aktivace“ neaktivní sloučeniny nebo živiny v tomto případě spočívá v selektivním příjmu sloučeniny nebo živiny transformovanými buňkami, zatímco příjem sloučeniny nebo živiny netransformovanými buňkami není možný nebo probíhá v menším rozsahu. Místo usnadňování příjmu sloučeniny do buňky, může kointrodukovaná nukleotidová sekvence alternativně řídit svůj produkt do kompartmentu, kde je lokalizována neaktivní sloučenina, například mimo plazmatickou membránu nebo do vakuoly či endoplazmatického retikula.
Selekce se při použití tohoto přístupu tedy dosáhne tím, že se sloučenina zpřístupní transformovaným buňkám, zatímco není dostupná nebo je méně dostupná pro netransformované buňky. Daná sloučenina nebo živina, která v tomto případě nemusí být „neaktivní“ jako taková (tj. může jít o takovou sloučeninu nebo živinu, jejíž aktivita se uplatní po proniknutí do transformovaných buněk, aniž by musela být v buňkách bezpodmínečně podrobena například hydrolýze), může být stejného typu jako libovolná z výše zmíněných sloučenin nebo živin, s tím rozdílem, že sloučenina nebo živina je v tomto případě transportována do transformovaných buněk místo (nebo kromě) její aktivace v transformovaných buňkách.
Příklady sloučenin, které mohou uplatnit fyziologické účinky po proniknutí do buňky, které však nejsou do buňky nebo buněčného kompertmentu snadno přijímány, zahrnují silně hydrofilní nebo hydrofobní sloučeniny, zejména sloučeniny nesoucí náboj, velké molekuly jako jsou polymeiy, zejména proteiny, peptidy, oligo- a polysacharidy, včetně rostlinných hormonů, fosforylované metabolity jako jsou fosforylované glycidy, fosforylované vitaminy, fosforylované nukleosidy, včetně cytokininů, a sloučeniny, které jsou konjugované s aminokyselinami nebo glycidy obsahujícími karboxylovou skupinu, včetně konjugátů rostlinných hormonů.
Základní způsob pozitivní selekce může být modifikován tak, že místo aktivace neaktivní sloučeniny nebo živiny v transformovaných buňkách může být selekce prováděna blokováním metabolické syntézy sloučeniny v těchto buňkách. Například metabolizmus cytokininů přidaného k substrátu může být blokován v transformovaných buňkách proti působícím mechanizmem. Vynálezci tak zjistili, že v případě, že je inhibována glykosylace zeatinu, snižuje se optimální koncentrace indukující tvorby prýtů 5- až 100-násobně. Inhibování metabolizmu zeatinu je tedy možné dosáhnout tvorby prýtů z listových terčíků tabáku při koncentracích zeatinu, které nejsou schopny indukovat tvorby prýtů u netransformovaných listových terčíků, které mají normální metabolizmus zeatinu. Bylo též zjištěno, že účinky indoloctové kyseliny (IAA, indole acetic acid) mohou být zvýšeny, pokud je inhibován metabolizmus této sloučeniny. Tak v případě, že byl metabolizmus IAA částečně inhibován, bylo zjištěno, že byl účinek indoloctové kyseliny na růst kalusu zvýšen 5- až 100- násobně. Podobně může inhibice metabolizmu glycidu a polysacharidu ovlivnit využití přidaného glycidu a poskytnout další možnosti pro pozitivní selekci tímto způsobem.
-7CZ 292882 B6 „Selekční výhoda“ transformovaných buněk může být libovolná odlišnost nebo výhoda vzhledem k netransformovaným buňkám, která umožňuje snadnou identifikaci a izolaci transformovaných buněk z netransformovaných buněk. Typicky jde o odlišnost nebo výhodu, která umožňuje identifikaci transformovaných buněk jednoduchým vitálním způsobem, tj. bez použití zvláštního testu pro stanovení přítomnosti markerového genu.
Pokud polypeptid kódovaný kointrodukovanou nukleotidovou sekvencí nebo požadovanou nukleotidovou sekvencí v transformovaných buňkách přímo aktivuje neaktivní sloučeninu nebo živinu, mohou netransformované buňky v některých případech obsahovat nebo produkovat určité množství daného polypeptidů. Například v případě, že je aktivačním polypeptidem enzym, mohou netransformované buňky vykazovat určitou přirozenou enzymovou aktivitu, kdy je přirozený enzym stejného typu jako introdukovaný aktivační enzym. V těchto případech nemusí být „neaktivní sloučenina nebo živina“ v netransformovaných buňkách nutně zcela neaktivní, jelikož může být postačující, je-li tato sloučenina nebo živina pouze podstatně méně aktivní v netransformovaných buňkách než v transformovaných buňkách. Jinými slovy, v některých případech může být pro selekční účely postačující kvalitativní rozdíl mezi transformovanými buňkami a netransformovanými buňkami ohledně aktivace původně neaktivní sloučeniny nebo živiny. V takových případech mohou být přidány inhibitory nebo substráty soutěžící s přirozenými enzymy, které mají za následek spontánní katalytickou tvorbu aktivního inhibitoru v množství, při kterém je přirozený enzym v podstatě úplně inhibován.
Aktivační polypeptid kódovaný kointrodukovanou nebo požadovanou nukleotidovou sekvencí není omezen na žádný konkrétní polypeptid a jedná se pochopitelně o takový polypeptid, který je aktivní, buď přímo, nebo nepřímo, ve vztahu ke konkrétní sloučenině nebo živině, která má být v geneticky transformovaných buňkách aktivována. Tímto polypeptidem je zejména často enzym.
Jedním z enzymů, o kterém bylo zjištěno, že je vhodný pro selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk je beta-glukuronidasa („GUS“), přičemž selekce se provádí za použití glukuronidové sloučeniny obsahující rostlinný růstový regulátor, která je štěpená beta-glukuronidasou, například za použití cytokinin-glukuronidu (jak je zřejmý ze zde uvedených příkladů). Je překvapující, že může být za použití genu GUS dosaženo selekce geneticky transformovaných rostlinných buněk, jelikož bylo ve spojení s vynálezem zjištěno, že vyšší rostliny vykazují přirozenou aktivitu GUS. Toto zjištění je v protikladu s tím, co bylo uváděno dříve. Tak v GB 2 197 653-A se uvádí, že vyšší rostliny nevykazují detekovatelnou beta-glukuronidasovou aktivitu a z toho se vyvozuje, že vzhledem ktomu, že ve vyšších rostlinách nebyla zjištěna aktivita GUS, je relativně snadné sledovat expresi zkoumaného genového konstruktu za použití genu GUS. Avšak, jak je vysvětleno níže (viz příklady provedení vynálezu), není tomu tak, a použití genu GUS pro sledování přítomnosti zkoumaného genu není vůbec jednoduché, díky tomu, že vyšší rostliny ve skutečnosti vykazují podstatnou vnitřní (jako pozadí) aktivitu betaglukuronidasy.
Pro selekci geneticky transformovaných rostlinných buněk může být tedy populace buněk kultivována na nebo v médiu obsahujícím cytokinin-glukuronid, který je v transformovaných buňkách štěpen beta-glukuronidasou, čímž se uvolňuje volný cytokinin a vede to v transformovaných buňkách k indukci prýtů nebo/a kalusu.
Pro účely vynálezu bylo vyvinuto mnoho nových cytokinin-glukuronidů. Příprava těchto sloučenin je podrobně popsána v našem souvisejícím patentu č. 284828.
V některých případech může být žádoucí modifikovat zde popsaný základní způsob, například kvůli dosažení větší efektivity selekce nebo kvůli zjednodušení selekčního procesu. Pokud je neaktivní sloučeninou použitou pro proces pozitivní selekce sloučenina, která je štěpená betaglukuronidasou, může být základní způsob různě modifikován k získání lepších výsledků. Jednou z možností modifikace je použití určitých sterol-glukuronidů, například cholesteryl-beta-Dglukuronidu nebo beta-sitosteryl-beta-D-glukuronidu, společně se sloučeninou inhibující
-8CZ 292882 B6 syntézu sterolů, jako je tridemorf (4-tridecyl-2,6-dimethylmorfolin). Použití takových sloučenin popisují níže uvedené příklady 4 a 5. Má se za to, že při použití inhibitoru syntézy sterolů společně se sterol-glukuronidy, které po hydrolýze beta-glukuronidasou působí proti účinku inhibitoru syntézy sterolů, lze během selekčního procesu zabránit, tzv. „cross-feedingu“ (tj. difusi aktivované sloučeniny z buňky, ve které je aktivována do jiné buňky), jelikož u sterolů nedochází k difúzi z buňky do buňky, pokud je odštěpen hydrofilní glukuronidový zbytek. Tak se dosáhne přesněji lokalizovaného účinku. Podobných výsledků může být dosaženo s velkým množstvím jiných glukuronidů, které obsahují hydrofobní aglykon.
Jak je vysvětleno výše, bylo v protikladu s tím, co bylo uváděno dříve, zjištěno, že vyšší rostliny ve skutečnosti vykazují přirozenou aktivitu GUS. Z tohoto důvodu nemusí být pouhé zavedení genu GUS do rostliny bezpodmínečně postačující pro dosažení požadované selekce geneticky transformovaných buněk, a může být nutné nebo žádoucí omezit v populaci buněk jakoukoli přirozenou beta-glukuronidasou aktivitu. Jelikož zavedená beta-glukuronidasa, může být snížení libovolné přirozené beta-glukuronidasové aktivity provedeno různými způsoby, například přidáním sloučeniny inhibující beta-glukuronidasu, která má vyšší inhibiční účinek na přirozenou beta-glukuronidasu než na beta-glukuronidasu kódovanou nukleotidovou sekvencí nebo její subsekvencí, do kultivačního média. Jedním takovým typem sloučeniny je jemná sůl.
Přirozená beta-glukuronidasová aktivita v populaci buněk může být též podstatně snížena tím že se do kultivačního média přidá sloučenina, která po hydrolýze dává produkt, který inhibuje aktivitu přirozené beta-glukuronidasy, a který s výhodou inhibuje aktivitu přirozené beta-glukuronidasy více než je inhibována aktivita zavedené beta-glukuronidasy. To může probíhat autoregulovaným nebo lokalizovaným způsobem, například lokalizací do specifických kompartmantů, kde je lokalizován nebo není lokalizován zavedený gen GUS. Příkladem produktu hydrolýzy, který inhibuje přirozenou beta-glukuronidasu, je glukuronová kyselina, která vzniká například hydrolýzou glyccyrrhizové kyseliny nebo sterol-glukuronidů.
Přirozená beta-glukuronidasová aktivita může být v populaci buněk dále snížena tím, že se do kultivačního média přidá inhibitor beta-glukuronidasy, zejména beta-glukuronid, který v buňkách bez zavedeného genu beta-glukuronidasy. Může to být například špatný beta-glukuronidasový substrát (glukuronid), který má vyšší afinitu k přirozené beta-glukuronidase než k zavedení beta-glukuronidase.
Beta-glukuronidasa kódovaná zavedeným beta-glukuronidasovým genem používaná pro účely tohoto vynálezu je aktivní v relativně širokém rozmezí pH, zatímco přirozená beta-glukuronidasa nacházející se v řadě různých rostlinných druhů je aktivní pouze v relativně úzkém rozmezí hodnot pH, typicky okolo pH 4 až 5 (viz příklad 2 níže). Přirozená beta-glukuronidasová aktivita může být tudíž v tomto případě snížena tím, že se do kultivačního média přidá glukuronid, který může být hydrolyzován přirozenou beta-glukuronidasou a který po hydrolýze způsobuje zvýšení pH, například o-kumaryl-glukuronid.
Jelikož bylo zjištěno, že beta-glukuronidasa vyskytující se přirozeně v rostlinách je obecně aktivní při pH okolo 4 až 5, může být přirozené beta-glukuronidasová aktivita snížena též tím, že se do kultivačního média přidá sloučenina regulující pH, která upravuje pH kultivačního média na hodnotu mezi přibližně 5,5 a 8,5, výhodně mezi přibližně 6,0 a 8,0, například mezi přibližně 6,5 a 7,5, nebo sloučenina regulující pH, která zvyšuje pH v buňkách nebo v kompartmentech buněk na pH v těchto rozmezích. Při těchto hodnotách pH je beta-glukuronidasa kódována zavedeným genem GUS aktivní, ale přirozená beta-glukuronidasa je v podstatě neaktivní. Příkladem sloučeniny regulující pH, která může být použita, je amonná sůl, nebo sloučenina uvolňující amoniak, například dusičnan amonný.
Konečně může být přirozená beta-glukuronidasová aktivita snížena nebo podstatně eliminována fyzikálním ošetřením, jako je ošetření teplem, například použitím teploty v rozmezí 50 až 65 °C
-9CZ 292882 B6 formou krátkých tepelných impulzů přibližně 1 až 2 dny před přenesením na selekční substrát nebo/a použitím teploty v rozmezí 30 až 45 °C během selekce (viz příklad 9).
Genetická transformace rostlinných buněk se často provádí za použití kmenů Aglobacteria, zejména kmenů Agrobacterium tumefaciens. Bylo zjištěno, že některé „odzbrojené“ kmeny Agrobacteria indukují tvorbu prýtů díky tvorbě látek indukujících prýty během kokultivace, a pokud má být pro účely selekce geneticky transformovaných buněk použito hydrolýzy cytokininglukuronidů pomocí GUS, je těmto kmenům normálně třeba se vyhnout. Genetická transformace buněk za použití cytokinin-glukuronidu jako neaktivní sloučeniny se tedy výhodně provádí za použití kmenu Agrobacteria, kteiý netvoří cytokininy či jiné sloučeniny, které indukují prýty (růst), nebo který tvoří pouze nepodstatná množství těchto látek, čímž se eliminuje nebo podstatně snižuje indukce růstu prýtů díky přítomnosti živých bakterií na nebo v buňkách.
V některých případech, například pokud je vyžadována zlepšená selekční frekvence, může být výhodné, aby byla požadovaná nukleotidová sekvence kointrodukována s alespoň dvěma odlišnými selekčními geny. Dalším selekčním genem může být další gen kódující enzym (nebo jiný protein nebo polypeptid) vhodný pro pozitivní selekci podle vynálezu, nebo jím může být gen kódující enzym (nebo jiný protein či polypeptid) vhodný pro tradiční negativní selekci, například kódující rezistenci vůči toxinu, antibiotiku nebo herbicidu. Selekce geneticky transformovaných buněk tedy může probíhat za použití kombinace pozitivní selekce a negativní selekce, přičemž je požadovaná nukleotidová sekvence v geneticky transformovaných buňkách dále kointrodukována se subsekvencí kódující rezistenci vůči alespoň jednomu toxinu, antibiotiku nebo herbicidu, a médiu obsahuje alespoň jeden toxin, antibiotikum nebo herbicid, vůči kterému jsou transformované buňky rezistentní.
Jak bylo uvedeno výše, vynález se týká geneticky transformovaných rostlinných buněk, které byly vyselektovány pomocí výše uvedeného způsobu, jejich potomstva nebo semen získaných z těchto geneticky transformovaných rostlinných buněk. Výhodou je často zejména to, že tyto buňky jsou geneticky transformované rostlinné buňky, jejichž genom neobsahuje jako selekční markér zavedenou (tj. nepřirozenou) nukleotidovou sekvenci kódující rezistenci vůči toxinu, antibiotiku nebo herbicidu. Jak bylo vysvětleno výše, vyskytují se obavy, zdali je bezpečné začleňovat geny kódující například rezistenci vůči antibiotiku do například potravinářských plodin. Z tohoto hlediska jsou tedy geneticky transformované rostlinné buňky vyselektované způsobem podle vynálezu, které neobsahují selekční geny například pro rezistenci vůči antibiotiku, stejně jako rostliny, jejich potomstvo a semena získaná z těchto buněk, jasně výhodné.
Pro syntézu cytokinin-glukoronidů obecného vzorce I jsou k dispozici různé postupy, které jsou více či méně obecné, a dva z těchto postupů, které jsou považovány za nejlepší, jsou popsány v našem souvisejícím patentu č. 284828.
Komerčně je dostupná řada cytokininů a prekurzorů cytokininů vhodných pro použití jako výchozích materiálů, zatímco další lze syntetizovat známými způsoby uvedenými v literatuře. Například syntéza mnoho vhodných N6-substituovaných adeninů majících skupinu označenou symbolem R6 v rámci zde uvedené definice tohoto symbolu může být provedena v literatuře uvedeným způsobem, který popsali Iwamura a kol. (Phytochemistry 19 (1980) 1309) a řada N6-(2'-izopentenyl)adeninů substituovaných v poloze 2, 8 a 2,8 majících skupiny označené symboly R2 nebo/a R8 v rámci zde uvedených definic těchto symbolů může být připravena jak popsali Dammann a kol. (Phytochemistry 13 (1974) 329).
Výhodnými sloučeninami obecného vzorce I jsou následující sloučeniny:
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R3 znamená beta-Dglukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, každý ze symbolů R9 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená benzylovou skupinu,
-10CZ 292882 B6 každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R3 znamená amidový derivát beta-D-glukopyranuronosylové skupiny na karboxylové skupině, každý ze symbolů R9 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená benzylovou skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R9 znamená beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, R6 znamená benzylovou skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R3 znamená beta-Dglukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, každý ze symbolů R9 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená 2-izopentenylovou skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 20 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje -S-beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině, R9 znamená atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená 2-izopentenylovou 25 skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku;
sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, R9 znamená atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R6 znamená 30 2-izopentenylovou skupinu, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazby a R8 znamená -S-beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu nebo její sůl na karboxylové skupině; a sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R2 představuje atom vodíku, každý ze symbolů R3 a X 35 představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu, R9 znamená atom vodíku, R6 představuje skupinu vzorce
nebo její sůl, každý ze symbolů R7 a Y představuje polovinu vazby, které dohromady tvoří vazbu a R8 znamená atom vodíku.
Sloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II lze snadno připravit za použití lehce připravitelného methylesteru kyseliny o-kumarové (tj. kyseliny 3-(2-hydroxyfenyl)-2-propenové) jako výchozího materiálu. Příprava sloučenin obecného vzorce Π jakož i uvedeného výchozího materiálu je podrobně popsána v našem souvisejícím patentu 284828.
-11 CZ 292882 B6
Výhodnými sloučeninami obecného vzorce II jsou následující sloučeniny:
sloučenina obecného vzorce II, ve kterém R1 představuje cis- nebo/a trans-2-amidoethylenylovou skupinu (cis- nebo/a trans- CH=CHCONH2), a R10 znamená amidový derivát beta-Dglukopyranuronosylové skupiny na její karboxylové funkci (2-hydroxycinnamyl-beta-Dglukopyranuronamid); a sloučenina obecného vzorce II, ve kterém R1 představuje cis-2-karboxyethenylovou skupinu (cis-CH=CHCOOH), a R10 znamená beta-D-glukopyranuronosylovou skupinu (2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranuronová kyselina).
Níže uvedené příklady ilustrují obecné principy vynálezu v rostlinách, zejména použití betaglukuronidasy jako selekčního genu a použití nových glukoronidových substrátů, které mohou být tímto genem hydrolyzovány. Na základě této práce se předpokládá, že geny jako je gen betaglukuronidasy mohou být použity pro řadu souvisejících cílů. Tak může být gen betaglukoronidasy použit v postupu pro dosažení lokalizovaného nebo tkáňově specifického účinku regulujícího růst rostliny v části rostliny nebo rostlinné tkáni, která exprimuje zavedený gen betaglukuronidasy ve vyšším množství než ostatní části nebo tkáně ve stejné rostlině, přičemž tento postup zahrnuje poskytnutí sloučeniny, která může být hydrolyzována zavedeným genem betaglukuronidasy, rostlině, takže je tato sloučenina hydrolyzována v té části nebo tkáni rostliny, která obsahuje zavedený gen beta-glukoronidasy, čímž se uvolní sloučenina regulující růst a vede to k regulaci růstu pouze v této části nebo tkáni rostliny, nebo je regulace růstu v této části nebo tkáni větší než účinek dosažený v jiných částech nebo tkáních rostliny. Předpokládá se též, že může být výhodné použít regulátory růstu rostlin, jako jsou cytokininy, ve formě glukuronidů nebo derivátů glukuronidů, spíše než jako volní cytokininy, například proto, aby se využila výhoda,že budou pravděpodobně v rostlinách odlišně transportovány a distribuovány ve srovnání například s odpovídajícími volnými nebo ribosylovanými cytokininy.
Podobně naznačují níže uvedené příklady některé další způsoby využití beta-glukoronidasy. Jedním z nich je způsob pro in vitro vyhledávání a identifikaci cytokinin-glukoronidů (nebo glukuronidových sloučenin jiných regulátorů růstu rostlin), které mohou být hydrolyzovány in vivo pomocí zavedeného genu beta-glukuronidasy. Beta-glukuronidasa může být též využita při vyhledávání sloučenin, které jsou vhodné pro použití jako selekční činidla ve zde popsaném způsobu pozitivní selekce (viz Příklad 1). V příkladech 2 a 11 jsou popsány systémy, které mohou být použity pro vyhledávání sloučenin, které selektivně inhibují přirozený enzym betaglukoronidasu v rostlinných buňkách aniž by podstatně ovlivňovaly aktivitu enzymu kódovaného zavedeným genem beta-glukuronidasy.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Hydrolýza cytokinin-glukuronidů pomocí beta-glukuronidasy za uvolnění nemodifikovaných cytokininů
Byl vyvinut test pro identifikaci těch cytokinin-glukoronidů, které mohou být hydrolyzovány pomocí beta-glukuronidasy zEscherichia coli. (Různé charakteristiky enzymu beta-glukoronidasy a jeho genu jsou popsány například v následujících pracech: Blonco a nemoz, Biochimie 69, str. 157 -161, 1987; Jefferson a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 83, str. 8447 - 8451, 1986; Lewy a Marsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, str. 381 - 428; US 4 721 671).
- 12CZ 292882 B6
Sloučenina, která má být testována, se inkubuje v 50mM natriumfosfátovém pufru, o pH 7,0 (obecně 500 pg sloučeniny v 500 μΐ pufru) s beta-glukuronidasou (obecně Sigma typ G7896, 2500 jednotek Sigma „Fishman“) po dobu 12 až 24 hodin při teplotě 37 °C. Přítomnost produktů hydrolýzy se poté stanoví za použití HPLC a TLC.
Tabulka 1 znázorňuje výsledky výše popsaného testu prováděného s řadou cytokinin-beta-Dglukoronidů a jedním cytokinin-D-glukuronamiden.
Tabulka 1
Cytokinin-beta-D-glukuronidy (a cytokinin-beta-D-glukuronamid) jako substráty beta-glukuronidasy s Escherichia coli
Hydrolýza Sloučenina
+ sodná sůl BA3GN
— BA3GNamid
— sodná sůl BA9GN
+ sodná sůl ZOGN
-1- sodná sůl IP3GN
+ sodná sůl IP2SGN
+ sodná sůl IP8SGN
Legenda:
sodná sůl BA3Gn = sodná sůl 3-beta-D-glukopyranuronosyl-6-benzylaminopurinu (synonyma: sodná sůl N6-benzyladenin-N3-beta-D-glukopyranuronové kyseliny, sodná sůl N6-benzyladenin-N3-beta-D-glukopyranuronové kyseliny, sodná sůl N6-benzyladenin-N3-glukuronidu),
BA3GNamid = 3-beta-D-glukopyranuronamido-6-benzylaminopurin (synonyma: N6-benzyladenin-N3-beta-D-glukopyranuronamid, N6-benzyladenin-3-glukuronamid), sodná sůl BA9GN = sodná sůl 9-beta-D-glukopyranuronosyl-6-benzylaminopurin (synonyma: sodná sůl N6-benzyladenin-N6-beta-D-glukopyranuronové kyseliny, sodná sůl N6-benzyladenin-9-glukuronidu), sodná sůl ZOGN = sodná sůl O-beta-D-glukopyranuronosylzeatinu (synonyma: sodná sůl zeatin-O-beta-D-glukopyranuronové kyseliny, sodná sůl zeatin-O-glukuronidu), sodná sůl IP3GN = sodná sůl 3-beta-D-glukopyranuronosyl-6-(3-methylbut-2-enylamino)purinu (synonyma: sodná sůl N6-(2'-izopentenyl)adenin-N3-beta-D-glukopyranuronové kyseliny, sodná sůl N6-(2'-izopentenyl)adenin-3-glukuronidu), sodná sůl IP2SGN = sodná sůl 6-(3-methylbut-2-enylamino)purin-2-yl-l-thio-beta-D-glukopyranuronové kyseliny (synonyma: sodná sůl N6-(2'-izopentenyl)adenin-2-thioglykopyranuronové kyseliny, sodná sůl N6-(2'-izopentenyl)adenin-2-thioglukuronidu, sodná sůl IP8SGN = sodná sůl 6-(3-methylbut-2-enylamino)purin-8-yl-l-thio-beta-D-glukopyranuronové kyseliny (synonyma: sodná sůl N6-(2'-izopentenyl)adenin-8-thioglukopyranuronové kyseliny, sodná sůl N6-(2'-izopentenyl)adenin-8-thioglukuronidu).
Vzhledem ktomu, že jako substrátů pro testování enzymu GUS z Escherichia coli vtransgenických organizmech se používalo pouze O-glukuronidů, a že bylo dříve uváděno (Jefferson, „The GUS reportér gene Systém“, Nátuře, sv. 242, str. 837 - 838, 1989), že substráty beta-glukuronidasy sestávající z D-glukuronové kyseliny spojené beta-O-glykosidickou vazbou
-13CZ 292882 B6 s aglykonem, je překvapivé, že bylo zjištěno, že některé N-glukuronidy a S-glukuronidy jsou též dobrými substráty tohoto enzymu. Předpokládá se tudíž také, že těchto N- a S-glukuronidů lze použít při testování enzymu beta-glukoronidasy z Escherichia coli a rostlin, například podobným způsobem jako je test X-gluc, uvedený níže.
V GB 2 197 653 A je uvedeno, že za použití beta-glukuronidasového systému a nových substrátů je možno pozitivní a negativní selekce využívající aktivity GUS. Tato hypotéza však nikdy nebyla zkoumána, a enzymatická hydrolýza těchto sloučenin se nikdy neukázala jako pravděpodobná a ani na základě teoretických úvah týkajících se chemických charakteristik substrátů pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli. Jak je zde prokázáno, ne všechny glukuronidy jsou substráty pro enzym beta-glukuronidasu z Escherichia coli, a neočekává se, že by většina glukuronidů byla substráty pro enzym GUS.
Jako způsobu pro zhodnocení, zda mohou být určité glukuronidy (včetně prekurzorů rostlinných hormonů) hydrolyzovány enzymem beta-glukuronidasou z Escherichia coli in vivo, byly použito zkoumání odpovědí v rostlinných tkáních exprimujících gen beta-glukuronidasy z Escherichia coli (Jefferson, „The GUS gene fúsion systém as a versatile tool for agricultural molecular biology“, abstrakt z kongresu Intemational Congress on Genetic Manipulation in Plant Breeding, konaného v Elsinoru, Dánsko, 11.-16. září 1988). Tento postup však bohužel není proveditelný díky přítomnosti silné endogenní aktivity beta-glukuronidasy v rostlinných tkáních (viz například níže uvedený příklad 2, stejně jako článek Hodal a kol., „Detection, expression and specifíc elimiation of endogenous beta-glucuronidasa activity in transgenic and non-transgenic plants“, určen k tisku v Plant Science). Přítomnost této endogenní beta-glukuronidasové aktivity též znamená, že při použití postupu, který popsal Jefferson, není možné stanovit, zda se účinky vyvoané glukuronidem ve skutečnosti projevují díky hydrolýze sloučeniny, nebo zdaje lze vysvětlit skutečností, že je aktivní sám glukuronid. Aby byla sloučenina vhodná pro selekční účely, musí být aktivována enzymem GUS a musí být ve formě glukuronidu bez podstatné aktivity.
Výše popsaný test může být použit pro vyhledávání cytokinin-glukuronidů, které mohou být hydrolyzovány daným enzymem beta-glukuronidasou. Jako příklad tohoto enzymu je zde uveden enzym beta-glukuronidasa z Escherichia coli.
Za použití HPLC a TLC bylo dále stanoveno, že produktem hydrolýzy pomocí GUS jsou nemoiioané aktivní cytokininy (postup viz příklady týkající se přípravy a analýzy nových cytokininglukoronidů v našem souvisejícím patentu 284828. Tak bylo například zjištěno, že hydrolýza sodné soli BA3GN beta-glukuronidasou z Escherichia coli měla za následek prakticky úplné (z více než 99 %) odstranění sodné soli BA3GN za vzniku sloučeniny, která se při chromatografii ve směsi 1 : 1 chová shodně jako autentický N6-benzyladenin. Podobně, při inkubaci sodné soli ZOGN s beta-glukuronidasou z Escherichia coli došlo k prakticky úplné přeměně na transzeatin, jak bylo stanoveno pomocí HPLC (za použití 50% izokratického methanolu); a v případě inkubace sodné soli IP8SGN s beta-glukuronidasou po dobu 24 hodin bylo zjištěno pomocí TLC (1:1, methanol / chloroform), že došlo k téměř úplné (z více než z 95 %) přeměně IP8SGN na sloučeninu, která se při chromatografii chová shodně jako 8-thio-(2-izopentenyl)adenin.
Podobně může být testována možnost hydrolýzy dalších typů glukuronidů danou beta-glukuronidasou. Například, při stanovení pomocí TLC bylo zjištěno, že při inkubaci 5 mg o-kumarylbeta-D-glukuronidu v 1 ml pufru po dobu 12 hodin s beta-glukuronidasou (Sigma typu G5897, 1000 jednotek) došlo z 93,4% k přeměně na sloučeninu, která se při chromatografii chová shodně jako o-kumarová kyselina. Inkubací dalších sloučenin uvedených v Tabulce 1 (s výjimkou dvou sloučenin, které se nechovaly jako substráty pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli) bylo dosaženo podobných výsledků, tj. vznikly produkty hydrolýzy odpovídající očekávaným výsledkům po hydrolýze beta-glukuronidasou (viz příklady týkající se přípravy různých cytokinin-glukuronidů v našem souvisejícím patentu č. 284828. Na druhou stranu, BA9GN který není substrátem pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli, jak je uvedeno výše v Tabulce 1, a který vykazuje po inkubaci s beta-glukuronidasou po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C nezdeteko-14CZ 292882 B6 vatelnou (tj. méně než z 1 %) tvorbu N6-benzyladeninu, neindukuje tvorbu prýtů z listových terčících tabáku (viz Tabulka 2 níže).
Příklad 2
Inkubace tvorby prýtů z rostlinné tkáně s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy pomocí cytokinin-glukuronidů
Byly prováděny pokusy s cílem stanovit, zda jsou cytokinin-glukuronidy (stejně jako cytokininglukuronamid) schopny indukovat tvorbu vivo v rostlinném materiálu obsahujícím, respektive neobsahujícím zavedený gen beta-glukuronidasy.
Semena z GUS-negativní a GUS-pozitivní rostliny tabáku (Nicotiana tabacum „Wisconsin 38“) se nechala vyklíčit na substrátu MSO (substrát Murashige a Skoog bez hormonů, jak ho popsali Murashige a Skoog, Phisiol. Plant. 15: 473 - 497, 1962, který lze obdržet od firmy Sigma, USA). GUS-pozitivní rostlinný materiál obsahoval zavedený gen beta-glukuronidasy z Escherichia coli (uidA), řízený promotorem 35S z viru mozaika květáku, jak popsali například Jefferson a kol., The EMBO joumal, sv. 6, č. 13, str. 3901 - 3907, 1987. Původní transgenické GUS-pozitivní rostliny byly získány za použití tradičního systému negativní selekce založeného na kanamycinu, jak popsali například Burow a kol., Plant Molecular Biology Reportér, sv. 8 (2), str. 124 - 130, 1990. GUS-pozitivní semenáčky byly identifikovány za použití testu X-gluc, jak je popsán níže v tomto příkladu.
Po 4 až 5 týdnech byly vrcholové části rostlin nebo prýtů přeneseny na nový substrát MSO a tento postup se v případě nutnosti opakoval. Tímto způsobem byl rostlinný materiál (jak GUSpozitivní tak GUS-negativní) udržován ve formě sterilních kultur piýtů (viz Burow a kol., Plant Molecular Biology Reportér, sv. 8 (2), str. 124 - 139, 1990). Z největších listů (3 až 5 týdnů starých) byly vyříznuty terčíky a ty byly přeneseny na níže uvedené substráty (viz Tabulka 2). Základním použitým substrátem byl MSO, s přídavkem různých testovaných sloučenin v několika koncentracích až do 250 μΜ. byly použity malé Petriho misky (o průměru 5 cm) obsahující přibližně 6 ml substrátu, přičemž byly na každé Petriho misce umístěny tři listové terčíky. Každé testované varianty byla opakována alespoň ve třech opakováních.
Za použití popsaného postupu bylo zjištěno, že některé cytokinin-glukuronidy indukují v rostlinných tkáních obsahujících beta-glukuronidasu tvorbu prýtů. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:
Tabulka 2
Tvorba prýtů indukovaná cytokinin-beta-D-glukuronidy (a cytokinin-glukuronamidem) na listových terčících tabáku s (GUS+) nebo bez (GUS-) zavedeného genu beta-glukuronidasy
GUS- GUS+ Sloučenina
- - Žádná (kontrola)
+ + N6-benzyladenin (kontrola)
+ + Zeatin (kontrola)
- — Kyselina glukuronová (kontrola)
4- + Sodná sůl BA3GN
+ + BA3GNamid
— — Sodná sůl BA9GN
+ + Sodná sůl IP3GN
+ + Sodná sůl IP2SGN
+ + Sodná sůl IP8SGN
-15CZ 292882 B6
Legenda:
+ označuje tvorbu prýtů při koncentracích pod 250 μΜ
- znamená, že při koncentracích pod 250 μΜ nedochází k tvorbě prýtů (250 μΜ odpovídá přibližně 100 mg/ml)
Z výše uvedené tabulky je vidět, že všechny cytokinin-glukuronidy, které při koncentraci pod 250 μΜ indukovaly tvorbu prýtů u listových terčíků tabáku obsahujících zavedený gen betaglukuronidasy byly za použití podobné koncentrace též schopné indukovat tvorbu prýtů u odpovídajících listových terčíků neobsahujících zavedený gen beta-glukuronidasy. Na druhou stranu, cytokinin-glukuronid BA9GN, o kterém bylo zjištěno, že nepůsobí jako substrát pro betaglukuronidasu zEscherichia coli (viz příklad 1), nezpůsoboval tvorbu prýtů u listových terčíků jak obsahujících, tak neobsahujících zavedený gen beta-glukuronidasy. Cytokinin-glukuronamid BA3GNamid, který, jak bylo zajištěno v příkladu 1, nepůsobí jako substrát pro beta-glukuronidasu z Escherichia coli, však indukoval tvorbu prýtů jak u GUS-pozitivních, tak u GUS-negativních listových terčíků, což svědčí o tom, že cytokinin-glukuronamidy jsou v rostlinné tkáni přeměňovány na odpovídající cytokinin-glukuronové kyseliny. Zdá se tedy, že prekurzory cytokinin-glukuronidů mohou in vivo působit stejným způsobem jako samotné cytokininglukuronidy.
Uvedené výsledky svědčí o tom, že vyšší rostliny, v tomto případě tabák, vykazují endogenní beta-glukuronidasovou aktivitu. Toto zjištění je v souladu s tím, co v poslední době uvedli Hu a kol. (Plant Cell Report 9, str. 1 - 5, 1990), kteří zkoumali výskyt aktivity podobné GUS u 52 druhů semenných rostlin, a s tím, co zjistili Hodal a kol. (určeno k tisku v Plant Science). Hu a kol. zjistili, že druhy exprimující pozitivní aktivitu podobno GUS jsou přítomny ve všech klíčových skupinách krytosemenných stejně jako u některých nahosemenných. (Hu a kol. nezdetekovali aktivitu GUS v tabáku, tento výsledek však lze vysvětlit skutečností, že jejich test byl prováděn in vitro při pH 7. Jak je uvedeno níže, zdá se, že enzym odpovědný za přirozenou aktivitu GUS v tabáku není aktivní při pH 7, bylo však zjištěno, že je aktivní při pH 4 až 5).
Tato zjištění jsou v protikladu stím, co je uvedeno v GB 2 197 653 A, kde se uvádí, že vyšší rostliny, včetně tabáku, nevykazují detekovatelnou aktivitu beta-glukuronidasy. GB 2 197 653 A, který se týká mimo jiné způsobu sledování exprese zajímavého genu za použití genu GUS, uvádí, že přítomnost aktivity GUS vyjadřuje přítomnost zajímavého genu atak se předpokládá, že vzhledem k tomu, že ve vyšších rostlinách nebyla zjištěna aktivitu GUS, je relativně snadné sledování exprese zajímavého genu za použití genu GUS. Z výše uvedených výsledků však vyplývá, že tomu tak není, a že použití genu GUS pro sledování přítomnosti zajímavého genu není vůbec jednoduché nebo snadné, vzhledem k tomu, že vyšší rostliny ve skutečnosti vykazují podstatnou vnitřní (jako pozadí) aktivitu beta-glukuronidasy.
Z důvodů studia podstaty pozorované aktivity GUS v rostlinném materiálu s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy, byla stanovena závislost aktivity GUS na pH pomocí standardního histochemického testu GUS za použití „X-gluc“ (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-glukuronidu).
Při provádění testu X-gluc se nejprve připraví testovací médium tak, že se rozpustí 50 mg X-gluc v roztoku obsahujícím 25 ml 0,2M fosfátového pufru, typicky o pH 7,0, 24 ml destilované vody, 0,25 ml 0,lM K3 (Fe(CN)6), 0,25 ml 0,1Μ K4 (Fe(CN)6) a 0,5 ml l,0M sodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové, přičemž se provádí míchání až do rozpuštění (přibližně 30 minut). Čerstvě nařezané nebo formaldehydem fixované řezy (tloušťka méně než 0,5 mm) či tkáně se poté inkubují v médiu X-gluk při teplotě 37 °C po dobu několika minut až 24 hodin. Po inkubaci se řezy promyjí v natriumfosfátovém pufru nebo ve vodě a zkoumají se mikroskopem. Aktivita GUS se pozoruje jako modré zabarvení ošetřeného rostlinného materiálu v místě aktivity enzymu (Jefferson, Plant Molecular Biology Reportér, sv. 5, č. 4, str. 387 - 405, 1987). Pro účely vynálezu byla typicky používána doba inkubace 20 hodin. Po inkubaci byly terčíky ošetřeny 96% ethanolem, aby se odstranil chlorofyl.
-16CZ 292882 B6
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka 3
Závislost aktivity BUS v listových terčících tabáku s (+) a bez (-) zavedeného genu GUS na pH
PH 3 4 5 6 7 8
GUS (-) 0 + + 0 0 0
GUS (+) 0 + + + + +
Legenda:
žádná reakce v testu X-gluc + modré zbarvení v testu X-gluc
Je vidět, že enzym odpovědný za beta-glukuronidasovou aktivitu projevující se jako pozadí v listových terčících tabáku bez zavedeného genu beta-glukuronidasy je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH, které odpovídá vnitřnímu pH rostlin (okolo pH 5), zatímco beta-glukuronidasa 15 exprimovaná zavedeným genem je aktivní v širokém rozmezí pH od hodnoty 4 do hodnoty 8.
Tato závislost na pH vysvětluje, proč byly předchozí snahy detekovat aktivitu GUS v rostlinách převážně neúspěšné a vedly k nesprávným závěrům (například v GB 2 197 653 A), že rostliny nemají vnitřní aktivitu GUS.
Skutečnost, že beta-glukuronidasová aktivita zjištěná výše pro rostlinný materiál bez zavedeného genu GUS je výsledkem hydrolýzy cytokinin-glukuronidu jako substrátu beta-glukuronidasou, a nikoli výsledkem nespecifické reakce, která štěpí substrát, například neenzymatické kyselé hydrolýzy glukuronidů (o kterých je známo, že jsou štěpeny při nízkých hodnotách pH), byla prokázána testováním účinku inhibitorů různých enzymů při pH 5 v negeneticky transformova25 ném rostlinném materiálu (tj. rostlinném materiálu vykazujícím pouze přirozenou aktivitu GUS). Testování bylo prováděno za použití výše popsaného testu X-gluc při pH 5,0 po dobu 20 hodin.
Tabulka 4
Test inhibitorů při pH = 5,0 u netransformovaného materiálu
Koncentrace (mM)
0 0,1 1 10 50
sacharo-1,4-lakton + + 0 0 0
glukonolakton + + + + +
UDP-glukuronid + + + + +
kyselina glukoronová + + + 0 0
galaktóza + + + + +
methylumbelliferyl-glukuronid + + + + 0
kyselina ethylendiamintetraoctová + + + + +
Legenda:
žádná reakce, tj. zcela bílý listový terčík + modré zbarvení s X-gluc
Šest testovaných inhibitorů mělo následující uvedené účinky:
Sacharo-l,4-lakton je inhibitor, který je specifický pro beta-glukuronidasy (jinými slovy, inhibuje pouze beta-glukuronidasy a inhibuje všechny beta-glukuronidasy). Obecně je uznáváno, že aktivita GUS, která může být inhibována touto sloučeninou, je následkem působení enzymu beta-glukuronidasy.
-17CZ 292882 B6
Glukonolakton je inhibitorem beta-glukusidas. Odpovídá sacharo-l,4-laktonu, stím rozdílem, že je specifický pro beta-glukosidasy.
UDP-glukuronid je substrátem pro UDP-glukuronid-transferázy.
Kyselina glukuronová je produktem každé reakce způsobené beta-glukuronidasou a tudíž je produktem inhibujícím beta-glukuronidasy a jiné enzymy tvořící kyselinu glukuronovou.
Galaktóza je inhibitorem reakcí závislých na UDP-glukuronid-transferáze.
Methylumbelliferyl-glukuronid je substrátem pro všechny dosud prozkoumané beta-glukuronidasy a je tedy kompetitivním inhibitorem enzymů GUS.
Jelikož bylo též zjištěno, že kyselina ethylendiamintetraoctová (která inhibuje UDP-glukuronidtransferázy) nemá žádný vliv, je nepravděpodobné, že by se tyto transferázy podílely na pozorované aktivitě GUS. Výše uvedená tabulka znázorňuje, že sloučeniny, které by měly inhibovat enzym transferázu neměly žádný účinek ani při velmi vysokých koncentracích. Dále je z tabulky možno vidět, že glukonolakton neměl žádný inhibiční účinek, a je tedy nepravděpodobné, že by aktivita GUS měla vztah k beta-glukosidasové aktivitě.
Dále je možno vidět, že inhibitor specifický pro GUS sacharo-l,4-lakton je silným inhibitorem, že kyselina glukoronová (produkt inhibující beta-blukuronidasu) je středně silným inhibitorem a že methylumbelliferyl-glukuronid (substrát GUS, a tudíž kompetitivní substrát s X-gluc, pokud je za hydrolýzu X-gluc odpovědný enzym beta-glukuronidasa) je slabým inhibitorem. Aktivita GUS v tabáku tedy splňuje všechna nutná kriteria, aby byla klasifikována jako důsledek enzymu beta-glukuronidasy. Může být tudíž učiněn závěr, že rostliny obsahují enzym beta-glukuronidasu.
Byla prováděna odpovídající řada pokusů s účelem stanovit, zda byl účinek inhibitorů dostatečně rychlý pro umožnění inhibice enzymu. V těchto pokusech byl rostlinný materiál preinkubován v testovaných sloučeninách (inhibitorech) po dobu 24 hodin před tím, než byl proveden test X-glux-se stejnými testovanými sloučeninami. Získané výsledky byly shodné s následky získanými bez preinkubace, což svědčí o tom, že inhibitory pronikají do rostlinné tkáně dostatečně rychle, aby způsobovaly inhibici v testu X-gluc předtím, než může dojít k modrému zbarvení.
Podobné výsledky jako jsou popsány výše byly získány při dalším výzkumu výskytu aktivity GUS v rostlinách. V tomto případě byla zkoumána závislosti histologické reakce GUS na pH u mnoha rostlinných druhů při hodnotách pH mezi 3 a 8 jak bez, tak s inhibitorem specifickým pro GUS sacharo-l,4-laktonem,
Používaným testem byl výše popsaný X-gluc, který byl prováděn při teplotě 37 °C po dobu 20 hodin. Listy byly rozřezány (sterilními žiletkami), takže byl každý z listů testován při několika odlišných hodnotách pH.
Jak je znázorněno v níže uvedené tabulce, tento výzkum potvrdil, že rostliny skutečně vlastní přirozenou aktivitu GUS, že tato aktivita je výsledkem enzymatické reakce (v přítomnosti inhibitoru specifického pro GUS nedocházelo k žádné reakci) a že je tento enzym primárně aktivní při hodnotách pH okolo 4 až 5.
-18CZ 292882 B6
Tabulka 5
Histologická reakce GUS při různých hodnotách pH
pH během testu 3 4 5 6 7 8 3-8
sacharo-l,4-laton (mM) 0 0 0 0 0 0 10
Rostlinný druh
Cukrová řepa, divoký typ + + + + (+) 0 0
Cukrová řepa, transgenická 1) + + + + + + (+)
Cukrová řepa, transgenická 2) + + + + (+) 0 0
Pšenice 0 + + + 0 0 0
Pšenice (albino) 0 + + + 0 0 0
Řepka olejka + + + (+) (+) 0 0
Tabák 0 + + 0 0 0 0
Tabák, transgenický 1) 0 + + + + + 0
Tabák, transgenický 2) 0 + + 0 0 0 0
Smrk sitka 0 + + 0 0 0 0
Reveň 3) n n + + + + 0
Hrách 3) 0 + + 0 0 0 0
Oxalis 3) n n n n (+) n 0
Pyl Chenopodium guinoa (merlík) n n n 0 + n n
Legenda:
1) listová tkáň exprimující gen GUS z Escherichia coli
2) transgenická listová tkáň obsahující pouze gen rezistence vůči kanamycinu (NPT), bez zavedeného genu GUS
3) tkáň stonku nebo řapíku
4) tkáň embryogenního kalusu + modré zbarvení (+) nízká frekvence aktivity GUS (slabé modré zbarvení) žádná reakce n nestanoveno
Skutečnost, že rostliny mají obecnou vnitřní aktivitu GUS, umožňuje použití gelu kódujícího glukuronid-permeasu jako genu pro pozitivní selekci bez použití libovolného dalšího selekčního genu, jelikož se tak poskytne výhoda zvýšeného příjmu glukuronidu transformovanými buňkami. Bylo například zjištěno, že glukuronidy nejsou do rostlinných buněk snadno přijímány přes plazmatické membrány. Pokud je však do buňky zaveden gen glukuronid-permeasy, mohou glukuronidy snadněji přejít plazmatickou membránu a proniknout do buňky. Glukuronidy jsou poté v transformovaných buňkách dostupné pro štěpení pomocí vnitřního enzymu GUS. Naproti tomu nebude daný gíukuronid dostupný pro netransformované buňky, čímž se dosáhne účinku pozitivní selekce. Podobně může být pozitivní selekce prováděna za použití dalších permeas a dalších typů sloučenin, které jsou buď aktivovány v transformovaných buňkách vnitřní enzymem, nebo jsou jinak biologicky účinné v transformovaných buňkách, do kterých jsou transportovány.
Příklad 3
Cytokinin-glukuronidy jsou stabilní a neaktivní
Účinek sodné soli cytokinin-glukuronidu BA3GN je blokován, pokud je v rostlinné tkáni obsahující tento cytokinin-glukuronid inhibována aktivita GUS. Jinými slovy, samotný cytokininglukuronid je neaktivní. Dále se ukázalo, že je tento cytokinin-glukuronid stabilní v růstovém médiu stejně jako v rostlinné tkáni, pokud není přítomna beta-glukuronidasa, což je doloženo
-19CZ 292882 B6 skutečností, že specifický inhibitor GUS, sacharo-l,4-laton (SL), silně inhibuje tvorbu prýtů indukovanou sodnou solí cytokinin-glukuronidu BA3Gn, ale pouze slabě inhibuje tvorbu prýtů indukovanou volným cytokinem N6-benzyladeninem (za použití základního postupu popsaného výše v příkladu 2):
Tabulka 6
Inhibice tvorby prýtů indukované N6-benzyladeninem (0,5 mg/1) a sodnou solí BA3GN (15 mg/1) pomocí sacharo-l,4-laktonu (SL)
Ošetření SL (mM) Počet a relativní poměr regenerovaných prýtů
BA sodná sůl BA3GN
0 4,3 100% 5,6 100%
16 3,6 84% 1,4 25%
Ze srovnání výsledků ve výše uvedené tabulce s výsledky v Tabulce 2 je vidět, že sodná sůl BA3GN, která indukuje tvorbu prýtů jak u GUS-pozitivních, tak u GUS-negativních listových terčíků, neindukuje tvorbu prýtů u odpovídajících listových terčíků v přítomnosti inhibitoru specifického pro beta-glukuronidu sacharo-l,4-laktonu.
Sacharo-1,4-lakton není při pH používaném v tomto příkladu stabilní sloučeninou, vytváří se rovnováha mezi sacharo-1,4-laktonem a kyselinou cukrovou (SA). Této rovnováhy se dosahuje pomalu, a přeměna sacharo-1,4-laktonu na kyselinu cukrovou je provázena poklesem pH. pH se proto musí během jednotýdenního období před použití sacharo-1,4-laktonu několikrát upravovat, až se pH v substrátu obsahujícím sacharo-1,4-lakton stabilizuje.
Skutečnost, že jsou cytokinin-glukuronidy stabilní a neaktivní, pokud nejsou v přítomnosti betaglukuronidasy, je dále doložena tím, že BA9GN, který nemůže být hydrolyzován beta-glukuronidasou, nemůže indukovat tvorbu prýtů v rostlinném materiálu vykazujícím beta-glukuronidasovou aktivitu (viz příklady 1 a 2).
Je důležité, že cytokinin-glukuronidy jsou neaktivní a stabilní v substrátech, které neobsahují enzym beta-glukoronidasu, jelikož je tato stabilita nezbytným předpokladem pro správné fungování systému pozitivní selekce, který jich využívá.
Ne u všech derivátů glukuronové kyseliny však může být očekávána stabilita. Například glukuronidy v esterové formě nebudou stabilní v rostlinné tkáni, která obsahuje nespecifické esterázy. To znamená, že cytokinin-glukuronidy připravené a používané podle vynález (beta-D-glukuronidy spojené s aglykonem přes glykosidický atom kyslíku, síry nebo dusíku) splňují předpoklad pro stabilitu. Na druhou stranu, u sloučenin majících jiné typy glukoronidových vazeb, například u beta-D-glukuronidů v amidové nebo esterové formě, se neočekává jejich selektivní hydrolýza pomocí beta-glukuronidas, díky výskytu nespecifických esteráz a amidas v rostlinách.
V souvislosti s výše uvedeným příkladem 2 bylo tedy zjištěno, že jsou testované cytokininglukuronidy, které jak je uvedeno v tomto příkladu samy o sobě nevykazují cytokininovou aktivitu, in vivo štěpeny účinkem beta-glukuronidasy - buď ve formě endogenní beta-glukoronidasy působící jako pozadí, nebo v důsledku zavedeného genu beta-glukuronidasy - přičemž se uvolňuje volný cytokinin.
Příklad 4
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně obsahujíc zavedený gen beta-glukuronidasy za použití sterol-glukoronidů
-20CZ 292882 B6
I o dalších glukuronidech, včetně glukuronidů sterolů, glycyrrhizové kyseliny a hydroxychinolinu, bylo zjištěno, že jsou hydrolyzovány beta-glukuronidasou a mají za následek tvorbu prýtů na modifikovaných substrátech na kterých jsou produkty hydrolýzy nezbytné pro tvorbu prýtů, což je uvedeno v příkladech 4 a 5.
Byly prováděny pokusy pro stanovení účinku dvou sterol-glukuronidů, beta-sitosteryl-beta-Dglukuronidu (SG) a cholesteiyl-beta-D-glukuronidu (CG) na indukci tvorbu prýtů, pokud je ve táních inhibována syntéza sterolů. Základní použité postupy v podstatě odpovídají postupům popsaným výše v příkladu 2. Kromě jednoho nebo obou výše zmíněných sterol-glukoronidů však substrát obsahovat tridemorf (0,1 mM) a 5 mg/1 sodné soli BA3GN. Počet prýtů byl zjišťován po 30 dnech.
Tridemorf (4-tridecyl-2,6-dimethylmorfolin) je fungicid, který inhibuje syntézu sterolů a podobných sloučenin. Pokud nejsou rostlinné tkáni dodávány steroly, má tridemorf inhibiční účinek na regeneraci prýtů (ačkoli nemá smrtící účinek na explantáty). V nepřítomnosti volných sterolů je tedy účinně zabráněno tvorbě prýtů.
Cholesteryl-beta-D-glukuronid (CG) byl získán od firmy Sigma, USA, a beta-sitosteryl-betaD-glukuronid (SG) byl syntetizován podle postupu, který popsali Ando a kol. v J. Antibiotics 73, str. 408, 1970.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka 7
Počet regenerovaných prýtů na listový terčík tabáku na substrátu doplněném tridemorfem (0,1 mM) a sodnou solí BA3Gn (5 mM)
Sloučenina Koncentrace (mg /1)
Sitosteryl-beta-D-glukuronid 0 0 12,5 12,5
Cholesteryl-beta-D-glukuronid 0 50 0 50
Prýtů na listový terčík 0,3 0,3 2,8 4,0
Z výše uvedené tabulky vyplývá, že sitosteryl-beta-D-glukuronid je schopen působit proti inhibičnímu účinku tridemorfu na tvorbu prýtů a že kombinace sitosteryl-beta-D-glukuronidu a cholesteryl-beta-D-glukuronidu způsobuje větší tvorbu prýtů. Tak je pozitivní selekce podle vynálezu pomocí zavedeného genu beta-glukuronidasy možná za použití například jednoho nebo obou výše uvedených sterol-glukuronidů společně se sloučeninou inhibující tvorbu prýtů, jak je tridemorf. Tyto výsledky svědčí o tom, že pro pozitivní selekci z tkáně obsahující zavedený gen beta-glukuronidasy mohou být použity též další steroly a sterolům podobné sloučeniny.
Výhodou použití těchto velmi málo rozpustných sloučenin pro pozitivní selekci je skutečnost, že jejich účinek bude pravděpodobně velmi lokální, jelikož tyto sloučeniny nedifundují z buňky do buňky po odštěpení hydrofilního glukuronidového zbytku enzymem beta-glukuronidasou. Jinými slovy, těchto sloučenin může být použito pro zabránění „cros feedingu“ během selekčního procesu.
Tento pokus dále naznačuje, že proti inhibičnímu účinku tridemorfu, a tudíž také ostatních sloučenin které inhibují syntézu sterolů, na tvoru prýtů, lze působit přidáním sterolů a derivátů sterolů k substrátu, čímž může být vytvořen selekční systém s výše zmíněnými výhodami, založený na poskytování sterolů a sterolům podobných sloučenin transgenickým buňkám.
-21 CZ 292882 B6
Příklad 5
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně a s bez zavedeného genu beta-glukuronidasy za použití sitosteiyl-beta-D-glukuronidu
Podobný pokus jako byl popsán v příkladu 4 byl proveden jak na transformovaných, tak na netransformovaných listových terčících tabáku za použití sitosteryl-beta-D-glukuronidu a buď N6-benzy laděn inu, nebo sodné soli BA3GN.
Použité postupy byly v podstatě takové, jako jsou popsány výše v příkladu 4. V tomto pokusu byl tridemorf přidán k substrátu v koncentraci 0,1 mM a sitosteryl-beta-D-glukuronid byl přidán v koncentraci 121 mg/1. Kromě toho substrát obsahoval buď 1,88 mg/1 sodné soli BA3GN, nebo 0,1 mg/1 N6-benzyladeninu. Počet prýtů byl zjišťován po 40 dnech.
Bylo získáno následující množství prýtů:
Počet regenerovaných prýtů na listový terčík
N6-benzyladenin Sodná sůl BA3GN
Sloučenina GUS+ GUS- GUS+ GUS-
Sitosteryl-beta-D-glukuronid 2,4 1,9 2,4 0,1
Je vidět, že, jak bylo podstatou výše uvedeného příkladu 4, působí přítomnost sitosteryl-beta-Dglukuronidu proti inhibičnímu účinku tridemorfu na tvorbu prýtů. Dále, pokud byl sitosterylbeta-D-glukuronid a tridemorf použit společně se sodnou solí BA3GN, bylo dosaženo selektivní tvorby piýtů u GUS-pozitivních listových terčíků, zatímco u GUS-negativních listových terčíků na substrátu obsahujícím sodnou sůl BA3Gn v podstatě nedocházelo k tvorbě prýtů.
Tyto výsledky svědčí též o tom, že použití kombinace odlišných glukuronidů (zde BA3GN a sitosteryl-beta-D-glukuronidu místo N6-benzyladeninu a sitosteryl-beta-D-glukuronidu) může zlepšit selektivní odpověď u transgenických tkání.
Jelikož steroly a steroidy jsou též důležitými regulátory růstu v živočišných buňkách, mohou být odpovídající selekční postupy použity též pro selekci živočišných buněk, které exprimují beta-blukuronidasu.
Příklad 6 „Odzbrojené“ kmeny Agrobacteria produkují cytokininy
Bylo zjištěno, že některé kmeny Agrobacteria indukuji tvorbu prýtů díky produkci látek indukujících tvorbu prýtů během kokultivace. Těmto kmenům je v případě, že má být použita hydrolýza cytokinin-glukuronidů pomocí GUS pro účely selekce geneticky transformovaných buněk, normálně potřeba se vyhnout, jelikož tyto kmeny mohou samy indukovat tvorbu prýtů a tím překážet selekčnímu procesu.
Jako příklad jsou v níže uvedené tabulce znázorněny výsledky pokusu s dvěma odlišnými kmeny Agrobacteria, z nichž jeden indukuje tvoru prýtů u listových terčíků tabáku po kokultivaci.
Použité postupy odpovídají v podstatě postupům popsaným v příkladu 12, ale po kokultivaci byly listové terčíky přeneseny na substrát MSO bez hormonů obsahující 300 mg/1 cefotaximu a 300 mg/1 karbenicillinu.
-22CZ 292882 B6
Počet regenerovaných prýtů byl zjišťován 4 týdny po kokultivaci.
Tabulka 8
Indukce tvorby prýtů na listových terčících tabák na substrátu bez hormonů po kokultivaci s „odzbrojeným“ Agrobacteriem
kmen Agrobacteria Plazmid Geny v T-DNA Počet prýtů na listový terčík
1.C58X T37 GUSaNPT 9,3
2. LBA4404X PAL4404 GUSaNPT 0
3. C58Y T37 Žádný 4,8
4. LBA4404Y PAL4404 Žádný 0
5. Žádný - - 0
Je vidět, že schopnosti některých kmenů Agrobacteria indukovat tvorbu prýtů nezávisí na genech obsažených v T-DNA. To znamená, že za indukci tvorby prýtů jsou odpovědné geny vně oblasti T-DNA.
Gen vně oblasti T-DNA odpovědný za tvorbu cytokininů byl pojmenován tzs (Morris, R. O., Ann. Rev. Plant Physiol. 37, str. 509 - 538, 1986). Kmen C58 obsahuje gen tzs, nepřenosný gen, který kóduje syntézu zeatinu během kokultivace. Kmen LBA4404 neobsahuje gen tzs. Skutečnost, že kmeny indukující tvorbu prýtů obsahují plazmid obsahující gen tzs svědčí o tom, že tento gen může být odpovědný za schopnost indukovat tvorbu prýtů, která byla pozorována v těchto pokusech, a že je kmenům Agrobacteria obsahujícím gen tzs potřeba se vyhnout v případě selekčních systémů založených na cytokininů. Normálně je potřeba vyhnout se též libovolným dalším kmenům Agrobacteria, které indukují tvorbu prýtů.
Příklad 7
Pozitivní selekce transgenických prýtů za použití cytokinin-glukuronidu sodné soli BA3GN
Za použití cytokinin-glukuronidů mohou být vybírány geneticky transformované prýty.
Byla prováděna řada pokusů testujících efektivitu systému pozitivní selekce za použití cytokininglukuronidu sodné soli BA3Gn v koncentracích 7,5 a 15 mg/1. Pokusy byly prováděny na listových terčících divokého typu tabáku za použití dvou odlišných kmenů Agrobacteria, stejně jako různých kokultivačních substrátů. Byl použit způsob transformace jako je popsán níže v příkladu 12, s tou výjimkou, že byl místo MSO použit substrát Gamborg B5 (Bamborg a kol., Exp. Cell Res. 50: 151 - 158, 1968; lze jej obdržet od firmy Sigma, USA). Níže uvedené výsledky jsou uváděny jako průměrné hodnoty získané ze dvou nezávislých pokusů, přičemž v obou z nich byl každý typ ošetření prováděn na 27 listových terčících.
Tabulka 9
Pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití cytokinin-glukuronidu sodné soli BA3GN
7,5 mg/ml sodné soli BA3GN
Kmen Agrobacteria Kokultivační substrát GUS+ prýtů na listový terčík % GUS+ prýtů z celkového počtu prýtů
BS10 B5 0,1 6,6
BS10 B5 + ammon. 0,02 0,7
BS10 B5 + ammon. + SL 0,3 6,1
BS10 průměr 0,1 4,4
-23 CZ 292882 B6
Pokračování tabulky 9
LDH1 B5 0,2 7,8
LDH1 B5 + ammon. 0,2 5,3
LDH1 B5 + ammon. + SL 0,2 4,7
LDH1 průměr 0,2 5,9
Oba průměr 0,2 5,1
BIO B5 0,3 6,0
BS10 B5 + ammon. 0,4 8,7
BS10 B5 + ammon. + SL 0,3 5,5
BS10 průměr 0,3 6,7
LDH1 B5 0,4 9,0
LDH1 B5 + ammon. 0,3 7,6
LDH1 B5 + ammon. + SL 0,3 7,7
LDH1 průměr 0,3 8,1
Oba průměr 0,3 7,4
Legenda:
B5 Substrát Gamborg B5, pH 5,4
Ammon. Kokultivační substrát s dusičnanem amonným (75 mM)
SL Kokultivační substrát s kyselinou cukrovou (25 mM) + sacharo-1,4—laktonem (25 mM) ze stabilizovaného roztoku.
BUS+ Prýty exprimující aktivitu GUS při zkoumání při pH 7, jak je popsáno v příkladu 2
Kmen BS10 zavádí gen GUS řízený modifikovaným promotorem 35S, který není aktivní v Agrobacteriu, jak popsali Janssena Gardner v Plant Molecular biology, 14, str. 61 až 72, 1989. Kmen LDH1 zavádí gen GUS řízený nemodifikovaným promotorem 35S.
Výsledky uvedené v Tabulce 9 ukazují, že pozitivní selekce transgenických prýtů exprimujících zavedený gen beta-glukuronidasy za použití sodné soli BA3GN je možná. Tyto výsledky jsou velmi významné, a byly neočekávané, jelikož bylo zjištěno, jak je popsáno v příkladu 2, že cytokinin-glukuronidy byly schopné indukovat tvorbu prýtů u listových terčíků, které neobsahují zavedený gen beta-glukuronidasy. Zdá se, že odlišná ošetření během kokultivace nemají na 20 selekci podstatný vliv.
Výše uvedené výsledky svědčí rovněž o tom, že použití kmenu Agrobacteria s aktivním genem beta-glukuronidasy (kmen LDH1 exprimuje v bakteriích aktivitu GUS) neovlivňuje v porovnání s kmenem, který nemá aktivní gen beta-glukuronidasy (kmen BS10 neexprimuje v bakteriích 25 aktivitu GUS), transformační systém.
Příklad 8
Selekce geneticky transformovaných prýtů za použití cytokinin-glukuronidu kyseliny zeatin-O-beta-glukuronové
Za použití v podstatě stejného postupu, jako je popsán v příkladu 12, byly připraveny a selektovány transgenické prýty tabáku za použití cytokinin-glukuronidu kyseliny zeatin-O-beta35 glukuronové (ZOGN) jako činidla pozitivní selekce.
-24CZ 292882 B6
Kokultivace byla prováděna po dobu 3 dnů, hustota inokula odpovídala hodnotě OD 1,5 při 660 nm. Substrátem použitým po kokultivaci byl substrát MSO obsahující 300 mg/1 karbenicillinu, 300 mg/1 cefotaximu a 0,1 mg/1 kyseliny indoloctové (IAA). Po třech týdnech byla provedena subkultivace do stejného substrátu, ale bez kyseliny indoloctové. pH používané u všech substrátů bylo 8,0. Pro každé ošetření bylo použito 18 listových terčíků.
Pět týdnů po kokultivaci byly prýty přeneseny na substrát MSO obsahující 200 mg/1 kanamycinsulfátu, 32 mM kyseliny cukrové, 300 mg/1 cefotaximu a 300 mg/1 karbenicillinu, pH 8,0. Kyselina cukrová, inhibitor enzymů beta-glukuronidas, byla přidána, aby zastavila další přeměnu zeatin-glukuronidu na zeatin. Společně s genem beta-glukuronidasy byl přenesen gen NPT způsobující rezistenci vůči kanamycinu. Netransformované prýty (negativní kontroly) přežily, ale růst těchto prýtů byl na tomto substrátu zpomalen, zatímco všechny transformované prýty (pozitivní kontroly) obsahující aktivní gen NPT přežily bez jakéhokoli zpomalení růstu.
týdny po poslední subkultivaci (8 týdnů po kokultivaci) byl zjištěn počet prýtů a podíl GUS-pozitivních prýtů v celkovém počtu prýtů byl stanoven pomocí testu X-gluc (příklad 2). Výsledky jsou uvedeny níže:
Tabulka 10
Pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití sodné soli ZOGN
ZOGN mg/1 GUS-pozitivních prýtů na listový terčík % GUS-pozitivních prýtů z celkového počtu prýtů
0,07 0,3 18,5
1,0 2,6 40,3
15,0 0,2 5,1
0,07 + SL * 0 0
Legenda:
* SL sacharo-l,4-lakton (2 mM)
Výsledky ve výše uvedené tabulce ukazují, že bylo dosaženo úspěšné pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití ZOGN. Indukce tvorby transgenických prýtů byla inhibována v případě, že byl do substrátu přidán specifický inhibitor beta-glukuronidas sacharo-l,4-lakton, což svědčí o tom, že růst transgenických prýtů a tedy úspěšnost pozitivní selekce je závislá na přeměně ZOGN na zeatin, která je katalyzována beta-glukuronidasou.
Příklad 9
Selekce geneticky transformovaných prýtů za použití kyseliny zeatin—beta-D-glukuronové při různých teplotách
Závislost systému pozitivní selekce používajícího cytokinin-glukuronidů na teplotě byla zkoumána za použití kyseliny zeatin-O-beta-glukuronové (ZOGN) jako činidla pozitivní selekce při teplotách 25 °C, 30 °C a 35 °C.
Transgenické prýty tabáku byly připraveny za použití v podstatě stejného postupu jak je popsán níže v příkladu 12. Kokultivace byla prováděna po dobu 3 dnů, hustota inokula odpovídala hodnotě OD 1,5 při 660 nm. Substrátem použitým po kokultivaci byl substrát MSO obsahující 10 mg/1 2-(2-hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurinu (9-met), 350 mg/1 karbenicillinu, 350 mg/1 cefotaximu a 0,1 mg/1 kyseliny indoloctové (IAA), a sodnou sůl ZOGN v uvedeném množství. 9-met (získaný od Apex Organics Ltd., Velká Británie) byl přidán, aby
-25CZ 292882 B6 inhiboval glykosylaci zeatinu a derivátu zeatinu. Pro každé ošetření bylo použito 18 listových terčíků.
Sedm týdnů po kokultivaci byly prýty přeneseny na substrát MSO obsahující 300 mg/1 kanamycin-substrátu, 350 mg/1 cefotaximu, 350 mg/1 karbenicillinu, 0,1 mg/1 kyseliny indoloctové a 10 mg/1 6-(m-hydroxybenzylamino)purinu (OH-BA) a umístěna do teploty 25 °C. 6-(m-hydroxybenzylamino)purin může být připraven jak popsali Kamínek a kol. (Plant Growth Reg. 6, str. 113-120,1987).
Po šesti týdnech byl na substrátu obsahujícím kanamycin zjištěn počet zelených prýtů. Rezistence vůči kanamycinu svědčí o tom, že je prýt transgenický, neboť společně s genem betaglukuronidasy byl přenesen gen NPT způsobující rezistenci vůči kanamycinu. Na daném substrátu nepřežily žádné netransformované prýty (negativní kontroly), zatímco všechny transformované prýty (pozitivní kontroly), obsahující aktivní gen NPT, přežily.
Procento prýtů rezistentních vůči kanamycinu z celkového počtu regenerovaných prýtů bylo vypočítáno dělení počtu zelených výhonků, které přežily na substrátu obsahujícím kanamycin, počtem prýtů přenesených na substrát obsahující kanamycin. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka 11
Pozitivní selekce geneticky transformovaných prýtů za použití sodné soli ZOGN při různých teplotách
T ZOGN Počet kanamycin-rezistentních % kanamycin-rezistentních prýtů
°c prýtů na listový terčík z celkového počtu prýtů
25 1 0,3 4,3
30 1 1,3 14,8
35 1 0,2 26,7
25 15 0 0
30 15 2,4 26,2
35 15 0,2 18,2
Test popsaný v tomto příkladu byl proveden se spojeným společně přeneseným genem. To znamená, že pro selekci je používán gen beta-glukuronidasy, zatímco je testována rezistence, která je následkem zavedení společně přeneseného genu NPT (genu rezistence vůči kanamycinu).
Výše uvedené výsledky ukazují, že je, pokud je prováděna selekce za použití genu betaglukuronidasy, kromě genu beta-glukuronidasy, exprimován též společně přenesený gen. Kromě toho je vidět, že selekce při zvýšených teplotách (tj. okolo 30 až 35 °C) zvyšuje počet vybraných prýtů na listový terčík a též podíl transgenických prýtů z celkového počtu regenerovaných prýtů.
Při provádění testu X-gluc při různých teplotách bylo v souvislosti s vynálezem pozorováno, že je aktivita vnitřní beta-glukuronidasy vyskytující se v rostlinách inhibována při vysokých teplotách, zatímco aktivita zavedené beta-glukuronidasy není ovlivněna. Bylo tak zjištěno, že se aktivita vnitřní beta-glukuronidasy postupně snižuje se zvyšující teplotou až do přibližně 60 °C, a při této teplotě nebyla pozorována v podstatě žádná aktivita vnitřní beta-glukuronidasy (jak bylo stanoveno pomocí testu X-gluc). To může vysvětlit lepší výsledky selekčního procesu při zvýšených teplotách.
-26CZ 292882 B6
Příklad 10
Pozitivní selekce v porovnání a v kombinaci s negativní selekcí
Bylo předvedeno, že zde popsaný systém pozitivní selekce je velmi účinný a výhodný ve srovnání s tradiční negativní selekcí zalouženou na kanamycinu. Dobrých výsledků lze však též dosáhnout pokud se systém pozitivní selekce použije společně s tradiční negativní selekcí.
Níže uvedená tabulka tedy znázorňuje výsledky, vyjádřené jako počet GUS-pozitivních prýtů tabáku na listový terčík a procento GUS-pozitivních prýtů z celkového počtu prýtů, získané při pozitivní selekci za použití sodné soli BA3GN, tradiční negativní selekci za použití kanamycinu a N6-benzyladeninu (BA), stejně jako při kombinaci pozitivní selekce a negativní selekce. Kromě toho byla do pokusu zařazena i selekce za použití sodné soli BA3GN společně se sacharo-1,415 laktonem (SL) (silným specifickým inhibitorem zavedené beta-glukuronidasy).
Byly používány v podstatě tytéž postupy, jako jsou popsány níže v příkladu 12, ale místo substrátu MSO byl použit substrát Gamborg B5.
-27CZ 292882 B6
>-« Ή o
'0)
> >
0 0 (O £5
λ: Li
i—1 to
0)
u <1)
N > +
Pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí
m rH CM «4< σι
•s «Β o
m r> o
H O O i—I CM
O
O
CN
H CM ΓΌ O
«»
O o o O o
** koncentrace v mg /
-28CZ 292882 B6
Pokus s N6-benzyladeninem společně s kanamycinem, který představuje tradiční systém negativní selekce, byl prováděn ve dvou nezávislých opakováních, přičemž v každém opakování bylo použito 54 listových terčíků. V celkovém počtu 23 vybraných prýtů byl nalezen jediný GUSpozitivní prýt. Výsledky pokusů používajících sodnou sůl GA3Gn byly získány za použití 324 listových terčíků. Pokus se sacharo-l,4-laktonem byl prováděn jednou za použití celkového počtu 162 listových terčíků.
Výše uvedená tabulka ukazuje, že pomocí pozitivní selekce za použití 15 mg/1 sodné soli BA3GN (bez kanamycinu) bylo získáno třicetkrát více GUS-pozitivních prýtů na listový terčík ve srovnání s tradičním systémem negativní selekce za použití 1 mg/1 N6-benzyladeninu a 300 mg/1 kanamycin-sulfátu. Při použití pozitivní selekce bylo dále vyšší procento GUSpozitivních prýtů z celkového počtu prýtů (7,4 %) než při použití negativní selekce (4,3 %).
Výhodných výsledků bylo též dosaženo při použití kombinace pozitivní a negativní selekce, tj. při nahrazení cytokininů v tradičním systému negativní selekce, založeném na kanamycinu, cytokinin-glukuronidem (sodnou solí BA3GN). Tak v případě, že bylo 15 mg/1 sodné soli BA3Gn kombinováno s 300 mg/1 kanamycin-sulfátu, bylo procento získaných GUS-pozitivních prýtů jedenáctkrát vyšší než při použití N6-benzyladeninu a kanamycinu s 33 mg/1 kanamycinsulfátu, byl počet získaných GUS-pozitivních prýtů na listový terčík čtyřicetkrát vyšší než při použití N-benzyladeninu a kanamycinu.
Při použití 15 mg/1 sodné soli BA3GN v kombinaci s inhibitorem GUS sacharo-l,4-laktonem (10 mM) byl ve srovnání s použitím samotné sodné soli BA3GN (15 mg/1) několikanásobně snížen jak počet GUS-pozitivních prýtů na listový terčík, tak procento GUS-pozitivních prýtů. Tato skutečnost svědčí o tom, že zavedený gen GUS je odpovědný za výhodné výsledky získané při použití systému pozitivní selekce, jelikož přidání sacharo-l,4-laktonu do růstového média silně inhibuje v buňkách pěstovaných na tomto substrátu přeměna neaktivního cytokininglukuronidu (sodné soli BA3GN) na aktivní cytokinin katalyzovanou beta-glukuronidasou, což vede k pozorovanému snížení počtu indukovaných prýtů. Systém pozitivní selekce tedy funguje jak se předpokládalo, tj. tak, že se využije zavedená beta-glukuronidasa k rozštěpení cytokininglukuronidu v geneticky transformovaných buňkách, čímž se v těchto buňkách uvolní volný cytokinin, což vede k tvorbě prýtů.
Příklad 11
Modifikace systému pozitivní selekce pro zlepšení selekčního účinku cytokinin-glukuronidů
Bylo již uvedeno (viz tabulka 3, příklad 2), že beta-glukuronidasa přirozeně se vyskytující v rostlinách je neaktivní při relativně vysokých hodnotách pH, tj. při pH okolo 6 nebo více, zatímco zavedená beta-glukuronidasa je aktivní až do pH 8. Přidáním sloučeniny, která může zvýšit vnitřní pH buněk, například dusičnanu amonného, do růstového média, se může dále zlepšit selektivita tvorby prýtů z GUS-pozitivních buněk, jelikož se tím umožní blokovat jakoukoli beta-glukuronidasovou aktivitu projevující se jako pozadí, která je důsledkem přirozeně se vyskytující beta-glukuronidasy v netransformovaných buňkách.
Níže uvedená tabulka uvádí počet prýtů získaných z GUS-pozitivních a GUS-negativních listových terčíků tabáku za použití různých koncentrací sodné soli BA3GN a dusičnanu amonného. Byly použity stejné postupy jako jsou popsány v příkladu 2, s tou výjimkou, že místo substrátu MSO byl použit substrát Gamborg B5.
-29CZ 292882 B6
Účinek dusičnanu amonného na selektivitu tvorby prýtů z listových terčíků ošetřených sodnou solí BA3GN (pH = 7)
<1> -r->
Π5
r-1 £ in t-H
B1 tn
I
X X X X X
OJ OJ OJ (*> r-l
vo σν o- i-l m
cn cn OJ H vi*
cn cn θ' in
o- Γ- m cn OJ
X
Ψ
cn
>N
X X X g) X
Ο- r* cn c
ι-1 <D
0
Ή
>
OJ r* vo O OJ
cn o o -Φ co
cn tn OJ m
X X X
i—i OJ
>N >N O c >N
X vo
<D U Ή o O M > <1) U Ή
> >
O i—l o O O
tn in tn tn in
OJ co li· m kO
cu (tí Ό
K
0) tn <υ
Faktor selektivity je poměr počtu GUS-pozitivních prýtů a počtu GUS-negativních prýtů, tedy známkou selektivity daného ošetření
-30CZ 292882 B6
Je vidět, že použití sodné soli BA3GN a dusičnanu amonného ve vhodných koncentracích má za následek selektivní tvorbu prýtů z GUS-pozitivních listových terčíků. Například při kombinaci 15mg/l sodné soli BA3GN a 55 mM dusičnanu amonného bylo získáno z GUS-pozitivních 5 listových terčíků 34 prýtů, zatímco na odpovídajících GUS-negativních listových terčících podrobených stejnému ošetření se nevytvořily žádné prýty.
Další možností pro zlepšení selektivity systému pozitivní selekce za použití cytokinin-glukuronidů je přidání substrátu, který po rozštěpení beta-glukuronidasou způsobuje zvýšení pH, do io růstového média, čímž se v netransformovaných buňkách inhibuje hydrolýza cytokininglukuronidů, aniž by byl inhibován účinek volných cytokininů.
Tento princip byl doložen pokusem zkoumajícím účinech různých koncentrací kyseliny o-kumaryl-beta-D-glukuronové (CouGN) na tvorbu prýtů z GUS-negativních listových terčíků 15 tabáku za indukce pomocí sodné soli BA3GN nebo N6-benzyladeninu. Při štěpení kyseliny o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové působením beta-glukuronidasy je uvolňována kyselina o-kumarová. Kyselina o-kumarová se spontánně přeměňuje na kumarin (viz příklad 11 v našem souvisejícím patentu 284828. Tento proces zahrnuje odstranění karboxylové skupiny (viz níže), čímž se zvyšuje pH na hodnotu, při které, jak se předpokládá, je snížena aktivita přirozené 20 rostlinné beta-glukuronidasy.
Byl proveden pokus za použití N6-benzyladeninu (BA) v koncentraci 0,5 mg/1 a sodné soli BA3GN v koncentraci 10,0 mg/1. Pro každé ošetření bylo použito 12 terčíků a počet prýtů byl zaznamenán po 19 dnech. Výsledky jsou uvedeny níže.
-31 CZ 292882 B6
Účinek o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové kyseliny (CouGN) na tvorbu prýtů indukovanou N*-benzyladeninem (BA) nebo sodnou solí BA3GN
D
O
σι r- rH kD o·
xf xf 04 rH rH
>N >N >N >N >N
σι 03 00 CO <D 0) Φ Q)
- * X X X ti ti ti ti ti
o rH o r-H rH
i—1 rH 0) Φ a> 0 <D
U ϋ u u υ
Ή Ή VH Ή Ή
> > > > >
o H oj <*) co in o o oo o rrH rH rH
O O O O O > co m σι ko ko o o o o o r- Γ <x> c- in
O o σι o σι 03 σι o- rH kO
O σ> o r- o <Λ O) xf xť 04 rH rH
rH rH rH
rH kD H kD rH O > ko r- m t t o
in 04 kD o .125 25 in O
o o o o rH
o o o o o o o? cn ·φ in ko rin o- ko ko oj ro kO CO on rH rH rH
-32CZ 292882 B6
Výše uvedená tabulka ukazuje, že přítomnost o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové kyseliny v růstovém médiu inhibuje regeneraci prýtů indukovanou pomocí sodné soli BA3GN, ale nikoli pro indukci pomocí N6-benzyladeninu. Nejlepších výsledků bylo v tomto pokusu dosaženo při použití o-kumaryl-beta-D-glukopyranuronové kyseliny v koncentraci okolo 3-4 mM. Na omezení tvorby prýtů indukované pomocí BA3GN se může podílet několik mechanizmů, včetně následujících: 1) zvýšení pH díky uvolnění o-umarové kyseliny, jak je vysvětleno výše, 2) substrátová kompetice mezi CouGN a BA3GN, mající za následek nižší frekvenci hydrolýzy BA3GN, a 3) snížení transport GA3GN do buněk. Ačkoli nebyl stanoven přesný mechanizmus způsobující pozorované omezení tvorby prýtů v přítomnosti CouGN, předpokládá se, že je za to pravděpodobně alespoň částečně odpovědné zvýšení pH. V každém případě tento pokus svědčí o tom, že selektivita systému pozitivní selekce může být zlepšena použitím zavedeného genu beta-glukuronidasy pro vytvoření samoregulačního mechanizmu, který může podstatně snížit účinek libovolného enzymu projevujícího se jako pozadí.
Příklad 12
Příprava geneticky transformovaných rostlin
V tomto příkladu je uveden obecný způsobe, který může být použit pro přípravu geneticky transformovaných rostlin.
Rostlinný materiál
Listy (Nicotiana tabacum „Wisconsin 38“) se získají z rostlin pěstovaných in vitro nebo in vivo.
V posledně uvedeném případě se listy před transformací sterilizují. Sterilizace může být prováděna umístěním listů na dobu 20 minut do roztoku 5% chlornanu vápenatého obsahujícího 0,1 ml povrchově aktivního činidla Tween 80 na 1, a následným pětinásobným promytím ve sterilní vodě. Rostliny pěstované in vitro se pěstují v nádobách na substrátu 1/2 MSO (substrát 1/2 MSO je stejný substrát jako MSO v 50% koncentraci a výjimkou agaru, cukru a vitaminů).
Listy se po jednom umístí do Petriho misek o průměru 14 cm. Poté se nařežou na části o ploše přibližně 1 cm2 neobsahující hlavní žilky tak, aby okraje částí byly tvořeny oříznutou tkání. Všechna řezaná tkáň, která byla odbarvena sterilizací pomocí chlornanu, se odstraní.
Kultivace bakterií
Jeden den před transformací se založí kultura bakterií přidáním 2 až 3 ml bakterií do 200 ml média LB v Erlenmeyerově baňce. Bakterie se pěstují při teplotě 28 °C za míchání (300 otáček za minutu).
Transformace
Kultura bakterií se bezprostředně před transformací naředí padesátkrát nebo na hodnotu OD 0,1 (při 660 nm) médiem 1/2 MSO. Přibližně 10 ml naředěné suspenze bakterií se nalije na Petriho misku o průměru 9 cm, a do této suspenze se ponoří přibližně na 15 minut části listů. Části listů se poté vyjmou a nadbytek suspenze bakterií se odstraní za použití sterilního filtračního papíru.
Kokultivace
Den před transformací se na kokultivační misky (typicky obsahující substrát MSO) umístí sterilní filtrační papír a části listů, které byly ponořeny do suspenze bakterií se umístí vrchní stranou dolů na filtrační papír. Listové části se inkubují v růstové komoře po dobu dvou dnů za světelného cyklu 12 hodin světla a 12 hodin tmy.
-33CZ 292882 B6
Selekce a regenerace
Listové části se přenesou na Petriho misky obsahující cytokinin-glukuronidy v uvedeném množství a buď 350 mg/1 karbenicillinu + 350 mg/1 cefotaximu, nebo pouze 800 mg/1 karbenicillinu, v některých případech v kombinaci s kanamycin-sulfátem. Listové části se po třech týdnech subkultivují na stejné médium, které však neobsahuje cytokinin-glukuronidy.
Test
Regenerované prýty se přenesou do nádob obsahujících substrát 1/2 MSO. Přibližně po dvou týdnech se na zelených prýtech provede test X-gluc. Prýty se subkultivují jak je potřeba.
Výsadba
Geneticky transformované prýty, které vytvořily kořeny (a které jsou GUS-pozitivní) se vysuší do růstové komory. Prýty se zasadí do vhodného růstového média, například rašeliníku. Poté se přikryjí umělohmotnými sáčky a pěstují se přibližně po dobu jednoho týdne, a poté se odstřihnou dva rohy umělohmotných sáčků. Po dalším týdnu se umělohmotové sáčky odstraní.
Příklad 13
Indukce tvorby prýtů z rostlinné tkáně s a bez zavedeného genu beta-glukuronidasy za použití sterolu a di-beta-D-glukuronidu
Na GUS-pozitivních a GUS-negativních listových terčících tabáku byly prováděny podrobné testy, jako jsou popsány v příkladech 4 a 5, za použití substrátů obsahujících 100 mg/1 betasitosterolu, 100 mg/1 cholesterolu, 10 mg/1 kampesterolu, 1,88 mg/1 sodné soli BA3GN a různé koncentrace kyseliny di-beta-D-glukuronid-glycyrrhizové ve formě diamoniové soli. Kromě toho polovina substrátů obsahovala tridemorf (0,1 mM). Počet prýtů byl zjištěn po 17 dnech.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
Tabulka 15
Počet regenerovaných prýtů na listový terčík
Diamoniová sůl kyseliny glycyrrhizové Bez tridemorfu S tridemorfem (0,1 mM)
Koncentrace (mM) GUS+ GUS- GUS+ GUS-
0,00125 1,6 0 0,4 0
0,125 1,1 0 2,3 0
0,125 1,3 0,1 7,7 0,4
1,25 0 0 0 0
6,25 0 0 0 0
Je vidět, že kombinace sterolů a diamoniové soli kyseliny glycyrrhizové má za následek selektivní tvorbu prýtů v listových terčících obsahujících zavedený gen beta-glukuronidasy. (Jak je uvedeno výše (viz příklad 4), tridemorf inhibuje syntézu sterolů a tudíž má inhibiční účinek na regeneraci prýtů, pokud nejsou rostlinné tkáni podávány steroly). Ačkoli lze selektivní indukci tvorby prýtů pozorovat za použití substrátů jak obsahujících, tak neobsahujících tridemorf, získá se větší počet prýtů při použití substrátů obsahujících tridemorf, a zejména při koncentraci diamoniové soli kyseliny glycyrrhizové 0,125 mM.
-34CZ 292882 B6
Příklad 14
Selektivní inhibice tvorby prýtů z listových terčíků divokého typu tabáku (GUS-) indukované BA3GN
Byly prováděny pokusy jak je popsáno v příkladu 2 za použití odrůdy tabáku „Burley“ místo odrůdy „Wisconsin 38“.
Do substrátu byl přidáván v různých koncentracích methyl-beta-D-glukuronid (MG), který je pomocí GUS hydrolyzován na methanol a kyselinu glukuronovou, a to společně buď s 1 mg/1 N6-benzyladeninu (BA), nebo s 15 mg/1 sodné soli BA3GN. Bylo zjištěno, že methanol inhibuje přirozený enzym GUS, aniž by příliš ovlivňoval zavedený gen získaný z Escherichia coli (Kosugi a kol., 1990, Planí Sci., 133 - 120), zatímco kyselina glukuronová, která se uvolňuje z methyl-beta-D-glukuronidu je produktem inhibujícím enzymy GUS. Pokud se místo nezávislého přidání těchto dvou sloučenin přidá methyl-beta-D-glukuronid, jsou produkty hydrolýzy vytvářeny lokálně a jsou koncentrovány v kompartmentu, které je lokalizován enzym. Získané výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 16.
Tabulka 16
Sloučenina Koncentrace mg/1 Prýtů na listový terčík Poměr
Methyl-beta-glukuronid 0 1,0 0,50 2,0
1000 1,91 1,00 1,9
3300 2,25 0 0
Kyselina glukuronová 0 1,00 0,50 2,0
1000 0,33 0,08 4,1
3300 0,83 0 -
1000 0,42 0 -
Legenda:
koncentrace BA je 1 mg/1 koncentrace BA3GN je 15 mg/1
Výše uvedené výsledky ukazují, že přidání buďto methyl-beta-D-glukuronidu, nebo kyseliny glukuronové má za následek snížení počtu prýtů získaných na substrátu obsahujícím BA3Gn ve srovnání s počtem prýtů získaných na substrátu obsahujícím N6-benzyladenin. Pomocí ošetření tkáně methyl-beta-D-glukuronidem před expresí zavedeného enzymu GUS může být tedy možné selektivně odstranit nebo snížit aktivitu či účinky přirozeného enzymu GUS během selekčního procesu. Za účinky methyl-beta-D-glukuronidu a jiných sloučenin, které mají podobný účinek na tkáně divokého typu ošetřené glukuronidy, mohou být též odpovědné rozdíly mezi zavedeným a přirozeným enzymem GUS týkající se inhibice pomocí substrátové kompetice, senzitivity vůči substrátové inhibici, množství (aktivity) enzymu, a senzitivity vůči inhibici produktem.
Je též možné, že methyl-beta-D-glukuronid působí pomocí kompetice s příjmem jiných glukoronidů, jako je BA3GN. Pokud tomu tak je, mohl by být methyl-beta-D-glukuronid použit pro snížení nebo eliminaci příjmu ostatních glukuronidů do buněk divokého typu. Zavedení genu kódujícího enzym GUS, který je vylučován, nebo genu kódujícího enzym GUS, který je vylučován, nebo genu kódujícího glukuronid-permeasu, může být v případě, že je příjem inhibován například přidáním methyl-beta-D-glukuronidu do substrátu, použito pro selekci transgenických buněk. V případě glukuronid-permeasy budou přijímat glukuronid (například BA3GN) pouze transgenické buňky a díky obecné přítomnosti přirozeného enzymu v rostlinách
-35CZ 292882 B6 (viz příklad 2) bude sloučenina aktivována uvnitř buněk exprimujících permeasu (nebo jiný protein, který usnadňuje příjem glukuronidů).
Je též zajímavé, že samotná glukuronové kyselina je schopna selektivně inhibovat účinek BA3GN, pravděpodobně pomocí blokování účinku N6-benzyladeninu uvolňovaného štěpením GAB3GN pomocí GUS.
Příklad 15
Použití pozitivní selekce a kombinace pozitivní a negativní selekce pro zlepšení účinnosti selekce transgenických buněk, tkání nebo prýtů u rekalcitrantních druhů
Cukrová řepa je vzhledem k produkci transgenických rostlin velmi rekalcitrantním druhem.
V běžných transformačních systémech se za podmínek, které vyvolávají vznik transgenických prýtů, „vybere“ mnoho netransformovaných prýtů. Totéž bylo zjištěno v případě provádění pokusů s pozitivní selekcí (bez přidání kanamycinu) za použití 5 až 15 mg/1 sodné soli BA3GN za podmínek popsaných v následujícím textu.
V příkladu 10 (viz tabulka 12) bylo zjištěno, že kombinace pozitivní a negativní selekce redukuje počet „vybraných“ netransformovaných prýtů. Kombinace pozitivní a negativní selekce byla proto testována na cukrové řepě, a bylo zjištěno, že poskytuje výhodné výsledky.
Transformace byla prováděna za použití děložních explantátů, jak je popsáno níže.
Semena se nechala klíčit po dobu 4 dnů v temnu na substrátu obsahujícím 0,7 g/1 agarosy a 2 mg/1 sacharosy. Semenáčky byly poté přeneseny do nádoby (Nunc) obsahující substrát 1/2 x MSO a pěstovány po dobu 3 dnů na světle. Ze semenáčků byly odstraněny dělohy a děložní explantáty byly poté na řapíku odřeny malým kartáčkem obsahujícím suspenzi Agrobacteria, které obsahovalo 35S-NPTII a 35S-GUS (OD 660 = 0,1). Dělohy byl poté kokultivovány po dobu 4 dnů na substrátu obsahujícím substrát 1/10 MSO a 200 μΜ acetosyringonu. Transformované explantáty byl přeneseny na substrát MSO doplněný 0,25 mg/1 BA nebo 15 mg/1 sodné soli BA3GN (místo BAP), 0,025 mg/1 kyseliny naftyloctové, 400 mg/1 kanamycinu, 800 mg/1 karbenicillinu a 25 mg/1 ml vancomycinu, a explantáty byly na tomto substrátu inkubovány po dobu 21 dnů. Regenerované prýty byl poté přeneseny do nádob obsahujících stejný substrát. Po 52 dnech na tomto substrátu byly všechny prýty přeneseny na substrát MSO doplněný 800 mg/1 karbenicillinu, 25 mg/1 vancomycinu a 0,1 mg/1 N6-benzýladeninu. Po 14 dnech byly na vyselektovaném rostlinném materiálu provedeny testy GUS, jak je popsáno v příkladu 2.
Výsledky jsou uvedeny níže v tabulce.
Tabulka 17
Transformace cukrové řepy
Kombinace pozitivní a negativní selekce
Počet explantátů GUS+ piýty % GUS+ prýtů
Negativní selekce 100 0 0%
Pozitivní a negativní selekce 177 4 2,3 %
Legenda
Negativní selekce: 400 mg/1 kanamycin-sulfátu + 1 mg/1 BAP
Pozitivní a negativní selekce: 400 mg/1 kanamycin-sulfátu + 15 mg/1 BA3GN
-36CZ 292882 B6
Je vidět, že při kombinaci pozitivní a negativní selekce jsou vytvářeny transgenická prýty za podmínek, za kterých při použití tradičního systému negativní selekce žádné transgenické prýty vytvářeny nejsou, což svědčí o tom, že využití systému pozitivní selekce je u cukrové řepy velmi výhodné ve srovnání s použitím samotných systémů negativní selekce.
Tato skutečnost dále znamená, že použití pozitivní selekce (samotné v kombinaci s negativní selekcí) může umožnit vytvoření transgenických rostlin u ostatních rekalcitrantních druhů, u kterých je dosahováno pouze nízkých transformačních a selekčních frekvencí, nebo u kterých není za použití systémů negativní selekce vůbec možno vyselektovat transgenické rostliny.
Příklad 16
Systémy pozitivní selekce založené na použití neaktivních zdrojů dusíku, které jsou učiněny dostupnými pomocí zavedení metabolizujících genů
Byly prováděny pokusy, jak jsou popsány v příkladu 2, s tím, že normální obsah dusíku substrátu MSO byl snížen na nulu. Místo toho byly přidány dusíkaté sloučeniny uvedené v Tabulce 18. Substrát obsahoval 1 mg/1 N6-benzyladeninu. Jako pozitivních kontrol bylo použito substrátů obsahujících dusičnan amonný.
Tyto pokusy byly prováděny kvůli zjištění, zda jsou opiny neaktivní, nebo zda mohou být rostlinnými buňkami využity jako zdroje dusíku na substrátech neobsahujících žádný další zdroj dusíku. Jelikož jsou geny kódující enzymy, které metabolizují opiny, dobře známé, je hlavním předpokladem pro použití opinů v systému pozitivní selekce identifikace opinů, které nemohou být použity jako zdroje dusíku pro rostlinné tkáně a buňky, které neobsahují zavedení geny umožňují rostlinným buňkám využít dané opiny. Výsledky jsou uvedeny níže.
Tabulka 18
Účinek opinů na tvorbu prýtů z listových terčíků tabáku na substrátech bez dusíku (počet prýtů na 9 listových terčíků)
Sloučenina 0 Koncentrace (mM) 80
10 20 40
Octopin 13 11 15 15 6
Mannopin 13 >50 >50 >50 >50
Nopalin 13 18 19 11 8
Dusičnan amonný 13 >50 >50 >50 >50
(kontrola)
Na testovaných substrátech neobsahujících žádný dusík bylo regenerováno několik prýtů, což je možné, protože dusík může být mobilizován z tkáně explantátu. Úplně se vyhnout tvorbě prýtů v pokusech s nulovým obsahem dusíku je možné, pokud se explantáty nechají trpět nedostatkem dusíku pomocí pěstování rodičovských kultur před použitím na substrátech bez dusíku, nebo pokud se explantáty předběžně ošetří na substrátu bez dusíku, například bez hormonů indukujících tvorbu prýtů.
Překvapivě bylo zjištěno, že octopin a nopalin nemohou podporovat tvorbu prýtů, zatímco mannopin může sloužit jako dobrý zdroj dusíku a podporovat tvorbu prýtů z listových terčíků.
Je pravděpodobné, že důvodem, proč nopalin a octopin nemohou sloužit jako zdroje dusíku je, že tyto sloučeniny nejsou přijímány, metabolizovány nebo hydrolyzovány na využitelné sloučeniny. Je dobře známo, že organizmy obsahující geny podílející se na transportu a metabolizmu opinů, například Agrobacterium, jsou schopné využít opinů jako zdroje dusíku, zatímco kmeny
-37CZ 292882 B6
Agrobacteria nebo jiných bakterií neobsahující geny kódující metabolizmus opinů nejsou schopny růstu na substrátech obsahujících jako zdroj dusíku pouze opiny.
Na základě těchto výsledků mohou být systémy pozitivní selekce vytvořeny pomocí zavedení jednoho nebo více genů metabolizmu nebo transportu opinů do transgenických rostlinných buněk za použití selekčních substrátů, které neobsahují nebo mají snížený obsah jiných zdrojů dusíku než je například nopalin nebo octopin. Identifikace nebo izolace genů či genetického materiálu poskytujícího příjemci schopnost využít octopin a nopalin je popsána v literatuře: viz například C. Beaulieu a kol., 1988, Can. J. Microbiol., 38: 843 - 40; P. M. Klapwijk a kol., 1976, J. Gen. Microbiol., 96: 155 - 163; C.L. Schardl a C.I. Kado, 1983, Mol. Gen. Genet., 191: 10 - 16; nebo H. Wabiko a kol., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97 - 103. Po izolaci genetického materiálu kódujícího metabolizmu opinů mohou být transformovány eukaryotické organizmy pomocí standardních postupů popsaných v literatuře za použití vhodných sekvencí nutných pro fungování genů pro metabolizmus opinů.
Na základě výše uvedených výsledků je pravděpodobné, že podobným způsobem mohou být použity další opiny a odpovídající katalyzující geny, a dále se zdá pravděpodobné, že mohou být podobně použity další neaktivní zdroje dusíku identifikované podobným způsobem a jim odpovídající geny, například amidy v kombinaci s amidasami, peptidy v kombinaci se specifickým peptidasami, atd.
Příklad 17
Tvorba transgenického kalusu z rekalcitrantních druhů za použití pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí
S určitými modifikacemi byly prováděny pokusy, jak jsou popsány v příkladu 10. Použitými rostlinnými druhy byl velmi rekalcitrantní linie „V486“ ozimé řepky olejky a „S487“ jarní řepky olejky. Semena byla sterilizována a nechána klíčit jak je popsáno v příkladu 15. Jako explantátů bylo použito hypokotylů, které byly inokulovány a kokultivovány jak je popsáno v příkladu 10. Po kokultivaci byly explantáty přeneseny na substrát MSO obsahující 0,1 mg/1 kyseliny nafityloctové, 0,01 mg/1 kyseliny gibberellové (GA3), 500 mg/1 karbenicillinu, 50 mg/1 kanamycinsulfátu a 6,0 g/1 agarosy. Substrát kromě toho obsahoval buď 1 mg/1 N6-benzyladeninu, nebo 3,75, 7,5 či 15,0 mg/1 sodné soli BA3GN. pH bylo upraveno na hodnotu 5,8. Použité Agrobacterium obsahovalo ve své T-DNA gen GUS a gen neomycinfosfotransferázy II řízené promotory 35A. Testy GUS byly provedeny po 8 týdnech a kalus, který vykazoval intenzivní modré zbarvení ve většině kalusových buněk, byl shledán GUS+.
Tabulka 19
Tvorba transgenického kalusu z řepky olejky za použití pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí
Řepka olejka, ozimý typ „V486“
BA3GN (mg/1) BA (mg/1)
3,75 7,5 15 1
Explantátů s kalusem 19,0 % 23,0 % 30,6 % 0%
GUS+ kalusů na explantát 1,4% 1,4% 2,3 % 0%
GUS+ kalusů na kalus 7,1 % 5,9 % 7,5 % 0%
-38CZ 292882 B6
Řepka olejka, jarní typ „S487“
BA3GN (mg/1) BA (mg/1)
3,75 7,5 15 1
Explantátů s kalusem 5,2 % 9,2 % 6,3 % 0%
GUS+ kalusů na explantát 1,7% 2,3 % 0,9 % 0%
GUS+ kalusů na kalus 33,3 % 25,0 % 24,2 % 0%
Tyto pokusy ukazují, že v případě těchto velmi rekalcitrantních typů řepky olejky pouze pozitivní selekce v kombinaci s negativní selekcí umožňuje selekci transgenického kalusu, jelikož za použití tradiční negativní selekce (substráty sN-benzyladeninem místo sodné soli BA3GN) nebyl získán žádný GUS-pozitivní kalus.
Tato skutečnost svědčí o tom, že zavedené systémů pozitivní selekce je též v kalusových systémech velmi výhodné ve srovnání se samotnými systémy negativní selekce. Svědčí též o tom, že použití pozitivní selekce (samotné nebo v kombinaci s negativní selekcí) může umožňovat vytvoření transgenických rostlin u dalších rekalcitrantních druhů, u kterých je dosahováno pouze nízkých transformačních a selekčních frekvencí, nebo u kterých není za použití systémů negativní selekce vůbec možno vyselektovat transgenické rostliny.
Poté co byl transgenický kalus vybrán, může být regenerován do transgenických prýtů, například na substrátu obsahujícím cytokinin v kombinaci s nízkou koncentrací auxinů. Během tohoto procesu není nutná žádná selekce.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Geneticky transformované rostlinné buňky, které obsahují kromě požadované nenativní nukleotidové sekvence další nenativní kointrodukovanou sekvenci, která slouží jako reportérový a selekční gen tím, že produkt exprese kointrodukované nukleotidové sekvence vyvolává nebo zvyšuje pozitivní účinek vybrané živiny nebo sloučeniny podávané populaci buněk obsahující transformované a netransformované buňky, a tím poskytuje transformované a netransformované buňky, a tím poskytuje netransformovaným buňkám pozitivní výhodu ve srovnání s netransformovanými buňkami, takže geneticky transformované buňky mohou být selektovány z populace rostlinných buněk, přičemž sloučenina není antibiotikum, toxin ani herbicid.
2. Geneticky transformované rostlinné buňky podle nároku 1, kde sloučenina je vybrána ze skupiny obsahující cytokininy, auxiny, gibereliny, vitaminy, sacharidy, opiny, proteiny, steroly a saponiny.
3. Geneticky transformované rostlinné buňky podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2, kde kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje (I) manóza-6-fosfátizomerasu, (II) UDPgalaktóza-4-epimerasu, (III) permeasu nebo (IV) gen pro metabolizmus nebo transport opinů.
4. Geneticky transformované rostlinné buňky podle kteréhokoliv z předchozích nároků, které obsahují ještě další introdukovanou sekvenci.
5. Geneticky transformované rostlinné buňky podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde kointrodukovaná nukleotidová sekvence kóduje nenativní β-glukuronidasu.
-39CZ 292882 B6
6. Geneticky transformované rostlinné buňky podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde kointrodukovaná nukleotidová sekvence obsahuje gen pro metabolizmus nebo transport opinů, které po expresi umožňuje, aby opin působil v transformovaných buňkách jako zdroj aminokyselin, dusíku a/nebo sacharidů.
7. Geneticky transformované rostlinné buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde exprese nebo transkripce kointrodukované nukleotidové sekvence vede ke zvýšení aktivity enzymu vyskytujícího se endogenně v populaci buněk, takže aktivita enzymu v transformovaných buňkách je vyšší než aktivita enzymu v netransformovaných buňkách, nebo kde exprese nebo to transkripce introdukované nukleotidové sekvence vede k blokování metabolizmu sloučeniny, která je dodávána populaci buněk, nebo k blokování syntézy sloučeniny.
8. Geneticky transformovaná rostlina obsahující rostlinné buňky podle kteréhokoliv z předchozích nároků.
9. Rostlinné potomstvo pocházející z rostliny podle nároku 8.
10. Semena procházející z rostlin podle nároku 8 nebo 9.
CZ19973624A 1991-08-28 1997-11-14 Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují CZ292882B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK911522A DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Fremgangsmaade og kemiske forbindelser

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ292882B6 true CZ292882B6 (cs) 2003-12-17

Family

ID=8105710

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ94444A CZ284828B6 (cs) 1991-08-28 1992-08-27 Způsob selekce geneticky transformovaných buněk a sloučeniny pro použití v tomto způsobu
CZ19973624A CZ292882B6 (cs) 1991-08-28 1997-11-14 Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ94444A CZ284828B6 (cs) 1991-08-28 1992-08-27 Způsob selekce geneticky transformovaných buněk a sloučeniny pro použití v tomto způsobu

Country Status (16)

Country Link
EP (3) EP0601092B2 (cs)
JP (1) JPH06511146A (cs)
AT (2) ATE181963T1 (cs)
AU (1) AU664200B2 (cs)
CA (1) CA2110401C (cs)
CY (1) CY2217B1 (cs)
CZ (2) CZ284828B6 (cs)
DE (2) DE69233771D1 (cs)
DK (2) DK152291D0 (cs)
ES (1) ES2135415T5 (cs)
GR (1) GR3031279T3 (cs)
HU (1) HU227979B1 (cs)
NZ (1) NZ244135A (cs)
RU (1) RU2126834C1 (cs)
SK (1) SK280639B6 (cs)
WO (1) WO1993005163A1 (cs)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9304200D0 (en) † 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) * 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
DE4305295B4 (de) * 1992-03-04 2006-05-18 Volkswagen Ag Kraftfahrzeug mit einem Sitz, der zumindest eine zwischen einer Ruhestellung und einer Betriebsstellung bewegbare Seitenwange besitzt
US5608147A (en) * 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
CN1155713C (zh) * 1995-04-06 2004-06-30 塞迷尼思蔬菜种子公司 选择转基因植物细胞的方法
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
ATE226255T1 (de) * 1997-07-07 2002-11-15 Pioneer Hi Bred Int Fumonisinentgiftungszusammensetzungen und verfahren
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
US7026526B2 (en) 2000-02-11 2006-04-11 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
ATE373098T1 (de) 2000-04-21 2007-09-15 Martek Biosciences Corp Trophische umwandlung von obligat phototropischen algen durch metabolische manipulation
WO2001096383A2 (en) 2000-06-16 2001-12-20 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
EP1334181B1 (en) 2000-11-17 2010-03-17 Metabolix, Inc. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
WO2002081696A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Syngenta Participations Ag Oryza sativa nuclear cap binding protein 80
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
EP1527183B1 (de) 2002-07-26 2008-08-20 BASF Plant Science GmbH Neue selektionsverfahren
US20060253917A1 (en) 2002-12-26 2006-11-09 Bret Cooper Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
CN101001951B (zh) 2004-08-02 2011-06-15 巴斯福植物科学有限公司 分离转录终止序列的方法
EP2163632A1 (en) 2004-10-05 2010-03-17 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP2072620B1 (en) 2004-12-08 2013-05-08 SunGene GmbH Expression casstettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
WO2006084868A2 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
ATE541043T1 (de) 2005-03-08 2012-01-15 Basf Plant Science Gmbh Expressionsverstärkende intron-sequenz
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
WO2006111512A1 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Basf Plant Science Gmbh Improved methods controlling gene expression
US8034994B2 (en) 2005-04-19 2011-10-11 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US7994399B2 (en) 2005-06-23 2011-08-09 Basf Plant Science Gmbh Methods for the production of stably transformed, fertile Zea mays plants
CN101268194A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 巴斯福植物科学有限公司 使用ta-siRNA调控基因表达的方法
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
AU2010270309A1 (en) 2009-07-10 2012-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
EP2275564A1 (en) 2009-07-17 2011-01-19 Freie Universität Berlin Means and method for the production of transgenic plants that are resistant to clubroot
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
CA2781835A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
BR112012012747A2 (pt) 2009-11-27 2015-09-29 Basf Plant Science Co Gmbh "endonuclease quimérica, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, vetor célula hospedeira ou organismo não humano, método para fornecer a endonuclease quimérica, método para a recombinação homóloga dos polinucleotídeos e método para mutação direcionada de polinucleotídeos"
CA2782014C (en) 2009-11-27 2021-08-31 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
CN102782141A (zh) 2009-12-03 2012-11-14 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚-特异性表达的表达盒
US9598473B2 (en) 2011-06-10 2017-03-21 Keygene N.V. Trichome-specific transcription factor modulating terpene biosynthesis
WO2013014585A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Basf Plant Science Company Gmbh Plant transformation method
EP2768952A2 (en) 2011-10-19 2014-08-27 Keygene N.V. Methods for producing cinnamolide and/or drimendiol
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
CA2881787A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
CN104531656B (zh) * 2015-01-05 2018-02-09 安徽省农业科学院水稻研究所 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
US20190338302A1 (en) 2016-02-04 2019-11-07 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
WO2018156686A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
CA3111368A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield rna
CN114829612A (zh) 2019-12-16 2022-07-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用配对切口酶的改进的基因组编辑
CA3161725A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Timothy James Golds Precise introduction of dna or mutations into the genome of wheat
AU2021267373A1 (en) 2020-05-06 2022-12-08 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as JAK2 inhibitors
AU2022388555A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ajax Therapeutics, Inc. 6-he tero aryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
GB8725402D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Jefferson R A Gene fusion
GB8626862D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Jefferson R A Gene fusion
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase

Also Published As

Publication number Publication date
ATE443771T1 (de) 2009-10-15
DE69229556T3 (de) 2007-09-20
CA2110401C (en) 2006-02-21
JPH06511146A (ja) 1994-12-15
EP0601092A1 (en) 1994-06-15
EP0896063B1 (en) 2009-09-23
DK152291D0 (da) 1991-08-28
EP0601092B2 (en) 2006-11-15
EP0601092B1 (en) 1999-07-07
SK280639B6 (sk) 2000-05-16
SK22294A3 (en) 1994-07-06
WO1993005163A1 (en) 1993-03-18
HUT69606A (en) 1995-09-28
CY2217B1 (en) 2003-04-18
CZ44494A3 (en) 1994-06-15
EP0896063B9 (en) 2010-05-26
DK0601092T4 (da) 2007-02-26
DE69229556T2 (de) 1999-11-11
NZ244135A (en) 1995-04-27
HU227979B1 (en) 2012-07-30
DK0601092T3 (da) 2000-02-07
HU9400570D0 (en) 1994-05-30
GR3031279T3 (en) 1999-12-31
EP0896063A2 (en) 1999-02-10
DE69233771D1 (de) 2009-11-05
EP0896063A3 (en) 2000-02-09
CA2110401A1 (en) 1993-03-18
ES2135415T3 (es) 1999-11-01
RU2126834C1 (ru) 1999-02-27
ES2135415T5 (es) 2007-06-01
DE69229556D1 (de) 1999-08-12
ATE181963T1 (de) 1999-07-15
AU664200B2 (en) 1995-11-09
CZ284828B6 (cs) 1999-03-17
EP0530129A1 (en) 1993-03-03
AU2556792A (en) 1993-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ292882B6 (cs) Geneticky transformované rostlinné buňky a rostliny, které je obsahují
US5994629A (en) Positive selection
Enríquez-Obregón et al. Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation
JP3698722B2 (ja) マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択
Chowdhury et al. Stably transformed herbicide resistant callus of sugarcane via microprojectile bombardment of cell suspension cultures and electroporation of protoplasts
JPH11262394A (ja) グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性を有する遺伝子操作により得られた植物細胞及び植物、前記細胞及び植物を産生するために使用するｄｎａフラグメント及び組換え体
JPH03504798A (ja) 植物類においてリジン過剰生産を誘導する方法
JPH07505531A (ja) 単子葉植物細胞の形質転換法
WO2008137985A2 (en) Methods for inducing cotton embryogenic callus
JPH11511116A (ja) 新規な植物ホルモンである５−ブロモインドール−３−酢酸を用いる植物組織およびトランスジェニック植物組織の両方の再生
US6815205B2 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
US6255559B1 (en) Methods for producing genetically modified plants, genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby
AU6127099A (en) Methods for producing genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby
US6924145B1 (en) Selection method
US20130091606A1 (en) Methods and compositions for enhanced Agrobacterium-mediated transformation Efficiency
WO1997020034A9 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
Ellis et al. REGENERATION OF THE GENETICALLY ENGINEERED CONIFER-THE IMPORTANCE OF THE BIOLOGICAL SYSTEM¹
Australia GENETIC TRANSFORMATION OF WHEAT
Tripepi et al. PRE-CONDITIONING RHODODENDRON AND CHRYSANTHEMUM LEAF EXPLANTS AFFECTS TRANSIENT BETA-GLUCURONIDASE EXPRESSION AFTER BIOLISTIC PARTICLE BOMBARDMENT
MXPA05013189A (es) Transformacion y selección de plantas
JP2000501395A (ja) インドール―３―酢酸のオーキシンアナログ

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20120827