HU227979B1 - Method for the selection of genetically transformed cells - Google Patents

Method for the selection of genetically transformed cells Download PDF

Info

Publication number
HU227979B1
HU227979B1 HU9400570A HU9400570A HU227979B1 HU 227979 B1 HU227979 B1 HU 227979B1 HU 9400570 A HU9400570 A HU 9400570A HU 9400570 A HU9400570 A HU 9400570A HU 227979 B1 HU227979 B1 HU 227979B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
glucuronidase
compound
selection
gus
Prior art date
Application number
HU9400570A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9400570D0 (en
HUT69606A (en
Inventor
Finn T Okkels
Robert J Whenham
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8105710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU227979(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of HU9400570D0 publication Critical patent/HU9400570D0/hu
Publication of HUT69606A publication Critical patent/HUT69606A/hu
Publication of HU227979B1 publication Critical patent/HU227979B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

ELJÁRÁS GENETIKAILAG TI
SEJTEK
A találmány tárgya eljárás genetikailag transzformáit növényi sejtek szelektálásáraf amelyekbe egy kiválasztott nukleotid-szekvenciát építettünk be, oly sódon hogy a transzformált sejteknek szelektív előnyt biztosítunk, anélkül, hogy a nem-transzformált sejteket elpusztítanánk, illetve a találmány tárgyát képezik az eljárás során alkalmazott üj vegyületek.
Jól ismert tény, hogy ha egy új genetikai anyagot kell bejuttatni egy sejtpopulációba transzformációval, akkor a sejteknek csak egy bizonyos számát sikerül transzformálni, azaz csak ezek kapják meg az üj genetikai anyagot. Azután azonosítani kell a genetikai transzformált sejteket, hogy ezek elkülöníthetők legyenek a populációban maradt nemtranszformált eejtöktől. A transzformált sejtek azonosítása és elválasztása hagyományosan a «negatív szelekció** elvén alapul, másszóval egy olyan módszer alkalmazásán, amelyben csak a transzformált sejtek képesek életben maradni és szaporodni, míg a nem-transzformált sejtek szaporodása gátolt, vagy éppen el is pusztulnak egy olyan anyag hatására, amelyet a transzformált sejtek el tudnak viselni.
Például, ha egy növényi sejtpopulációt genetikai transzformációnak vetünk alá, akkor a transzformált sejtek szelekciója tipikusan olyan szelekciós gén alapján történik, amely egy antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódol. A szelekciós gént - amelynek önmagában nincs hasznos funkciója a genetikailag transzformált növényben és esetleg éppen káros hatással van a növényre - egy olyan génhez kapcsoljuk, illetve azzal ko-transsforrnáljuk a kérdéses növénybe úgy, »
- 3 hogy mindkét gén beépüljön a sejtpopulációba, illetve inkább a populáció egyes sejtjeibe, mivel a gyakorlatban nincs lehetőség arra, begy as összes sejtet, vagy legalább a legtöbb sejtet transzformáljuk. Λ sejteket azután egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely azt as antibiotikumot vagy herbicidet tartalmazza, amelyre a genetikailag transzformált sejtek a szelekciós gén hatására rezisztensek, eszel lehetővé válik a transzformált sejtek azonosítása, mivel a nem-transsformait sejtek - amelyek nem tartalmazzák a kérdéses antibiotikum vagy herbicid rezisztencia gént növekedése gátlódik, illetve elpusztulnak.
Ezen negatív szelekciós módszereknek azonban megvan a hátrányuk is. Először is, a nem-transzformált sejtek elpusztulhatnak a szelekciós ágens, például az antibiotikum jelenléte miatt a táptalajban. Ennek következtében ha a sejtpopuláció egy egybefüggő szövet, akkor megvan annak a kockázata, hogy nemcsak a nem-transzformáXt sejtek, hanem a transzformált sejtek is elpusztulnak, annak következtében, hogy a nem-transzformált sejtek pusztulása elvághatja a táp anyag-utánpótlást a transzformált sejtekhez, illetve a roncsolt vagy pusztuló sejtek toxikus vegyületeket választhatnak ki.
A negatív szelekció egy másik hátránya, hogy egy szükségtelen gén, például egy antibiotikum rezisztencia van jelen, amely esetleg nem kívánatos. Például a környezetvédő csoportok és kormányhatöságok azon gondolkodnak, hogy vajon biztonságos-e antibiotikum-rezisztenciát kódoló géneket beépíteni növényekbe és mikroorganizmusokba. Ennek a megfontolásnak különösen az élelmiszer-növények és olyan mikroorganizmusok esetében van jelentősége, amelyeket nem egy zárt környezetben való felhasználás céljára terveztek (például a mezőgazdaságban használatos növények) , valamint olyan mikroorganizmusoknál, amelyeket zárt környezetben való felhasználás céljára terveztek, de amelyek véletlenszerűen kiszabadulhatnak a zárt környezetből» Jóllehet esek a megfontolások lehetnek alaptalanok, mégis vezethetnek ahhoz, hogy a kormányzat korlátozza az antibiotikum-rezisztencia gének felhasználását például növényekben, és ennek következtében kívánatos lehet öj módszerek kifejlesztése genetikailag transzformált sejtek szelektálására, amelyek nem függenek az ilyen génektől.
A negatív szelekció hátránya továbbá, hogy a toxikus anyagokkal kezelt növényi szövetek vagy sejtek sokkal érzékenyebbekké válnak a baktérium-fertőzésre. Ez például, akkor probléma, amikor az égrobacteriumot használjuk transzformáló vektorként, mivel a kezelt szöveteket vagy sejteket néha túlnövik a baktériumok még akkor is, ha a baktériumok szaporodásának gátlására antibiotikumokat használunk, kmellett a sejtek vagy szövetek szelektálására negatív szelekció alkalmazása megköveteli, hogy a bevitt gén expressz lóját nagyon pontosan időzítsük a szelekciós eljáráshoz. Ha a transzgenikus sejteket egy toxikus vegyülettel kezeljük, mielőtt a detoxikálő gén expresszálódik, illetve mielőtt elegendő géntermék keletkezik a toxikus vegyület hatásának antagonízálására, a transzgenikus sejtek a nemtransz gén.ikus sejtekkel együtt pusztulnak el. Ha a szelékei- 5 őt töl későn végezzük, akkor a transzgeníkus sejtek vagy szövetek szelekciója gátlödhat, például azáltal, hogy a nemtranszgeníkus sejtek vagy szövetek hajtást növesztenek.
A fenti hátrányokat ki lehet küszöbölni a jelen találmány szerinti módszer alkalmazásával (a ^pozitív szelekció** alkalmazásával), amely először teszi lehetővé, hogy genetikailag transzformált sejteket azonosítsunk és izoláljunk, anélkül, hogy a nem-transzformált sejteket károsítanánk vagy elpusztítanánk a populációban, és anélkül, hogy antibiotikum vagy herbicid rezisztencia gént juttatnánk be a növénybe. Amellett, hogy nincs szükség antibiotikum vagy herbicid rezisztencia gén alkalmazására, azt is igazoljuk, hogy a jelen találmány szerinti pozitív szelekciós módszer gyakran sokkal hatékonyabb mint a tradicionális negatív szelekció. Amint azt az alábbi példákban ismertetjük, a dohány levélkorongokból szelektált transzgeníkus hajtások száma pozitív szelekció alkalmazásával például harmincszor nagyobb, mint a szokásos kanamicin alapú negatív szelekciós rendszer alkalmazásánál, és a transzgeníkus hajtásoknál a pozitív, valamint a negatív szelekció kombinációjával tízszer nagyobb szelekciós frekvenciát lehet elérni, mint ha csak a negatív szelekciót alkalmazzuk (lásd 11. példa). Emellett a pozitív szelekció használatának megvan az az előnye is, hogy egyetlen gén használható riporter génként és szelekciós génként ís, ezzel leegyszerűsödik a vektor konstrukciója, sokkal stabilabbak a konstrukciók, és 1ÖG %-os a korreláció a riporter gén és a szelekciós gén expresszlója között. A pozitív szelekció elíminálja az előzőkben említett, az időzi$·
- 6 tóssel kapcsolatos- problémákat is, mivel a szelekciót eredményezd vegyületek mindig a gén expressziója következtében keletkeznek. Tehát a szelektív hatóanyag akkor halmozódik fel, ha a szelekciós gén expresszálódik, a szelekció akkor lép fel, ha már elegendő mennyiségű szelektív hatóanyag termelődött,
A találmány tárgya tehát eljárás genetikailag transzformált eejtek szelektálására egy sejtpopulációból, úgy, hogy e transzformált sejtekbe egy kiválasztott nukleotid szekvenciát juttattunk be, miközben a. transzformált sejtekben a kiválasztott nnkleotid-szekvancía vagy egy azzal együtt bejuttatott nukleotíd-szekvencía egy, a sejtpopuláció tápanyagához adagolt vegyület vagy tápanyag pozitív hatását fokozza, és ezzel lehetővé teszi, hogy a transzformált sejtek azonosíthatók, illetve szelektálhatők legyenek a nemtranszformált sejtek közül.
Az egyik megvalósítási mód szerint az eljárást ügy hajtjuk végre, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely legalább egy olyan inaktív vegyületet vagy tápanyagot tartalmaz, amely közvetlenül vagy közvetve aktiválódik azokban a sejtekben, amelyek a kiválasztott, nukleotíd-szekvenciát, illetve az azzal együtt bejuttatott szekvenciát tartalmazzák, de a vegyület vagy tápanyag inaktív marad a nem-transzformált sejtekben, illetve kevésbé aktív a nem-transzformált sejtekben mint a transzformált sejtekben, így a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert, és ezáltal a sejtpopulációból kivé 1a s z thatÓk.
Egy másik -megvalósítási mód szerint az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely legalább egy olyan vegyületet vagy tápanyagot tartalmaz, amely akkor hozzáférhető a transzformált sejt számára, ha a kiválasztott nukleotid-szekvencia, illetve a vele együtt bejuttatott nukleotid-szekvemcia expresszálődik vagy át Íródik, a vegyűlet vagy tápanyag nem hozzáférhető' a nem-transzforsiált sejtek számára, illetve kevésbé hozzáférhető a nem-transzformált sejtek szamára, mint a transzformált sejtek száziára, igy a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert, és ezáltal a sejtpopuláeíőból kiválaszthatók.
Egy másik megvalósítási siód szerint a kiválasztott nukleotid-szekvenciával együtt bejuttatott szekvencia expressziója fokozza egy olyan enzimnek az aktivitását, amely endogén módon megtalálható a sejtpopulációban, oly módon, hogy a transzformált sejtekben as enzim aktivitása nagyobb mint a nem-transzformált sejtekben levő enzim aktivitása.
Egy további megvalósítási mód szerint a kiválasztott nukleotid-ssekvencia, vagy a kiválasztott nukleotíd szekvenciával együtt bejuttatott nukieotid-szekvencia expressziója azt eredményezi, hogy egy, a sejtpopulációhoz adagolt vegyület metabolismusa blokkolódik, illetve egy vegyűlet szintézise blokkolódik a transzformált sejtekben, és ezáltal a transzformált sejtek megkülönböztethetőek vagy szelektálhatok a nem-transzformált sejtek közül.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan új hatóanyagok, amelyek alkalmazhatók az említett eljárásban.
- S *
E hatóanyagokat as (1) általános képlet szemlélteti, ahol
R2 jelentése hidrogénatom, “CH3, -S-CHj, -SO^-Ci^,
-30¾-fenil, -SH, -ÖH, képletű csoport, klór atom vagy -S-E10, ~RH~Ri0 vagy -0-R^° általános képletű csoport, ahol
R^O jelentése egy S-D-giükopíranuronozíl-csoport (ennek szerkezetét a példákban szemléltetjük), illetve ennek sója vagy a karbonsav™funkcionál kialakított észter- vagy amid-származéka,
Rs jelentése benzilesöpört, amely a fenilcsoporton hidroxil-, 1-6 szénatornos álkoricsoporttal, halogénatommal, 1-4 szénatomos alkilesoporttal, -NHg vagy ~CF3 csoporttal vagy -ö-R10, -s-R10 vagy -RH-R10 általános képletű csoporttal lehet helyettesítve;
1-8 szénatomos alkil- vagy 2-8 szénatornos alkenilcsoport, amely egy-hárem hidroxil-, glükozil-oxivagy 1-6 szénatomos alkoxi-, fenil- és/vagy -0-R10, -S-R10 vagy -RH-R10 általános képletű csoporttal lehet helyettesítve; észterezett 1-6 szénatornos alkil- vagy 2-6 szénatornos alkenil-, furfurxl- vagy cíklohexil-ureido-, fenil-ureido- vagy toluílnreido-osoport; és vagy i) R2 és Y együttesen egy kötést képeznek;
ii) R3 és R9 közül az egyik hidrogénatom vagy egy R10 általános képletű csoport, a másik pedig az X helyettesítővel együtt egy kötést képez, vagy R° jelentése rihozil-, 5 *-íossforibozii-, glükóz!!vagy -CHgCHCRHgiCOOH csoport, és R3 az X helyettesítővel együtt egy kötést képes, és iíx) Rs jelentése hidrogénatom, -CHg, -S-CH3,
-SO2~CH3, -3-0¾-feníl, -SH, -OH, Cl vagy ~HH~RX0 vagy ~0~R10 általános képletű csoport;
vagy iv) &7 jelentése ri.bozi.l-, 5’-foszforibozxl vagy glükózílesöpört, R3 jelentése hidrogénatom, R® és ¥ együttesen egy kötést képesnek, és R3 és X együttesen egy kötést képes;
ássál a feltétellel, hogy R3, R3, R&, R3 és R3 késül as egyik egy ö-D-glükopíranuronozxl-csoportot, illetve annak sóját vagy a karbonsavfunkcíénál kialakított észter- vagy amid-származékát képviseli vagy tartalmazza.
& találmány tárgykörébe tartósnak továbbá olyan vegyűietek, amelyek a fenti eljárásban használhatók, Ilyenek a (IX) általános képletű vegyület, ahol
R3 jelentése cxsz-CH-CK-COOH csoport, annak sója, illetve a karbonsavcsoporton kialakított észterszármazéka, illetve a cisz- és/vagy transz-CH-CH-CöOH csoporton kialakított amidszármazéka, és pűO jelentése a fenti.
Emellett a találmány tárgyát képezik genetikailag transzformait sejtek, amelyeket az előzőkben ismertetett módszer alapján szelektálunk, különösen növényi sejtek valamint növények, ások utódai és magvak, amelyek az ilyen genetikailag transzformált sejtekből származnak.
A «sejt** kifejezésen bármely olyan sejttípust értünk, amelyből egyedi, genetikailag transzformált sejtek azonosíthatók és izolálhatok a találmány szerinti módszer alkalmazásával., beleértve a növényi sejteket, állati sejteket és mikroorganiznusokat, azaz a baktériumokat, gombákat, élesztőket stb. A *ssejt« kifejezés emellett protoplasztokra is vonatkozik, azaz a sejtek membránnal határolt plazmájára, amelynek nincs sejtfala* Jóllehet nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti általános elvek bármely sejttípusra használhatók, a -módszert különösen alkalmasnak találtuk arra, hogy genetikailag transzformált sejteket szelektáljunk vele.
A «sejtpopuláció* kifejezés bármely olyan sejtcsoportra vonatkozik, amelyet genetikai transzformációnak vetettek alá, és amelyből olyan sejteket szeretnénk azonosítani, amelyek genetikailag transzformálva vannak, és a genetikailag transzformált sejteket szeretnénk elválasztani a genetikailag nem-transzformált sejtektől. A populáció lehet például egy szövet, egy szerv vagy azok egy része, különálló sejtek populációja egy szufesztráton vagy szabsztratban, azaz például mikroorganizmus sejtek tenyészete vagy egy egész szervezet, például egy egész növény.
A «szelektálás* kifejezés egy olyan eljárásra vonatkozik, amellyel a genetikailag transzformált sejteket azonosítani és/vagy izolálni lehat a genetikailag nem-transzformált sejtek közül, az alábbiakban ismertetett módszer alkalmazásával .
A «kiválasztott nukleotid-szekvencía* szakkifejezés jelenthet bármely nukleotid-szekveneiát, amelyet a kérdéses « φφ
- 11 sejtbe be akarunk juttatni, hogy ezáltal genetikailag transzformált sejteket hozzunk létre. A nukXeotid szekvenciák növényekbe, oíkroorganizousokba és állatokba való bejuttatását széles körben gyakorolják, és nincs korlátozás azokra a nukleotid-szekveneiákra nézve, amelyeknek a jelenlétét ki lehet mutatni. a pozitív szelekciós módszer segítségével, amelyet az alábbiakban ismertetünk. Ennek a módszernek az alkalmazásával a kiválasztott szekvencia jelenléte a genetikailag transzformált sejtekben meghatározható anélkül, hogy az előzőkben említett, a tradicionális negatív szelekciós rendszerekhez kötődő hátrányok előfordulnának.
Az az állítás, hogy egy nukleotid-szekvenciát «együtt bejuttatunk” a kiválasztott nukleotid-szekveneiával, arra a tényre utal, hogy a két nukleotid-szekvenciát egymáshoz kapcsoljuk, illetve más módon együtt juttatjuk be őket oly módon, hogy az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia a sejtben jelzi, hogy a kiválasztott nukleotid-szekvéneiét is bejuttattuk a sejtbe, azaz, ha az egyik nukleotid-szekveneiáról kimutattuk, hogy sikerült bevinni, akkor annak valószínűsége, hogy a másikat is sikerült bejuttatni, jelentősen megnő. Tehát a két nukleotíd-ssekvenoía általában, de nem szükségszerűen ugyanannak a genetikai konstrukciónak a részét képezi, és Így ugyanazzal a vektorra lehet bejuttatni«
Az alábbiakban ismertetett módszerek akkor is használhatók, ha az együtt bejuttatott nukleotid-szekvenciát és a kiválasztott nukleotid-szekvenciát egymástól függetlenül visszük be egy sejtbe. Ezt például ügy hajthatjuk végre, hogy ugyanazt a baktériumot használjuk mindkét gén bevitelére , és a kiválasztott nukieotid szekvenciából viszonylag nagyszámú molekulát építünk be a sejtekbe, és ennek következtében annak valószínűsége viszonylag nagy, hogy azok a sejtek, amelyekről ki lehet mutatni, hogy az együtt bejuttatott nukieotid-szekvenoiát expresszálják, tartalmazzák és expresszéljak a kiválasztott nukieotid-szekvenoiát is. Két vagy több gén egymástól független bejuttatása, amely a géneknek ugyanabban a sejtben való együtt expressziójával végződik, várhatóan alacsony valószínűséggel játszódik le, és a pozitív szelekciós módszerrel kapott magasabb szelekciós frekvenciák ennélfogva várhatóan különösen előnyösek az i Xy en rendszerekben.
Kivel szükséges, hogy a bejuttatott nukleotid-szekvenciák expresszálódjanak a transzformált sejtekben, egy konstrukció, amely a két nnkleotid-szekvencíát tartalmazza, általában, de nem szükségszerűen tartalmaz szabályozó szekvenciákat is, amelyek lehetővé teszik, hogy a nukieotid-szekvenciák expresszálódjanak; ilyenek például az ismert promoterek és transzkripciós termínátorok. Tehát az együtt bejuttatott nukleotíd-szekvencía általában egy promoterhez kapcsolódik, amely lehet konstitutív vagy szabályozható promoter, és a kiválasztott nukleotíd-szekvencía általában szintén egy konstitutív vagy szabályozható promoterhez kapcsolódik.
kmint az előzőkben említettük, a módszer különösen alkalmas genetikailag transzformált növényi sejtek szelektálására, ezzel lehetővé téve az ilyen sejtek azonosítását
9
- 13 9 * > » φ <·*
Φ «
9« «9 és izolálását, anélkül, hogy szelekciós géneket használnánk, amelyek antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódolnak, Ami a hagyományos negatív szelekciós módszereket illeti, az itt ismertetett pozitív szelekciós módszer használható sejtek lm vitro történd szelektálására. De a pozitív szelekciós módszer használható in vívó is. A pozitív szelekciós módszer in vivő történő' alkalmazása különösen fontos az egész növényekkel vagy növényi részekkel végzett genetikai transzformáció esetében, amikor a növények vagy növényi részek mind transzformált és nemtranszformált növényi részeket tartalmaznak, mivel a transzformáit sejtek szelekcióját anélkül érhetjük el, hogy közvetlenül károsítanánk a szomszédos nemtranszformált sejteket. így tehát a transzformált sejtek szelektív 58előnnyel” rendelkeznek a nemtranszformált sejtekkel szemben (például képesek hajtásokat hozni), de a nem transzformált sejtek nem szenvednek semmilyen súlyos hátrányt abból a szempontból, hogy károsodnak vagy elpusztulnak, amint az az antibiotikumokat vagy heröícideket alkalmazó negatív szelekció esetében történik.
áz 88inaktív vegyület vagy tápanyag” kifejezés jelenthet bármely olyan vegyületet vagy tápanyagot inaktív vagy prekurzor formában, azaz olyan formában, hogy az együtt bejuttatott nukleotíd-szekveneia expressz lójának hiányában egy olyan formában létezik, amely biológiailag lényegében inaktív a kérdéses sejtek szempontjából, de amely az együtt bejuttatott nukleotíd-szekveneia expresszálása vagy transzkripciója esetében hidrolizál vagy más módon aktiválódik, illetve metafeoiizálődik, és így olyan, genetikailag transz14 formált sejtek jönnek létre, amelyek tartalmazzák a kiválasztott nukleotid-szekvenciát,. és ennek következtében szelektív előnnyel rendelkeznek, és lehetővé válik, hogy azonosítsuk és izoláljuk őket. A® inaktív vegyűlet vagy tápanyag lehet tehát egy inaktív növényi növekedés-szabályozó, például egy inaktívált citokínin, auxin vagy gibberellin, egy vitamin, például inaktívált tiamín, egy szénhidrát (például mannőz, ha az együtt bejuttatott nukleotíd-szekvencia mannőz-ó-foszfát-izomerázt tartalmaz, vagy galaktoz, vagy egy gaiaktózt tartalmazó· vegyűlet, ha az együtt bejuttatott szekvencia nDP-gaIakfóz-4-epimerázt kódol), egy nitrogéntartalmú vegyűlet (például egy opín, ha az együtt bejuttatott nukleotíd-szekvencia egy opín-metabolizmus vagy -transzport enzimet kódol), keményítő, fehérje vagy bármely más tápanyag inaktív formában, vagy egy olyan vegyűlet, amelynek lényeges szerepe van a sejtek és szövetek differenciálódásában és dedifferenciálódásában. & sejtek és szövetek vegyületekkei való kezelése, beleértve az esszenciális vegyületek kiegészítő hozzáadásától való függőség indukalását, használható a megfelelő inaktív vegyületekkei. Ez a megközelítés használható például akkor is, ha a szterin- vagy szaponín-szintézíst gátoljuk és inaktív szterineket vagy szaponinokat adunk hozzá. Az inaktív vegyűlet lehet továbbá például egy ásványi anyag, amely kelátot képez, és ezáltal elérhető a genetikailag transzformáit sejtek számára.
A hagyományos negatív szelekcióval ellentétben, amelyben a nemtranszformált sejtek károsodnak vagy elpusztulnak egy antibiotikum, herbicid vagy taxin táptalajban φ * φ φ » »*» χ* χ φ X Φ β Λ*Φ X Φ
Φ Φ * * φφφ ΦΦ ΦΦΓ való jelenlétének következtében, a pozitív szelekció során alkalmazott inaktív vegyüietek vagy tápanyagok nem rendelkeznek káros hatással a nemtranszformált sejtekre nézve. Ezzel ellentétben,, a transzformált sejtek rendelkeznek azzal a fiziológiai előnnyel, amely lehetővé teszi, hogy azonosítsak és izoláljuk őket, míg a nemtranszformált sejteket nem érinti, illetve sokkal kevésbé érinti a szelekciós célokkal alkalmazott inaktív vegyület vagy tápanyag jelenléte»
A hagyományos negatív szelekciós” módszereket tehát az jellemzi, hogy egy olyan szelekciós gént használnak, amely csökkenti egy hozzáadott vegyületnek a transzformált sejtekre gyakorolt negatív hatását» Ezzel szemben a pozitív szelekció” kifejezés egy olyan szelekciós gén alkalmazására utal, amely egy hozzáadott vegyületnek a transzformált sejtekre gyakorolt pozitív hatását idézi elő vagy fokozza»
Egy szelekciós eljárásban alkalmazott vegyület emellett rendelkezhet mind pozitív, mind negatív hatással. Például a mannöz a legtöbb növényi sejtre toxikus, de a mannöz-6-foszfát-ízomeráat tartalmazó sejtekben a negatív hatás eliminálódik és a sejtek emellett azzal az előnnyel is rendelkeznek, hogy képesek a mannózt szénhidrátforráéként alkalmazni. Ebben az esetben egy adott vegyület és egy adott gén egy kombinált pozitív és negatív szelekciós rendszer komponensei, jóllehet egy ilyen kombinált pozitív és negatív rendszer úgy is létrehozható, hogy két vagy több gént alkalmazunk, amelyek együttesen felelnek a vegyület negatív hatásainak gátlásáért és a vegyület pozitív hatásainak megnyilvánulásáért a transzformált sejtekben» φ* * ** * ·¥* x* * χ # « φ ·*»* * «·♦.♦ « χ » .* φ χ- χ· «♦ « « « » χ # »
A pozitív szelekcióban alkalmazott inaktív vegyület vagy tápanyag nem feltétlenül olyan, hogy közvetlenül aktiválja az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia által kódolt polxpe.ptid, Lehet olyan is, amely közvetve aktiválódik, azaz az együtt bejuttatott nukXeotid-szekvenciának van egy índirekt hatása az indlrekt. vegyületre vagy tápanyagra a genetikailag transzformált sejtekben, de nincs meg ez a hatás a nemtranszformált sejtekben- Tehát az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia lehet olyan, amely a transzformáit sejtben való expresszió hatására például közvetve fokozza. egy olyan enzim hatását, amely az adott sejtpopulációban természetesen megtalálható, ennélfogva egy magasabb enzimakti vitást eredményez, és a kérdéses inaktív vegyület vagy tápanyag aktiválását a genetikailag transzformált sejAz együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia lehet például olyan, amely egy permeá2fc vagy egyéb transzport faktort kódol, amely lehetővé teszi, hogy a kérdéses vegyület vagy tápanyag átlépje a sejtmembránt és belépjen a transzformált sejtbe, illetve átlépjen egy másik {sejtszerv) membránt , azaz az inaktív vegyület vagy tápanyag «aktiválása” ebben az esetben azt jelenti, hogy a vegyületet vagy tápanyagot szelektíven felveszik a transzformált sejtek, síig a hem-transzformált sejtek nem képesek felvenni a vegyületet vagy tápanyagot, illetve sokkal kisebb sebességgel veszik fel- Ahelyett, hogy egy vegyület felvételét megkönnyítené a sejtbe, az együtt bejuttatott szekvencia a termékét egy olyan sejtrészecskébe irányíthatja, ahol az inaktív vegyület * <f x * «<ί « S ί Λ ί
-ti Λ * ϊ k· #* *
♦ #·* található, azaz például a plazma membránon kívülre, vagy a vakuólumba vagy as endoplazmatrkus retikulumba.
Ennek a megközelítésnek az alkalmazásával elért szelekció tehát azon alapul, hegy egy vegyületet hozzáférhetővé teszünk a transzformált sejtek számára, míg a vegyület nem hozzáférhető vagy kevésbé hozzáférhető a nemtranszformált sejtek számára, A kérdéses vegyület vagy tápanyag, amelynek, ebben as esetben nem kell ** inakt ívnak** lennie (azaz a vegyület vagy tápanyag olyan tulajdonságú lehet, hegy aktivitását a transzformált sejtbe lépve fejti ki, anélkül, hogy szükségszerűen alá lenne vetve például hidrolízisnek a sejten belül), ugyanolyan típusú lehet, mint az előzőkben említett vegyületek, a különbség annyi, hegy a vegyületet vagy tápanyagot ebben az esetben a transzformált sejtekbe transzportáljuk, ahelyett (vagy amellett), hogy aktiválódna a transzformált sejtekben,
Azok a vegyületek, amelyek fiziológiai hatást fejthetnek ki a sejtbe lépve, de amelyek nem. jutnak be könnyen a sejtbe vagy a sejtszervekbe, erősen hidrofil vagy hi.drofőh vegyületek, főleg töltött vegyületek, nagy molekulák vagy polimerek, különösen fehérjék, peptidek, oügoszaoharídok és poliszaoharidök, beleértve a növényi hormonokat, foszforilezett metabolitokat, azaz a foszforilezett szénhidrátokat, foszforilezett vitaminokat, foszforilezett nukleozidokat, beleértve a oltok in-eket, és az olyan vegyületeket, amelyek karhonsavtartalmű szénhidrátokhoz vagy aminosavakhoz vannak kon jógáivá, beleértve a növényi hormon konjugátumokat.
A találmány szerinti alapmódszer módosítható, oly v
$ * *: * í « » « í * s « «» «. .«« *4« «» X ·>
LS módon, hogy ahelyett, hogy aktiválnánk egy inaktív vegyületet vagy tápanyagot a transzformált sejtekben, a szelekciót úgy végezhetjük, hogy ezekben a sejtekben blokkoljuk egy vegyületnek a metahoiikus szintézisét. Például, a szubsztráthoz adott citokinin metaholizmusa blokkolható a transzformált sejtekben, egy antiszensz mechanizmus alkalmazásával. Úgy találtuk, hogy ha a zeatin glikozilezését gátoljuk, akkor az optimális hajtás-indukáló koncentráció egyötöd-egyszázad részére csökken. A zeatin métából izmus gátlásával tehát hajtás-képződést lehet kapni dohány levélkorongokból olyan zeatin koncentráció mellett, amely nem képes hajtást indukálni a nemtranszformált levélkorongokban, amelyek normál zeatin métábólizmussal rendelkeznek. Az is kiderült, hogy az indoleoetsav (XAA) hatásai fokozhatok, ha ennek a vegyületnek a metabolizmusát gátoljuk. Tehát, ha az XAA metabolizmusát részlegesen gátoljuk, akkor kiderül, hogy az XAA hatása a kallusz növekedésére ó-löö-szorosara fokozódik. Hasonlóképpen, a szénhidrát- és poliszacharid-metahólizmus gátlása befolyásolhatja egy hozzáadott szénhidrát felhasználását, és további lehetőségeket biztosít az így elvégezhető pozitív szelekcióhoz.
A transzformált sejtek ^szelektív előnye5* lehet bármely különbség vagy előny a nemtranszformált sejtekkel szemben, amely lehetővé teszi, hogy a transzformáit sejtek könynyen azonosíthatók és izoláihatók legyenek a nemtranszformált sejtek közül, Ez tipikusan egy olyan különbség vagy előny, amely lehetővé teszi, hogy az azonosítandó transzformált sejteket egyszerű vizuális módszerrel különböztessük fc fcfc * fc* fc fc »V fc Jffcfc 4 « « fc fcfcfc fc.4 fcfcfc fcfc fc* fc fc Φ tfcfc « a fc 4 fc fcfc *« la aeg, azaz anélkül, hogy egy külön vizsgálatot alkalmaznánk egy markor gén jelenlétének meghatározására.
Ha egy polipeptid, amelyet az együtt bejuttatott nukleotid-szekvéneia vagy a kiválasztott nukleotid-szekvénein kódol, közvetlenül aktivál egy inaktív vegyületet vagy tápanyagot a transzformált sejtekben, a nemtranszformált sejtek bizonyos esetekben tartalmazhatnak vagy termelhetnek bizonyos mennyiségű kérdéses poiipeptidet. Például, ha az aktiváló polipeptid egy enzim, akkor a nemtranszformált sejtek tartalmazhatnak bizonyos természetes enzimaktivitást, és a natív enzim ugyanolyan tipusű lehet, mint az, amelyet aktiváló enzimként bejuttattunk, áz ilyen esetekben az inaktív vegyűlet vagy tápanyag nem szükségszerűen kell, hogy teljesen inaktív legyen a nemtranszformáit sejtekben, mivel az is elegendő, ha a vegyűlet vagy a tápanyag egyszerűén lényegesen kevésbé aktív a nemtranszformált sejtekben mint a transzformált sejtekben. Más szóval, a transzformált sejtek és a nemtranszformáit sejtek közötti kvalitatív különbség az eredetileg inaktív vegyűlet vagy tápanyag aktiválása szempontjából bizonyos esetekben elegendő lehet a szelekciós folyamatokhoz. ilyen esetekben a natív enzimekkel versengő inhibitorokat vagy szubsztrátokát adhatunk a rendszerhez. Különösen alkalmasak azok az inhibitorok, amelyeket a natív enzim aktivál, és így az aktív inhibitor ónkatalifcikus termelődését eredményezi egy olyan szinten, amelyen a természetes enzim lényegében teljesen gátolva van.
áz együtt bejuttatott vagy' kiválasztott nukleotídwy
Κ # 99 χ 9 9 » * « ««» « # * fc * * * * ««-# $$ Λ* «ΐ
- 20 -szekvencia által kődalt aktiváló polipeptxd. nem korlátozódik egyetlen polipeptidre sem, és természetesen lehet egy olyan polipeptíd, amely aktív - akár közvetve, akár közvetlenül - egy adott vegyülettel vagy tápanyaggal szemben, amelyet a genetikailag transzformált sejtekben aktiválni kell. A polipeptid gyakran egy enzim.
A genetikailag transzformált növényi sejtek szelekciójára különösen alkalmasnak talált enzim a ő-l,3-glükuronidáz (fSGGS”), és a szelekciót ügy végezzük, hogy egy növényi növekedés-szabályozó glükuronid vegyűletet használunk, amelyet a B-glükuronidáz elhasít; ilyen például egy citokin in-glükuronid (ennek a jelentése világos less az alábbi példákból).« Meglepő, hogy a genetikailag transzformált növényi sejtek szelekciója egy GUS gén alkalmazásával elérhető, mivel a találmánnyal kapcsolatban kiderült, hogy a magasabbrendű növények natív GUS aktivitással rendelkeznek. Ez a felfedezés ellentétben áll azzal, amit korábban leírtak. Tehát a GB 2 197,653-A szabadalmi bejelentésben azt állítják,· hogy a magasabbrendü növényekben nincs kimutatható 81,3-glükuronídáz aktivitás, és ebből következik, hogy mivel a GUS aktivitás nem található meg a magasabbrendü növényekben, viszonylag egyszerű dolog egy szamunkra érdekes génkonstrukció expressziéj át követni a GUS gén alkalmazásával. Azonban, amint azt az alábbiakban megvilágítjuk (lásd példák) , ez nem igaz, és a GUS gén alkalmazása egy számunkra érdekes gén jelenlétének követésére egyáltalán nem egyszerű, annak a ténynek a következtében, hogy a magasabbrendü növények valójában igenis tartalmaznak jelentős mennyiségű saját
- 2.1 (háttér) β-glükuronidáz aktivitást.
Tehát a genetikailag transzformált növények szelektálásához a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban növesztjük, amely egy cítokínín-glükuronídot tartalmaz, ezt a transzformált sejtekben a Ó-glükuronidáz elhasitja, felszabadítja a citokinint, és ezáltal hajtás és/vagy kallusz indukciót eredményez a transzformáit sejtekben.
Számos újszerű citokinín-glükuronid vegyüíetet fejlesztettünk ki a találmány céljára. Bzeknek a vegyületeknek a készítését, valamint alkalmazásukat a genetikailag transzformált sejtek pozitív szelekciójára az alábbiakban részletesen közöljük.
Bizonyos esetekben kívánatos lehet az alábbiakban ismertetett alapmódszerek módosítása, azaz például egy hatékonyabb szelekció kidolgozása vagy a szelekciós módszer egyszerűsítése. Ha a pozitív szelekciós eljárásban alkalmazott inaktív vegyüíetet a B~glükuronidáz hasítja, akkor az alapmódszert különbözőképpen módosíthat juk. jobb eredmény elérése céljából. Az egyik ilyen módosítás lehet bizonyos sztorin-glükuronid vegyüietek alkalmazása, azaz például a koleszteril-S-D-glükuronid vagy a S-szitosztéril-B-D-glükuronid alkalmazása egy szterin-szintézist gátló vegyülettel együtt azaz például a tridemorph-fal (4-tridecíl-2,ó-öímetíl-mor™ folin). Az 5. és f. példákban ismertetjük ezeknek a vegyületeknek az alkalmazását, áz a véleményünk, hogy ha egy szterin-szinfcézis-inhibitort együtt használunk szterin-glükuronidckkal, amelyek a szterín-szintézis-ínhíbítor hatása ellen dolgoznak a Ó-glükuronidás által kifejtett hidrolízis követ- 22 fi
Restében, akkor az úgynevezett ”cross~£eeding“ (azaz az aktivált vegyület diffúziója abból a sejtből, amelyben aktiválódott, egy másik sejtbe) megakadályozható a szelekciós eljárás során, mivel a szterinvegyületek nem diffundálnak az egyik sejtből a másikba, ha a hidrofil glükuronídrész le van hasítva róluk. így tehát egy sokkal lokaiizáltabb hatást lehet elérni. Hasonló eredmények kaphatók nagyszámú egyéb glükuroniddal, amelyek egy hidrofób agiikont tartalmaznak,
Amint azt az előzőkben elmagyaráztuk, ez ellentétben van azzal a korábbi közléssel, hogy a magasabtorendű növények nem tartalmaznak természetes GUS aktivitást. Ezért ha csak a GÜS gént juttatjuk be a növénybe, ez nem szükségszerűen elegendő ahhoz, hogy a genetikailag transzformált sejtek kívánatos szelekcióját elérjük, és szükséges vagy kívánatos lehet bármely natív S-glnkuromidáz aktivitás csökkentése a sejtpopulációban. Mivel egy bejuttatott Ő-glükuronídáz a természetes S-glükuronídázétől eltérő tulajdonságokkal rendelkezhet, ezért bármely természetes ű-glükuronidáz aktivitás csökkentését különböző módokon érhetjük el, azaz például úgy, hogy a táptalajhoz egy S-glükuronidázt gátló vegyűletet adunk, amelynek erősebb a gátló hatása a természetes ú-glükuronidázra mint arra a ú-glükuronidázra, amelyet a nukleotid-szekvencia vagy annak alszekvenciája kódol. Az egyik ilyen vegyülettípus az ammőniumsök.
A natív Ö-giukuronidáz aktivitás a sejtpopulációban jelentősen csökkenthető még oly módon is, hogy a táptalajhoz egy olyan vegyűletet adunk, amely a hidrolízis következtében egy olyan terméket eredményez, amely gátolja a természetes
4
- 23 δ-glükuronidáz aktivitását, és amely jobban gátolja a természetes ö-glükuronidáz aktivitását, mint a bevitt S~gl.ükuro-~ nidáz aktivitását. Ez autoregulált vagy lokalizált módon érhető el, azaz úgy, ha specifikus sejtszervekre lokalizálóik, ahol a bevitt GUS gén elhelyezkedik, illetve nem helyezkedik el, A hiúrólízis-termékre az egyik példa, amely gátolja a természetes S-glükuronídázt, a glükuronsav, amely például a glicirrizinsav vagy steril, glükuronidok hidrolíziséből származik.
Λ sejtpopulációban a természetes Ő-glükuronídáz aktivitás tovább csökkenthető, ha a táptalajhoz egy S-glükuronidáz inhibitort adunk, főleg egy S~glükuronidot, amely azokban a sejtekben, amelyekben nincs kívülről bevitt S-glü~ kuronídáz gén, jobban gátolja a a A-glükuronídáz aktivitást, mint azokban a sejtekben, amelyekben van kívülről bevitt Sglükuronidáz gén. Ez lehet például egy rossz δ-glükuronidáz szubsztrát (egy g1ókoronid), amelynek nagyobb affinitása van a természetes S-glükuroniöázhoz mint a kívülről bevitt S-glükuronidáshoz.
A bevitt Ö-glókuronidáz gén által kódolt, a találmány céljaira használt ő-glükuronidáz viszonylag széles pHtartományban aktív, míg a számos különböző növényben talált természetes S-gíükuronidáz csak egy viszonylag szűk pH-tartományban, tipikusan körülbelül 4-5-ös pH tartományban aktív (lásd az alábbi 3. példát). A természetes S-glókuroniúás aktivitás ennélfogva ebben az esetben csökkenthető, ha. a táptalajhoz egy olyan glükuronidot adunk, amelyet a természetes S-glókuronídáz képes hidrolizáíní, és amely hidrolízis a pH emelkedését eredményezi , nid .
ilyen például az o-kusaril-glükuroMivel kiderült, begy a növényekben a természetes őglükuronidáz általában 4-5-ös pH-η aktív, a természetes Ö-glükuronidáz aktivitását ezért ügy is csökkenteni lehet, ba a táptalajhoz egy pH-szabáiyozó vegyüietet adunk, amely a táptalajban 5,5 és 8,5 közötti pH-t biztosit, előnyösen 5,0 és 8,0 közötti, például S,S-7,5-ös pH-t, vagy egy olyan pHszabályosé vegyüietet, amely megemeli a sejteken vagy a sejtszerveken belüli pH értékét az említett pH-tartosiányon belül. Ezeknél a pH-értőkéknél a kívülről bevitt OUS gén által kódolt Ő-glükuronidáz aktív, de a természetes B-glüknronidás lényegében inaktív. A használható pH-szabályozé vegyüli etekre egy példa egy ammonium-sé vagy ammónia-felszabadító anyag, például az ammőniun-nitrát.
Végezetül, a természetes Ö-glükuronidáz aktivitás csökkenthető vagy lényegében elímlnalhatő fizikai kezeléssel is, például hőkezeléssel, például az 50-65 ’C-os hőmérséklettartományban rövid, impulzusézerű kezeléseket alkalmazva körülbelül 1-2 nappal a szelekciós közegre való átvitel előtt és/vagy 30-45 oC-os hőmérsékletet alkalmazva a szelekció során (lásd 10. példa).
A növényi sejtek genetikai, transzformálását gyakran Agrobacterium törzsekkel, főleg az Agrobacterium tumeíaciens törzsekkel végezzük. Kiderült, hogy bizonyos ártalmatlanná tett Agrobacterium törzsek bajtásképzödést indukálnak, hajtásképzödést indukáló anyagok termelése miatt az együtttenyésztés ideje alatt, és az ilyen törzseket általában el kell kerülni, ha a citokínín-glükuronidok GüS hidrolízisét kell alkalmaznunk a genetikailag transzformált sejtek szelektálására. Tehát ha citokínin-glükuronidot alkalmazunk inaktív vegyülétként, akkor a sejtek genetikai transzformálását előnyösen egy olyan Agrobacterium törzzsel kell végezni, amely nem termel citokinineket, illetve egyéb hajtás (növekedés) indukáló vegyületeket, illetve amely csak lényegtelen mennyiségeket termel ezekből a vegyületekből, ezzel elíminálva, vagy lényegesen lecsökkentve a hajtás növekedését az élő baktériumok jelenléte miatt a sejteken vagy a sejtekben.
Bizonyos esetekben, például ha jobb szelekciós frekvenciára van szükség, akkor előnyös lehet, ha a kiválasztott nukleotid-szekvenciát legalább két különböző szelekciós génnel együtt juttatjuk be. A további szelekciós gén lehet például egy további gén, amely egy olyan enzimet (vagy más fehérjét illetve poiipeptidet) kódol, amely alkalmas a találmány szerinti pozitív szelekcióra, illetve lehet egy olyan gén, amely egy olyan enzimet (illetve más fehérjét vagy polípeptídet) kódol, amely alkalmas a hagyományos negatív szelekcióra, például egy toxín, antibiotikum vagy herbicid elleni rezisztenciát kódol. Tehát a genetikailag transzformált sejtek szelektálhatok a pozitív szelekció és a negatív szelekció kombinációjával, a kiválasztott nukleotid-szekvenciát a genetikailag transzformált sejtekbe olyan alszekvenciával együtt juttathatjuk be, amely legalább egy toxín, antibiotikum vagy herbicid elleni rezisztenciát kódol, és a táptalaj, amelyre a transzformait sejteket átvisszük, legalább egy toxinh, antibiotikumot vagy herbicidet tartalmaz, amelyre a transzformált sejtek rezísztensek,
Amint az előzőkben említettük, a találmány egyik tárgyat olyan genetikailag transzformált sejtek képezik, amelyeket az előzőkben említett módszerrel szelektáltunk, főleg növényi sejtek, valamint az ilyen genetikailag transzformáit sejtekből származó növények, utódok vagy magvak. Gyakran előny, hogy ezek a sejtek, amelyeknek a genom ja szelekciós markerként nem tartalmaz egy kívülről bevitt (azaz nem természetes) nukleotid szekvenciát, amely torín, antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódol. Amint azt az előzőkben említettük, kérdés, hogy vajon biztonságos-e olyan géneket bejuttatni, amelyek például antibiotikum rezisztenciát kódolnak mondjuk élelmiszernövényekben. A genetikailag transzformált növényi sejteket a találmány szerinti módszerrel szelektáljuk, amelyek nem tartalmaznak szelekciós géneket például antibiotikum rezisztenciára, valamint az ilyen sejtekből származó növényeket, utódokat és magvakat, és es a® említett szempontból előnyös.
A találmány szerinti (1) általános képletü· vegyületek szintézise
Az (I) általános képlettel leírható citckinin-glükuronidok szintézisére különböző, többé kevésbé általános módszerek ismertek, és ezek közül kettőt, amelyekről az az általános vélemény, hogy ezek a legjobbak, az alábbiakban ismertétünk.
**♦ ♦ *·χ φ * ♦.
A). A megfelelő citokinln-D-giükozld •oxidációja.
Ebben a megközelítésben a glükuronidnak megfelelő S~
-D-glükozid piranóz gyűrűjéhez kapcsolódé -CHyOh csoportot a megfelelő körülmények között karboxilesöpörttá oxidáljuk. Ennek az oxidációnak ez elvégzéséhez valószínűleg a legjobb módszere egy közvetlen, nagyon szelektív, oxigénnel végzett katalitikus oxidáció, katalizátorként fekete platinát vagy csontszenes platinát alkalmazva, valamint gyengén lügos (pH-S-lö) vizes vagy vizes alkoholos (azaz vizes etanolos) reakcióközeget alkalmazva; a reakciót megfelelő módon δδ-ΙΟδ ’C-on hajthatjuk végre 2-24 óra alatt, A szokásos, oxigéntől eltérő oxidáló szerekkel végzett oxidáció (általában nem katalitikus) is használható, de várható, hogy a végbemenő oxidációs reakció általában alacsonyabb termelési hozamot és kisebb speoifitást mutat (azaz oxidációs termékek keverékét eredményezi, hacsak nem védjük meg előzőleg az egyéb, oxidálható funkciós csoportokat a glükózid kiindulási anyagon, megfelelő védőcsoportok bevitelével).
A katalitikus oxidációs megközelítésre egy példát a találmány IC példájának.· 1-es módszerében adunk, amelyben az N^-benziladenin-9-B-Ü-glükopiranuronozidőt (BA9G) benziladenín-á-ü-ó-glükoptranuronsavvá oxidáljuk (amelyet azután náhriumsőja forrnájóban izolálunk) oxigénnel, fekete p i at ina jelen 1étében.
Ez a módszer elég széles körben alkalmazható oitokinín-9-glükuronidok szintézisére, a megfelelő 9-glükozid.okbél kiindulva. Ez a módszer megfelelőnek bizonyult például zeatin-O-glükuronid szintézisére is (lásd például az 1G pélas dát) , a megfelelő zeatín-O-gíükozidböl kiindulva; a zeatínO-giüknronid egy olyan, találmány szerinti (I) általános képletö vegyület, amelyben a glükuroníd egység egy Cg-g-alkenil-típusü R6 egység szubsztituense - amint azt a® alábbiakban meghatározzuk, h kérdéses módszer általánosan használható más, a találmány szerinti oitokinín-glükuronidokhoz is, amelyekben egy O-glükuronid egység szubsztituensként található meg egy csoporton, amely lehet benzilesöpört,
1- 8 szénatomos alkil- vagy helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport; 2-8 szénatomos aikem.il- vagy helyettesített
2- 8 szénatomos alkenilcsoport.
Ez a módszer azonban nem használható széles kórben, például a cítokinin~3~glükuronidok szintézisére.
Amint azt már jeleztük, világos, hogy ha egy olyan megközelítést alkalmazunk, amely egy citokinín-glükozíd oxidációját is magában foglalja, bármely más, az adott oxidációs körülmények között oxidálható funkciós csoportot, amely a kiindulási citokinín-glükosid molekulán jelen lehet, és amelyet változatlanul át kell vinni az (X) általános képletű végleges glükuronidba, megfelelő védőcsoportokkal meg kell védeni. A potenciálisan oxidálható csoportok, amelyek jelen lehetnek az (X) általános képletű vegyületeken, lehetnek például -SH csoport az R2 és/vagy egy csoport helyén; hidroxil- vagy glükózil-oxí-osoportok, amelyek szubsztíturnusként lehetnek jelen az csoportokon (ezek típusa helyettesített 1-8 szénatomos alkil- vagy helyettesített 2-8 szénatomos alkenilcsoport); valamint ribozil-, 58föszforíbozil” vagy glükozil-esoportok, amelyek R9 vagy R? < « φ csoportokként lehetnek jelen. Ka például arra van szükség, hogy alifás (alkoholos) hídroxilosoportokat védjünk meg, azaz a ribozíl-, 5'-foszforibozil- vagy glükózilcsoportok szekunder szénatomján levő hídroxilosoportokat, akkor megfelelő védőcsoportok lehetnek például az acetilcsoportok, amelyeket a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel lehet bevinni, és amelyeket az oxidációs eljárás után lúgos hidrolízissel el lehet távolítani.
Ha azonban az előzőkben leírt enyhe katalitikus oxidációs eljárást alkalmazzuk, akkor általában a primer alifás szénatomokon levő hidroxilesöpörtök oxidálódnak, miközben a szekunder (és tercier) szénatomokon levő hidroxilesöpörtök általában nem; tehát, ha a citohinin-B-b-glükozid glükopiranőz gyűrűjének. 5-ös pozíciójában levő -CIfeOH csoportot oxidáljuk ily módon, akkor a glükopiranóz gyűrű 2-es, 3-as és 4-es pozíciójában levő hidroxi lesöpörtök általában nem oxidálódnak, és ezért nem kell megvédeni őket. Azonban egy SH csoportot, amely egy k2 vagy k® csoport formájában van jelen, általában meg kell védeni egy ilyen katalitikus eljárás során, éspedig például benzilszármazék formájában (lásd az alábbiakban ismertetett B módszert).
Számos megfelelő citokinín-glükozíd, ehhez az eljáráshoz használható kiindulási anyag van kereskedelmi forgalomban; például ezek közül számúé különböző vegyüíetet árul az Apex 0rgani.es Ltd., Leicester, Anglia, néhány cifcckinin9-glükozidot pedig a Sigma Chemical Company árul Box
14508, St. Louis, MG, €3178, USA), á eitokinin-glükozidokat úgy is elő lehet állítani, ha a szakirodalomban ismertetett módszert alkalmazzuk, Például számos különböző megfelelő citokinin-9-glükozídot, amely az a találmányban való alkalmazás céljára megfelelő csoportot tartalmaz, szintetizálhatunk a Covley és munkatársai által közölt módszer közvetlen kiterjesztésével [Aust. J. Chem,, 31, 1095 (1975)3 a zeatin és az h6-benziladenin-9-S-D-glükopíranuronozídjainak szintéziséi-e,
B) Keenigs-Knerr típusé szintézisek
Ez a sédszer, amely h\ Koenigs és B. Knorr eredeti módszerén alapul [Chem, Bér,, 34, 957 (1901)] magában foglalja a metil-(2f3,4-tri-O-acet.íl-a-D-glükopiranozilhromíd)-uronát [rövidítése HBTG; az előállítására alkalmas módszert Bollenback és munkatársai írták le Journal of the American Chemical Society, 77, 3310 (1955)] reakcióját egy alkoholos vagy fenolos hidroxilosoporttal, egy merkaptocsoporttal (-SH) vagy egy aromás vagy telítetlen heterociklusos gyűrűben levő nitrogénatommal,
Bz a megközelítés szolgáltatja valószínűleg a legáltalánosabban alkalmazható módszer a találmány szerinti cito~ kinin-glükuronídok szintézisére (vagy a prekurzorok glükuronidjaínak szintézisére, amelyeket azután könnyen át lehet alakítani a kiválasztott citokinin-glükuronidokká), kiindulva a megfelelő eítokininekhöl [vagy a citokinin prekurzorokbői], és az a vélemény alakult ki, hogy nagyon széles körben alkalmazható az (I) általános képletű vegyületek előállítására.
Az általános eljárás az alábbi: A megfelelő citoki« * φ φ
- 31 mint vagy citokínin prekurzort oldószerben, azaz például di~ metil-formamidban, kimolinban.,· propilén-karbonátban, metanolban vagy dietíl -éterben oldjuk, majd hagyjuk, hogy reagáljon 1,25 mólekvivalens MBTG-vel 25 és 100 °C közötti hőmérsékleten 3-95 éra hosszat, előnyösen hozzáadott halogenid-megkötöszer (bromíd-megkötőszer), például ezüst-oxid vagy ezüst-karbonát jelenlétében (ha például dimetil-formamidet használunk oldószerként, akkor gyakran maga az oldószer is képes megkötni a halogénatomokat, amely esetben további megköfcöszer hozzáadására nincs szükség). Ez a reakció eredményezi az intermedier peracetilezett gíükuroniö metilészterét, amit általában izolálunk és tisztítunk? ezt általában az alábbiak szerint hajtjuk végre:
(i) az oldószert bepároljuk, majd az oldószer maradékát egy másik oldószerrel, például kloroformmal extraháljuk, ezt az oldószert eltávolítjuk az extrakkumból, majd a keletkező nyers közti terméket átkristályosítással és/vagy szokásos őszlopkromatográfíás technikáva1 kis ztí tj uk;
vagy (ii) a reakoíöelegyböl származó köztiterméket szokásos ősz lopkromatográf í ás módszerrel választjuk el, amelyben közvetlenül a reakcióelegyet visszük fel az oszlopra, majd az elnálöszert eltávolítjuk a számunkra érdekes **·♦ * Φ * « χ
Φ Φ Η *« «« eiuált frakciókból, és a nyers terméket áfekristályosítjuk.
Azokban az esetekben, amikor az (1) általános képletű vegyület kiválasztott végtermékében a glükuronid egységnek amió (glükuronamid) formában keli lennie, akkor a glükuronid egység peracetilezett metilesztér formájának amid formára való alakítását ebben a lépésben célszerű elvégezni, és ezt általában úgy hajtjuk végre, hogy a peracetilezett metilésztert (előnyösen tisztítva, például az előzőkben leírt módon) vízmentes ammónia vízmentes metanolban készített oldatával kezeljük alacsony hőmérsékleten, azaz például 0 °C és -10 °C közötti hőmérsékleten, illetve egy másik lehetőség az, hogy tömény (megfelelően telített) vizes ammónia-oldattal kezeljük hozzávetőlegesen szobahőmérsékleten, 0,5-4 óra hosszat. A glükuromamidot azután úgy izolálhatjuk, hogy az ammónia-oldatot lepároljuk, például csökkentett nyomáson, majd egy megfelelő oldószerből vagy oldoszer-elegyből, például 90%-os ©tanéiból átkristályosítjuk. Erre a konverzióra példát az 1B. példában adunk meg, amelyben az N^-benzíiadenin-3-glükuronamídot (BA3GNamid) állítjuk elő a megfelelő metílésztérből.
Emellett bizonyos típusú citokinin prekurzorokkal kezdődő eljárások esetében kémiai transzformáció ís szükséges a citokinin prekurzor egység megfelelő citokinin egységgé való átalakításához, ezt gyakran a metíléssterrel végezzük el, mielőtt a szabad glükuronidot felszabadítanánk. Erre egy példa a citokinin~9~glüknronídok szintézise (amelyek szintézisére a katalitikus megközelítési módot máshol már φ φ • ♦ φ * » φ φ ΦΦ* Φ χ * * ♦ 9
XX »Φ «Φ leírtuk), amelyet általában kielégítően végre lehet hajtani, egy helyettesített vagy helyettesitétlen purinból kiindulva, amelyben a 6-os pozícióban klöratom ven? az utóbbi 6-klör vegyületet lehet általában a megfelelő peracetilesett 9-glükuroni.d ©etilészterévé alakítani, az előzőkben leírt nődön MBTG felhasználásával, majd a 6-klőr csoportot ezután a kiválasztott -SS-R® csoporttá lehet alakítani, oly módon, hogy az utóbbi reakcióból származó termeket a megfelelő aminnal (R6-NH2) reagáltatjuk, amelyet általában ín situ a megfelelő amin-hidrok lóridból x BCÍ) és feleslegben levő (célszerűen 2~4~szeres mőlfelesleg) megfelelő bázis, például tercier alifás amin, azaz trietilamin alkalmazásával, egy megfelelő poláros oldószerben, például 1-4-szénatomos alifás alkoholban, 65-120 ’C közötti hőmérsékleten- Ezt az IC példa 2~es módszerében mutatjuk be, amelyben az N6~benziíadenín~3~ glükuroníd (BA9GK) (nátriumsója formájában) történő szintézisét írjuk leA glükuroníd egységen levő acetÉlcsoportokat ezután lügos hidrolízissel eltávolítjuk egy bázis, például vizes nátrium-hidroxíd, vizes-mefcanolos vagy etanolos nátrium-hidroxid alkalmazásával, illetve ©etanolos ammónia alkalmazásává 1 0-25 ®-C közötti hőmérsékleten, 0,5-6 óra hosszat. Egy bázis, például az előzőkben leírt vizes vagy etanolos nátrium-hidroxid oldatok alkalmazásával ez az eljárás - a feleslegben levő bázis semlegesítése után - a megfelelő citckínin-glükuroníd sóforcáját adja, míg egy reagens alkalmazása, például metanolos ammónia, majd a feleslegben levő ammónia bepárlással való eltávolítása a glükuroníd
0
- 34 amid-f ormá ját. eredményezi. Az utóbbit szokásos módszerekkel tisztítjuk, például kromatográfiával, főleg fordított fázisú kromatográfiával, és/vagy megfelelő oldószerből, például vizes szerves oldószerből, előnyösen SG-90 %-os standból való átkrístályositassa1.
világos, hogy ha a kiindulási cítokínin vagy cítokinin prekurzor* egy vagy több olyan funkciós csoportot tartalmaz, amely képes az MSTG-vel reagálni a kérdéses reakciókörülmények között, és amelyeknek változatlanul meg kell maradniuk a végső, (X) általános képleté glükuronidban, akkor az ilyen funkciós csoportokat meg kell védeni a megfelelő védőcsoportok időben való bevitelével; az ilyen reaktív funkciós csoportok, amelyek jelen lehetnek a kiindulási citokinineken és aa (X) általános képleté vegyűletnek megfelelő vegyületeket eredményezhetnek, as alábbiak lehetnek (pozíciójukat az (I) általános képletnek megfelelően adjuk meg) : -OH vagy -SH csoport, amely R2 csoportként lehet jelen, -OH vagy -SH csoport, amely Rs csoport lehet; -OH vagy -HHg csoport, amely a fenilgyéru szubsztituense lehet egy csoporton, amely helyettesített benzíl típusú; hidroxi! vagy glükózíloxi-csoport, amely szabsztituensként lehet jelen az Εδ csoporton (ezek típusa 1-8 szénatomos helyettesített alkilcsoport vagy 2-8 szénatomos helyettesített alkenilesoport); valamint ríhozil-, 5’-foszforibozil- vagy glükózilesöpörtök, amelyek R9 vagy R7 csoportokként lehetnek jelen; és -HKy csoport egy -CH^CHCNH^}COOH csoportban,amely R9 csoportként van jelen.
Ami az előzőkben említett példáknál a kiindulási *
X* 99 ιΧ X 9 χ φ $ <<*? « * ♦ 9 9 Sf 'ÍX 9 9 9 9 citokinekben előfordulható reaktív funkciós csoportjaínak védelmére alkalmas védőosoportokat illeti, az -OH csoport általában megfelelően védhető egy acetil csoport bevitelével (lásd az (1) általános képletü vegyületek készítésének oxldafcív módszerével kapcsolatban), a megfelelő' -OOCCH3 csoport kialakításával. Az -SH csoport általában nagyon megfelelő módon védhető benziltioéter (-SCH^CgHg) származék formájában, egy benzilcsoport bevitelével [azaz benzil-kloriddal való reakcióval, hasonló módon, mint amit részletesebben közlünk az alábbiakban azokkal a citokinin prekurzorokkal kapcsolatban, amelyek, legalábbis formálisan oxo <~ö) vagy tioxo (=S) csoportokat tartalmaznak a 2-es pozícióban, és egy oxocsoportot a 6-os pozícióban}. Egy -hhg csoport általában megfelelő módon védhető egy ftálimidocsoporttá való átalakítással, az alábbiak szerint: a cítokinint vagy a citokinin prekursort feleslegben levő ftálsavanhidriddel melegítjük egy viszonylag semleges oldószerben, például kloroformban vagy 1,2-dÍmetoxi-etánban, 70-100 CC körüli hőmérsékleten egy óra hosszat, gyakran 4 óra hosszat. Az -Oh2 csoportot a Koenigs-Knorr típusé reakció végrehajtása után vizes alkoholos (azaz vizes etanolos) bidrazinoldattal lehet regeneráIni.
A citokinin prekurzoroknak egy csoportja, amely különösen jól alkalmazható a találmány szerinti citokinin glüRuronidok szintézisére, amelyek a glükuronid egységet (ami megfelel az csoportnak az (I) általános képletben) -O-R10 vagy -S-R3-0 csoportként kapcsolva tartalmazzák a parin gyürürendszer 2-es pozíciójában, olyan citokinin pre-
- 36 ·'·*·♦ kurzorok, amelyek, legalábbis formálisan, oxo (-0) vagy tioxo <~S> csoportokat tartalmaznak a 2-es pozícióban és egy oxo csoportot a β-os pozícióban; itt kell megemlíteni, hogy a kérdéses típusé vegyületek, amelyek 2-oxo- és 2-tíoxo-csoportokat tartalmaznak, legalábbis oldatban tautomer egyensúlyban vannak a megfeleld 2-hidroxi- és 2-merkapto-vegyületekkel (a 6-oxo csoport ezután 6-hidroxílesöpört formájában van jelen), és az utóbbi tautomer formák általában jelentős mennyiségben fordulnak elő.
Az utóbb említett hidroxil- vagy merkaptocsoport a 2-es pozícióban konvertálődik, a szintézis végső fázisában, a Koenigs-Knorr típusú eljárással, a megfelelő -0-R10 vagy ”S~áAö csoporttá; azonban a Koenigs-Knorr típusú reakoíősorozat végrehajtása előtt a ó-hidroxilcsoportot megfelelően át kell alakítani az ideiglenes ó-balogén- (előnyösen 6-klór) származékká való átalakításán keresztül az (I) általános képletben bemutatott -KH-k® egységgé, és ehhez általában arra van szükség, hogy a 2-es pozícióban levő hidroxíl vagy merkaptocsoportot megfelelő védőcsoporttal védjük az átalakítás lépései során. Mindkét csoportnál a választható védőosoport a benzílesöpört, amelyet általában egyenesen be lehet vinni egy olyan reakcióval, amely enyhe feleslegben levő benzilk.lo.rid fokozatos hozzáadását jelenti a kérdéses citokínin prekurzor kevertetett oldatához vagy szuszpenzlójához vizes lúgban (a pH tipikusan 12-13), azaz például vizes nátríum-hidroxid- vagy vizes kálíum-hidrcxid-oldatban, körülbelül szobahőmérsékleten.
Egy általában 1-2 órás .folyamatos kevertetés után a *·* X * w»
X 9 « * < 9*4 9 *
9. 4 jt ►*X ** reakeióelegyet semlegesítjük, például jégecet hozzáadásával, majd az oldhatatlan, benzilcsoporttal védett terméket szűréssel izoláljuk,
A keletkező 2-benzil-oxi- vagy a-benzil-tio-S-purinol-származék 6-hidroxilcsoportját ezután 6-kloriddá alakít juk, megfelelően alkalmazva feleslegben levő klórozó reagenst, azaz például foszfor-oxi-kloridot (foszforil-kloridot) szerves bázis, azaz például H,b-dietii~anilin jelenlétében; az utóbbi reakciót általában refluxálási körülmények között lehet végrehajtani körülbelül 10 perc és körülbelül óra időtartam alatt,
A 6-kloridot azután megfelelő módon át lehet alakítani a kiválasztott -KH-Re egységgé, oly módon hogy az előző reakcióból származó terméket hagyjuk a megfelelő aminnal reagálni, amit általában megfelelő módon in situ állítunk elő amin-bidroklóridból x HCI) és feleslegben levő (célszerűen 2-4-szeres mólfelesieg) megfelelő bázis, például tercier alifás amin, azaz trietil-amín alkalmazásával egy megfelelő poláros oldószerben, például i-4 szénatomos alifás alkoholban (azaz 1-butanolban), 65 és 120 °C közötti hőmérsékleten.
A termék izolálása után a védőcsoportot eltávolítjuk, ezzel regeneráljuk a szabad 2-hidroxii™ vagy 2-merkaptocsoportot; a benzil védőcsoport esetében ezt megfelelően égy végezhetjük, hogy a terméket feleslegben levő nátrium folyékony ammőníás oldatával kezeljük.
Az olyan termékek esetében, amelyek 2-merkaptocsoporttal rendelkeznek ebben a stádiumban, az a véleményünk, * * 9 X > « «♦X *Χ «ίί ΦΦ ««
- 38 hogy a 2-merkapéoesoportot általában előnyös a megfelelő sóformává alakítani (~S~)f azaz a nátriumső formájára, mielőtt továbhmemnénk a glükuronid egység bevitelével, a
Koenig-Knorr típusú reakció alkalmazásával. As ilyen célokra a lka. Ima zható eljárásra megfelelő példát a nunkapéldák 4. 1E. pontjában frank le, és az ott ismertetett körülményekről as a véleményünk, hogy meglehetősen széles körben alkalmazhatók. Néhány esetben azonban lehetséges, hogy a Koenigs-Knorr típusú reakciót közvetlenül MBTS-vel végezzük el (lásd alább) anélkül, hogy a 2~merkaptocsoportot séformává alakítanánk .
Végezetül a glükuronid egységet a fentiekben leírt módon HBTG-vel végzett reakcióval juttatjuk be, a KoenigsKnorr típusú reakció végrehajtásával.
Az előzőkben ismertetett szintézislépések sorozatát az IS·, példában mutatjuk be az (2 ’-izopentil) -adenin-2-tíoglükuronid (IF2SGN) nátríumsójának szintézisére, amely 2-tioxa.ntinból indul ki, A legtöbb, itt megadott információ, amely az átkristáiyosltó és extrakciös oldószerekre, a reagensek koncentrációjának és mennyiségének megválasztására vonatkozik, szélesebb körben alkalmazható az előzőkben ismertetett reakciók végrehajtásában, egy citokinín prekursorból kiindulva, amely egy M2-tíoxo” csoportot (azaz 2-merkapfoesoportot) és egy fí6-oxoi!-csoportot (azaz ó-hidroxílcsoportot) tartalmaz.
Hasonlóképpen, a citokinín prekursoroknak az a csoportja, amelyek különösen alkalmasak a találmány szerinti citokinín glükuroeidok szintézisére, és rendelkeznek a glü* »* $ » * ·'♦♦*· * * *·* 9 φφ φ » «ί
Χ»Φ $ φ * * * ♦ φ φ φ
kuronid egységgel (ami. megfelel az (I) általános· képlet Riö csoportjának.) -G-R10 vagy -S-R10 formában a parin gyűrűrendszer 3-as pozíciójához kapcsolva, olyan citokinin preknrzorokat tartalmaz, amelyek, legalábbis formálisan (hasonló okokból, mint amit az előzőkben ismertettünk azokkal a citokinin prekurzorokkal kapcsolatban, amelyek formális 2-oxovagy 2-tioxo-csoporttal és formális 6-oxo-csoporttal rendelkeznek) egy oxo- (~0) vagy tioxo- (-S) csoportot tartalmaznak a 8~as pozícióban, és amelyek emellett hidroxilcsoportot is tartalmaznak a 6-os pozícióban. Székét általában a kiválasztott (I) általános képletű végtermékké lehet alakítani, a megfelelő reakciólépések alkalmazásával (védőcsoport bevitele, 6-klór bevitele, az ~N~R$ egység bevitele, védőcsoport eltávolítása és végül az MBTG~vel valő reakció), analóg módon ahhoz, amit az előzőkben az olyan citokininglükuronidokkal kapcsolatban vázoltunk, amelyek tartalmazzák a glükuronid egységet a purín gyűrűrendszer 2-es pozíciójához -0-R10 vagy -S-R10 csoportként hozzákapcsolva. Erre példaként megemlítjük az íF. példát, amelyben az R0-(2s-izopentenii)-adenin-S-tioglükuroníd szintézisét írjuk le (nátriumsőja formájában).
Az (I) általános képletű vegyűíeteket, amelyekben a glükuronid rész karbonsav formában található, általában előállíthatjuk a megfelelő sóiormából, azaz például a nátriumodból (az előzőkben más ismertetett módszer szerint lehet előállítani), oly módon, hogy a sóforma megfelelő oldószerben (például vizes alkoholban, azaz vizes etanolban) készített keverhetett oldatát vagy szuszpenzióját megsava* * ** $ « .»« ·* »«'» ft * » * *** «« ««« ·♦'% > * »» **« « » <J>
*« «ft •♦♦ft nyitjuk, előnyösen 25 ’C -alatt, ásványi savval, például sósavval; a pH körülbelül 2,5, Néhány perces kevertetés után az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, A nyers jsaradékot előnyösen kromatográfiás kezelésnek vethetjük alá a szervetlen sók eltávolítása céljából (lásd az II példát, az ilyen célú tipikus eljárás és megfelelő kromatográfiás szubsztrát részleteit illetően) , ami után a terméket a .megfelelő oldószerből, tipikusan egy poláros oldószerből, azaz metanolból vagy etanolből, átfcrístályosíthatjuk.
Az (X) általános képletű vegyületeket, amelyekben a glükuronid rész metilészter vagy etilészter formában található, általában egyszerűen előállíthatjuk, jő kitermeléssel, oly módon hogy a citokinin glükuronid megfelelő karbonsav formáját (amelyet például az előzőkben leírt módon állíthatunk elő) diazenetannal vagy díazoetánnal reagáitatjük, olyan reakciókörülmények között, amelyek szokásosak az ilyen 'típusú, reakcióban, és amelyek a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek.
Számos, a b) módszernél kiindulási anyagként használható citokinin prekurzor kereskedelmi forgalomban van, míg másokat az irodalomban leírt módszerekkel állíthatunk elő, Például számos különböző, megfelelő -helyettesített adenin, amely a találmány szerinti P6 csoportot tartalmaz, szintézise elérhető a szakirodalomban közölt módszerrel [Iwamura et al., Phytochemístry, IS, 1309 (1980)], valamint számos 2-, S- és 2,8-helyettesitett N6-(2’-izopentenil)adenín, amely a találmány szerinti R2 és/vagy R®' csoportot tartalmaz, előállítható Damman és munkatársai leírása szeφ φ φ rint [Phytochemistry, 13., 329 (1974)].
Előnyös (I) általános képletü vegyületek az alábbiak :
az (Ij általános képletü vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése S-D-glükopiranuronozil csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, S7 és X jelentése együttesen egy kötés, k8 jelentése bemzalcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidr egénatóm;
az (X) általános képletü vegyölet, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése B-D-glükopiranuronozilcsoport amid származéka a karbonsav funkciónál, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R8 jelentése bernilesöpört, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános képletü vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R9 jelentése B-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, Rs jelentése benzalcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése b idrogénato®;
az (X) általános képletü vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, k3 jelentése S-D-glükopiranuronozilcsoport, illetve annak sója a karbonsav funkcionál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R8 jelentése 2-izopentenilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R3 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános· képletű vegyület, amelyben R2' jelentése S-D-glükopiranuronozii-osoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, Rs jelentése 2-izopenteni.l-csoport, R3 és ¥ jelentése együttesen egy kötés, és Rs jele nt é se hi drogénatom;
az (I) általános képletű vegyület, amelyben jelentése hidrogénatom, R$ jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R& jelentése 2-izopenteniIcsoport, R? és V jelentése együttesen egy kötés, és R® jelentése S-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál; és az (I) általános képletű vegyület, amelyben Rs jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R5 jelentése hidrogénatom, Rö jelentése a (111) általános képletű csoport, vagy annak sója, amelyben R~ és Y jelentése együttesen egy kötés hoznak létre, R® jelentése hidrogénatom.
A (II) általános képletű vegyületek találmány szerinti szintézise
A találmány szerinti (II) általános képletű vegyűleteket közvetlenül eló lehet állítani, a könnyen előállítható o-kumarinsav metilészterének (azaz a 3~<2-hidroxi~fe~ nil)-2-propénsav) mint kiindulási anyagnak a felhasználásával. Az utóbbi észtert ügy állíthatjuk elő, hogy a szabad savat (amely például az Aidrich Chemical Company-töl szerezhető be, Gillingham, Oorset, Anglia, H2.,280-9 katalógusszám « «
- 43 ~
alatt) metanolban reflexéItatjuk kénsav jelenlétében. Meg kell jegyeznünk, hogy a cisz és transz formák keveréke (az etilén kettőskötés szempontjából) állítható így elő. Az a véleményünk, hogy a transz forma, függetlenül az előállítás módszerétől, általában jóval na>gyobb arányban fordul elő kezdetben. Ez azonban nem lényeges, mert mivel azt találtuk, hogy mind a cisz (kumaril), mind a transz (kumaril) glükuromidok végezetül kumarinná alakulnak, a GÜS-sal végzett hidrolízis hatására, annak következtében, hogy a kumarínsav lassan (nem-enzimátikusan, feltételezhetően fénykatalízis hatására) kumarinná alakul néhány nap alatt.
Az olyan (II) általános képletű vegyületek szintézisének hatásos módszereit, amely vegyületekben (a) A1 és k^·0 karbonsav-formában találhatók, és (b) k1 és H10 amid-formáhan találhatók, részletesen ismertetjük az XH és II példákban. Az olyan (II) általános képleté vegyület(ekj, amelyekben mind az R1 mind az k10 csoport nátriumsó formájában található, könnyen előáliíthatók a peraoetílezett glükuronld metllészterének lügos hidrolízisével (előállítása (metíl-o-kumarátbői) és szintézise ügy játszódik le, mint az XI példában közölt szintézis első részében), metanolom nátrium-hidroxidot használva az XI példában közölt szintézis második részének elején közölt módszer szerint; ahelyett, hogy a hídrólizátum pH-ját 2,5-re állítanánk sósavval az XI példában leírtak alapján, az elegyet egyszerűen csak semlegesítjük (körülbelül pH™ 7 értékre) sósavval. A nátriumsó formát a keverékből kromatográfiával izolálhatjuk, például Amberlite XAD+ # *
2 nem-ionos gyantán, az oszlopot vízzel mossuk a szervetlen sók eltávolítása céljából, majd eluáljük, általában metanollal. A nyers glükuroníd nátriumsó formáját, amelyet a metanol eltávolítása után kapunk, átkristályosíthatjuk, például abszolút metanolból. A káliumsó alak is előállítható nagyon hasonló eljárással, például metanolos kálíum-hídroxíddaX a hidrolízis részben.
lyekben mind A3- mind R2 metiiészter formában, illetve etilészter formában vannak jelen, megfelelően előállíthatjuk diazometánnal vagy diazoetánnal végzett reakcióval olyan (II) általános képletű vegyületekből, amelyekben mind az S1 és R10 karbonsav formában találhatók. A reakciókörülmények lényegében azonosak, az előzőkben a eitokinin-glükuronidok metiiészter vagy etilészter formáinak készítésénél leírtakkal.
Előnyös (II) általános képletű vegyületek az alábbiak í a (Ií) általános képletű vegyület, amelyben R3- jelentése cisz- és/vagy transz-2~amidoeten.il (cisz- és/vagy transz-Cü-CHCOhh^]-csoport, és R-° a é-d-glükopiranuronozilcsoport amídszármazéka a karbonsav funkción (2-hÍdroxi-oina (II) általános képletű vegyület, amelyben R3- jelentése cisz-2-amidoeteniI- (cisz-CH-CHCöhHjj csoport, és R3-0 a Ó-d-glükopiranuronozíl csoport (2-hidroxi-cinnamil-BAz alábbi példákban a találmány általános elveit «ο illusztráljuk növényekben, főleg egy S-b-glükuronidáz gént használva szelekciós markerként, és űj glükuronid szabsztrátokát alkalmazva, amelyeket ezzel a gáztermékkel lehet hidrölizélní. Feltételezhető, hogy gének, például a S-glükuronidáz gén használható számos rokon célra is. Tehát a S~glü~ kuronidáz gén használható egy olyan módszerben, amellyel lokalizált vagy szövetspecifikus növény“növekedési hatást akarunk elérni egy növényi részben vagy növényi, szövetben, amely egy bejuttatott S-glühuronidáz gént sokkal magasabb szinten exprosszál, mint az ugyanabban a növényben levő egyéb növényi részek vagy szövetek, a módszer abban áll, hogy a növényt egy olyan vegyület hatásának teszünk ki, amely elhidrolizálhatδ a bejuttatott ü-glükuronidáz génnel, oly módon hogy a vegyület hídrólizéi abban a részben, amely a bejuttatott S-giükuronidáz gént tartalmazza, ezáltal egy növényi növekedést szabályozó vegyületet szabadit fel a szövetben, és növekedést szabályosé hatást fejt ki, kizárólag ebben a szövetben vagy növényi részben, illetve ebben a részben vagy szövetben olyan szövetszabályozásí hatást fejt ki, amely nagyobb mint a növény más részeiben vagy sző” vetőiben kapott hatás. Az is meggondolandó, hogy előnyös lehet növényi növekedésszabályozok, azaz oitokininek alkalmazása glükuronidok vagy giükuronídszármazékok formájában a szabad oitokininek helyett, például azért, hogy kihasználjuk azt a tényt, hogy feltehetően másképpen transzpor'táiódnak és oszlanak meg a növényekben, mondjuk a megfelelő szabad vagy ribozilezett citokininekhez viszonyítva.
Hasonlóképpen, az alábbi példák a ó-giükuronidok hí™ zonycs más felhasználási lehetőségeire is rámutatnak. Esek közül az egyik egy ín vitro módszer citokínin glükurenid vegyületek screenelésére és azonosítására (illetve más növényi növekedésszabályoz© glükuronldokkal való munkára), amelyek képesek ín vívó hidrolísálódni egy bevitt B-glükuronídáz gén hatására. A Ö-glükurcnidás használható szelekcióra egy olyan rendszerben, amellyel olyan vegyületeket screenelünk, amelyek az alábbiakban ismertetett pozitív szelekciós módszerben szelekciós ágensként használhatók (lásd 2. példa). A 3« és 12. példában olyan rendszereket írunk le, amelyek használhatók olyan vegyületek szelektálására, amelyek szelektíven gátolnak egy natív B-glükuronidáz enzimet növényi sejtekben, anélkül, hogy lényegesen érintenék a kívülről bevitt B-glükuromidás gén által kódolt enzim aktivitását.
1v példa
Glükuroaíd vegyületek szintézise
Az alábbiakban számos új glükurenid vegyűlet szinté
zisét írjuk le. Az egyes szintetizált vegyületekhez megadott
rövidítések mellett as alábbi rövidítéseket használjuk:
,BA p 6_tenziIaden ín
AcOH ecetsav
ΒΒΓ h,N,-dimet i1-formamid
IP $ ó ~ (2 - i. z openten i 1.) - a d en i n
MBTG nstí1-(2,3,4-tri-O-aoetil-o-P-glükopira- nos í1-bromid)~urorcát
♦ «φφ φ « φ φ φ
1Α, példa
3-S-D-GXükopiranmronoziX-á-benzilaminopurin nátriumsója [(XV) képletü vegyület]
Szinonimak: K^-foenzi.ladeni.n-N3 -B-D-glükopiranuronsav-nátriumső
Rs-benzilaáenin-3~giükuronid-nátriumsó
Rövid x tés ί BA3 GR-nátriumsö áz R^-benziladauin <BA) és & metil-(2,3,4-tri-öaoetlX-e-O-glükopiranozii-bromid) -arénát (íSBTS) kondenzációja
12,6 mmol BA~t és 15,1 mmol RBTG-t fBollenback el al., Journal of the American Chemical Socxety, 77, 3310-33IS (1SSS)} szuszpendálunk Sö ml vízmentes dxmetxl-formamídban, majd körülbelül 10 óra hosszat Iöö °C-on tartjuk, á dimetil-förmamíd legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a nyers terméket 300 mi kloroformban oldjuk, majd 3x300 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes megnézrum-szulfáton végzett szárítás után a kloroformom extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk, és a kapott sötét szirupot etanolhól átkristályosít juk. A nyers terméket (BA, BA9GR és BA3GR peraeetilezett metilésztereinek keveréke) 100 g, kloroformmal oszlopba töltött szilikagéíen tisztítjuk, majd 0-4 %-os kloroformban készített etanolgradienssel eluáljuk. A nyers peraoetil-BAOGN-metilésztex-t etanolból kristályosítjuk át. Kitermelési 2SÖ mg színtelen, amorf szilárd anyag.
A peracetíl BA30R mefcílésztert hidrolizáljuk, 5 %-os nátrium-hídroxid 50- %-os vizes etanolban készített oldaté48 val, szobahőmérsékleten, öt perccel azután, hogy a szilárd anyag feloldódott, a reakcióelegyet óvatosan semlegesítjük sósav hozzáadásával, miközben jégen tartjuk. Csökkentett nyomáson való szárítás után a nyers BASÖH-nátriumsót fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk (löO g oktadecilszilikagélen), 1 liter vízzel eluáljuk, majd 20 %-os vizes metanollal, végül pedig etanolból átkristályosítjuk. A tiszta BA3CH-nát.riumsót (150 mg) színtelen, mikrokristályos szilárd anyag formájában kapjuk, amelyet kaleium-kloridon szárltunk tömegá11and óságig.
Elemzés
W
Etanol A max 29? nm
Etanol/ecetsav A max 291 nm
Etanol/ammónia A max 297 nm
Ezek az értékek azonosak azokkal az szakirodalomban közölt értékekkel, amelyeket a BA-3-S-B-gÍükopiranuronozldra és az N^H^-díszuhsztituált adenínre leírnak [N.J. Leonard, K.L. Carraway and J.P. Helgámon, d. Heterocyolic Chem., 2, 291-29? (1905)1.
HPLC
A HPLC vizsgálatokat egy 10x0,45 cm-es, oktadeoil szilíkagéllel töltött oszlopon végezzük, izokratikusan eluáljuk 10 % ecetsavat tartalmazó 60 %-os metanollal 1 ml/perc sebességgel, UV követés 290 nm~en.
- 49 φ
A BASGB-nátríumsö tisztasága 95+%, a szabad BA tartalmát 0,05 %-nál kevesebbre becsüljük.
Hidrolízis B-glükuronidázzal (GHS)
500 gg BA3GH nátriumső 500 μ! 50 mmol/l-es nátrium-foszfát pufferben (pH=?,0) készített oldatát B-glükuronidázzal inkubáljuk (GUS, sígma Type G7896)t 2500 Sígma ”Fishmanw egységgel 18 óra hosszat 3?*C-on, A HPLC vizsgálatok (a körülményeket az előzőkben megadtuk) a 8A3GN csúcs szinte teljes eltűnését mutatják, egy olyan csúcs keletkezése közben, amely együtt kromatografálődik az autentikus BA-val, ha 1:1 arányú keveréket készítünk belőlük, Bz megerősíti, hogy a termék BA és B-B-glükuronsav konjugátum.
Az alábbi elemzést az előzőkben készített BA3GH-nát~ riumső egy másik részletével végeztük el:
uy
Etanol
A max 297 nm
HPLC
15x0,46 cm-es oktadecii-szilikagél oszlop, eluálás 20-60 %-os metanol/10%-os ecetsav gradienssel 38 perc alatt 1 ml/perc sebességgel, Tisztaság HPLC alapján 99,5 %. A szabad BA tartalom <0,05 %.
Vékonyréteg kromatográfla
Sziiikagél, amelyet 1-foutanol/ecetsav/víz (12/3/5) eleggyel fejlesztünk ki. Tisztaság vékonyréteg kromatográfia ♦ * alapján 99,5 %·. Szabad BA tartalom <0,05 %.·
Hidrolízis β-giüknronldárzal (GHS)
500 pg BA3GH-nátriumsó 500 pl 50 mmol/I-es nátrium-foszfát pufferben (pH=7,0) készített oldatát S-glükuronidázzal inkutáljuk (GHS, Sígma Type G789S), 2500 Sígma Fishman egységgel 12 éra hosszat 37 *C~on. A HPLC és vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatok a BA3GN csúcs szinte teljes eltűnését mutatják, egy olyan csúcs keletkezése közben, amely együtt kromatografálődík az autentikus BA-val, ha ül arányú keveréket készítünk belőlük.
ί (V) képletei vegyűlet]
Sz ínőnimák
Rövidítés;
Ν»-benz iladenin-N-5-S-D-glükopíranuramid N6~benz i ladenin~3-glükuronamid
BASGNamíd
Szintézis
1,5 g, az IA példában leírtak alapján készített, átkristályosített peracetil-BA3GN~metilésztert szuszpendálünk 200 ml vízmentes metanolban, majd 0 °C~ra hűt jük. További 400 ml vízmentes metanolt adunk hozzá, amely -fö °C~on vízmentes ammóniával van telítve, majd az elegyet jeges vízfürdőben kevertetjük. További jéghideg vízmentes metanolt adunk hozzá, addig, ameddig a szilárd anyag teljesen feloldódik. A reakciőelegyet jeges vízfürdőben további 3 óra * i « *9
X * Φ * X*
hosszat kevertetjük. A feleslegben levő ammóniát és metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a terméket tríkurdijuk forró etanollal, így kapunk 1,3 g színtelen szilárd anyagot,
A BASGNamíd, csakúgy mint más adenin-3-glikozídok, csak gyengén oldódik vízben vagy alkoholban, de feloldódik 2,4 mg/ml koncentrációban 50 %-os metanolban, amely 2S % ecetsavat tartalmaz,
Elemzés
Vékonyréteg kromatográfla
Sa i1ikagél-kloroform/metano1/jágecet # S ö/5ö/5 Egyetlen ÜV pozitív folt látható {Rf~ö,36), és nem mutathatók ki szennyeződések SGgg anyag felvitele mellett. A tisztaság 984%. Nincs kimutatható {<!%} peracetíl~BA3GNmetilészter {Rf~G,S9} vagy 8A3GN (Rf«0,02).
Sz i1ikagél -klorof orm/metanol, §/1 A BA-tartalom vizsgálatára használjuk. 192 pg
BAOGNamid felvitelekor nincs kimutatható 6-benziladenin mennyiség. A BA-tartalom ennélfogva <0,2%.
IC. példa
9-S-B-slükopiranuronozil-6-benzílaminopurín nátriumsőja ((VI) képletű vegyület]
Szinonimák: N6-benziladenin-N9-S-D-glükopíranursav-nátriumsó
Nő~benziladenin-S-glükuronid-nátriinsső
Rövidítés: BA9GÜ nátriumod
Szintézis
1» módszer
Az Ms-benziladenin-3-8-B-glükopirannronozid (BA9G) katalitikus oxidációja mg BaáG-t szuszpendálunk 25 ml 50 mmol/i koncentrációjú. nátrium-hidrogén-karbonát oldatban, 200 mg fekete platinával, A keveréket 80 eC~ra melegítjük vízfürdőben, miközben intenzíven oxigént áramoltatunk át rajta, 4 óra elteltével újabb 100 mg platinakatalizátort adunk a keverékhez, A BA9G~nek körülbelül 954-%-a a megfeleld 9-B-D-glüköpíranursavvá, valamint valamennyi SA-vá oxidálódik húszórás kezelés után, A keveréket semlegesítjük, majd a terméket, a BA9GN nátriumsőt fordított fázisú kromatográfiávai tisztítjuk (20 g oktadecil-szilíkagélen), 200 ml vízzel, majd 20 %-os metanollal eluálva,
A tiszta BASGR-nátrlnmsót, amely mentes a glükózídtól és a BA-tól, színtelen szilárd anyaggá szárítjuk kaiéi um~kloridőn, csökkentett nyomáson,
2, módszer
A S-klör-purin ás a metii-<2,3,4-tri-O-acetil-a-B-glükopiranczil-bromid)-uronát (bBTG) kondenzációja
1,13 g, foszfor-pentoxídon szárított ó-klör-purint,
3,8? g MBTG-t és 1,5 g frissen szárított kálium-karbonátot ml vízmentes propilén-karbonátban keverhetünk szcbahómér- 53 X* Φ φφ ΦΦ φ Φ «. Φ 9 Φ φ *
ΦΦΦ X »♦♦ ♦ X
X χ £ Φ X
ΦΦ φφφ »χ ** sékleten 24 óra hosszat. A sötét keveréket megszűrjük., majd őszlopkromatográfiával tisztítjuk 100 g szilikagélen, majd O-SOá-os, kloroformban készített etil~acetát gradienssel eluáljuk. A fő frakciót (mást, mint a reagálatlan 6-klórpurín) megszáritjuk, majd forró etanolböl átkristályosítjuk, így kapunk 450 mg metil-ó-klór-purín-S- <2s, 38,4 *-tri-O-aceti 1)-B-D-glükopiranuronátot világossárga szilárd anyag formájában, amelyet azután foszfor-pentoxídon csökkentett nyomáson szárítunk. A HPL-C vizsgálat alapján a tisztasága
9St%.
312 mg metil-6-klór~purin-9- (2 5,3 *, 4 ’ -tri-O-acetíl)-d-G-giükopiranuromStot ás 171 pl benzíiamínt melegítünk együtt 13,5 ml 1-butancllal 1 óra hosszat 100 *C-on, A szilárd anyag könnyen feloldódik, így egy világossárga oldatot kapunk. A butanol legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így fehér szilárd anyagot, amelyet 25 ml 5 %os, 50 %-os vizes etanolban készített nátríum-hidroxiddal rázatunk 1-2 óra hosszat szobahőmérsékleten. Semlegesítés után a terméket csökkentett nyomáson megszárítjuk, a butanal-nyomokat eltávolít juk, és a nyers BA9GN nátríumsót fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk, az 1. módszerben leírtak alapján.
A tiszta terméket csökkentett nyomáson kalcium-kloradon és foszfor-pentoxidcn szárítjuk, így 210 mg színtelen szilárd anyagot kapunk, amely együtt kromatografálódik a katalitikus oxidációval előállított 8A9GN-nel.
·* V
ΦΦ »Φ # 9 ♦ 9 * χ χ*« 9 9
X 9X9 «9 9 9# *-*
Α 2. módszer szerinti kondenzációs reakcióval előállított BA9GN-nátriumsó e.lengése
H¥ %-os etanol A max 270 nm (17400) %-os etanol/0,1 mol/1 HCI A max 270 nm (16-200) %-os etanoi/0,1 mol/1 HaOH A max 270 nm (17400)
Ezek az eredmények összhangban vannak az -díszubsztítuált adeninszerkezettel. Az extínkciős koefficiensek lényegében ugyanazok, mint a tiszta BA9G-jé, jelezve, hogy mentes az OT-t nem abszorbeáló szennyeződésektől. Tisztaság W szerint 95+%.
HPLC
10x0,46 cm~es oktadecil-szilikagél oszlop, EV követés 270 nm-en. Xzokratíkus (50 %-os metanol/0,2 mol/1 ecetsav, 2 ml/perc) és gradiens HPLC vizsgalatok (0-60 %-os metanol/0,2 mol/1 ecetsav, 2 ml/perc) éles, szimmetrikus csúcsot .mutatnak a BAOGM-re, amely közvetlenül a megfelelő glükóz id előtt eluálődik. A kondenzációs reakcióval előállított BA9GN együtt kromatograíálődik 1:1 arányú keverék formájában a HPLC oszlopon (izokratíkus és gradiens elűclóval) a katalitikus oxidációval előállított BA9Gh-nel, Ez megerősíti, hogy a kondenzációs reakcióval előállított BA9GÜ a óD-glükopíranuronozíl-izomer. A BASGH nem tartalmaz kimutatható (<2%) e-anomert vagy más szennyezést, beleértve a BA-t. A BA9GH tisztasága HPLC alapján 98+%.
φ φ φ*>· φφ φ φ φ φ φ φ ♦ Φ
Szilíkagel-kloroform/metano.l, 9/1
A BA9GB termék BA szennyeződésének mérésére használ” juk. A BABGh nem mozdul ki a felviteli pontból ebben a rendszerben. A BA minimális kimutatási határértéke 2ö0 ng, Ka 200 pg B&SGN-t visszük fel, nem mutatható ki BA vagy egyéb szennyeződés. A vékonyréteg kromatográfiás tisztaság 98+%, BA-tarbalom <0,1%
Savas hidrolízis
Az ásványi sav a citokínin glükózidokat a megfelelő citokínin bázisokká alakítja át. A BASGk-nátríumsót (1 mg/ml) 1 mol/1 sósavval kezelve 100 ’CHan éjszakán át, egyetlen foltot kapunk vékonyréteg kromatográfiával, ha a megfelelő autentikus BA-val együtt kromatografáljuk a reakciót érmékét. Ss a vizsgálat megerősíti, hogy a BA9GB a BA savra érzékeny konjugátuma.
En s imát i kos h idr ο1í z is
500 pg BA9GN~nátríumsó 500 pl 50 mmol /l-es nátrium-foszfát- pufferhen (pH«7,0) készített oldatát B-glükuronidázzal inkubáljuk (CüS, Sigma Type G7896), 2500 Sigma ”Fishmanff egységgel 12 óra hosszat 3? aC-on, A BPL-C és vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatok szerint nincs kimutatható mennyiségű BA, Szobahőmérsékleten végzett további háromnapos ínkubálással nem figyelhető meg hidrolízis. A BÁ9GN ennélfogva nem érzékeny a B-glükuronídázos hidrolízisre.
- 56 ~ ** > 0 >
* * * φ
0 0 0 ·»·Μ· Μ·*·
0 * * 0 0 0'0'0 0 X
0 0 X *0 .0«. »0
ID, példa
3-β-ü-élükopíramur©noa i1-s-(3-meti1-bút-2-eni1amino)-parin nátriumső ((VII) képletű vegyület]
Szinonimák: N6- (2 ’ -izopentenil.) -adenin-lP-B-D-glükopiranuronsav-nátriumsö Νδ- (2*-izopentenil)-adenin~3-glükuronid-nátriumsó
Rövidítés: IP3G.K nátriumáé
Szintézis
9,48 g Νδ~(Z-izopenteníl)-adenint és 22,1 g kBTG-t 170 ml vízmentes dimetil-formamidban 100 °C-on 2.2 óra hosszat melegítünk. A DHF legnagyobb részét csökkentett nyomáson, forrásban levő vízfürdőn eltávolítjuk, majd a lehűtött szirupot 500 ml kloroformban vesszük fel. A kloroformom oldatot 3x500 ml vízzel extraháljuk, majd a szerves extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. A kloroform legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a szirupot szilifcagélen kromatográfiásan tisztítjuk, a kromatogrammot 0-3,75 %-os metanol kloroformban készített oldatával fejlesztjük ki. A nyers peracetil~IP3GN-metllésztert metanolból átkristályositjuk, aktív szénnel végzett színtelenítés közben, így 3,2 g tiszta színtelen peracetilIRSGN-metílésztert kapunk, amelyet azután csökkentett nyomáson kalcium-klóridőn szárítunk. A peracetil-IP3GN~metilészfer egy részét (1,2 g) hídról ízál jük, oly módon, hogy körülbelül 1 liter 75 %-os vizes metanolban oldjuk, amely 5 % nátrium-hidroxidot tartalmaz, és az elegyet 10 percig szó* *χ *Χ * * * * ·* φ « «ΧΑ * Φ < <· ♦ « * Φ ♦ ->:< *$τχ ♦♦ ♦♦ bahőmérsékleten keverhetjük. As elegyet jégbehűtjük, óvatosan semlegesítjük sósavval, majd csökkentett nyomáson szirup formára bepároljuk. A nyers terméket több egymást követő' kromatográfiás lépésben, XAD-2 gyantán és cktadecíl-szilikagélen tisztítjuk, így 820 mg XPlGN-nátriumsöt kapunk színtelen, mikrokristályos szilárd anyag formájában, amelyet kalcium-klorídon szárítunk.
Az XP3Gk-nátríumsö 2 mg/ml koncentrációban oldódik vízben.
Analízis
Vékonyréteg krcmatcgráfia
Szillkagéi-l-butanol/jégecet/víz, 12/3/5
Az XPIGH-nátriumső egyetlen éles foltot ad (Rf-0,32), ha .100 pg-ot viszünk fel, az Νδ-(20izope.ntenil5adenín (IP) (Rf~0f6ó) vagy egyéb szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 9St%.
Hidrolízis B-glükuronídázzal (GUS)
5ö0 pg XP3GN-nátriumső 500 pl 50 mmol/l-es nátrium-foszfát pufferben (pH=7,G) készített oldatát S-glükuronídázzal inkubáljuk (GUS·, Sigma Type G7896) , 2500 Sigma «Físhrnan*’ egységgel 12 éra hosszat 3? öC-on. A vékonyréteg kromatográfiával kimutatható az IP3GR-nek megfeleld UV folt eltűnése, egy űj W pozitív folt keletkezése közben, amely együtt kromatografálődik az autentikus lP-vel«
ΛΛ ft ** * ft> * χ.* χ # « « «*« « #
Λ ft ft ft S *ft 0ftx * ft ftft
- 58 1B. példa é- <3~MetíX~but~2-eníX~amxno) -purxn-2-ί X-l-tio-S-b~ -glükopiraauronsav nátriwsé ((Vili) képletű vegyület]
Szinonimak: Ns~(2f-xzopenieníl}-adenxn-2t lóg 1 í köp xr amursav-nátr iumső Ms-(28-izopenteníl)-udenin-2tioglükuronid-nátriumsö
Rövidítés: 1P2SGN nátriumáé
Szintézis
1, 2-Benzxl~tíö~8-purxnol
1,4 ml benzil-kloridőt adunk oseppenként, erős kevertetés közben 2 g txoxantín 12 ml l mol/X-es nátrium-hiúroxidban készült oldatához, majd vízzel 140 ml-re hígítjuk. Miután az adagolást befejeztük, krémszínű csapadék keletkezik χ A reakcióelegyet további egy óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, majd megszűrjük. A szilárd anyagot alaposan mossuk vízzel, majd egy éjszakán át csökkentett nyomáson szárítjuk kalcxum-kiorxdon, majd tömegállandőságxg fossfor-pentoxxdon. A kapott 2 g nyers terméket használjuk közvetlenül a következő lépésben, anélkül, hogy átkrxstályosítanunk.
2. 2-Bsnzi1-tio-6-klór-pur in g 2~öenzíl“tiO“ő-pnrinolt lefedünk 20 ml foszfor-oxx-kloríd és 2 ml dxetilanxlín keverékével, A keveréket kevertetés közben 1 óra hosszat refluxáltatjuk, lehűtjük, majd jégre öntjük (100 g)« Sárga csapadék keletkezik, amit
- 50 Φ * X «<Φ ♦ X * *«:♦
J» Φ
ΦΦ* *
<»Φ χ Φ Λ * « »«« 9 φ κ * Φ « **φ * > ** kiszűrünk, alaposan mosunk vízzel, majd csökkentett nyomáson szárítunk, A nyers terméket átkristályosítva kapunk egy világos krémszínű szilárd anyagot (1,2 g), amelyet foszforpentoxídon tömegállandőságig szárítunk.
3. 2-Benzil-tío-h^-(2-izopentenil)-adenin
1,2 g 2-henziltio-6-klor-purin és 1,04 g izopsntenil-amin-hidroklorid 25 ml, 2,2 ml tríetilamint tartalmazó 1-butanolban készített elegyét lezárt csőben 110 ’C-oa 2 óra hosszat melegítjük. A butanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd az eiegyet jeges vízzel (100 ml) rázatjuk. A terméket kiszűrjük, etanolból kristályosítjuk aktívszenes színtelenítés közben, majd csökkentett nyomáson szárítjuk foszfor-pentoxidom. Kitermelés 0,64 g. A kitermelés 1,3 g 2-benzíl-tio-K6-(2-izopenteníl)-adenin színtelen szilárd anyag formájában. A nyers terméket közvetlenül használjuk a következő lépésben.
4,. 2-Tío-h®-(2-izopentenil) -adenin
0,64 g 2-benzil-tiO“N6”(2’-izopentenil)-adenint oldunk 62,5 ml folyékony ammóniában, így kapunk egy tiszta sárga oldatot. Körülbelül 200 mg nátriumot adunk hozzá kis adagokban, ameddig a kék szín tíz percig fennmarad. Kismennyiségű szilárd arasóníum-kloridőt adunk hozzá a feleslegben levő nátrium eltávolítására, majd hagyjuk hogy az ammónia kis térfogatra bepárlödjon, 65,5 mi dietíl-étert adunk hozzá, majd az éteres extraktumot 62,5 ml vízzel extraháljuk. A vizes extraktum pH-ját 4 és 5 közé állítjuk
- 60 φφ « * * 4 φφΦ Φ ecetsavval, ekkor krémszerű szilárd csapadékot kapunk. Hűtés után a terméket kiszűrjük, majd csökkentett nyomáson foszfor-pentoxidon szárítjuk. Kitermelés 340 mg.
űyers 2-tio-Rs-(2-izopentenil)-adenint nátriumáévá alakítunk oly módon, hogy vízben szuszpendáljuk, majd ekvimoláris mennyiségű kálium-hiörostídöt adunk hozzá és annyi alkoholt, amennyi az oldódáshoz szükséges. Az oldatot csökkentett nyomáson szárítjuk foszfor-pentoxidon.
5. - (2-Izopentenii) -adenin-2-tioglükopiranuroníd
2,83 mmol 2-tio-Jí6-(2-ízopentenil)-adenínt oldunk vízmentes metanolban, és 5 mmol KSTG-t adunk hozzá. A keveréket 24 óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, ami alatt krémes fehér anyag válik ki. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárítjuk, majd szobahőmérsékleten hídrolizáljuk 50 mi 5 %-os vizes nátrium-hidroxid hozzáadásával, így kapjuk a szabad glükopiranuronldot nátriumsó formájában, A keveréket semlegesítjük, tömény sósav óvatos hozzáadásával, külső hűtés mellett, így kapunk egy színtelen csapadékot, ez az IF2SG-K náfcríumsója,
A nyers terméket fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk, majd etanolból átkristályosítjuk és csökkentett nyomáson kalcium-kloridon szárítjuk, így színtelen, amorf szilárd anyagot (150 mg) kapunk, A termék gyengén oldódik 50 %-os vizes alkoholban.
« » * * ♦ Λ
Φ Φ Ά *<f **
Analízis
W
víz, pH:~l A max 284, 241, 20 6 nm
víz, pH>? 278, 230 (váll)
víz, pH—14 283, 227
Az IP2SGN nátriumsőja a 2-~tio~szubsztituált citokininek jellemző üV spektrumát mutatja, és a spektrum nagyon hasonló az autentikus 2~metil~tio~Ns~<2-isopenteniX)-adeninéhez. Az ÜV elemzés megerősítette, hogy a termék a 2-H®~ szubsztituált adenin.
HPLC
A HPLC vizsgálathoz egy 15x0,46 cm-es oktadecilsziiikagél oszlopot használunk, amelyet 0-60 %~os metanol gradienssel eluálunk, amely 0,2 mol/l ecetsavat tartalmaz (30 pere, 1 ml/perc, UV követéé 270 nm-en).
Az 1P2SGN nátriumsőjának tisztasága 98+%, és nem tartalmaz kimutatható szabad 2~tio~£í6~ (2~ízopenteníl) ~ade~ mint (<0,l%).
Hidrolízis ö-glukuronldázzal
500 pg lF2SGH~nátriumsét inkubálunk 500 pl 50 mmol/l-es nátrium-foszfát-pufferben (pH-7,ö) 2500 Sigma ^Fishman” egység ö-glükuronidázzal (GUS, Sigma Type G7896) 48 őrén át 37 °C~on. Az előzőkben leírt HPLC körülmények között kimutatható az 1P2SGP részleges eltávolítása (85 %)., így jön létre egy olyan csúcs, amely 1:1 arányban keverve
Λ * *««· * £« •fc
Of » » $· « $ « Φ * « .*:♦'♦ tm> »» együtt kromatógrafálódik a 2~tio-N^~{2-isopent«níl}-adeninnel. Ez a vizsgálat megerősíti, hegy az XP2SGh'-nátriumsó a 2-tio-K0-(2-izopentenil)-adenin és a Ó-D-glükuronsav konjugátuma, amely részlegesen érzékeny a GÜS hidrolízisre..
ÍM»
Szinonimák: N6-(2’-izopenteni!)-adenin-S~tioglükopíranursav nátriumsó E6-(2 ?“i.zopentenii) -adenin-8-tíoglükuroníd-náfríumső
Rövidítés; XPSSGH-nátriumsó
1. reakció
6-Hidroxi-S-tiopurín g 4, S-diamino-e-hídroxi-pirimídin-szulfátöt és 100 g tiokarbamidot összeőrlnnk, majd olajfürdőben 30 percig .200 °C~on tartjuk, A lehűtött megszilárdult terseket 500 ml 1 mól/1-es forró nátrium-hidroxidban oldjuk, aktívszénnel forraljuk, majd megszűrjük. A forró szűrletet tömény sósavval savanyítjuk, majd a forró oldatot megszűrjük, így vörösszí nü szilárd anyagot kapunk, amely forró lügos oldatból újra kicsapódik, majd alaposan mossuk vízzel és csökkentett nyomáson 80 °C-on szárítjuk. Kitermelés 5,28 g.
* «0 V V* **
4# X V & «, 4 X fc $0« 4 xfc* « « * 4 * » « 4
00« «« »04 «0 00
- 63 Anniί a is
ÜV
A max, pK=l 235,292 nm (Írod.;234,290 nm} pH~ll 234,291 nm (írod.:234,290 nm) ó-Ηidroxi-8-benz i1-1iopuri n
5,28 g S-hidroxi-S-tiopurint szuszpendálunk 78,5 ml 1 mol/l-es nátrium-hidroxidban, majd 400 ml-re hígítjuk vízzel. 3,7 ml benzil-kloridot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet erősen kevertetjük 3 óra hosszat szobahőmérsékleten, p.H~ját 5-re állítjuk jégecettel, majd megszűrjük. A terméket vízzel alaposan mossuk, majd egy éjszakán át csökkentett nyomáson 80 ®C-on szárítjuk, így 7,33 g lazacrózsaszín szilárd anyagot, amelyet további tisztítás nélkül felhasználunk.
3. reakció
6-Klór-S-benz i 1 -1 iopurín
7,33 g e-hídroxi-S-benzíl-tiopurint adunk 70 ml foszfor-oxi-klorid és 7,5 ml N,b-dietil~anílin elegyéhez, majd az elegyet 2 őrá hosszat refluxáltatjuk, így egy sötétvörös· terméket. A keveréket csökkentett nyomáson betöményltjük, majd a kapott szirupot lassan, kevertetés közben 400 g jégre öntjük. A keveréket 15 percig hagyjuk állni, majd hideg tömény KOH-dal erősen meglűgositjuk. A keveréket alaposan tríturáljuk, hogy a szirup legnagyobb részét feloldjuk, majd 1-es pH-ra savanyítjuk hideg tömény sósav hozzáadásé«♦
- 64 Miután szobahőmérsékleten hagytuk állni egy éra hosszat, a terméket kiszűrjük, alaposan mossuk vízzel, és csökkentett nyomáson 8ö ®C~on 2 öra hosszat szárítjuk, így 7,8 g terméket kapunk« . reakció
8-BenziX~tio-ds- (2 *-izopentenil) -adenin
3,9 g 6-kÍőr-8~benzíl-tíopurin és 3,42 g ízopentenll-amín-hídrokloríd 100 ml, 7,5 ml trietil-amint tartalmazó X~öntanoJos oldatban készített elegyét 2 óra hosszat refluváltatjuk. Az l-butanol .legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a reakcióelegyet jégbehűtjük és 400 ml vízzel rázatjuk.
Egy éjszakán át történd hűtés után a keveréket megszűrjük, így nyers terméket kapunk, amelyet 100 g sziíikagélen végzett kromatográfiával tisztítunk, 0-2,5% MeOH klóréiormos oldatával elválva. A kromatográfiásan tiszta terméket metanolból átkristályosítjuk, igy kapunk 1,18 g színtelen, amorf szilárd anyagot.
Analízis
Vékonyréteg kromatooráfia
Szíli.kagsi~2,5%-os metanol/kloroform
98+%-os tisztaság; kimutatható szennyeződés nincs φ φ
95 % Etanol/HCI 307 nm
95 % Etanol 291 nm
95 % Etano1/ammön ia 298 nm
5. reakció
8-Tío-N6-(28-izopentenil)-adenin
1,18 g 8-benzil~ti.o-~MA-(28~izöpentenil>~adenimfc oldunk 1.25 mi folyékony ammóniában, így tiszta sárga oldatot kapunk. Nátriumot adunk, hozzá kis részietekben, ameddig a kék szín 15 percig fennmarad. Kísmennyiségű szilárd ammóníum-klorídot adunk hozzá a feleslegben lévé nátrium eltávolítására. Az ammóniát egy forró lapon kis térfogatra bepároljuk, majd 125 ml étert adunk hozzá.
Miután az összes megmaradt ammónia eltávozott, az éteres extraktumot 2x65 ml vízzel extraháijuk. A vizes extraktumot (pH~12-13) jégbehűtjük, majd pH-ját jégeoet hozzáadásával 5~re állítjuk be. Egy krémes fehér szilárd anyag csapódik ki, amelyet kiszűrünk, alaposan mosunk vízzel, majd egy éjszakán át kaloium-kloridon szárítunk, így látszólag fehér, nagyon könnyű port kapunk. Kitermelés 760 mg.
Megjegyzés: a 8~tio~Ms~{2’-izopentenil)-adenin könnyen oxidálódik lúgos oldatban.
Analízis
HPLC cm hosszá oktadecil-szilikagél oszlop, 0-80 %-os metanol/0,2 mol/1 jégecet, 30 perc, 1 ml/perc, UV követés
0 nm-en
Éles, szimmetrikus csúcs, szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 98-+%.
sy % Etanoi/BCI 245, 307 (éles), 315 nm % Etanol 241, 305, 313 nm
6. reakció
XP8SGK~náiríumsó
600 mg S~tio~K6~(2f-izopentenil)-adenlnt szuszpendálünk 102 ml 50 mmol/l-es kálíum-hidroxídban, amely 1 % B-merkapto-etanolt tartalmaz antioxidánsként. Elegendő etanolt adunk hozzá, hogy a szilárd anyag feloldódjon. Az oldatot csökkentett nyomáson szárítjuk kalcium-klóridőn, majd főszfór-pentöxidon. A száraz terméket 100 ml vízmentes metanolban oldjuk, amely 50 pl S-merkapto-etanolt tartalmaz, és g MBTG-t adunk hozzá. A keveréket 24 óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, majd csökkentett nyomáson szárítjuk kaicium-kloridon és foszfor-pentoxídon. A védett észtert 1 óra hosszat szobahőmérsékleten hidrolizáljuk 50 ml 5 %-os nátrium-hidroxidban.
Tömény sósawal végzett semlegesítés után a nyers terméket fordított fázisú és normál fázisú kromatográfiávai tisztítjuk, Így színtelen szilárd anyagot kapunk, amelyet tömegéi landósáoíg szárítunk kalcium-klorídon. Kitermelés
190 mg.
Az XPSSGb-nátrlumsé ana.lig.ise ys
max Stanol/pH::::l 300 nm
Etanol/sémieges 285 (erős váll), 291, 301 nm
Etanol/pH-12 283 (váll), 290, 300 nm
Vékonyréteg kromatográfla
Sziiikagél-klórof orm/metanol , 1/ X
34, 68, 102 és 134 gg IPSSCh-nátriumsot f elvive egyetlen éles foltot kapunk, szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 99,5+%. Szabad citokinin bázis {8-tio”Hs-{2’ízopenteníl) -adenin tai*taima <ö,l%.
cm-es oktadecil-szílikagél oszlop, 0-80 %-os metanol/©,2 mol/1 jégecet,30 perc, 1 ml, 300 nm
Egyetlen széles csúcs, TPIS-HC1 pH==~18,2 perc. Szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 99,54-%.
GUS hidrolízis mg/ml koncentrációjú IPSSGü-nátriumsót Inknbálunk 2500 egység GUS enzimmel (Sigma) 50 mmol/l-es foszfát pufferben (pH~7) 37°C-on 24 éra hosszat. Vékonyréteg kromatográf iáva l (1/í metanol/kloroform) az XPSSGN-nátriumső teljes konverziója {>95%) mutatható ki egy olyan vegyületté, amely együtt kromatografálődik a 8-tio-(2 *-izopentenil)-adenínnel. Az XPSSGH-nátriumső ennélfogva érzékeny a GUS hidrolízisre.
Szinonimák:
Rövidítésϊ vegyület] zeatin -ö-B - D -g 1 ükuronsa v-ná t r i umső, z ea t in-O~ g1 ükur on id- na tr íums 6 2OGN-nátr í umső
Trans2~2~metil~4~ftálÍmidobut-2-eníl-(2‘»3’,4'-tri-G-aoetí l-B-D-gTükopiranursav-metil-észter
1,87 g transz-l-hidroxi~2~metiX-4£tálim.ido-fout-2-ént (Corse & kuhnle, Synthesis, 618-619 (1972)) és 9 g frissen aktivált ezüst-karbonátot szuszpendálunk 300 ml vízmentes éterben, amely 9 g moiekulaszitát tartalmaz, 30 percig kevertetjük szobahőmérsékleten, majd 3,24 g MBTG~t adunk hozzá, és a keveréket sötétben kevertetjük 2 napig szobahőmérsékleten. További 1,62 g MBTG-t adunk a reakcióelegyhez, majd újabb 2 napig kevertetjük. A reakeióelegyet megszűrjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, így színtelen szirupot kapunk, amelyet tovább szárítunk csökkentett nyomáson kalcium-klóridőn, így színtelen, porithatö habot kapunk. A nyers terméket megszabadítjuk a cnkorszennyezödésektői 200 g sziiikagélen végzett kromatográfiával, majd kloroformmal eluáljuk. A tiszta termékből 2,45 g-ot kapunk (kitermelés 55,4 %).
SS
Transz-2~metíl~4~amino“but~2-enil~.8~D~glükopiranozi.X~uronamid
2,45 g metil-transz-2-metÍl-4-ftálimidobut-2-enil-(2 8,3 8,4*-trí-O-acetil)“ö-D-glükopiranuronátot oldunk 150 ml vízmentes metanolban, jégbehü'tjük, majd hat óra hosszat ammóniát bocsátunk át a jéghideg oldaton. Miután a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítóttűk, a nyers terméket cellulóz -kromatográfiával (200 g) tisztítjuk, és a kromatogrammot butanol-etanol-ecetsav-víz (8:2:1:3 térf/térf) eieggyei fejlesztjük ki. Az eluátumot csökkentett nyomáson szárítjuk, így barna szirupot kapunk, amelyet további tisztítás nélkül használunk a kondenzációs lépésben.
Bea t i n-0-S-D ~glükuronsav-nátr íumsó
Az előző lépésben kapott szirupot lezárt csőben ö,8 g S-klör—purinnal és X,s ml trietíl-aminnal 25 ml metanolban melegítünk üO^C-on 4 óra hosszat, így kapjuk az amidet. Ahhoz, hogy az amidet savvá alakítsuk, a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd 25 ml 5 %-os vizes nátríum-hidroxidot adunk hozzá. Miután szobahőmérsékleten 6 óra hosszat keverhettük, az elegyet óvatosan semlegesítjük 2 mol/1 sósavval, majd fordított fázisé kromatográíiával tisztítjuk 100 g oktadecil-szilikagélem, majd vízzel eluáijuk. A nyers üOGM-nátríumsöt, amely reagálatlan S-klór-purint tartalmaz, csökkentett nyomáson szárítjuk, majd kromatográfiával tisztítjuk 50 g szilikagéien, az elválást 0-100 %-os metanol kloroformos oldatával végezzük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így a terméket amorf szilárd ♦*·♦
- 7ö anyag formájában kapjuk, amelyet csökkentett nyomáson kalcium-ki őri dón szárítunk. Kitermelési 158 mg.
Analízis
UV
vizes etanoi 276 nm, 270 nm ; (váll),
283 nm (váll)
vizes etanol/HCl 279 nm
vi zes etanoi/ammónia 276 nm, 270 nm (váll).
283 nm (váll)
Vékonyréteg kr urn a fcográf1a
Szilíkagél-X-butanol/jégecet/víz, 12/3/5 pg ZOGN-nátriumsót felvitelénél egyetlen foltot kapunk (Kf--0,16), szennyeződések nem mutathatók ki. Seatin (Rf~0,66) vagy 6-klőr-purin (Rf~G,70) nem mutatható ki. A tisztaság 98·+%.
HPLC
15x0,46 em oktadeci.1 -sziiikagél oszlop, UV követés
270 nm-en
Gradiens-elüció
0-100 % metanol 30 percig 1 ml/perc sebességgel A 2GGN—nátriumsó meglehetősen széles csúcs formájúbán eluálődik (tk~lö,ö perc), az oldószercsöcsban kismenynyiségő szervetlen szennyezés van jelen. Tisztaság 9?-+%, φ φ φ ·>
X ζ okra t ikus © lőc lé %-os metanol, 1 ml/perc
Az izokratikus eluálást a zeatin-tsrtalom mérésére használjuk. A SOGN-nátriumsó retenciós ideje, tR«l,l perc, míg az autentikus transz-zeatin tA értéke 2,2 perc. Egészen 96 pg EOGN-náérinmsét felvíve nem mutatható ki zeatin. A zeatín-tartalom ennélfogva kisebb mint 0,1 %. Ezt szílikagél vékonyréteg kromatográfiával is igazoljuk, kloroform/metanol 9/1 elegyet használva. A fOGN-nátríunsó nem mozdul ki a felvitel helyérél ebben a rendszerben, de a. szennyező zeatin világosan elválik Rf=0,39 értéknél. Nem mutatható ki zeatin, ha 200 pg EOGh-nátriumsőt futtatunk. A transz-zeatin kimutatási határa vékonyréteg kromatografiával 200 ng; tehát a transz-zeatin szennyezés mértéke kisebb mint 0,1 %.
Enzimátikus hidrolízis
Egy EGGN-nátriumsó mintát inkubálunk d-glükuronidázzai (Sigma G9387) 50 mmol/1 nátrium-főszfát-pufferben <pH~7,ö) 37 °C-on. A KPLC mérés (50 %-os izokratikus metanol) azt mutatja, hogy az anyag lényegében teljesen transzzeatinná alakult. Az enzimes hídrólizátumban levő anyag transz-zeatinnal való azonosságát ügy igazoljuk, hogy a hldrolizátum és autentikus transz-zeatin 1:1 arányú keverékét 3 különböző kromatográfiás rendszerben futtatjuk.
φ * ** * letu vegyület]
Szinonimák:
Rövidítés:
o-kumsr χ 1 - 5-D-glükopiranuronamid o~kumar1 1-glükuronamid CouGRamid g metíl-o-kumarátot és 16,8 g MBTG-t 25 ml kín©!ínnal eldörzsölünk, igy homogén pasztát kapunk. 1.0,7 g ezüst (I)-oxi dót adunk hozzá részletekben, alapos keverfcetés közben, miközben a keveréket jégbehütjük. Miután a hozzáadás teljes, a reakcióé legyet 3 éra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk. Az elegyet 1 liter étex'rel extraháljuk, majd az éteres extraktot 1 liter vízzel mossuk. Az éteres extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárítva vörös szirupot kapunk. A nyers szirupot 300 ml petroléterrel extraháljuk, a reagálatlan metil-okumarát eltávolítása érdekében, majd csökkentett nyomáson szárítjuk, hogy a petrolétex* nyomait eltávolítsák. A nyers terméket etanolból átkrlstályosítjűk aktívszenes színtelenítés közben, így a tiszta peracetilesett metíl-2-híöroxicinnamil-O-Ő-O-glükopiranuronátot (3,5 g) kapjuk.
A peracetil-metil-észtert (3,5 g) 250 ml vízmentes metanolban oldjuk, majd hidrolizáljuk, oly módon,hogy 0 ‘’Con kevertetjuk 3 óra hosszat újabb 250 mi vízmentes metanollal, amelyet -10 cC-on száraz ammóniával telítettünk. Az ammóniát és a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, ♦ * fc * φ fc fc ♦
* X « *
*♦ majd a nyers terméket standból átkristályositjuk, így 1,7 g tiszta CouGhanidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában ..
Szilikagél-kloroform/mefanol, 1/1
Egyetlen éles folt, Rt értéke 0,63. Szennyeződés nem mutatható ki egészen 50 pg felvitt anyagmennyiségig. Tisztaság 98t%. Szennyeződések; <0,5%~ban metil-o-kumarát vagy kumarin.
S z i 1 ik ágé 1 - k I o.r of orm /metano 1 / jégecet, 50/50/5 Egyetlen éles folt Rf-0,ó8~nál. Tisztaság SS+%. Okumarínsav nem mutatható ki {<0,5%, Rf~ö,8öj.
S-Hiöroxi-oiananil-O-D-glükopiranursav r(XIX) képletei vegyűlet]
Sz inonímák. í o-kuear i l-.S-D-giakopIranursav o~kumari1-g1ükuronid Rövidítés: CouGR
Szintézis
17,8 g ®etil“O~kumarátot és 20 g MBTG-t 20 ml kinő1innal eldörzsölünk, amíg homogén pasztát nem kapunk. 13 g ezüst (!)-οχidőt adunk hozzá részletekben, alapos kevertetés ·* ♦ közben, miközben a keveréket jégbehü'tjük. Miután az adagolást befejeztük, a reakei .óeiegyet hagyjuk szobahőmérsékleten állni 3 őrá hosszat, A keveréket X liter éterrel extraháljuk, majd az éteres extraktumot X liter vízzel mossuk, Az éteres extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárítva vörös szirupot kapunk. A nyers szirupot 300 ml petroléterrel extraháljuk a reagálatlan metí1-o-kumarát eltávolítása céljából, majd csökkentett nyomáson szárítjuk a petroléter nyomainak eltávolítása céljából. A nyers terméket etanoíból átkristályosítjuk aktívszenes színtelenítés közben, így 2,9 g tiszta peracetilezetfc metiX-CouGM-fc kapunk,
A 2,9 g peraeetíl-metíX-észtert 250 ml metanolban szuszpendáljuk, majd 250 ml 2 mol/i náfcrium-hidroxidofc adunk hozzá kevertetés közben, míg a reakcióelegyet jégen tartjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1,5 óra hosszat kevertetjűk, majd a pH-ját sósavval 2,5-re állítjuk. A metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a nyers terméket KAD-2 kromatográfiávai tisztítjuk. A kromatográfiás gyantát először vízzel mossuk a szervetlen sók eltávolítása céljából, majd a terméket metanollal eluáljuk, Csökkentett nyomáson való szárítás után a terméket etanoíból átkrístályosítjuk és csökkentett nyomáson kalcium-kloridon szárítjuk, így 1,5 g tiszta CouGh-t kapunk színtelen amorf szilárd anyag formájában.
A CcuGN 5 mg/ml koncentrációban oldódik vizes pufferhen (pH=7> és 50%-os vizes alkoholban, így egy tiszta színtelen oldatot kapunk.
μ/ <*
Analízis
Szi1xkagél-kloroform/metanol/jégecet, 50/50/1 Fő folt Rf=0,12, kis szennyezéssel Rf=ö,24-nél.
Tisztaság 90+%. Nincs kimutatható (<1 %) kumarin (Rf=0,90), metii-o-kumarát (Rf=ö,$l) vagy o-kumarinsav (Rf=0,8ö), A főtermék együtt kromatografálődik az autentikus CouGN-nel, amelyet a 2-hídroxioínnamoíl-0-Ö-g.lükopíranozid katalitikus oxidációjával állítunk elő,
GUS hidrolízis mg CouSN—t oldunk. 1 ml 50 mmol/1-es nátrium-f ossfát-pufferben (pH-:7,0), majd GUS-szal ínkubáljuk (1000 egység Sigma Type G5S97) 12 óra hosszat 37 ®C-on. Vékonyréteg kromatográfiával 93,4 %-os konverzió mutatható ki egy olyan vegyűletté, amely együtt kromatografálődik az o-kumarinsavval. Az o-kumarinsav lassan (nem enzimátikusan) kumarínná alakul néhány nap alatt.
2. példa lizálja# módosítatlan citokininek felszabadulása közben Vizsgálati módszert fejlesztettünk ki azoknak a citokinineknek az azonosítására, amelyek az Escheríchía coli-hói származó S-gXükuronidázsal hidrolizálhatók. [A 8-glükuronidáz enzim különböző tulajdonságait többek között az alábbi cikkekben ismertetik: Blanoo & Nemez, Biochimie, 69, 157-161 (1957), űefferson et al,, Prooeedings of the
National Academy of Sciences, USA, .83, 8447-8451 (1985), Levvy & Marsh, Adván. Carbohydrate Chem., 14, 381-428;
721 071 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom),
A vizsgálandó vegyüíetet 50 mmol/l-ee nátrium-foszfát-pufferhen (pü~7,ö) inkubáíjuk. (általában 500 pg vegyüíetet 500 pl pufferben) B-glükuronidázzal (általában Sigma Type G7986, 2500 Sigma 5SFishman,? egység) 12-24 óra hosszat 37 °C-on, A hidrollzistermékek jelenlétét azután HPLC-vel vagy vékonyréteg kromatográfíával határozzuk meg.
Az alábbi táblázatban az előzőkben ismertetett vizsgálati módszer eredményei láthatók számos citokinín-8-D-glükuronidon és egy citokinin-ö-D-glükuronamidon.
1. táblázat
Citokinin-8-b-glükuronidok (és egy citokinin-8-D-glükur©Kamid) mint az 8s©hetiobia coli-ból származó S-glükuronídéz szubsztrátgai
Hidrolízis Vegyület §
V BA3GR-nátriumsó
BASGMamid
SA9GM~nátríumső 1
ί EOGN-nátriumső i }
f TPOGH-nátríumsó ]
IP2SGM-nátriumső 1P8SGR-nátriumsó ..............-_3
Mivel, az Escherichía coli-bői származó CCS vizsgálatához transzgenikus szervezetekben kizárólag az O-glükuronidókat használtuk, és mivel korábban már leírták [Jefferson, ·»*' * ♦ ♦ ”The GOS reporter gene system”, Natúré, 342. 837-838 (1989)1, hogy a ó-glükoronidáz szubsztrátjai a D-glükuronsavak, amelyek egy S-G-glikozídos kötésen keresztül kapcsolódnak egy ágiikonhoz, meglepd volt, hogy bizonyos N-glükuronidok és S-glükuronidok szintén jó szubsztrátjai ennek az enzimnek. Ennélfogva az a feltételezésünk, hogy az ilyen Hés s-giükuronid vegyületek használhatók az Escherichia coliból és növényekből származó S-glükuronídáz enzim vizsgálatánál, hasonlóképpen a későbbiekben ismertetendő X-glük vizsgálathoz.
A GB-2 119? 635-A számú szabadalmi leírásban közük, hogy a ó-glükuronídás rendszer és űj szubsztrátok alkalmazásával a GbS aktivitás alapján pozitív és negatív szelekció a lehetséges. Ezt a feltételezést azonban soha nem vizsgálták, és az ilyen vegyületek enzimatikus hidrolízise soha nem bizonyult valószínűnek, még az elméleti megfontolások alapján sem, figyelembe véve az Escherichía co-li-ből származó S~glü~ kuronidáz szubsztrátjainak kémiai jellemzőit. Amint az alábbiakban igazoljuk, nem mindegyik g'lükuronid szubsztrátja az Escherichia coli-ból származó 8-glüku.ronidáz enzimnek, és várható, hogy a legtöbb glükurenid szubsztrátja a GUS enz imnek.
Az Escherichia coli B-glükuronidáz génjét expreszszálé növényi szövetek válaszát használjuk olyan módszerként, amellyel kiértékelhető, hogy vajon bizonyos glükuronidok (beleértve a növényi hormon prekurzorokat) hidrolizálhatók-e az enzimmel in vivő [Jeffersorn, ÍSThe GUS gene fusion system as a verseti le tooi fór agx'icul tural molecular ♦ #
- 78 biology'8, Absztrakt, International Congress on Genetic Manipulation in Plánt Sreeding, Esinőre, Dánia, 1988. szeptember 11—16], Ez a megközelítés sajnos nem alkalmazható, mivel a növényi szövetekben erős endogén ő-glükuronidáz aktivitás található [lásd például az alábbi, 3. példát, valamint Hodal et al., S8öetection, expression and spéci fin elimination of endogenous S-gluouronidase activity in transgenic and non-transgeníc plantsd, Plánt Science; megjelenés előtt}. Ennek az endogén Ő-giükuronidáz aktivitásnak a megjelenése azt is jelenti, hogy a Jeftersen által közölt eljárással lehetetlen meghatározni, hogy a glükuronid által okozott hatások a vegyület hidrolízisének következményei, vagy megmagyarázhatók azzal a ténnyel, hogy a glükuronid maga is aktív, Ahhoz, hogy a szelekciós folyamatban alkalmazható legyen, a vegyüietnek a GÜS enzimmel kell aktíválhatönak lennie, és a glükuronid formának nem szabad jelentős aktivitással rendelkeznie.
Az előzőkben ismertetett vizsgáló módszer használható olyan citokinin glükuronidok átvizsgálására, amelyeket az adott B-glükuronidáz enzim képes hídrólizálni, ilyen például a mi esetünkben például az Bscheriehía coli-bői származó S-gluknronidáz enzim.
Azt is meghatároztuk HPLC és vékonyréteg kromatográfía alkalmazásával, hogy a módosítatlan aktív citokininek a GÜS hidrolízis termékei (lásd a fenti példákat, amelyek az üj oitokinin-glükuronid vegyületek készítésére és analizálására vonatkoznak). Tehát például azt találtuk, hogy a BA3Gd-nátríumsö hidrolízise Escheríchia coli B-glükuronidázzal a g
BA3GN~nátríumsó lényegében teljes (>99%) eltávolítását jelenti, egy olyan vegyüiet keletkezése közben, amely autentikus BA-val képzett 1:1 arányú keverékben együtt kromatografálódik az autentikus BA-val, Hasonlóképpen, ha a 20GK nátriumáét Escherichia coli B-glükuronídázzal inkubáljuk, akkor HPLC-vei igazolható (50 %-os izokratíkus metanol), hogy majdnem teljesen transz-zeatinná alakul át; az IP8SGN—nátriumső B-glükuronidázzal való 24-órás inkubálása után vékonyréteg kromatográf iával (l:i metanol/kloroform) igazolható, hogy az IP8SGH majdnem teljesen (>95%) egy olyan vegyületté alakul át, amely együtt kromatografálódik a 8tío~(2-izopentenil)-adeninnel,
Hasonlóképpen, más típusú glükuronidokat is vizsgálhatunk abból a szempontból, hogy egy adott B-glÜkuronidázzaX hidrolizálhatók-e. Például, az o-kumaril-B-D-glüknronidot (5 mg 1 ml pufferben) 12 óra hosszat B-glükuronidázzal (Sígrna Type G5897, 1000 egység) inkubáiva vékonyréteg kromatográfiával igazolható, hogy a kiindulási anyag 94,3 %~ban egy olyan vegyületté alakult, amely együtt kromatografálödik az ο-kumarinsavval. Más, az 1. táblázatban felsorolt vegyü1 eteket inkubáiva (annak a két vegyületnek a kivételével, amelyek nem voltak az Escherichia coli B-glükuronidáz szabsztrátjai) hasonló eredményeket kaptunk, azaz olyan hidrolízis termékeket eredményeztek, amelyek azoknak felelnek meg, amelyeket a B-glükuronídázzal végzett hidrolízis után várunk (lásd az előzd' példákat, amelyek a különböző glükuronid vegyületekre vonatkoznak), Másrészről, a BA9GH, amely, mint az az i. táblázatból kiderül, nem szubsztráfja az
- 80 Esoheríchia coli B-glükuronidáznak, és amelyből nem keletkezik kimutatható mennyiségű (<!%} BA, ha 18 óra hosszat 37 ®c-on 8-glűknronídázzal inkubáljuk,, nem indukál hajtásképződést dohánylevél korongokból (2. táblázat, a későbbiekben) .
3. példa
B&jtásképződéa indukciója kívülről bevitt B-glükurcniőáz génnel vagy anélkül# oitokinin-glükuronidokknl
Kísérleteket végeztünk annak meghatározására, hogy a cítokinin-glükuronidok (valamint a oitokinín-glükuronamidok) képesek-e ín vivő hajtást indukálni növényi anyagban, kívülről bevitt 8-glükuronidáz génnel, illetve anélkül.
Egy GVS-negatív és egy GVS-pozitív dohánynövényből (Nieotiana tabacum ’Wísconsin 38 *) származó magvakat csíráztatunk MSO táptalajon (kurashíge & Skoog szubsztrát hormonok nélkül; hurashige & Skoog, Physiol. Plánt., 15, 473-497 (1962) ; Sigma, VSA]. A GVS-pozitív növényi anyag egy kívülről bevitt Sscheríohía coli B-glükuronidáz gént tartalmaz (uidA), amelyet karfíol-mozaíkvirusböl származó 35S proaoter hajt meg [Jefferson et al., The EMBO Journal, 6(13), 3901-3907 (1987)]« Az eredeti transzgenikus GVS-pozitív növényeket a hagyományos kanamiein alapú negatív szelekciós rendszerrel [Burow et al., Plánt Rolecular Bíology Beporter, 8(2) , 124-139 (1990)] állítottuk elő. A GUS pozitív palántákat az K-glük vizsgálattal azonosítottuk, amint azt a későbbiekben, ebben a példában leírjuk.
* «ϊ
4-S hét elteltével a növények vagy hajtások felső részét új MSO szuhsztrátra vittük át, és ezt az eljárást szükség esetén megismételtük. Ilymódon a növényi anyagot (mind a GüG-pozitív, mind a GüS-negatív) steril hajtástenyészet formájában tartottuk fenn [Burow et al., Plánt Molecular Siology Peporter, &<2) , 124-139 (1980)]. A korongokat a legnagyobb levelekből vágtuk ki (3-5 hetesek), és az alábbiakban ismertetendő (2. táblázat) ssubsztrátokra vittük, át. A használt alaptáptalaj az hSQ volt, a különböző vizsgált vegyületeket különböző koncentrációkban adtuk hozzá, egészen 250 pmol/l-ig. Kis Petri-csészéket (átmérő - 5 om) használtunk, amelyek körülbelül 6 ml szubsztrátot tartalmaztak, ezekre 3-3 levélkorongct tettünk, kíndegyik kezelést legalább négyszer megismételtük.
Azt találtuk, hogy számos citokimin-glükuronid indukál hajtásképződést B-glükuronidáz enzimet tartalmazó növényi szövetekben. Az eredmények az alábbi táblázatban láthatók:
*40
2. táblázat
Gxtokxuía-S-D-glükuronxáok (és egy oitokisin“-glükuronamiá) által indukált hajtásképződéa dohány levélkorongokon fi®S+ (azaz bevitt S-giükuronidáz gént tartalmazó) vagy GGS- (azaz bevitt S-giükuronidáz gént nem tartalmazó) dohánylevél korongokon
r CVS- GüSe Vegyület
Semmi (kontroll kezelés)
e SA (kontroll kezelés) ί
4· 4* Seatxn (kontroll kezelés) !
1 - Glükuronsav (kontroll kezelés)
t 4· BA3GÜ nátrxumsó
1 4 4* SAGGNamid
j - - BAOGM nátriumsó
-X 4 4* SOGk nátriumáé I.P3GN nátrxumső 1
1 XP2SGM nátriumsó
4 4- IP8SGN nátriumáé l 4
«•t* jelentése hajtásképződés 250 pmol/1 koncentráció alatt «-» jelentése az, hogy nincs hajtásképződés 250 pmol/l koncentráció- alatt (a 250 pm.ol/1 megfelel körülbelül 100 mg/ml-nek.
A fenti táblázatból látható, hogy mindegyik cxtokxnin-glükuronid, amelyik hajtásképződést indukál 25G pmol/1 koncentrációban, vagy az alatt, olyan dohánylevél korongokban, amelyek tartalmaznak kívülről bevitt S-giükuronidáz gént, képes hajtásképződést indukálni hasonló koncentrációban olyan levélkorongokban, amelyek nem tartalmaznak kívülről bevitt B-glükuronidás gént. Másrészt a BA9GM cítokiίί .« φ η in glükuroníd, amelyről kimutattuk, hogy nem szubsztrátja az Eschericbia coli ű-glűkuronidáz enzimnek (lásd 2. példa), nem eredményez hajtásképző'dést levélkorongokban sem a kívülről bevitt S-gXükuronidáz gén jelenlétében, sem anélkül, A SASGHamid oltok inin-glükuronamid azonban, amely a 2. példában látható eredmények szerint nem szubsztrátja az
Esoherichia coli 8-glükuronídáz enzimnek, megfigyeléseink szerint hajtásképződést indukál mind GUS-pozitív mind GUSnegatív levélkorongokban, jelezve, hogy a citokínin-glükuronamldok a megfelelő eitokinín-glükuronsavvá alakulnak a növényi szövetben. Tehát úgy tűnik, hogy a eitokinin glükuronidok prekursorai in vivő ugyanúgy tudnak működni, mint a eitokinin glükuronidok maguk.
Esek az eredmények azt mutatják, hogy a magasahbrendű növények, ebben az esetben a dohány, endogén S-glükuronídáz aktivitással rendelkezik. Ez a megfigyelés összhangban van azzal, amit újabban Hu és munkatársai közöltek (Plánt Ceil Reports, 9, 1-5 (1990) ), akik a GUS-szerű aktivitás előfordulását vizsgálták 52 növényfajban, valamint Hodal és munkatársai megfigyeléseivel, (Plánt Science, megjelenés előtt) . Hu és munkatársai azt találták, hogy a pozitív GUSszerű aktivitást expresszáió fajták a zárvatermők minden kulcs-csoportjában megtalálhatok, valamint néhány zárvatermőben is. (Hu és munkatársai nem tudtak GUS aktivitást kimutatní dohányban, ez az eredmény azzal magyarázható, hogy vizsgálataikat in vítro, pH~7 értéknél végezték. Amint azt az alábbiakban bemutatjuk, a dohányban található természetes
GUS aktivitásért felelős enzim nem aktív ph-7 értéknél, visssont aktív pH~4-5 értéknél.)
Ezek a megfigyelések ellentétben vannak a
S8-2-19? 643-A szabadalmi bejelentésben leírtakkal, amelyben azt állítják, hogy a magasabbrendü növények, beleértve a dohányt is, nem tartalmaznak kimutatható ő-glükuronidáz aktivitást. A GB-2 19? S43-A számú szabadalmi leirés szerint, amely egyebek között egy olyan módszert ismertet, amellyel egy szánunkra érdekes gén expresszlóját lehet követni a GUS gén segítségével, a GUS aktivitás jelenléte a fontos gén ekpresssióját jelzi, és ebből az is következik, hogy mivel GUS aktivitás nem található a magasabbrendű növényekben, viszonylag jó módszer, ha a számunkra érdekes gén expresszlóját a GUS génnel követjük. A fenti eredmények azonban azt mutatják, hogy nem ez a helyzet, és a GUS gén használata egy számunkra érdekes gén jelenlétének követésére egyáltalán nem egyszerű, közvetlen dolog, annak a ténynek a következtében, hogy a magasabbrendű növények jelentős menynyxségű belső (háttér) S-glükuronidáz aktivitással rendelkeznek.
Abból a célból, hogy a megfigyelt GBS aktivitás térmészetét vizsgáljuk növényi anyagban, amely vagy tartalmaz kívülről bevitt B-glÜkuronídáz gént, vagy nem, a GUS aktivitás pH-függését standard hísztokémmiai módszerrel határozzuk meg, *X-glük« (S”brőm-4-klör-3-indoliI~B~glükuroníd) alkalmazásával.
Az X-glük vizsgálatot ügy végezhetjük el, hogy először egy vizsgáló közeget készítünk, 50 mg X-glük-öt oldva egy oldatban, melynek Összetétele: 25 ml NaPÖ4 puffer, tipl♦ ♦ ft X -jr ft * ft X*« ♦ « * X *»« ft* kusan pH~?,G, 24 mi desztillált víz, 0,25 ml 0,1 mol/l K3(Fe(CN>6), 0,25 ml 0,1 K4(Fe(CH)6)és 0,5 mi 1 mol/l NapBDTA, majd addig kevertetjük, ameddig feloldódik (körülbelül 30 perc). Frissen vágott, vagy formaldehiddel rögzített szekciókat (0,5 m-nél vékonyabbak) , vagy szöveteket 37 *C~on inkubálunk as X-glük közegben, néhány peretői 24 óráig terjedő ideig. Inkubálás után a szekciókat nátriumfoszfát pufferr-e.1 vagy vízzel Öblítjük, majd mikroszkóppal vizsgáljuk. A GOS aktivitást a kezelt növényi anyag kék festődéeeként látjuk az enzimaktivitás helyén (Jefferson, Plánt Molecuiar Bioiogy Reporter, 5(4), 387-405 (1987)]. A találmány szempontjából általában a húszórás vizsgálati idő az alkalmas, Inkubálás után a korongokat 96 %-os etanollal kezeljük a klorofill eltávolítására.
Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be:
3. táblázat
A GüS-aktivitás pH függése dohánylevél korongokban, kívülről bevitt ÜSS génekkel <D vagy anélkül <-) pH
GUS(-)
GÜS(+)
7 8 0 0 0 4 4*· 4
0: nincs reakció az X-glük vizsgálatban *: kék reakció az X-glük vizsgálatban
Látható, hogy az az enzim, amely a kívülről bevitt ő-glükuronidáz gént nem tartalmazó dohánylevél korongokban a háttér B-glükuronidáz aktivitásért felelős, csak egy keskeny pH-tartományban aktív, amely megfelel a növények belső pHjának (körülbelül pH~5), míg a bevitt gén által expresszált ö-glükuronidáz széles pH-tartományban (4-8) aktív. Ez a pHfüggés lehet a magyarázat arra, hogy a korábbi próbálkozások a növényekben levő CDS aktivitás kimutatására miért voltak sikertelenek, és vezettek ahhoz a rossz következtetéshez (például a GS-2 197 653 sz. szabadalmi leírásban), hogy a növények nem tartalmaznak belső GUS aktivitást.
Azt a tényt, hogy a fentiekben igazolt S-glükuronidér aktivitás olyan növényi anyag esetében, amely nem tartalmaz kívülről bevitt GUS gént, valójában a oitokinin-glükuroníö szubsztrát S-glükuronidázzal való hidrolízisének következménye, és inén egy aspecifíkus, a szubsztrátot hasító reakció eredménye (például a glükuronidok nem enzímatíkns savas hidrolízise, a glükuronidokröl ugyanis ismert, hogy alacsony pH~értéken elhasadnak), ügy igazoltuk, hogy különböző' enzimek inhibitorainak hatását vizsgáltuk pH~5 értéknél, genetikailag nem transzformált növények esetében (azaz olyan növényeknél, amelyek csak natív GUS aktivitással rendelkeznek) . A vizsgálatot az előzőkben ismertetett X-glük módszerrel hajtottuk végre pH~5 érték mellett, 20 óra alatt.
4« táblázat
Inhibitorok vizsgálat® pB-5 mellett» Hem-transzformált anyag
Koncentráció (mmol/1)
0 0,1 1 10 50
S zacharo-l,4-lakton 4* 4 0 0 0
Glükonolakton 4 4 4 + 4-
GDP-g1ükuronid 4 4- 4 4 4*
Glükuronsav -U 4· + 4 4
Galaktóz 4 4- 4 4 4
Met i X ~ umbe X1 i fér í 1 ~g 1 ükur on i d '+ + 4- 4' 0
EDTA 4 4 4* + 4
- nincs reakció, azaz teljesen fehér levélkorong + - kék festőóás X-glük-kel
A hat vizsgált inhibitor a következő hatásokkal rendelkez ik £
A szaoharo-i,4-lakton egy olyan inhibitor, amely a ő~glükuronidáz enzimekre specifikus (másszával, csak a B~ glükuromidázokaf, éspedig mindegyik S-glukuronidázt gátolja) . Általánosan elfogadott, hogy az ezzel a vegyülettel gátolható GUS aktivitás 8-gIükuronidúz enzimtől származik.
A glükonolakton a S-glükozidézők inhibitora. Megfelel a szaeharo-ljá-Iaktonnak, azzal a különbséggel, hogy a &-g1ükozidázokra spécifikos.
Az GDP-glükuronid az üBP-glükuronid-transzferáz enzimre specifikus.
Glükuronsav a terméke mindegyik B-giükuronidáz reakciónak, és ennélfogva egy termék-inhibitora a B-giükuronídáS8 zoknak és egyéb, glükuronsav-képző enzimeknek.
A gáláktóz az üDP-gXükuronid-transzferáz depende-ns reakciók inhibitora.
A metil-umbelliferil-glükuronid az eddig vizsgáit összes B-glökuronidáz szubsztrátja, és így a GUS enzimek kompétitív inhibitora.
Úgy találtuk, hogy az EDTA-nak (amely gátolja az UDP-glükuroníd-transzferázokát) nincs hatása, ezért valószínűtlen, hegy az Ilyen transzferázok szerepet játszanak a megfigyelt GUS aktivitásban. Az előző táblázat azt mutatja, hogy azoknak a vegyületeknek, amelyeknek gátolniuk kellene egy transzferár· enzimet, nagyon magas koncentrációban nincs hatásuk. Az is látható továbbá, hogy a glükonolaktonnak nincs gátló hatása, és ennélfogva valószínűtlen, hogy a GUS aktivitás a S-glükozidáz aktivitáshoz kapcsolódik.
Az is látható továbbá, hogy a GUS specifikus inhibitor, a szacharo-í,4-lakton egy erős inhibitor, a glükuronsav (a 8-glukuronidáz termék-gátlása) egy közepes erősségű inhibitor, és a metíl-umbellíferil-giükuronid (gyenge inhibitor, (amely egy GUS szubsstrát, és ennélfogva kompetüív szubsztrátja az X-glük-nek, ha az X~giük hidrolíziséért egy Ő-glukuronidáz enzim: felelős). A dohányban megfigyelt GUS aktivitás tehát minden szükséges feltételnek megfelel, és ezért mondhatjuk, hogy egy S-giükuronidáz enzimtől származik. Tehát le lehet vonni azt a következtetést, hogy a növények egy S-glükuronidáz enzimet tartalmaznak.
Egy hasonló kísérletsorozatot végeztünk annak eldöntésére, hogy az inhibitorok hatása elég gyors-e ahhoz, hogy az enzimet gátolják, Ebben a sorozatban a növényi anyagot a vizsgált vegyülettel 24 óra hosszat előinkubáijuk (inhibitorok), mielőtt az X-glük vizsgálatot elvégezzük ugyanazzal a vizsgált vegyülettel. A kapott eredmények azonosak azokkal^ amelyeket az előinkubálás nélkül kaptunk, ami azt mutatja, hogy az inhibitorok elég gyorsan behatolnak a növényi szövetbe ahhoz, hogy gátolják az X-glük vizsgálatot, mielőtt a kék festődén megtörténik.
A fentiekben ismertetett eredményekhez hasonló eredményeket kaptunk más vizsgálatokkal, amelyek a GüS aktivitás előfordulását elemezték növényekben. Ebben az esetben a hisztolőgiai GüS reakció pH-függését számos növényfajban elemeztük 3 és S közötti pH értéktartományban, a GUS-specifíkus inhibitor, a szacharo-l,4~lakton jelenlétében és anélkül is.
A használt vizsgálati módszer az előzőekben ismertetett X-glük módszer. A vizsgálatot 37 °C-on végezzük 20 őrá hosszat. A leveleket darabokra vágjuk (steril borotvapengével) , Így mindegyik levelet számos különböző pH-értéken lehet vizsgálni.
Amint az alábbi táblázatbői látható, ez a vizsgálat megerősíti, hogy a növények valóban rendelkeznek természetes GUS aktivitással, ez az aktivitás egy enzimátikus reakció eredménye (nincs reakció a GUS-spéciiikus inhibitor jelenlétében) , Ós az enzim elsődlegesen pH~4-5 között aktív.
>* * * <. :♦ « *
- 90 5. táblásat
Hisztológiaí S0S reakció különböző pH-órtékeknél
J pH a vizsgálat során j Szacharo-X, 4-lakkon (nmoi/1) 3 0 4 0 5 0 6 0 ? 0 á 0 ------------- 3-8 lö
1 Kövénvfai i Cukorrépa, vad típus 4· 4 4 4“ (4) δ 0
| Cukorrépa, transzgenikus 1) 4 4 4* 4 4 4 <t)
1 Cukorrépa, transzgenikus 2) -4- 4 4 4* (t) 0 0
1 Bőza 0 4- 4 4 0 0 0
? Búza, albínó 0 4 4 4 0 0 0
ί Olajrepce mag 4 4* 4 (4) {*) 0 0
j Dohány 0 0 0 0 0
I Dohány, transzgenikus l) 0 4 4 4 4 4 0
| Dohány, transzgenikus 2) 0 4· 4- 0 0 0 0 1
| Fenyő 4) 0 4* 4 0 0 0 0 I
| Rebarbara 3) n n 4 4* 4 4 0
5 1 Borsó 3) 0 4 4 0 0 0 0
Hadársóska 3) n n n n (4) n 0
j Cbenopoö iám n n n 0 4 n n
1) Az Escherichia coli CCS gén jét expressz áló
levélszövet
2) Transzgenikus levélszövet, amely csak kanalaiéin rezisztencia gént (NPT) tartalmaz, kívülről bevitt GDS gént nem
3) .Levélnyél vagy őssejt szövet
4) Embriogén kailusz-szövet
Kék reakció (4) A GUS aktivitás kis gyakorisága (világoskék reakció)
Kincs reakció n Kincs meghatározva
Az a tény, hogy a növények általában rendelkeznek saját GUS aktivitással, lehetővé teszi, hogy a glükuronid-permeást kódoló gént használjuk pozitív szelekciós génként, anélkül, hogy bármi más· szelekciós gént használnánk, kihasználva azt, hogy a transzformált sejtek sokkal jobban vesznek
Kiderült például, hogy a glükuronidok nem könnyen jutnak he a növényi sejtbe a plazmamembránon keresztül. Ha egy glükuronid-permeáz gént juttatunk be egy sejtbe, akkor azonban a glükuronidok. sokkal könnyebben át tudnak hatolni a plazma-membránon és belépnek a sejtekbe, A glükuronidok. azután hasífehatők a transzformált sejtekben levő GUS enzimekkel. Ezzel szemben a kérdéses glükuronid nem hozzáférhető a nem-transzformált sejtek számára, és ezzel pozitív szelekciós hatás érhető el. Hasonlóképpen, pozitív szelekció elérhető más permeázok és más tipusű vegyületek alkalmazásával, amelyek vagy aktiválódnak a transzformált sejtekben egy belső enzim révén, vagy amelyek egyéb módon fejtik k.i biológiai hatásukat a transzformált sejtekben , amelyekbe
A BA3GH-nátriumsó citokinin glükuronid hatása biokkolédík, ha az ezt a citokinin glükuronidot tartalmazó növényi szövetben a GOS aktivitást gátoljuk. Hás szóval, a citokinin-glükuronid Önmagában inaktív. Emellett, a citokinin glükuronidról igazolták, hegy a szaporító táptalajban stabil, és stabil a növényi szövetben is, ha B-glükuronidáz enssim nincs jelen, amit az a tény is mutat, hogy a specifikus GÜS inhibitor, a szacharo-X? 4—1 akton (SXJ , erősen gátolja a BA3GN~nátriwsső citokinin giükoronid által indukált, de csak gyengén gátolja a szabad citokinin, a SA által indu9 *9 *♦ «X * 99 9 « «99 9 » * Φ Φ « «
Φ* ΦΦ Φφ
a...
6. táblázat
A BA (¢,5 mg/l> és a BA3GN nátriumsd <15 jag/1) által
A fenti táblázat eredményeit a 2. táblázat eredményeivel összehasonlítva látható, hogy a 8A3GN~nátríumső, amely hajtásképzödést indukál mind a GUS-pozitlv, mind a GUS-negatív dohány levélkorongokban, nem indukál hajtásképződést a megfelelő levélkorongokban a Ú-glükuronidáz specifikus inhibitor szaehare~I,4-lakton jelenlétében.
A szacharo-1,4-lakton (SL) nem egy stabil vegyület az ebben a példában alkalmazott pH-η. Egyensúly áll fenn az SL és a szacharinsav (SA) között, Ezt az egyensúlyt csak lassan lehet elérni, és az SB SA-vá való konverzióját a pH esése kíséri. A pú-t ezért számos alkalommal állítani kell egy egyhetes periódus során# mielőtt az SL-t használjuk,
- 93 φ ** Φ »9 fc* ** fc ΦΦΦ Φ * * » * ΦΦΦ fc φ φ' χ «· · χ fc fc fc Φ χ ♦ fc* φφ. ΧΦΦ fcfc *χ ameddig a pH stabilizálódik az SX-t tartalmazó szubsztrátbán.
Az a tény, hogy a citokínin glükuronidok stabilak és inaktívak, ha nincs mellettük jelen &~glükuromidáz, az a tény is igazolja, hogy a 8A9GH, amely nem hídról íz álható a S-g.liikuronidázzal, nem képes hajtásképződést indukálni S2. és 3« példa).
Fontos, hogy a citokínin glüknronid vegyületek inaktívak és stabilak olyan szubszirátoköan, amelyek nem tartalmaznak 8-glÜkuronidás enzimet, mivel ez a stabilitás az előfeltétele az őket alkalmazó pozitív szelekciós rendszer megfelelő működésének.
Azonban nem mindegyik glókuronsav származéktól várható el, hogy stabil legyen. Például a. glükuroniő-észterek nem stabilak olyan növényi szövetekben, amelyek aspecifikus észterázokat tartalmaznak. Ez azt jelenti, hogy a találmány szerint készített és használt citokinin-glükuronid vegyületek (ó-D-glükeronídok az aglikonhoz kapcsolva a glíkozidcs O, S és M atomokon keresztül) kielégítik a stabilitás körülményeit. Másrészről, a más típusú glükuronid kötéseket tartalmazó vegyületek, azaz például az amidok vagy az észter-SD-glükuronidok nem várható, hogy szelektíven hidrolizálódjanak. a ő-glükuronidázok hatására, a növényekben található aspecifikus észterázok és amidázok következtében.
Az előző, 3, példában tehát igazoltuk, hogy a vizsgált citokínin glükuronidok, amelyek, mint ebből a példából látható, önmagukban nem rendelkeznek citokínin aktivitással, ** *9« »« * X 99 9 Φ ♦
9φφ Vl·
- 94 in vivő elhasadnak, a á-glükuronidáz hatására, amely lehet endogén, háttér ö-glükuronidáz, vagy kívülről hevitt ó-glü kuronídáz gén, és ezáltal szabad citokinin keletkezik.
5. példa
Sajtásképződés indákélése kívülről bevitt églüteroaidáz gént tartalmazd növényi szövetből, ssteriaglükuronidok alkalmazásával
Más glükuronidokről, beleértve a sztorin-, glioirrizinsav- és hidroxikínolin-glükuronidokat, igazoltuk, hogy hídrólízálhatók ő-glükuronidás enzimmel, és ennek eredménye hajtásképsődés módosított szubsztrátokon, amelyekben a hidrolízis termékei lényegesek a hajtásképződéshez, Ezt az 5. és 6. példában mutatjuk be, kísérleteket végeztünk két ssterin-glükuronid, a Bszitoszteril-S-D-glükuronid (SG) és a koleszteril-S-D-glükuronid (CG) hajtás-indukáló hatásának meghatározására, ha a szterin-szintézis gátolva van a szövetekben. Az alkalmazott alapmódszer lényegében megfelel az előző, 3. példában leírtnak, Amellett azonban, hogy egyet, vagy mindkét említett szterin-giükuronídot hozzáadtuk, a szabsztrát 0,1 mmol/1 tridemorf-ot és 5 mg/1 3A3CH~náfcriumsőt tartalmaz. A hajtások számát 30 nap elteltével határozzuk meg.
A tridemorf (4-tridec.il-2,ö-dimetil-morfolim) egy fungicid, amely gátolja a szterinok és hasonló vegyületek szintézisét. A tridemorfnak gátló hatása van a hajtások regenerálódására (jóllehet nem végzetes a kivágott növénydarabokra) , ha a növényi szövetet nem látjuk el sztérisekkel.
* φ « φ φ-Χ ΐ Φ X ♦ 4 t « * ♦ Φ
X *«« φ ·« *
X * φ X * *
ΦΦΦ -φ-φ Λΐν «Φ **
Tehát szabad saterínek távollétében a hajtásképződés hatásosan megelőzhető.
A CG-t a Sígma-tol (USA) vásároltuk, a CG-t az &ndö és munkatársai által közölt módszerrel szintetizáltuk (J, Antibíotics, 71, 40S (1970)],
A kapott eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be:
7. táblázat
Regenerált hajtások dohány íevélkorongonként 0,1 mol/l txideaorffal és 5 mol/l SASGH-nátriumsóval kiegészített szubsztrátokon
Vegyület Koncentráció mg/1
Szitossteril-Ő-D-giükuronid 0 0 12,5 12,5
KoIeszierii-e-D-glükuronid 0 50 0 50
Hajtás per levélkorong 0,3 0,3 2,8 4,0
A fenti táblázat t os z tér í 1-S-D-glükur onid hatását, és a szitoszter adatai azt mutatják, hogy a sziképes leküzdeni a tridenorf gátló ,1-A-D-glükuronid és a koleszterilŐ-D-glükuronid kombinációja eredményezi a legjobb hajtásképződést. Tehát a találmány szerinti pozitív szelekció, bevitt ő-glükuroni.dáz gén alkalmazásával, lehetséges, ha az előzőkben említett szterin-glükurohíd vegyűieteket együtt alkalmazzuk egy hajtás-gátié vegyülettel, például tridemorffal. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy más sz térinek és szte0 *0 Λ- «0 **
0*0 * 9 9 9 9 0 ♦ » 994 * »** ♦ * » * 0 X * *
XX 0 0* 0*0 00 **
- 96 rínsserü vegyületek is használhatók a pozitív szelekciós eljárásban# ha olyan szövetre alkalmazzuk, amely kívülről bevitt ö-glükuronldáz gént tartalmaz.
Ezeknek a nagyon gyengén oldódó vegyületeknek a használatakor a pozitív szelekció előnye, hogy hatásuk feltehetőleg lokális, mivel a vegyületek nem díffundálődnak sejtről sejtre, ha a hidrofil glükuronid egység egy B-glükuronidáz enzim révén lehasad. Más szóval, ezek a vegyületek használhatók a kereszttáplálás megelőzésére a szelekciós eljárás során.
Ezek a kísérletek azt is mutatják, hogy a tridemorf, valamint egyéb, a szterín-szintézist gátló vegyületek hajtás-gátló hatását ki lehet védeni, ha szterinekei és szterínszármazékokat adunk a szufosztráthoz, és így egy olyan szelekciós rendszer hozható létre, amely azon alapul, hogy a transzgenikus sejteket ssterinekkel és szterinszerü vegyületekkel látjuk el, és az előzőkben leírt előnyökkel rendelkezik.
6. példa hajtás-képződés indukciója szitoszteril-á-D-glükuromid felhasználásával olyan növényi szövetekből# amelyek vagy tartalmaznak# vagy nem tartalmaznak kívülről bevitt B~ -glükuronidás gént
Az ő. példában leírthoz hasonló kísérletet hajtunk végre mind transzformált, mind nem transz formált dohánylevél szöveteken, szitoszteril-Ő-D-glükuronídot, illetve vagy BA vagy BA3Gh~nátríums6t alkalmazva.
«*
A használt módszerek lényegében azok, amelyeket az 5. példában ismertettünk. Ebben a kísérletben a tridemorfot 0,1 mmol/1 koncentrációban adjuk a szubsztráthoz, a szítoszteril-B-ö-glükuronidot pedig 121 mg/1 koncentrációban. A szubsztrát emellett vagy 1,88 mg/1 BASGK-nátriumsőt, vagy 0,1 sg/1 BA~t tartalmaz. A hajtások számát 40 nap elteltével reg is z tr á 1 j uk.
A kapott hajtások száma az alábbi:
Látható, hogy csakúgy, mint az előzd, 5. példában, a szitoszteril“8-D~glükeronid jelenléte képes kivédeni a tridemorf hajtásgátló hatását. Emellett, ha szitoszterí1-B-D-gíükuronidot és tridemorfot együtt alkalmazunk a 8A3GN-nátriumsóval, akkor szelektív hajtásképződést kapunk a GUS~ -pozitív levélkorongokban, míg a GüS-negatív levélkorongok a BA3GN~nátriumsót tartalmazó szubsztráton lényegében nem növesztenek baj tasokat.
Ezek az eredmények azt is mutatják, hogy a különböző glükuronidok kombinációjának alkalmazása (itt a SA3GB és SG, a BA és SG helyett) javíthatja a transzgenikus szövetek szelektív válaszát.
X* * Φφ ♦ * 4 Φ Φ φ 4 Φ Φ « φ Φ « ««« Φ* * Φ 8 *
X ·»#♦
X * «ΦΦ Φφ
- 9S Mivel a satérinek és szteroidok az állati sejtekben is fontos növekedés-szabályozó szerepet játszanak, a megfelelő szelekciós eljárások használhatók olyan állati sejtek szelektálására, amelyek 8-glükuronidSzt expresszálnak.
7. példa
As ártalmatlanított Agrobaoterium törzsek oitokininőket termelnek
Úgy találtuk, hogy bizonyos Agrobacterium törzsek hajtásképződést indukálnak hajtás-indukálö hatású anyagoknak az együtt-tenyésztés során való termelése révén. Az ilyen törzseket általában el kell kerülni, ha a citokinin glükurcnidok CVS hidrolízisét keli használni a genetikailag transzformált sejtek szelektálására, mivel esek a törzsek egyedül is képesek hajtás-képződést indukálni, és így zavarják a szelekciós eljárást.
Az alábbi táblázatban bemutatjuk egy olyan kísérletnek az eredményeit, amelyben két különböző Agrobacterium törzset alkalmaztunk, ezek közül az egyik hajtásképződést indukál dohány levélkorongokon együtt-tenyésztés után.
Az alkalmazott módszerek lényegében azonosak azokkal, amelyeket a 13. példában írunk le, de az együtt-tenyésztés után a levélkoröngokat olyan kSO szubsztrátra visszük át, amely nem tartalmaz hormonokat, de tartalmaz 3öö mg/1 kefotaximot és 3ö0 mg/1 karbeniciliint.
A regenerált hajtások számát az együtt-tenyésztés után négy héttel jegyeztük fel.
ί* <* <·* φφ·χ ··'*
8. táblázat
Hajtásbégződés indukciója dohány levélkorongokon hormonmentes ssubsztráton, ártalmatlanított Agrohaoteríum-mal való együtt tenyésztés után
Agrobacteríum Hajtások száma törzs Plazmád Gének a T-DNS-ben levélkorongonként
C58X T37 GUS és NPT 9,3
LBA4404X PAL4404 GÜS és NPT 0
C58Y T37 Semmi 4,8
LBA4404V PAL4404 Semmi 0
Semmi 0
Látható, hogy néhány Agrobaeterium törzs hajtás-índukáló tulajdonsága nem függ a T-őHS-en található génektől. Ez azt jelenti, hogy a T-DHS régión kívül található gének a felelősek a hajtás-indukcióért,
Egy, a T-DHS régión kívül található gént, amely a citokinin termelésért felelős, fczs jelzéssel láttak el (Morris, P.G., Ann. Rév. Plánt Physíol,, 3.7, 599-538 (1988)], A C58 törzs tartalmazza a tzs gént, egy nem-transzferálódó gént, amely a zeatin szintézisét kódolja az együtttenyésztés során. Az LBA44Ö4 törzs nem tartalmazza a tzs gént. Az a tény, hogy a hajtás-indukcióra képes törzsek egy olyan plazmidot tartalmaznak, amely a tzs gént hordozza, azt mutatja, hogy ez a gén lehet felelős az ezekben a kísérletekben megfigyelt hajtás-indnkáló tulajdonságokért, és a tzs gént tartalmazó Agrobaeterium törzseket el kell kerülni a citokinin-slapú szelekciós rendszerekben. Bármely egyéb
100
Agrofoacterium törzset, amely hajtásképződést indukál, általában szintén el kell kerülni.
Transzgenikus hajtások pozitív szelekciója a BA3GMnátriumsó eifcekínim-glükuronid alkalmazásával
Kísérletsorozatot végeztünk, hogy meghatározzuk a pozitív szelekciós rendszer hatékonyságát, a BA3GN~nátriumső citokinin-glükoronid 7,5 és 15 mg/1 koncentrációban való alkalmazásával. A kísérleteket vad típusú dohánykorongokon végeztük, 2 különböző Agrobacteríum törzset, valamint különböző együtt-tenyésstö szubsztrátot használva. A 13. példában ismertetett transzformációs módszert alkalmaztuk, azzal az eltéréssel, hogy az MSO helyett Gamborg B5 szubsztrátot használtunk [Gamborg et al,, Exp. Cell Rés,, 50, 151-1S8 (1968); beszerezhető a Sígma-tól, USA], Az alábbiakban megadott eredmények két független kísérlet átlagából származnak, és ezek közül mindegyiket 27 levélkorongon végeztük kezelésenként» > ♦ φ
- 101
*
Λ V> X
XX κ* * X 94 * ί «
9. táblásat
Genetikailag transzformált hajtások szelekciója a BA3GH-nátriumsc citoiíuin-glükuroaidot alkalmazva
7,5 ng/1 SASOM-nátriumsó sAgr obacter íum Együtt-tenyész- GüSv hajtások. GOS+ hajtások j: törzsek to szubsztrát levélkoron- %-a az összes Ι- gonként hajtás között
BS10 SS 0,1 6,6
SS 10 B5^ammónia 0,02 0,7
BS10 BS+amnőnis-i-SL 0,3 6, 1
SS 10 átlag 0,1 4,4
LDH1. BS 0,2 7,8
LDH1 SS+amrönia 0,2 5, 3
LDH1 BS+ammöniatSL 0,2 4,7
LÖKI átlag 0,2 5,9
| Mindkettő átlag 0,2 5,1
ag/X BAZOk-nátriumsö
| Agrobacterium Együtt-tenyész- GUS+ hajtások GUS-t hajtások j %-a az összes j hajtás között 1
j törzsek tő szubsztrát levélkoron- gonként
| SS 10 B5 0,3 6,0 j
j SS10 55+ammónia 0,4 8,7
| SS 10 SStasBsőnia-tSL 0,3 5,5
> BS10 átlag 0,3 6,7
LDH1 SS 0,4 9,0
| LDH1 B5+ammónia 0,3 7,6
] LDH1 SS -f- ammőn i a v SL 0,3 7,7
| LDH1 átlag 0,3 8,1 ;
Mindkettő átlag 0,3 7,4 j
« fi « Ίφ fi Φ* & φφφ « i * * *φ fi*.
- 102 m 9fi φ # -$ * φ <» $ * φ * <·
85; Gamborg 85 szubsztrát, pK~5,4
Ammónia: Együtt-tenyésztö táptalaj 75 mmol/1 anmenium- n i t r á fc t a 1
SE: Együtt-tenyésztő táptalaj 25 mmol/1 szacharínsav * 25 mmol/1 szacharo-l,4—laktón egy stabilizált oldatból
GUS·*·: GUS aktivitást expresszáió hajtások, pH~?~en vizsgálva, a 3, példában leírtak
A BSXO törzs egy Agrobacterium-ban inaktív, módosított 355 promoterrel meghajtott GUS gént visz be [Janssen & Gardner, Plánt Moleoular Eiology, 14, 61-72 (1989)1. As EDHl törzse egy módosítatlan 35S promoterrel meghajtott GUS gént visz be.
A 9. táblázatban látható eredmények azt mutatják, hogy a .kívülről bevitt B-glükuronidáz gént expresszáió transzgenikus hajtások pozitív szelekciója lehetséges, BASGN-nátriumsó alkalmazásával. Ezek az eredmények nagyon jelentősek és váratlanok, mivel amint azt a 3. példában leírtuk, a citokinin glükuronidok képesek hajtásképződést indukálni olyan lévéIkerongokban, amelyek nem tartalmaznak kívülről bevitt B-glükuronidáz gént. Az együtt-tenyésztés során alkalmazott különböző kezeléseknek láthatóan nincs jelentős hatásuk a szelekcióra.
A fentiekben ismertetett eredmények azt is mutatják, hogy egy aktív S-glükuronidáz gént tartalmazó Agrobacterium törzs alkalmazása (az EDHl expresssálja a GUS aktivitást baktériumokban) nem érinti a transzformációs rendszert, egy olyan törzzsel összehasonlítva, amelynek nincs aktív B-glü0 «
·**-»
- 103 0» « * JC«* kuronídáz génje (a BS10 törzs nem expresszál GUS aktivitást baktériumokban)
9. példa
Genetikailag transzformált hajtások szelekciója, a zeatiu-G-B-glükuroneav oitokxuín-glükuroníd alkalmazásával
Lényegében a 13. példában ismertetett eljárás alkalmazásával transzgenlkus dohánynövényeket készítünk és szelektálunk, a zeatín-G-B-glükuronsav (2OGN) mint pozitív szelekciós ágens alkalmazásával.
Az együtt-tenyésztést 3 napig végezzük, az oltóanyag sűrűsége ΟΦ^θ^Ι,δ. Az együtt-tenyésztés után használt .szubsztrát. MSO, amely 300 mg/1 karbenxcillint, 300 mg/1 kefotaxímot és 0,1 mg/1 indoleoetsavat (IAA) tartalmaz. 3 hét elteltével az átoltást ugyanerre a táptalajra végezzük, azzal a különbséggel, hogy ez nem tartalmaz IAA~t. Az ebben a példában használt mindegyik szubsztrát pH-ja 8,0. Az egyes kezelésekhez 18 levélkorongot használunk.
Az együtt-tenyésztés után öt héttel a hajtásokat HSO táptalajra visszük át, amely 200 mg/1 kanamicin-szulfátot, mmol/1 szacharinsavat, 300 mg/1 kefotaximot és 300 mg/1 karbenicillxnt tartalmaz, pn™8,0. A szacharinsavat, amely a β-glükuronidáz enzimek gátlószere azért adjuk hozzá, hogy leállítsuk a zeatin-glükuroníd további zeatínná alakulását.
A S-glükuronidáz génnel együtt egy NPT gént is bejuttatunk, amely kanamíeim-rezxszteneiát biztosit. A nem-tx’anszformált hajtások (negatív kontroll) túlélték az eljárást, de ezeknek a hajtásoknak a növekedése késett esen a táptalajon, míg az
- 104 ~ * * ’φ'β'φ
4» ** ·»:♦: Ό »· » * β ♦$>* > * « < ·»· * * * ««? #$ »* ** összes transzformált hajtás (pozitív kontroll), amely aktív N.PT gént tartalmaz, szintén túlélte az eljárást, de a növekedésükben semmi késleltetés nem volt.
A hajtások számát meghatároztuk, valamint meghatároztuk a GUS-pozitív hajtások számát az összes hajtás között az X-glük vizsgálati módszer alkalmazásával (3. példa), 3 héttel az utolsó átoltás után (8 héttel az együtt-tenyésztés után). Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be:
10. táblázat
A genetikailag transzformált hajtások pozitív szelekciója XOöh nátriumsó alkalmazásával
1---- GUS-pozitív hajtások
j 2GGN GUS-pozitív hajtások
ί mg/1 1évéIkerongonként %-a az összes hajtás között
l·----------- — --------
| o,g? 0,3 18,5
i 1,0 2,6 40,3
| 15,0 0,2 o j 2.
1 0,07-i-SL* Ö 0
* SL: 2 mmol/1 szaoharo-1,4-lakton
A fenti táblázatban megadott eredmények azt mutatják, hogy a genetikailag transzformált hajtások sikeres pozitív szelekcióját sikerült elérni XOGN alkalmazásával. A transzgenikus hajtások indukcióját gátoltuk, amikor a B-glükuronidáz specifikus inhibitor szacharo-X,4-lakként adtuk a sznbsztráthoz, ami azt mutatja, hogy a transzgenikus hajtások növekedése, és így a pozitív szelekció sikere függ »** *
·»* ν* ** ytf ♦ »
Λί« Λ· * 9 « «« ««
- 105 a 3OGH S-glükuronidázzal katalizált konverziójától.
10. példa zeatin-0-B-glükuron.savat használva különböző hóméra ék leteken
A oitokínin-glükuronidot alkalmazó pozitív szelekciós rendszer hőmérséklet-függését vizsgáljuk zeatin-ö-glükuronsav (ZÖGR), mint pozitív szelekciós ágens felhasználásával 25 oC-on, 30 ‘’C-on és 35 “C-on,
Transsgenikus dohánybajfásokat készítünk lényegében ugyanazzal az eljárással, mint amelyet az alábbi, 13. példában Ismertetünk. Az együtt-tenyésztést 3 napig végezzük, az oltóanyag sűrűsége megfelel 1,5 öDg§0~nak, Az együtt-tenyésztés után használt szubsztrát MSO, amely 10 mg/1 2~<2~ -hidroxi-etil-amino) “5-benzil-amino~9-metx.l~purint (9-met), 350 mg/1 karbenicí Hint, 350 mg/1 kefotaximot és 0,1 mg/1 índolecetsavat (IAA) tartalmaz, valamint a jelzett mennyiségű ZOGN nátriumsót. A 9-met-et (Apex Organics Ltd,, Anglia) használjuk a zeatin és zeatin származékok glikozilezésének gátlására. Az egyes kezelésekben 18 levélkorongot alkalmazunk.
Hét héttel az együtt-tenyésztés után a hajtásokat M'SO táptalajra visszük, amely 300 mg/1 kanamicin-szulfátot, 350 mg/i kefotaximot# 35G mg/1 karbeniciilínt, 0,1 mg/1 IAAt és 10 mg/1 5-(m-hidroxi”benzíl-amíno)-purint (CH-BA) tartalmaz, majd 25 ®c-ra tesszük, Az GH-BA-t Kaminek és munkatársai leírása alapján lehet előállítani [Plánt Grcwtb Reg,, 6, 113-120 (1937)].
*♦
106 Hat. hét elteltével a kanamíeint tartalmazó táptalajon kifejlődött zöld hajtásokat megszámláljuk. A kanamicinrezisztencia azt mutatja, hogy a hajtás transzgenikus, mivel a ő-glükuronidáz génnel együtt egy KFT gént is átvittünk (amely kanamicín rezisztenciát biztosít) , Transsformálatian hajtások (negatív kontroll) nem éltek meg ezen a táptalajon, míg az összes transzformált hajtás (pozitív kontroll), amely akt.lv NPT gént tartalmas, megélt ezen a táptalajon,
A kanamicín rezisztens hajtások százalékát az őszszes regenerált hajtás között úgy számítjuk ki, hogy a kanamicin-tartaimú táptalajon megélő zöld hajtások számát elosztjuk a kanamicín-tartalmü táptalajra átvitt hajtások számával. Az eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg:
11. táblázat
Genetikailag transzformált hajtások pozitív szelekciója zeatin-O-S-giükuronsavat használva különböző hőmérsékleteken f---• Js?
ZOGN Kanamicin-rezisztems Kanamicin-rezisztens mg/1 hajtások levélkoron- hajtások százaléka . . i gonként az összes ha3tas kozott |
25 .1 0,3 4,3
30 1 1,3 14,8
35 1 0 , 2 26,7
25 IS 0 0
30 15 2,4 26,2
35 15 0,2 18,2
- 107
Az ebben a példában ismertetett biológiai vizsgálatot egy kapcsolt, együtt transzformált génnel végeztük. Ez azt jelenti, hogy a Ő-glükuronidáz gént használtuk szelekcióra, míg az együtt bevitt HPT {kanamicín rezisztencia) génből származó rezisztenciát vizsgáltuk.
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a S-glükuronidáz gén mellett egy együtt átvitt gén is expresszálödik, ha a szelekciót a S-glükuronídáz gén használatával végezzük. Emellett az is látható, hogy az emelt hőmérsékleten végzett szelekció (azaz körülbelül 38-35 °C-on) javltja a hajtások szelekcióját levélkorongonként, valamint a transzgenikus hajtások, százalékát az összes regenerálódott hajtás között.
Az X-glük vizsgálatot különböző hőmérsékleteken elvégezve azt figyeltük meg a találmánnyal kapcsolatban, hogy a növényekben előforduló belső B-glükuronidáz aktivitást a magas hőmérséklet gátolja, míg a bevitt S-glükuronidáz aktivitást nem befolyásolja. Azt találtuk tehát, hogy a belső B-giükuronidáz aktivitás lassan csökken a növekvő hőmérséklettel, egészen 60 *C-ig, amely hőmérsékleten már lényegében nincs belső S-glükuronidáz aktivitás (az X™ glük vizsgálattal meghatározva). Ez megmagyarázhatja a szelekciós eljárás javulását a magasabb hőmérsékleteken.
11. példa
A pozitív szelekció a negatív szelekcióval összehasonlítva és kombinálva
Kimutattuk, hogy az ismertetett pozitív szelekciós rendszer nagyon hatékony és előnyös a hagyományos kanamicin * A * « *
- 10 8 -alapú negatív szelekcióval összehasonlítva. Akkor is jó eredményeket kapunk azonban, ha a pozitív szelekciós rendszert a hagyományos negatív szelekcióval, kombinálva alkalmazzuk.
Az alábbi táblázatban láthatók az eredmények a levélkorongonként megszámlált GGS-pozitív dohány-hajtások számában és a GUS-pozitív hajtásoknak az összes hajtásokra vonatkoztatott számában kifejezve, a pozitív szelekcióra a BA3GN-nátriumsöt, a hagyományos negatív szelekcióra a kanamicint és BA-t használva, valamint a pozitív és negatív szelekciót kombinálva. Emellett a kísérletekhez tartozik a BA3GN~nátriumsóval és a szaoharo-1,4-laktonnal (SL, a bevitt b-glükurenidáz erős, specifikus inhibitora) együtt végzett szelekció.
A 13. példában ismertetett módszereket alkalmaztuk közlünk, azzal a különbséggel, hogy Gamborg 85 szubsztrátofc használtunk az MSO helyett.
109
12. táblásat
Pozitív szelekció negatív szelekcióval kombinálva
Szelekciós szubsztrát Kanamicin GUS 4 hajtások lévéIkorongonként GÜS 4 hajtások j az Összes hajtás | között |
Szám ** BA4kanami~ cinhez hasonlítva
% BA4kana- 1 micínhez hasonlítva
Konc.** Konc.
| BA 1 300 0,01 Ix 4,3 Xx |
I BA3GN* 15 300 0,1 löx 47,1 11X j
) BA3GN* 15 100 0,2 2 Ok 3,2 0,7x
1 8A3GN* 15 33 0,4 4ÖX 4,? 1,XX
| BA3GN* 0 0 0,3 3ÖX 7,4 1,7x
1 BA3GN* 15 0
| ~r SL (10 mmol/1) 0,02 2x 0,9 0,2x
*: nátriumsó koncentráció mg/l-hen
A BA-t és kanamicint együtt alkalmazó kísérletet, amely megfelel a hagyományos negatív szelekciós rendszernek, két különböző kísérlet formájában ismételtük meg, kísérletenként 54 levélkoromget használva. Egyetlen GUS pozitív hajtást mutattunk ki a 23 kiválasztott hajtás között, A BASGN-nátriumsóval kapott eredményeket 324 levélkorong felhasználásával végeztük. Az SL-lal {szacharo-1,4-lakion) végzett kísérleteket egyszer végeztük el összesen 162 levélkorong felhasználásával.
A fenti táblázat azt mutatja, hogy a pozitív szelekció, 15 mg/1 B&SGN-mátríumsót. alkalmazva (kanamicin nélkül.) harmincszor annyi GüS-pozitív hajtást eredményez levélkorongonként mint a hagyományos negatív szelekciós rendszer, 1 mg/1 BA és 300 mg/1 kanamlcin-szulfáfc felhasználásával.
» X φ .Emellett az összes hajtásnak, sokkal nagyobb száma vo.lt GUSpozitív, ha pozitív szelekciót használtunk (7,4 %), mint amikor negatív szelekciót használtunk (4,3 %).
Jó eredményeket kaptunk a pozitív és negatív szelekció kombinációjával is, azaz akkor, ha a hagyományos kanamícin-alapú negatív szelekciós rendszerben a citokinint agy citokinin glükuroniddal (BASGN-nátriumsó) helyettesítettük. Tehát, amikor 15 mg/1 BASGh-nátriumsót kombináltunk 300 mg/1 kanamícin-szulfáttai, akkor a GUS-pozit.lv hajtások százaléka ll-Ssér magasabb mint akkor, amikor a BA-t és a kanamicint kombináltuk, és ha a BA3Gh~nátriumsót kombináltuk 33 mg/1 kanamieín-szuifáttal, akkor a GUS-pozitív hajtások száma negyvenszer magasabb volt, mint amikor a BA-fc és a .kanamicint használtuk.
Ha 15 mg/1 B.A3GN-nátriumsófc kombináltunk 10 mmol/1 GUS inhibitorral (SL), akkor mind a GUS-pozitív hajtások lévé Ikorongonkénti száma, mind a GüS-pozitív hajtások százaléka drasztikusan lecsökkent, ahhoz hasonlítva, amikor csak a 15 mg/1 SA3GN~nátriumsót használtuk. Ez azt mutatja, hogy a kívülről bevitt GUS gén a felelős a pozitív szelekciós módszerrel kapott jő eredményekért, mivel as SL-t hozzáadva a növesztő táptalajhoz erősen gátolni lehet az inaktív cítokínín glükuronid (BA'3GN~nátriumsó) S-glükuronidázzal katalizált konverzióját aktív citokininné az ezen a táptalajon növekvő sejtekben, ezzel az indukált hajtások számának megfigyelt csökkenését eredményezve. Tehát a pozitív szelekciós rendszer a szándékaink szerint működik, azaz egy kívülről bevitt δ-glükuronídáz. enzimet használunk egy citokinin-glü1X1 kuroni-d elhasítására genetikailag transzformált sejtekben, ezzel szabad citokinint szabadítva fel ezekben a sejtekben és hajtás indukcióját eredményezve.
12. példa nin-glükuroaid szelektív hatásának javítására
Ismertetés (lásd 3. táblázat, 3. példa), hogy a természetben előforduló B-glükuronidáz a nővényben inaktív viszonylag magas pfí-ertékeken, azaz pH:~6 vagy magasabb értékeken, míg a kívülről bevitt S-glükuronídáz egészen pH~8 értékig aktív. Azzal, hogy a táptalajhoz egy olyan anyagot adunk, amely megnövelheti a sejtek belső pH-ját (például ilyen az amménium-nítrát) , a GUS-pozitív sejtekből a szelektív hajtásképződés tovább fokozható, mivel ezáltal lehetségessé válik, hogy a nen-transzformált sejtekben a természetes B-glükuronidázböl származó minden háttér S-glükuronidás aktivitást blokkoljunk.
Az alábbi táblázat a GUS-pozitív és GUS-negatív dohánylevél korongokból kapott hajtások számát mutatja, különböző koncentráciőjű BAlGk-nátriumsőt és ammőnium~niiratot alkalmazva. Az alkalmazott módszer ugyanaz, mint amit a 3» példában leírtunk, aszal a különbséggel, hogy az MSO szubsztrát helyett Gamborg Bő szubsztrátot használunk.
«φ» * * «
13. táblázat
As ammőnium-nítrát tatása a szelektív hajtásképződésre BA3GX nátríumsóval kezelt levélkormagokból <pR~?)
Hajtás-képződés (szán és szeiektivitási faktor *) GUS+ félkorongokban - és i
GUS-le^
7 ,5 mg/1 BA3GN** 15 mg/1 BA3GN** 30 mg/1 BA 3GU** )
Ammóniám -nitrát konc. (mmol/1) GUS+ GUS szel.* - faktor GÜS+ GÜS- szel.* faktor GÜS+ GÜS- szel.* i faktor 1 } t
25 4 0 >4x 33 •sií 17x 73 36 2x )
35 S 1 6k 50 ? 7x 73 39 2X
45 0 0 20 6 3X 57 27 2X
55 14 0 >X4x 34 0 >34x 37 11 3X
65 2 0 S A 4X 25 45 IX ...........................i
r— ~ $ í ~ j Átlag 26 1 26x 145 1? 9x 265 158 2x |
* A szeiektivitási faktor jelentése az a szám, amelyet úgy kapunk meg, hogy a GUS-pozitív hajtások számát osztjuk a GUS-negatív hajtások számával, és ezzel egy adott kezelés szelektivitására kapunk adatot.
** nátriumsó
Látható, hogy mind a BA3GN~nátriusső mind az ammónium-nitráfc alkalmazása megfelelő koncentrációban szelektív hajtásképződéshez vezet a GöS-pozitlv levélkorongokban. Például .15 mg/1 BA3GN~nátríumsó és 55 mol/l ammóníum-nitrát kombinációja 34 hajtást eredményez a GUS-pozitív levélkorongokbol, míg nem keletkeznek hajtások a megfelelő GUS-negativ levélkorongokon, amelyeket ugyanannak a kezelésnek vetettünk φ >
w ♦ v χ »* X ♦ « »
X ΧΦ« φ «VX X « » « ♦ X » *
ΦΦΦ φφ v*« «·> »» .13 alá.
Egy másik lehetőség a pozitív szelekciós rendszer szelektivitásának javítására cítokinin-glükuronidok alkalmazásával, ha a növesztő táptalajhoz egy olyan szubsztrátot adunk hozzá, amely B-glükuronidázzal való hasítás «tán a pH növekedését eredményezi, és ezzel gátolja a citokinin-glükuronídok hidrolízisét a nem-transzformáit sejtekben, anélkül, hogy gátolná a szabad cítokinin hatását.
Ezt az elvet illusztráljuk egy kísérletben, amely a különböző koncentrációjú o-kumaril-B-D-glükopiranursav (CouGH) hatását vizsgálja BASGN-nátriumsőval vagy BA~vaX indukált GUS-negat ív dohány levélkorongokból. Ha az o-kumariX-B-D-glnkopiranursavat B-glükuronidázzal hasítjuk, akkor o-kumarinsav szabadul fel. Amint az előzőkben említettük (lásd 11 példa), az o-kumarinsav spontán kumarínná alakul.
Ez magában foglalja egy savcsoport eliminálödását (lásd az A reakcióegyenletet) , és ezzel megnöveli a pH-t egy olyan szintre, amelynél a természetes növényi Ó-glükuronidáz aktivitása feltehetően redukálódik.
A kísérletet. 0,5 mg/1 BA koncentrációval és 10,0 mg/1 BASGN-nátriumsó koncentrációval végeztük. Kezelésenként 1.2 korong volt, és a hajtások számát 19 nap elteltével regíszii’áltuk. Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be.
114 14. táblázat
Az o-kumaxil-S-b-s (CouGB) hatása a BA vagy SMáGB-mátriumsovaX indukált hmjtáeképződézre
CouGN ; konc. (mmol/1)
A regenerált, hajtások száma Relatív % BA relativl BA3GH réiativk BA/BA3GR*
0 71 100 77 100 1,0
0,0625 66 93 78 101 0,9
0,125 71 100 63 82 1,2
0,25 56 79 79 103 0,8
0,5 71 100 56 73 1,4
1,0 70 99 4 5 19,8
2,0 65 92 6 8 11,5
3,0 37 49 0 0 >49
4, 0 36 47 0 0 >47
5,0 16 21 0 0 >21
6,0 12 16 0 0 >16
7,0 13 17 0 0 >17
* nátríanső
A fenti táblázat azt mutatja, hogy as o-kumaril-B-D-glükopiranursav jelenléte a növesztő táptalajban gátolja a BA3GN~nátrivmsöva.l indukált regenerálást, de nem gátolja a BA-vel indukált regenerálást. A legjobb eredményeket ebben a kísérletben akkor kaptuk, ha az o-kumaríi-B-D-gl.ükop.iranursavat körülbelül 3-4 mmol/1 koncentrációban használtuk. Számos mechanizmus vehet részt a. BA3GR által indukált hajtásképződés csökkentésében, beleértve az alábbiakat:
1) megnövekedett pH az o-kumarinsav felszabadulása következtében, lásd az előzőket, φφ
- 115 ♦ 9 Φ Φ
Φ XX*
Φ * < Φ φ Φ Φ
X X* φ* •φ φ. φ φ * φ φ ΦΦΧ Φ φ.
φ φ φ * *Χφ «Φ **
2) szubsztrát kompetició a CouGK és a BA3GN között, ezzel a BA3GM alacsonyabb gyakoriságú hidrolízisét eredményezve, és
3) a BA3GN csökkent transzportja a sejtekbe,
Jóllehet a hajtásképződés gyakoriságában CouGN jelenlétében megfigyelt csökkenésében szerepet játszó pontos mechanizmust nem határoztuk meg, az a véleményünk, hogy a megnövekedett pH valószínűleg legalábbis részben felelős a jelenségért. Akárhogy is van, ez a kísérlet azt mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer szelektivitása fokozható a kívülről bevitt S~glüfcuronídáz gén felhasználásával, hogy ezzel olyan Önszabályozó mechanizmust hozzunk létre·, amely jelentősen csökkenteni képes bármely háfctérenzim hatását.
13,
Az alábbiakban egy általános módszert adunk meg, amely genetikailag transzformáit növények készítésére hasznáIható.
A leveleket (hicotiana tabacum ’b’iseonsin 38’) in vitro vagy in vivő növesztett növényekről nyerjük. Az utóbbi esetben a leveleket a transzformálás előtt sterilezzük, A sterílezést úgy végezhetjük, hogy a leveleket 20 percre 5 %-os kalcium-hipoklorlt oldatba tesszük, amely 0,1 ml Tween 80-at tartalmaz literenként, majd ötször mossuk steril desztillált vízzel. Az in vitro növesztett növényeket 1/2
« * X ftft
Kft « X ftX
X XX ft ft ♦ ft ft ftftft ftft XX:
- 1.16 MSO-t tartalmazd táptalaj mint az edényekben növesztjük. (A 1/2 MSO ugyanaz a MSO 50 %-os koncentrációban, azzal az eltéréssel, hegy as agar, a cukor és a vitaminok más koncentrációban vannak).
A leveleket egyenként 14 cm-es Petri-csészékbe teszszük. Kilyukaszt juk vagy körülbelül 1 cr^-es darabokra vágjuk, amelyek nem tartalmaznak fő ereket, a darabok szélei vágott szövetből vannak. Minden olyan vágott szövetet eltávolítunk, amelyet előzőleg hipokloritos sterilezőének vetettünk alá.
A baktériumok tenyésztése
Sgy nappal a transzformáció előtt egy baktériumtenyészetet indítunk oly módon, hogy 2-3 ml baktériumot adunk. 200 ml LB táptalajhoz (Erlenmeyer lombikban) .. A baktériumokat 28 °C~on növesztjük kevertetve (300/perc).
Transz f ormácló
A baktérium tenyészetet közvetlenül a transzformáció előtt 50-szeresre, vagy ΟΒ-Ο,Ι-re hígítjuk (660 nm-en mérve) 1/2 MSO-val. A hígított baktérium-szuszpenzlóból körülbelül 10 ml~t egy 9 cm-es Petri-csészébe öntjük, majd a levéldarabokat ebbe a szusspenzíőba merítjük körülbelül 15 percre. A levéldarabokaf azután eltávolítjuk és a fölösleges baktérium-szuszpenzíót steril szűrőpapírral itatjuk fel.
117
Eoyütt-fe?:vésztés
A transzformálás előtti napon egy steril szűrőpapírdarabot teszünk az együtt-tenyésztő Petrí-csészékre (amelyek általában MSO szubszfcrátot tartalmaznak), ás a levéldarabokát, amelyeket a baktérium-sauszpenziőba merítettünk, fejjel lefelé a szűrőpapírra helyezzük. A levéldarabokat növesztő kamrában ínkubáljuk 12 árás megvilágítási ciklussal 2 napig,
A levélőarabokat olyan Petri-csészékre visszük át, amelyek citokínin glükuronidokat tartalmasnak a jelzett mennyiségben, valamint vagy ISO mg/1 karbenioillint * 350 mg/1 kefotaximoi, vagy csak 80ü mg/1 karben lei Hint, bizonyos esetekben kanamíoin-sznlfáttai kombinálva. A levéldarabokat 3 bét elteltével ugyanilyen friss táptalajra tesszük át, de ez már nem tartalmaz glükuronidokat.
Vizsgálati módszer
A regenerált hajtásokat 1/2 MSO~t tartalmazó edénysetbe tesszük át. körülbelül 2 hét elteltével az X-glük vizsgálatot elvégezzük a zöld hajtásokkal, A hajtásokat szükség szerint átültetjük.,
Elültetés
A genetikailag transzformált hajtásokat, amelyek gyökereket növesztettek (és amelyek GüS-pozitivak) kiültetjük egy nővesztő-kamrába, egy alkalmas növesztő táptalajba, például tőzegmohába. Azután műanyag zacskóval lefedjük, és
- 118 -
körülbelül. 1 hétig növesztjük, ami után a műanyag zacskók két sarkét kivágjuk, hég egy hét elteltével a műanyag zacskókat eltávolítjuk.
14. példa
Hajtásképződés Indukálása szterineket és egy di-S-glükuronidot alkalmazva növényi szövetből, amely vagy tartalmaz kívülről bevitt S-glükuronidáz gént vagy ne®
Az 5. és 6, példákban leírtakhoz hasonló vizsgálatokat végzünk GUS-pozitív és GUS-negatív dohány levélkorongokon, 100 mg/1 B-szitoszterinfc, löö mg/1 koleszterint, 10 mg/1 kampeszterlnt, 1,88 mg/I BASGK-nátriumsót és a di-S-D-glükuroniából, a glieirrisinsavból diammónium-só formájában különböző mennyiséget tartalmazó szubsztrátokon. Emellett a szubsztrátok fele 0,1 mmol/1 trldemorfot tartalmaz. A hajtások számát l? nap elteltével regisztráljuk. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.
15, táblázat
Regenerált hajtások levélkorongonként
Glicirrizin sav* Tridemorf nélkül Tridemorf fal (0,1 mmol/1)
Konc. (mmol/1) : ................ GUS+ GUS- GUS+ GUS-
0,00125 1,6 0 0,4 0
0,0125 1,1 0 2,3 0
0,125 1,3 0,1 7,7 0,4
1,25 0 0 0 0
6,25 0 0 0 0 j .............J
* diammóníumsó
Φ Φ X φ * φ * * ί>
119
Látható, hogy a szterxnek és a glicirrizinsav kombinációja szelektív hajtás-képződéshez vezet kívülről bevitt B~glükuronidáz gént tartalmazó levélkorongokon. (Amint az előzőekben említettük (5. példa), a tridemorf gátolja a szterínek szintézisét, és így gátló hatást fejt ki a hajtásregenerálásra, ha a növényi szövet nem kap szterint.) Míg a szelektív hajtásindukáló hatás látható, mind tridemorfot tartalmazó, mind tridemorfot nem tartalmazó szubsztrátokkal, a legnagyobb számban akkor kapjuk a hajtásokat, ha a szubsztrát tartalmas tridemorfot, különösen 0,125 mmol/1 glxcirrízinsav díammőniumső koncentráció mellett.
15. példa
A SA3Gü~nsl indukált hajtásképződés szelektív gátlása ved típusú (GUS-) dohány levélkorongokban
A kísérleteket a 3. példában leírtak alapján végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a 'Burley* dohányvaríánst használjuk a ’Wiseonsin 38' helyett, metil-D-glükuronidot (MG), amely metanolra és glükuromsavra hídrólízál, adunk a szubsztráthoz különböző koncentrációban, vagy 1 mg/'l BA-nátriumsóval vagy 15 ng/1 BASGk-nátriumsóval együtt. A metanolról igazolták, hogy gátolja a natív GUS enzimet, anélkül, hogy a kívülről bevitt Eseherichia coli enzimet túlzottan gátolná (Kosugi et al., Plánt Sci., 133-120 (1990), míg a metíl-B~D~glükuronídból felszabaduló glükuronsav a GUS enzimek termék-inhibitora. Ha MG-t adunk hozzá, ahelyett, hogy a két vegyületet függetlenül adnánk hozzá, akkor a hidrolízis termékek lokálisan képződnek és abban a « fcr $ ·> ♦♦ * Jí
X, Φ * ·» χχ Φ x » *** $ Χ*Λ * «
X * * Φ * *
Α«« *Λ ΦΧχ ♦* **
120 sejtrészben koncentrálódnak, ahol az enzim található. A kapott eredmények az alábbi, 16« táblázatban láthatók.
16. táblázat
Vegyület Konc. mg/1 Hajtás per levélkorong Arány |
BA BA3GH BA/BA3GH j
He t i X -ü-g 1 ükur on id 0 1,00 0,50 2,8 j
1000 1,91 1,00 1,9
3300 2,25 0
Gidkuronsav 0 1,00 0,50 2,0 |
1000 0,33 0,08 4,1 i
3300 0,83 0 1 I
10000 0,42 0
BA; lmg/1
SA3GK; .15 mg/1
A fenti eredmények azt mutatják, hogy ha vagy MG-t vagy glükuronsavat adunk a rendszerhez, akkor annak az az eredménye, hogy a BA2GN szubsztráttal kapott hajtások száma csökken a BA szubsztráttal kapott hajtások számához viszonyítva. Ha a szövetet MG-vel kezeljük mielőtt a kívülről bevitt GUS enzim expresszálödik, akkor lehet szelektíven élimínální vagy csökkenteni a natív GUS enzim aktivitását vagy hatását a szelekciós eljárás során. A bevitt és a natív GUS enzimek közötti különbségek a szubsztrát kompétíciö következtében létrejövő inhiblcíót, a szubsztrát inhihíciőra való érzékenységet, az enzim mennyiségét (aktivitás) és a termék inhibícióra való érzékenységét illetően az MG és egyéb ha* «4 Φ * * Φφ
Φ 9
Φ * <· *** »·* *ΦΦ
121 sonló hatással rendelkező vegyületeknek a glükuronidökkal kezelt ved típusú szövetre gyakorolt hatásának tudhatok be.
Az is lehetséges, hogy az MG úgy működik, hogy más glükuronidökkal, például a BA3GH~nel verseng a bejutásért.
Ha ez az eset, akkor az MG csökkenteni tudja vagy meg tudja akadályozni más glükuronidok bejutását a vad típusú sejtekbe. Ha egy szekretálddé GUS enzimet kódold gént vagy egy glükuronid-permeást kódoló gént juttatunk be, ez arra használható, hogy transzgenikus sejteket szelektáljunk, ha a bejutás gátolt, például MG-nek a szubsztráthoz való adásának következtében. A glükuronid-permeáz esetében csak a transzgenikus sejtek veszik fel a glükuronidot (azaz a BA3SU-t), és a természetes enzimek növényekben való általános előfordulása következtében (lásd például a 3. példát), a vegyüiet a permeázt (vagy egyéb fehérjét, amely megkönnyíti a glükuronidok felvételét) expresszáió sejt belsejében aktiválódik.
Az is érdekes, hogy a glükuronsav önmagában is képes szelektíven gátolni a BA3GM hatását, feltehetően oly módon, hogy blokkolja a SA3GN GUS hatására való hasadásának termékeként keletkező BA hatását.
IS. példa
A pozitív szelekció,
Φ Jt __ Ί» V _ < _ ......
A cukorrépa egy nagyon nehezen kezelhető növényfaj a transzgenikus növények előállítását illetően. Számos nem« «9
9¼ 9 9 « «99 i 9 r*» JC* >9 99 * # * 9 ifi 9 9 9 9 » * * 9
9«9 0« *♦
122 transzformáit hajtást lehet ”szelektálni olyan körülmények között, amelyek egy normális transzformációs rendszerben transzgeníkus hajtásokat eredményeznek. Ugyanezt találtuk abban az esetben is, amelyben pozitív szelekciós kísérleteket (hozzáadott kanamicin nélkül) végeztünk, 5-15 mg/1 BA3GN~nátriumsö alkalmazásával, az alábbiakban ismertetett körülmények között.
A 11. példában (lásd 12. táblázat), a pozitív és negatív szelekció kombinációjáról azt találtuk, hogy csökkenti a szelektált” nem-transzformált hajtások számát. Snnek következtében a pozitív és negatív szelekció hatását vizsgáltuk cukorrépán, és erről kiderült, hogy előnyös eredményeket ad.
A magvakat négy napig sötétben csíráztatjuk 0,7 g/1 agarózt és 2 g/1 szacharózt tartalmazó táptalajon. A palántákat egy kuné tartóba tesszük át, amely 1/2 MSO saubsztrátot tartalmaz, majd 3 napig világosban tartjuk. A szikleveleket eltávolítjuk a palántákról, majd a sziklevél explantáfcumok levélnyelére egy kis kefével Agrobacterium-szuszpenziót viszünk fel, az Agrohaeterium pedig 35S~kPTXI és 35S-GUS (01>£§ο~0,1) tartalmú. A szikleveleket 4 napig együtt tenyésztjük egy olyan szabsztráton, amely 1/10 MSO szubsztrátót és 200 gmol/1 acetosyringont tartalmaz. A transzformált explantátumokat egy MSO szubsztrátra visszük át, amelyet 0,25 mg/1 BA-val vagy 15 mg/1 BA3GH~náfcrinmsóval (SAP helyett), 0,025 mg/1 naftílecetsavval, 400 mg/1 kanamicinnel, 800 mg/1 karbeniciHinnél és 25 mg/1 vankomicinnel egészítettük ki, majd az explantumokat 21 napig inkubáljuk ezen a
Ϊφφί β ν*
X * 99 ν * Φ » > Φ 9
9 0 0 9»
99« »0 *#« ** **
- 123 szubs2tráfcon«. A regenerált hajtásokat azután ugyanezt a szubsztrátot tartalmazó tartókba visszük át. 52 nap eltelte után ezen a szabsztrafón az összes hajtást MSO szubsztrátra visszük át, amelyet S00 cg/1 karbeniciHinnél, 25 mg/1 karbenicí Hinnél, 25 mg/1 vamkomicínnel és 0,1 mg/1 BA-val egészítettünk ki. 14 nap elteltével a 3. példában ismertetett GUS vizsgálatokat hajtjuk végre a kiválasztott növényi anyaAz eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk he.
17, táblázat
Cukorrépa transzformáció A pozitív és a negatív szelekció kombinációja
Az explamtáfcumok GüS·^ száma hajtások
r..............
| Megatív szelekció i Pozitív és negatív | szelekció $........................
GüS- j hajtások {%) I ___I
löö 0
177 4
Negatív szelekció: 400 mg/1 kanamicin-szulfát * 1 mg/1 SAP
Pozitív és negatív szelekció; 400 mg/1 kanamicin-szulfát t mg/1 SA3GN
Látható, hogy a pozitív és negatív szelekció kombinációjával transzgenikus hajtásokat lehet előállítani olyan körülmények között, amely körülmények között ilyenek keletkeznek a hagyományos negatív szelekciós rendszer alkalmazásával. Ez azt mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer alkalmazása nagyon előnyős cukorrépában, a tiszta negatív »«»
124 szelekciós rendszerrel összehasonlítva.
Bs egyben azt is mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer alkalmazása, (egyedül a negatív szelekcióval kombinálva) lehetővé teheti a transzgenikus növények előállítását más nehezen kezelhető fajokból is, amelyeknél csak alacsony transzformációs gyakoriság érhető elf illetve amelyeknél egyáltalán nem szelektálbatók transzgenikus növények a negatív szelekciós módszer alkalmazásával.
17. példa
Pozitív szelekciós rendszerek, amelyek azon alapulnak, hogy inaktív Η-forrásokat teszünk hozzáférhetővé metabolizálö gének bejuttatásával
A kísérleteket a 3. példában leírtak alapján végeztük azzal az eltéréssel, hogy az MSO szubsztrát normál nítrogéntarfcalnát nullára csökkentettük. Ehelyett a 18. táblázatban jelzett nitrogénvegyületeket adtuk hozzá. A szubsztrát 1 mg/1 BA-t tartalmazott. Az ammöníum-nitrátot tartalmazó szubsztrátokat használtuk pozitív kontroliként.
Ezeket a kísérleteket ezért végeztük el, begy megvizsgáljuk, vajon az opinok inaktívak-e, vagy pedig a növényi sejtek használhatják-e nitrogénforrásként olyan szubsztrátokon, amelyek egyéb nitrogénforrást nem tartalmaznak. Mivel jól ismertek azok a gének, amelyek az opinok métábólizálásához szükséges enzimeket kódolják, a fő feltétele az opinok alkalmazásának egy pozitív szelekciós rendszerben ez, hogy azonosítsuk azokat az opinokat, amelyeket nitrogénforrásként nem használhatják, olyan növényi sejtek és szövetek, * *
125 amelyek ne® tartalmaznak kívülről bevitt -géneket, amelyek alkalmassá teszik a növényi sejteket, hogy a kérdéses opinokat hasznosítsák. Az eredményeket az alábfchiakban adjuk meg.
18» táblázat
Az opirok hatása hajtások dohány levélkororgokból való képződésére nitrogént nem tartalmazó szubsztrátokon
A vizsgált, nitrogént nem tartalmazó szubsztrátokon néhány hajtás regenerálódott. Ez azért lehetséges, mivel a nitrogén mobilizálható az explantátum szöveteiből. Ahhoz, hogy elkerüljük a hajtásképződést a kezelések során minden nitrogén nélkül, az explantátumokat a nitrogénre ki kell éheztetní, oly módon,hogy a kiindulási tenyészeteket nitrogénxsentes szubsztrátokon növesztjük a felhasználás előtt, vagy úgy, hogy az explantátumokat egy nitrogénmentes szubsztráton előkezeljük, például hajtásindukáló hormonok nélkül .
Meglepő módon azt találtuk, hogy az oktopin és a nopalin nea támogatja a hajtásképződést, míg a mannopín jó nitrogéníorrúéként működhet, és támogatja a hajtásképződést
- 126 a lévéikorongokról.
Hogy a nopalin és az oktopin nem képes nitrogénforrásként működni valószínűleg az az, hogy ezek a vegyületek ne® jutnak te, nem netabolizáiódnak, illetve hídrolízálódnak használható vegyüietekké. dől ismert, hogy az opinok transzportjában és sétábólizmusában szerepet játszó géneket tartalmazó szervezetek, például az Agrobacterium-ok képesek az opínokat nifcrogénforrásként alkalmazni, míg azok az Agrobacterium vagy egyéb baktérium törzsek, amelyek nem tartalmaznak opin métábólizmusban szereplő enzimeket kódoló géneket, nem képesek olyan szabsztráton növekedni, amelyek nifcrogénforrásként csak opínokat tartalmaznak.
Ezeknek az eredményeknek az alapján pozitív szelekciós rendszer állítható fel, oly módon,hogy egy vagy több opin metabolizmus vagy transzport gént juttatunk be a transzgenikus növényi sejtekbe, szelekciós szabsztrátként olyan szubsztrátokat használva, amelyek mondjuk nopalínon vagy oktopinon kívül nem vagy csak csökkent szinten tartalmaznak más nitrogénforrást.. Azoknak a géneknek vagy genetikai anyagnak az azonosítását vagy izolálását, amelyek a befogadót azzal a képességgel látják el, hogy az oktopint és a nopalxnf hasznosítsa, az irodalomban már leírták (C. Beaulieu et al«, Can. J. Mícrobíol., 39, 843-49 (1988), P.M. K.lapuijk et al., Journal of General Microbíology, 96, 155163 (1976); C.Ií. Schardl and C.l.Kado, Molecular and. General Genetics, 191, 10-16 (1983); H. Habiko et al., Journal of General Mícrobioiogy, 136. 87-103 (1990)}. Az opin metabolízmust kódoló genetikai anyag izolálásával az eukaríóta
- 12? szervezetek az irodalomban közölt standard eljárásokkal transz forrná lkatok -olyan szekvenciákkal, amelyek az opin métából izmus génjeinek működéséhez szükségesek.
A fenti eredmények alapján valószínű, hogy más opínők és a megfelelő kafcafeolizálé gének hasonló módon használhatók, továbbá az is valószínűnek tűnik, hogy más, hasonlóképpen azonosított ínaktív nifrogénforrások és a nekik megfelelő gének hasonlóképpen használhatók, például amidok amidázokkal kombinálva, peptidek specifikus peptidázokkal kombinálva, stb.
Trnnszgemikus kalluss készítése nehezen kezelhető fajokból# pozitív és negatív szelekció kombinációjának alkalmazásával
A kísérleteket a 11. példában leírtak alapján végezzük, bizonyos módosításokkal. A használt növényfaj a nagyon nehezen kezelhető téli olaj repce «V486w tenyészvonala és a nyári olaj repce *S48?M -tenyészvonala. A magvakat sterilezzük és a 16, példában leírtak alapján csíráztatjuk, A szár alatti részeket használjuk explantátumként, oltjuk és együtt-tenyésztjük a 11. példában leírtak alapján. Az együtt-tenyésztés után az explantátumokat MSO szubsztrátra visszük át, amely 0,1 mg/1 naftílecetsavat, 0,01 mg/1 gibbereliínsavat (GA3), 500 mg/1 karbenicíllint, 50 mg/1 kanamiein-ssulfátot és 6,0 g/1 agarózt tartalmaz, A szufesztrát emellett vagy 1 mg/1 BA-t vagy 3#75, 7,5 vagy 15 mg/1 BA3GN nátriumsót tartalmaz. A pH-t 5,8-ra állítjuk be. Az
128 alkalmazott Agrobaetoriam a T-BN6-ében agy GUS gént tartalmas, valamint 35S promoterek által meghajtott neomicin-feszfotranszferáz II gént. A GUS vizsgálatokat 8 hét elteltével végezzük., és a legtöbb kallusz-sejtben intenzív kék festőŐést mutató kalluszt GüSt-ként regisztráljuk.
19« táblázat
Transzgeníkus kaHúsz készítése olajrepoéből, pozitív és negatív szelekció kombinációjával
Olajrepce, téli típusú !’V4S6fS
8A3GS (rng/Ι) BA (mg/l)
í .... 3,75 7,5 15,0 1
| Explantumok kallusszal 19,0% 23,0% 30,6% 0%
j GUS+ kallusz
| explantumonként í,4% 1,4% 2,3% 0%
ί GUS* kallusz
| per kallusz 7,1% 5,9% 7,5% 0%
Olajrepce, nyári típusú Í?S486,?
I BA3GN (mg/i) BA (mg/1)
I 3,75 7,5 15,0 1
Erplantumok kallusszal [ GUSi kallusz 5,2% 9,2% 6,3% 0%
1 explantumonként 1,7% 2,3% 0,9% 0%
GUS* kallusz
| per kallusz 33,3% 25,0% 14,2% 0%
|
S
Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy ezekkel a nehezen kezelhető' olajrepce típusokkal csak akkor lehet transzgenikus kalluszt szelektálni, ha a pozitív és a negatív szelekciót kombináljuk, míg a hagyományos negatív szelekciós eljárással nem kapunk GUS pozitív kalluszt (BASGh-nátriumsó helyett SA-nátriumsót tartalmasé ssubsztrátok).
Sz azt mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer bevezetése nagyon előnyös, a tiszta negatív szelekciós rendszerekkel összehasonlítva, a kallusz rendszerben ís. Azt is mutatja, hogy a pozitív szelekció alkalmazása (egyedül, vagy negatív szelekcióval kombinálva) lehetővé teszi transzgenikus növények előállítását más nehezen kezelhető fajokból is, amelyekkel csak alacsony transzformációs/szelekciós frekvenciát lehetett elérni, illetve amelyekből egyáltalán nem lehetett transzgenikus növényeket kapni negatív szelekciós rendszerek alkalmazásával.
Miután a transzgenikus kalluszt szelektáltuk, transzgenikus hajtásokká regenerálhatok, például citokinint alacsony koncentrációjú auxinokka.1 kombinálva tartalmazó szubsztráton. Ebben az eljárásban nincs szükség szelekcióra.

Claims (4)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Eljárás genetikailag transzformált növényi sejtek szelektálására egy sejtpopulációból, ahol a genetikailag transzformált növényi .sejtek egy kívánt expresszáihafő nukieofid-szekverseíávaL amely szekvencia egy a transzformáit sejtben az expressziőját lehetővé tevő reguiátor szekvenciát tartalmaz, valamint egy egyidejűleg bejuttatott expresszáiható nukleotid-szekvenciávai van transzformálva, amely utóbbi szekvencia szintén tartalmaz egy a transzformáit sejtben az expressziőját lehetővé tevő regulator szekvenciát, amely eljárás során az említett populációnak egy olyan vegyületet adunk, amely a transzformált sejtekbe a kívánt szekvenciával egyidejűleg bejuttatott éxpresszálhátő- nukleotid-szekvencla expressziós terméke által metabolizáíható, amelynek eredményeképpen a transzformált sejtek a nem-transzformált sejtekhez képest fiziológiai előnnyel fognak rendelkezni ? és ahol a vegyület antibiotikumtól vagy herbíoidtoi eltérő és nem fejt ki közvetlen káros hatást a nem-traszformáit sejtekre.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a vegyület egy citokin, auxín. gibbereilin, vitamin, szénhidrát, opin, fehérje, szterol vagy szaponin.
3. Az 1, vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett egyidejűleg bejuttatott expresszáiható nukleotid-szekvencla β-glükuronidázt. kódol, amennyiben a vegyület egy citokin glükuroold.
4. Az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a natív B-glükuronidáz aktivitást oly módon csökkentjük, hogy a médiumba egy pH-szabályoző vegyületet juttatunk, amely a tenyészközegnek, a sejteknek vagy a sejt alkotóelemeinek 5,5 és 8,5 közötti pH-értéket biztosít.
HU9400570A 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells HU227979B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK911522A DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
PCT/DK1992/000252 WO1993005163A1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400570D0 HU9400570D0 (en) 1994-05-30
HUT69606A HUT69606A (en) 1995-09-28
HU227979B1 true HU227979B1 (en) 2012-07-30

Family

ID=8105710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400570A HU227979B1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells

Country Status (16)

Country Link
EP (3) EP0896063B9 (hu)
JP (1) JPH06511146A (hu)
AT (2) ATE181963T1 (hu)
AU (1) AU664200B2 (hu)
CA (1) CA2110401C (hu)
CY (1) CY2217B1 (hu)
CZ (2) CZ284828B6 (hu)
DE (2) DE69233771D1 (hu)
DK (2) DK152291D0 (hu)
ES (1) ES2135415T5 (hu)
GR (1) GR3031279T3 (hu)
HU (1) HU227979B1 (hu)
NZ (1) NZ244135A (hu)
RU (1) RU2126834C1 (hu)
SK (1) SK280639B6 (hu)
WO (1) WO1993005163A1 (hu)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994629A (en) * 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
GB9304200D0 (en) † 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DE4305295B4 (de) * 1992-03-04 2006-05-18 Volkswagen Ag Kraftfahrzeug mit einem Sitz, der zumindest eine zwischen einer Ruhestellung und einer Betriebsstellung bewegbare Seitenwange besitzt
US5608147A (en) * 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
EP0820518B1 (en) * 1995-04-06 2005-12-07 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Process for selection of transgenic plant cells
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
WO1999002703A1 (en) * 1997-07-07 1999-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
DE60140996D1 (de) 2000-02-11 2010-02-25 Metabolix Inc Intein enthaltende multigen-expressionskonstrukte
DK1276885T3 (da) 2000-04-21 2007-10-15 Martek Biosciences Corp Trofisk omdannelse af obligate fototrofe alger ved metabolisk teknik
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
AU2001268523A1 (en) 2000-06-16 2001-12-24 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
ATE461273T1 (de) 2000-11-17 2010-04-15 Metabolix Inc Herstellung von polyhydroxyalkanoaten mittlerer kettenlänge aus fettsäure-biosynthesewegen
US7186887B2 (en) 2001-04-06 2007-03-06 Syngenta Participations Ag Nucleic acids encoding oryza sativa nuclear cap binding protein 80 and methods of use
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
CA2493364A1 (en) 2002-07-26 2004-02-12 Basf Plant Science Gmbh Inversion of the negative-selective effect of negative marker proteins using selection methods
US20060253917A1 (en) 2002-12-26 2006-11-09 Bret Cooper Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
EP1781784A2 (en) 2004-08-02 2007-05-09 BASF Plant Science GmbH Method for isolation of transcription termination sequences
EP1645633B1 (en) 2004-10-05 2011-09-21 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP1669455B1 (en) 2004-12-08 2009-10-28 SunGene GmbH Expression cassettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
EP2184361A3 (en) 2005-02-09 2010-07-14 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
CA2598307C (en) 2005-02-26 2014-12-30 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
CN101137752B (zh) 2005-03-08 2013-04-03 巴斯福植物科学有限公司 增强表达的内含子序列
BRPI0608637A2 (pt) 2005-03-16 2010-01-19 Metabolix Inc vetor recombinante para expressço de enzimas, cÉlula de planta transformada, mÉtodo para produÇço de produto biossintÉtico
EP1874938B1 (en) 2005-04-19 2012-04-04 BASF Plant Science GmbH Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP2159289A3 (en) 2005-06-23 2010-03-24 BASF Plant Science GmbH Improved methods for the production of stably transformed plants
EP2980220A1 (en) 2005-09-20 2016-02-03 BASF Plant Science GmbH Improved methods controlling gene expression
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
CN102471777B (zh) 2009-07-10 2014-09-24 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚乳-特异性表达的表达盒
EP2275564A1 (en) 2009-07-17 2011-01-19 Freie Universität Berlin Means and method for the production of transgenic plants that are resistant to clubroot
WO2011034946A1 (en) 2009-09-15 2011-03-24 Metabolix, Inc. Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
AU2010325563B2 (en) 2009-11-27 2017-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
WO2011064736A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
CN102762726A (zh) 2009-11-27 2012-10-31 巴斯夫植物科学有限公司 嵌合内切核酸酶及其用途
EP2507375A4 (en) 2009-12-03 2013-04-24 Basf Plant Science Co Gmbh EXPRESSION CASSETTES FOR EMBRYOSPECIFIC EXPRESSION IN PLANTS
JP6164657B2 (ja) 2011-06-10 2017-07-19 シュティッヒティング・テクノロジッシュ・トップインスティテュート・グレーネ・ジェネティカ・（ファウンデーション・テクノロジカル・トップ・インスティテュート・グリーン・ジェネティクス） テルペン生合成を調節する転写因子
EP2734035A4 (en) 2011-07-22 2015-03-25 Basf Plant Science Co Gmbh PLANT CONVERSION METHOD
US20140259223A1 (en) 2011-10-19 2014-09-11 Keygene N.V. Methods for producing cinnamolide and/or drimendiol
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
WO2014028426A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
CN104531656B (zh) * 2015-01-05 2018-02-09 安徽省农业科学院水稻研究所 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
WO2017136668A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative bicarbonate transporter protein of an edible eukaryotic algae
AU2018224065B2 (en) 2017-02-22 2021-11-11 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
CA3111368A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield rna
CN114829612A (zh) 2019-12-16 2022-07-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用配对切口酶的改进的基因组编辑
CN114846144A (zh) 2019-12-16 2022-08-02 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 将dna或突变精确引入小麦基因组
WO2021226261A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors
AU2022388555A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ajax Therapeutics, Inc. 6-he tero aryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
GB8725402D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Jefferson R A Gene fusion
GB8626862D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Jefferson R A Gene fusion
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase

Also Published As

Publication number Publication date
ES2135415T5 (es) 2007-06-01
GR3031279T3 (en) 1999-12-31
CZ284828B6 (cs) 1999-03-17
HU9400570D0 (en) 1994-05-30
HUT69606A (en) 1995-09-28
AU664200B2 (en) 1995-11-09
CZ292882B6 (cs) 2003-12-17
EP0601092A1 (en) 1994-06-15
EP0530129A1 (en) 1993-03-03
CA2110401A1 (en) 1993-03-18
JPH06511146A (ja) 1994-12-15
EP0896063A2 (en) 1999-02-10
DE69229556D1 (de) 1999-08-12
NZ244135A (en) 1995-04-27
ATE443771T1 (de) 2009-10-15
EP0896063A3 (en) 2000-02-09
DE69233771D1 (de) 2009-11-05
DK0601092T3 (da) 2000-02-07
WO1993005163A1 (en) 1993-03-18
CA2110401C (en) 2006-02-21
EP0896063B9 (en) 2010-05-26
ATE181963T1 (de) 1999-07-15
EP0601092B2 (en) 2006-11-15
DE69229556T2 (de) 1999-11-11
AU2556792A (en) 1993-04-05
SK22294A3 (en) 1994-07-06
ES2135415T3 (es) 1999-11-01
DK152291D0 (da) 1991-08-28
EP0601092B1 (en) 1999-07-07
RU2126834C1 (ru) 1999-02-27
SK280639B6 (sk) 2000-05-16
CZ44494A3 (en) 1994-06-15
DK0601092T4 (da) 2007-02-26
EP0896063B1 (en) 2009-09-23
CY2217B1 (en) 2003-04-18
DE69229556T3 (de) 2007-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU227979B1 (en) Method for the selection of genetically transformed cells
US5994629A (en) Positive selection
Fujioka et al. Brassinosteroids
US7750211B2 (en) Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
EP2142653B1 (en) Methods for inducing cotton embryogenic callus
JPH03504798A (ja) 植物類においてリジン過剰生産を誘導する方法
CA3111386A1 (en) Cellulose-synthase-like enzymes and uses thereof
Nan et al. Dendrobiumorchids contain an inducer ofAgrobacteriumvirulence genes
DE4013099A1 (de) Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
RU2347810C2 (ru) Способ детоксикации микотоксинов
Kreis et al. Cardenolide glucosyltransferases and glucohydrolases in leaves and cell cultures of three Digitalis (Scrophulariaceae) species
Luckner et al. Cardenolides
Eastwood et al. Repair replication in ultraviolet light-irradiated protoplasts of Daucus carota
Hoelz et al. Storage of cardiac glycosides in vacuoles of Digitalis lanata mesophyll cells
Seki et al. The “all-in-one” rol-type binary vectors as a tool for functional genomic studies using hairy roots
CN113957079B (zh) MtBGLU17基因在调控植物类黄酮合成中的应用
CN115820669B (zh) SlGA2ox基因在调节番茄有毒生物碱含量上的应用
CA2144898A1 (en) Pilocarpin production process
BRANDT¹ et al. IV Campanula (Bellflower) Species: In Vitro Culture, Micropropagation, and the Production of Anthocyanins, Polyacetylenes, and Other Secondary Metabolites
JENN et al. DNA Mediated Gene Tagging Arabidopsis
Ren Studies of Cytokinin Metabolism and Translocation in Relation to Leaf Senescence and Seed Development of Leguminous Plants

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH