SK280639B6 - Spôsob selekcie geneticky transformovaných rastlin - Google Patents

Spôsob selekcie geneticky transformovaných rastlin Download PDF

Info

Publication number
SK280639B6
SK280639B6 SK222-94A SK22294A SK280639B6 SK 280639 B6 SK280639 B6 SK 280639B6 SK 22294 A SK22294 A SK 22294A SK 280639 B6 SK280639 B6 SK 280639B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
beta
cells
compound
glucuronidase
gus
Prior art date
Application number
SK222-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK22294A3 (en
Inventor
Finn T. Okkels
Robert J. Whenham
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8105710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK280639(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of SK22294A3 publication Critical patent/SK22294A3/sk
Publication of SK280639B6 publication Critical patent/SK280639B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu selekcie geneticky transformovaných rastlinných buniek, do ktorých bola včlenená požadovaná nukleotidová sekvencia, ktorý sa vyznačuje tým, že sa transformovaným bunkám poskytne selekčná výhoda bez toho, aby sa poškodili netransformované bunky.
Doterajší stav techniky
Je známe, že pri zavádzaní nového genetického materiálu do populácie buniek pomocou transformácie transformuje sa úspešne len určitý počet buniek, t. j. len tento určitý počet buniek dostane nový genetický materiál. Potom je nutné identifikovať geneticky transformované bunky, aby sa mohli v populácii tieto bunky oddeliť od netransformovaných buniek. Identifikácia a separácia transformovaných buniek sa tradične uskutočňuje takzvanou „negatívnou selekciou“, inými slovami spôsobom, keď sú transformované bunky schopné prežiť a rásť, zatiaľ čo pri netransformovaných bunkách dochádza k inhibícii rastu alebo priamo usmrteniu látkou, ktorú sú transformované bunky schopné tolerovať.
Napríklad, pokiaľ je genetickej transformácii podrobená populácia rastlinných buniek, prebieha selekcia transformovaných buniek typicky pomocou selekčného génu, ktorý kóduje rezistenciu proti antibiotiku alebo herbicídu. Selekčný gén, ktorý sám osebe všeobecne nemá užitočnú funkciu v geneticky transformovanej rastline a môže byť v skutočnosti v rastline nežiaduci, je spojený alebo kointrodukovaný s génom, ktorý má byť včlenený do danej rastliny tak, že sú oba gény včlenené do populácie buniek alebo skôr do niektorých buniek v populácii, pretože v praxi nie je možné transformovať všetky ani väčšinu buniek. Bunky sa potom kultivujú na alebo v médiu obsahujúcom antibiotikum alebo herbicíd, proti ktorému sú geneticky transformované bunky vďaka selekčnému génu rezistentné, čo umožňuje identifikovať transformované bunky, lebo pri netransformovaných bunkách, ktoré neobsahujú daný gén rezistencie proti antibiotiku alebo herbicídu, dochádza k inhibícii rastu alebo usmrteniu.
Tieto spôsoby negatívnej selekcie majú však určité nevýhody. Hlavne netransformované bunky môžu odumrieť kvôli prítomnosti napríklad antibiotík v rastovom médiu. To má za následok nesporné riziko, že môžu, v prípade že je populáciou buniek koherentné tkanivo, odumrieť nielen netransformované bunky, ale tiež transformované bunky, kvôli tomu, že smrť netransformovaných buniek môže zamedziť zásobovanie transformovaných buniek živinami, aIebo preto, že poškodené alebo odumierajúce netransformované bunky môžu vylučovať toxické látky.
Ďalšou podstatnou nevýhodou negatívnej selekcie je, že prítomnosť nadbytočného génu na rezistenciu napríklad proti antibiotiku môže byť nežiaduca. V organizáciách na ochranu prírody a vládnych úradoch sa napríklad diskutuje o tom, či je bezpečné zavádzanie génov kódujúcich rezistenciu proti antibiotikám do rastlín a mikroorganizmov. Toto hľadisko je významné najmä pri potravinárskych plodinách a pri mikroorganizmoch, ktoré nie sú vytvárané na použitie v uzatvorenom prostredí (napríklad mikroorganizmov na použitie v poľnohospodárstve), rovnako ako pri mikroorganizmoch, ktoré sú vytvárané na použitie v uzatvorenom prostredí, ale môžu sa z uzatvoreného prostredia náhodne uvoľniť. 1 keď sa tieto obavy môžu ukázať ako neopodstatnené, môžu napriek tomu viesť k vládnym ob medzeniam použitia génov rezistencie proti antibiotikám napríklad pri rastlinách, a je preto žiaduce vyvinúť nové spôsoby selekcie geneticky transformovaných buniek, ktoré nie sú závislé od týchto génov.
Ďalšou nevýhodou negatívnej selekcie je, že sa rastlinné tkanivo alebo bunky ošetrené toxickými látkami stávajú citlivejšími proti bakteriálnej infekcii. To je problém pri použití Agrobacteria ako transformačného vektora, lebo ošetrené tkanivá alebo bunky sú niekedy prerastené baktériami, aj keď sa použijú antibiotiká na zabránenie rastu baktérií.
Okrem toho selekcia buniek alebo tkaniva pomocou negatívnej selekcie vyžaduje veľmi presné načasovanie expresie introdukovaných génov vo vzťahu k selekčnému postupu. Pokiaľ sú transgénne bunky ošetrené toxickou látkou skôr, ako je exprimovaný detoxikačný gén alebo ako sa vytvorí dostatočné množstvo produktu génu na potlačenie účinku toxickej látky, dochádza k usmrteniu transgénnych buniek spoločne s netransgénnymi bunkami. Pokiaľ sa selekcia vykoná príliš neskoro, môže selekcii transgénnych buniek alebo tkaniva brániť napríklad tvorba výhonkov z netransgénnych buniek alebo tkanív.
Podstata vynálezu
Tieto nevýhody sú eliminované spôsobom podľa vynálezu (označeným „pozitívna selekcia“), ktorý prvýkrát umožňuje identifikovať a izolovať geneticky transformované bunky bez poškodenia alebo usmrtenia netransformovaných buniek v populácii a bez kointrodukcie génov rezistencie proti antibiotikám alebo herbicídom. Okrem toho, že sa eliminovala potreba génov rezistencie proti antibiotikám alebo herbicídom, ukázalo sa, že sú spôsoby pozitívnej selekcie podľa vynálezu často omnoho účinnejšie ako tradičná negatívna selekcia. Ako je opísané v príkladoch uskutočnenia vynálezu, je počet transgénnych výhonkov získaných z listových terčíkov tabaku pomocou pozitívnej selekcie asi tridsaťkrát vyšší ako počet výhonkov získaných pomocou tradičného negatívneho selekčného systému založeného na kanamycíne, a pri kombinácii pozitívnej a negatívnej selekcie tvorila selekčná frekvencia transgénnych výhonkov asi desaťnásobok v porovnaní so samotnou negatívnou selekciou (pozri príklad 11). Použitie pozitívnej selekcie poskytuje ďalej tú výhodu, že sa môže ako reportérový gén a selekčný gén použiť jediný gén, čo má za následok zjednodušenie konštrukcie vektorov, väčšiu stabilitu konštruktov a stopercentnú koreláciu medzi expresiou reportérového a selekčného génu. Pozitívna selekcia tiež eliminuje uvedené problémy týkajúce sa načasovania, pretože zlúčeniny, ktoré majú za následok selekciu, sú vždy produkované ako dôsledok expresie génov. Selekčná zlúčenina sa teda akumuluje, pokiaľ je exprimovaný selekčný gén, a selekčný účinok sa prejavuje, keď sa vytvorí dostatočné množstvo selekčnej zlúčeniny.
Jedným aspektom, ktorého sa vynález týka, je spôsob selekcie geneticky transformovaných buniek, do ktorých je introdukovaná požadovaná nukleotidová sekvencia, z populácie buniek, pri ktorom požadovaná nukleotidová sekvencia alebo kointrodukovaná nukleotidová sekvencia v transformovaných bunkách vyvoláva alebo zvyšuje pozitívny účinok zlúčeniny alebo živiny dodávanej populácii buniek, a tým umožňuje identifikáciu alebo selekciu transformovaných buniek z netransformovaných buniek.
Podľa jedného uskutočnenia sa tento spôsob vykonáva kultiváciou populácie buniek na alebo v médiu obsahujúcom aspoň jednu neaktívnu zlúčeninu alebo živinu, ktorá je priamo alebo nepriamo aktivovaná v bunkách obsahujúcich kointrodukovanú nukleotidovú sekvenciu alebo požadovanú nukleotidovú sekvenciu, pričom je táto zlúčenina alebo živina neaktívna v netransformovaných bunkách alebo menej aktívna v netransformovaných bunkách ako v transformovaných bunkách, takže je transformovaným bunkám poskytovaná selekčná výhoda, ktorá umožňuje ich selekciu z populácie buniek.
Podľa iného uskutočnenia sa tento spôsob vykonáva kultiváciou populácie buniek na alebo v médiu obsahujúcom aspoň jednu zlúčeninu alebo živinu, ktorá je dostupná transformovaným bunkám vďaka expresii alebo transkripcii kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie alebo požadovanej nukleotidovej sekvencie, pričom táto zlúčenina alebo živina nie je dostupná netransformovaným bunkám alebo je netransformovaným bunkám menej dostupná ako transformovaným bunkám, takže je transformovaným bunkám poskytovaná selekčná výhoda, ktorá umožňuje ich selekciu z populácie buniek.
Podľa ďalšieho uskutočnenia vedie expresia kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie k zvýšeniu aktivity enzýmu, ktorý sa nachádza endogénne v populácii buniek, takže aktivita enzýmu v transformovaných bunkách je vyššia ako aktivita enzýmu v netransformovaných bunkách.
Podľa ešte ďalšieho uskutočnenia má expresia alebo transkripcia kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie alebo požadovanej nukleotidovej sekvencie za následok blokovanie metabolizmu zlúčeniny dodávanej populácii buniek alebo blokovanie syntézy zlúčeniny v transformovaných bunkách, čo umožňuje identifikáciu alebo selekciu transformovaných buniek z netransformovaných buniek.
Na použitie v uvedenom spôsobe sú vhodné zlúčeniny všeobecného vzorca (I)
NH-R·
I X I R* R3 R· v ktorom
R2 predstavuje atóm vodíka, metylovú skupinu, metyltioskupinu, metylsulfonylovú skupinu, benzyltioskupinu, merkaptoskupinu, hydroxylovú skupinu, atóm chlóru alebo skupinu vzorca -S-R10, -NH-R10 alebo -O-R10, kde
R10 znamená bcta-D-glukopyranuronozylovú skupinu (ktorej štruktúra je zrejmá z tu uvedených príkladov uskutočnenia) alebo jej soľ, alebo jej esterový, alebo amidový derivát na karboxylovej skupine,
R6 predstavuje benzylovú skupinu, ktorá môže byť na fenylovom kruhu substituovaná hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou obsahujúcou 1 až 6 atómov uhlíka, atómom halogénu, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 atómy uhlíka, aminoskupinou alebo trifluórmetylovou skupinou alebo skupinou vzorca -O-R10, -S-R10, alebo -NH-R10, kde má symbol R10 vyššie definovaný význam; alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 atómov uhlíka alebo alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 8 atómov uhlíka, ktorá môže byť substituovaná 1 až 3 hydroxylovými skupinami, glukozyloxyskupinami alebo alkoxylovými skupinami obsahujúcimi 1 až 6 atómov uhlíka, fenylovou skupinou, a/alebo skupinou vzorca -O-R10, -S-R10, alebo -NH-R10, kde má symbol R10 definovaný význam; esterifikovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 6 atómov uhlíka; furfurylovú skupinu alebo cyklohexylureidoskupinu, fenylureidoskupinu alebo tolylurcidoskupinu; a buď
i) každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré spoločne tvoria väzbu, ii) jeden zo symbolov R3 a R9 znamená atóm vodíka alebo skupinu R10, ako je už definovaná, a druhý predstavuje polovicu väzby, ktorá spoločne s polovicou väzby predstavovanou symbolom X tvorí väzbu, alebo R9 znamená ribozylovú skupinu, 5'-fosforibozylovú skupinu, glukózylovú skupinu alebo skupinu vzorca -CH2CH(NH2)COOH a R3 znamená polovicu väzby, ktorá spoločne s polovicou väzby predstavovanou symbolom X tvorí väzbu, a iii) R8 znamená atóm vodíka, metylovú skupinu, metyltioskupinu, metylsulfonylovú skupinu, benzyltioskupinu, merkaptoskupinu, hydroxylovú skupinu, atóm chlóru alebo skupinu vzorca -S-R10, -NH-R10 alebo -O-R10. kde má symbol R10 definovaný význam, alebo iv) R7 znamená ribozylovú skupinu, 5'-fosforibozylovú skupinu alebo glukozylovú skupinu, R8 predstavuje atóm vodíka, každý zo symbolov R9 a Y znamená polovicu väzby, ktoré spolu tvoria väzbu, a R3 znamená polovicu väzby, ktorá spoločne s polovicou väzby predstavovanou symbolom X tvorí väzbu;
s tou podmienkou, žc jeden zo symbolov R2, R3, R6, R8 a R9 predstavuje alebo obsahuje beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu alebo jej soľ, alebo jej esterový, alebo amidový derivát na karboxylovej skupine.
Ďalšie zlúčeniny, ktoré sa môžu použiť v uvedenom spôsobe sú zlúčeniny všeobecného vzorca (II) a:
I RIO v ktorom
R1 predstavuje skupinu vzorca cis- -CH=CH-COOH, jej soľ derivát na karboxylovej skupine alebo amidový derivát skupiny cis- a/alebo trans- -CH=CH-COOH a
R10 má už definovaný význam.
Okrem toho sa vynález týka geneticky transformovaných buniek, ktoré boli vyselektované podľa už uvedenej metódy, najmä rastlinných buniek, rovnako ako rastlín, ich potomstva a semien, získaných z týchto geneticky transformovaných rastlinných buniek.
Termín „bunky“ v kontexte tohto vynálezu označuje ľubovoľný typ buniek, z ktorých sa môžu identifikovať a izolovať pomocou spôsobu podľa vynálezu jednotlivé geneticky transformované, bunky, vrátane rastlinných buniek, živočíšnych buniek a mikroorganizmov, ako sú baktérie, huby, kvasinky atď. Ďalej termín „bunky“ tiež zahŕňa protoplasty, t. j. protoplazmu buniek uzatvorenú v membráne, ale bez bunkovej steny. Hoci sa predpokladá, že všeobecný princíp vynálezu sa môže použiť na ľubovoľný typ buniek, zistilo sa, že tento spôsob je vhodný najmä na selekciu geneticky transformovaných rastlinných buniek.
Termín „populácia buniek“ označuje ľubovoľnú skupinu buniek, ktorá bola podrobená genetickej transformácii a v ktorej je žiaduce identifikovať tie bunky, ktoré boli geneticky transformované a izolovať geneticky transformované bunky od geneticky netransformovaných buniek. Populáciou môže byť napríklad tkanivo, orgán alebo jeho časť, populácia jednotlivých buniek v alebo na substráte, ako jc kultúra buniek mikroorganizmov, napríklad populácia buniek v roztoku alebo suspenzii alebo celý organizmus, napríklad úplná rastlina.
Termín „selekcia“ označuje postup identifikácie a/alebo izolácie geneticky transformovaných buniek od geneticky netransformovaných buniek pomocou opísaného spôsobu.
„Požadovaná nukleotidová sekvencia“ môže byť ľubovoľná nukleotidová sekvencia, ktorá má byť včlenená do daných buniek, s cieľom vytvoriť geneticky transformovaných buniek. Introdukcia nukleotidových sekvencii do rastlín, mikroorganizmov a zvierat je široko používaná a neexistujú žiadne obmedzenia nukleotidových sekvencii, ktorých prítomnosť sa môže zisťovať tu opísaným spôsobom pozitívnej selekcie. Pomocou tohto spôsobu sa môže stanoviť prítomnosť požadovanej nukleotidovej sekvencie v geneticky transformovaných bunkách bez už zmienených nevýhod spojených s tradičnými systémami negatívnej selekcie.
Spojenie, že nukleotidová sekvencia je „kointrodukovaná s“ požadovanou nukleotidovú sekvenciou označuje skutočnosť, že sú dve nukleotidové sekvencie spolu spojené alebo inak spoločne introdukované takým spôsobom, že prítomnosť kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie v bunke svedčí o tom, že do bunky bola introdukovaná požadovaná nukleotidová sekvencia, t. j. pokiaľ sa ukáže, že jedna z nukleotidových sekvencii bola introdukovaná, je podstatne zvýšená pravdepodobnosť, že bola introdukovaná tiež druhá nukleotidová sekvencia. Tieto dve nukleotidové sekvencie sú teda typicky, hoci nie bezpodmienečne, časťou rovnakého genetického konštruktu a sú napríklad introdukované pomocou rovnakého vektora.
Tu opísané spôsoby sa môžu tiež použiť, keď sa kointrodukovaná nukleotidová sekvencia a požadovaná nukleotidová sekvencia introdukujú nezávisle. To sa môže uskutočniť napríklad použitím rovnakej baktérie na inkorporáciu oboch génov a inkorporáciu relatívne veľkého počtu kópií požadovanej nukleotidovej sekvencie do buniek, vďaka čomu je relatívne vysoká pravdepodobnosť, že bunky, v ktorých sa ukáže, že exprimujú kointrodukovanú nukleotidovú sekvenciu, budú tiež obsahovať a exprimovať požadovanú nukleotidovú sekvenciu. Všeobecne sa očakáva, že nezávislá introdukcia dvoch alebo viacerých génov majúca za následok spoločnú expresiu génov v rovnakej bunke má nízku pravdepodobnosť, a očakáva sa teda, že zlepšené selekčné frekvencie dosiahnuté spôsobom pozitívnej selekcie sú výhodné najmä v takýchto systémoch.
Pretože je nutné, aby sa introdukované nukleotidové sekvencie v transformovaných bunkách exprimovali, bude genetický konštrukt obsahujúci tieto dve nukleotidové sekvencie typicky, nie však bezpodmienečne, obsahovať regulačnú sekvenciu umožňujúcu expresiu nukleotidových sekvencii, napríklad známe promótory a transkripčné terminátory. Kointrodukovaná nukleotidová sekvencia bude teda typicky spojená s promótorom, ktorým môže byť buď konštitutívny, alebo regulovateľný promótor a požadovaná nukleotidová sekvencia bude typicky tiež spojená s konštitutívnym alebo regulovateľným promótorom.
Ako už bolo uvedené, opisovaný spôsob je vhodný najmä na selekciu geneticky transformovaných rastlinných buniek, čím umožňuje identifikáciu a izoláciu takýchto buniek bez použitia selekčných génov kódujúcich rezistenciu proti antibiotiku alebo herbicídu. Ako pri tradičných spôsoboch negatívnej selekcie, môže sa tu opísaný spôsob pozitívnej selekcie použiť na selekciu buniek in vitro. Spôsob pozitívnej selekcie sa môže však použiť tiež in vivo. Použitie spôsobu pozitívnej selekcie in vivo je významné napríklad najmä v spojení s genetickou transformáciou uskutočňovanou na celých rastlinách alebo rastlinných častiach, keď rastliny alebo rastlinné časti obsahujú tak transformované, ako netransformované bunky, pretože sa selekcia transformovaných buniek dosiahne bez priameho poškodenia susedných netransformovaných buniek. Transformované bunky majú teda selekčnú „výhodu“ v porovnaní s netransformovanými bunkami (napríklad schopnosť tvorby výhonkov), ale netransformované bunky netrpia žiadnou vážnou nevýhodou v zmysle ich poškodenia alebo usmrtenia, k čomu dochádza v prípade negatívnej selekcie používajúcej antibiotiká alebo herbicídy.
„Neaktívna zlúčenina alebo živina“ môže byť ľubovoľná zlúčenina alebo živina v neaktívnej forme alebo vo forme prekurzora, teda taká, ktorá je v prípade, že nedochádza k expresii kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie, vo forme ktorá je v podstate biologicky neaktívna vzhľadom na dané bunky, ale ktorá je v prípade, že dochádza k expresii alebo transkripcii kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie, hydrolyzovaná alebo inak aktivovaná, alebo metabolizovaná, takže je geneticky transformovaným bunkám obsahujúcim požadovanú nukleotidovú sekvenciu poskytovaná selekčná výhoda, ktorá umožňuje ich identifikáciu a izoláciu. Neaktívnou zlúčeninou alebo živinou môže teda byť napríklad neaktívny rastový regulátor rastlín, napríklad inaktivovaný cytokinín, auxín alebo giberelín, vitamín, napríklad inaktivovaný tiamín, glycidy (napríklad manóza, pokiaľ kointrodukovaná nukleotidová sekvencia kóduje manóza-6-fosfát-izomerázu, alebo galaktóza alebo galaktózu obsahujúca zlúčenina, pokiaľ kointrodukovaná nukleotidová sekvencia kóduje UPD-galaktóza-4-epimerázu), zlúčenina obsahujúca dusík (napríklad opín, pokiaľ kointrodukovaná nukleotidová sekvencia kóduje enzým metabolizmu alebo transportu opínov), škrob, proteín alebo iná živina v neaktívnej forme, alebo zlúčenina, ktorá zohráva podstatnú úlohu počas diferenciácie a dediferenciácie buniek a tkaniva. Spoločne so zodpovedajúcimi neaktívnymi zlúčeninami sa môže tiež použiť ošetrenie buniek a tkanív zlúčeninami indikujúcimi závislosť od dodatočného pridania esenciálnych zlúčenín. Tento prístup sa môže použiť napríklad v prípade, že je inhibovaná syntéza sterolu alebo saponínu a pridajú sa neaktívne steroly alebo saponíny. Neaktívnou zlúčeninou môže byť ďalej napríklad minerálna látka, ktorá je chelatovaná, a tým sa stane dostupnou geneticky transformovaným bunkám.
V protiklade k tradičnej negatívnej selekcii, v ktorej sú netransformované bunky poškodené alebo usmrtené vplyvom prítomnosti antibiotika, herbicídu alebo toxínu v substráte, nemajú neaktívne zlúčeniny alebo živiny používané v spôsobe pozitívnej selekcie podľa vynálezu žiadny priamy nepriaznivý vplyv na netransformované bunky. Miesto toho je transformovaným bunkám poskytovaná fyziologická výhoda, ktorá umožňuje ich identifikáciu a izoláciu, zatiaľ čo netransformované bunky nie sú ovplyvnené alebo sú menej ovplyvnené prítomnosťou neaktívnej zlúčeniny alebo živiny používanej na selekčné účely.
Tradičné spôsoby „negatívnej selekcie“ sú teda charakteristické použitím selekčného génu, ktorý znižuje negatívny účinok pridanej zlúčeniny na transformované bunky. Naproti tomu termín „pozitívna selekcia“, ako je používaný v kontexte tohto vynálezu, označuje použitie selekčného génu, ktorý spôsobuje alebo zvyšuje pozitívny účinok pridanej zlúčeniny na transformované bunky.
Zlúčenina používaná na selekčné účely môže mať okrem toho tak pozitívny, ako aj negatívny účinok. Napríklad manóza je toxická pre väčšinu rastlinných buniek, ale v bunkách obsahujúcich manóza-6-fosfát izomerázu je negatívny účinok eliminovaný a bunky navyše získajú úžitok tým, že sú schopné využiť manózu ako zdroj glycidov. V tomto prípade sú jediná zlúčenina a jediný gén zložkami kombinovaného pozitívneho a negatívneho selekčného systému, hoci takýto kombinovaný pozitívny a negatívny systém sa môže tiež vytvoriť pomocou dvoch alebo viacerých génov, ktoré sú spoločne zodpovedné za inhibíciu ne gatívnych účinkov zlúčeniny a prejavenie sa pozitívnych účinkov zlúčeniny v transformovaných bunkách.
Neaktívna zlúčenina alebo živina používaná v spôsobe pozitívnej selekcie nemusí byť aktivovaná priamo polypeptidom kódovaným kointrodukovanou nukleotidovou sekvenciou. Môže ísť tiež o neaktívnu zlúčeninu alebo živinu, ktorá je aktivovaná nepriamo, t. j. tak, že kointrodukovaná nukleotidová sekvencia má nepriamy účinok na neaktívnu zlúčeninu alebo živinu v geneticky transformovaných bunkách, ale nie v netransformovaných bunkách. Tak môže táto kointrodukovaná nukleotidová sekvencia po expresii v transformovaných bunkách napríklad nepriamo zvyšovať aktivitu enzýmu, ktorý je pre populáciu buniek endogénny, čo spôsobuje vyššiu aktivitu enzýmu a aktiváciu danej neaktívnej zlúčeniny alebo živiny v geneticky transformovaných bunkách.
Kointrodukovaná nukleotidová sekvencia môže tiež napríklad kódovať permeázu alebo iný transportný faktor, ktorý umožňuje danej zlúčenine alebo živine prejsť cez bunkovú membránu a dostať sa do transformovaných buniek alebo prejsť cez inú (organelovú) membránu, takže „aktivácia“ neaktívnej zlúčeniny alebo živiny v tomto prípade spočíva v selektívnom príjme zlúčeniny alebo živiny transformovanými bunkami, zatiaľ čo príjem zlúčeniny alebo živiny netransformovanými bunkami nie je možný alebo prebieha v menšom rozsahu. Miesto uľahčovania príjmu zlúčeniny do bunky môže kointrodukovaná nukleotidová sekvencia alternatívne smerovať svoj produkt do kompartmentu, kde je lokalizovaná neaktívna zlúčenina, napríklad za plazmatickú membránu, do vakuoly alebo endoplazmatického retikula.
Selekcia sa použitím tohto prístupu teda dosiahne tým, že sa zlúčenina sprístupní transformovaným bunkám, zatiaľ čo nie je dostupná alebo je menej dostupná netransformovaným bunkám. Daná zlúčenina alebo živina, ktorá v tomto nemusí byť „neaktívna“ sama osebe (t. j. môže ísť o takú zlúčeninu alebo živinu, ktorej aktivita sa uplatní po preniknutí do transformovaných buniek bez toho, aby musela byť v bunkách bezpodmienečne podrobená napríklad hydrolýze), môže byť rovnakého typu ako ľubovoľná z už zmienených zlúčenín alebo živín, s tým rozdielom, že zlúčenina alebo živina je v tomto prípade transportovaná do transformovaných buniek miesto (alebo okrem) jej aktivácie v transformovaných bunkách.
Príklady zlúčenín, ktoré môžu uplatniť fyziologické účinky po preniknutí do bunky, ktoré však nie sú do bunky alebo bunkového kompartmentu ľahko prijímané, zahrnujú silne hydrofilné alebo hydrofóbne zlúčeniny, najmä zlúčeniny nesúce náboj, veľké molekuly, ako sú polyméry, najmä proteiny, peptidy, oligo- a polysacharidy, vrátane rastlinných hormónov, fosforylované metabolity, ako sú fosforylované glycidy, fosforylované vitamíny, fosforylované nukleozidy, vrátane cytokinínov, a zlúčeniny, ktoré sú konjugované s aminokyselinami alebo glycidmi obsahujúcimi karboxylovú skupinu, vrátane konjugátov rastlinných hormónov.
Tiež sa počíta s tým, že základný spôsob podľa vynálezu sa môže modifikovať tak, že miesto aktivácie neaktívnej zlúčeniny alebo živiny v transformovaných bunkách sa môže selekcia uskutočňovať blokovaním metabolickej syntézy zlúčeniny v týchto bunkách. Napríklad metabolizmus cytokinínu pridaného k substrátu sa môže blokovať v transformovaných bunkách protipôsobiacim mechanizmom. Vynálezci tak zistili, že v prípade, že sa inhibuje glykozylácia zeatínu, znižuje sa optimálna koncentrácia indukujúca tvorbu výhonkov 5- až 100-násobne. Inhibovaním metabolizmu zeatínu je teda možné dosiahnuť tvorbu vý honkov z listových terčíkov tabaku pri koncentráciách zeatínu, ktoré nie sú schopné indukovať tvorbu výhonkov z netransformovaných listových terčíkov, ktoré majú normálny metabolizmus zeatínu. Tiež sa zistilo, že sa môžu zvýšiť účinky indoloctovej kyseliny (IAA, indole acetic acid), keď sa inhibuje metabolizmus tejto zlúčeniny. V prípade, že sa čiastočne inhiboval metabolizmus IAA sa zistilo, že účinok indoloctovej kyseliny na rast kalusu sa zvýšil 5- až 100-násobne. Podobne môže inhibícia metabolizmu glycidu a polysacharidu ovplyvniť využitie pridaného glycidu a poskytnúť ďalšie možnosti pozitívnej selekcie týmto spôsobom.
„Selekčná výhoda“ transformovaných buniek môže byť ľubovoľná odlišnosť alebo výhoda oproti netransformovaným bunkám, ktorá umožňuje ľahkú identifikáciu a izoláciu transformovaných buniek z netransformovaných buniek. Typicky ide o odlišnosť alebo výhodu, ktorá umožňuje identifikáciu transformovaných buniek jednoduchým vizuálnym spôsobom, t. j. bez použitia zvláštneho testu na stanovenie prítomnosti markerového génu.
Pokiaľ polypeptid kódovaný kointrodukovanou nukleotidovou sekvenciou alebo požadovanou nukleotidovou sekvenciou v transformovaných bunkách priamo aktivuje neaktívnu zlúčeninu alebo živinu, môžu netransformované bunky v niektorých prípadoch obsahovať alebo produkovať určité množstvo daného polypeptidu. Napríklad v prípade, že je aktivačným polypeptidom enzým, môžu netransformované bunky mať určitú prirodzenú enzýmovú aktivitu, keď je prirodzený enzým rovnakého typu ako introdukovaný aktivačný enzým. V týchto prípadoch nemusí byť „neaktívna zlúčenina alebo živina“ v netransformovaných bunkách nutne celkom neaktívna, pretože môže byť postačujúce, keď je táto zlúčenina alebo živina len podstatne menej aktívna v netransformovaných bunkách ako v transformovaných bunkách. Inými slovami, v niektorých prípadoch môže na selekčné účely stačiť kvalitatívny rozdiel' v aktivácii pôvodne neaktívnej zlúčeniny alebo živiny medzi transformovanými bunkami a netransformovanými bunkami. V takýchto prípadoch sa môžu pridať inhibítory alebo substráty súťažiace s prirodzenými enzýmami. Vhodné sú najmä inhibítory aktivované prirodzenými enzýmami, ktoré majú za následok spontánnu katalytickú tvorbu aktívneho inhibítora v množstve, pri ktorom je prirodzený enzým v podstate úplne inhibovaný.
Aktivačný polypeptid kódovaný kointrodukovanou nukleotidovou sekvenciou nie je obmedzený na žiadny konkrétny polypeptid a ide pochopiteľne o taký polypeptid, ktorý je aktívny, buď priamo, alebo nepriamo, vo vzťahu ku konkrétnej zlúčenine alebo živine, ktorá sa má v geneticky transformovaných bunkách aktivovať. Týmto polypeptidom je obzvlášť často enzým.
Jedným z enzýmov, o ktorom sa zistilo, že je vhodný na selekciu geneticky transformovaných rastlinných buniek, je beta-glukuronidáza („GUS“), pričom selekcia sa uskutočňuje pomocou glukuronidovej zlúčeniny obsahujúcej rastlinný rastový regulátor, ktorá je štiepená betaglukuronidázou, napríklad pomocou cytokinín-glukuronidu (ako je zrejmé z tu uvedených príkladov). Jc prekvapujúce, že sa pomocou génu GUS môže dosiahnuť selekcia geneticky transformovaných rastlinných buniek, pretože sa v spojení s vynálezom zistilo, že vyššie rastliny majú prirodzenú aktivitu GUS. Toto zistenie je v protiklade s tým, čo sa uvádzalo. Tak v GB 2 197 653-A sa uvádza, že vyššie rastliny nemajú detegovateľnú beta-glukuronidázovú aktivitu a z toho sa vyvodzuje, že vzhľadom na to, že sa vo vyšších rastlinách nezistila aktivita GUS, je relatívne ľahké sledovať expresiu skúmaného génového konštruktu pomo cou génu GUS. No, ako je vysvetlené (pozri príklady uskutočnenia vynálezu), nie je to tak, a použitie génu GUS na sledovanie prítomnosti skúmaného génu nie je vôbec jednoduché preto, že vyššie rastliny v skutočnosti majú značnú vnútornú (ako pozadie) beta-glukuronidázovú aktivitu.
Na selekciu geneticky transformovaných rastlinných buniek sa teda populácia buniek môže kultivovať na alebo v médiu obsahujúcom cytokinín-glukuronid, ktorý je v transformovaných bunkách štiepený beta-glukuronidázou, čím sa uvoľňuje voľný cytokinín, a to vedie v transformovaných bunkách k indukcii výhonkov a/alebo kalusu.
Na účely vynálezu sa vyvinulo mnoho nových cytokinínglukuronidov. Príprava týchto zlúčenín, rovnako ako ich použitie na pozitívnu selekciu geneticky transformovaných buniek, je podrobne opísaná ďalej.
V niektorých prípadoch môže byť žiaduce modifikovať tu opísaný základný spôsob, napríklad na dosiahnutie väčšej efektivity selekcie alebo na zjednodušenie selekčného procesu. Pokiaľ je neaktívnou zlúčeninou použitou v pozitívnom selekčnom procese zlúčenina, ktorá je štiepená beta-glukuronidázou, môže sa základný spôsob rôzne modifikovať, aby sa získali lepšie výsledky. Jednou z možností modifikácie je použitie určitých sterol-glukuronidov, napríklad cholesteryl-beta-D-glukuronidu alebo beta-sitosteryl-beta-D-glukuronidu, spoločne so zlúčeninou inhibujúcou syntézu sterolov, ako je tridemorf(4-tridecyl-2, 6-dimetylmorfolín). Použitie takýchto zlúčenín opisujú ďalej uvedené príklady 5 a 6. Predpokladá sa, že použitím inhibitorov syntézy sterolov spoločne so sterol-glukuronidmi, ktoré po hydrolýze beta-glukuronidázou pôsobia proti účinku inhibítora syntézy sterolov, je možné počas selekčného procesu zabrániť tzv. „cross-feedingu“ (t. j. difúzii aktivovanej zlúčeniny z bunky, v ktorej je aktivovaná, do inej bunky), pretože pri stcroloch nedochádza k difúzii z bunky do bunky, pokiaľ je odštiepený hydrofilný glukuronidový zvyšok. Tak sa dosiahne presnejšie lokalizovaný účinok. Podobné výsledky sa môžu dosiahnuť s veľkým množstvom iných glukuronidov, ktoré obsahujú hydrofóbny aglykón.
Ako už bolo vysvetlené, v protiklade s tým, čo sa uvádzalo skôr, sa zistilo, že vyššie rastliny v skutočnosti majú prirodzenú aktivitu GUS. Z tohto dôvodu nemusí jednoduché zavedenie génu GUS do rastliny bezpodmienečne postačovať na dosiahnutie požadovanej selekcie geneticky transformovaných buniek a môže byť nutné alebo žiaduce obmedziť v populácii buniek akúkoľvek prirodzenú beta-glukuronidázovú aktivitu. Keďže zavedená beta-glukuronidáza môže mať odlišné vlastnosti ako prirodzená betaglukuronidáza, môže sa zníženie ľubovoľnej prirodzenej beta-glukuronidázovej aktivity uskutočniť rôznymi spôsobmi, napríklad pridaním zlúčeniny inhibujúcej betaglukuronidázu, ktorá má vyšší inhibičný účinok na prirodzenú beta-glukuronidázu ako na beta-glukuronidázu kódovanú nukleotidovou sekvenciou alebo jej subsekvenciou, do kultivačného média. Jedným takým typom zlúčeniny je amónna soľ.
Prirodzená beta-glukuronidázová aktivita v populácii buniek sa môže tiež podstatne znížiť tým, že sa do kultivačného média pridá zlúčenina, ktorá po hydrolýze dáva produkt, ktorý inhibuje aktivitu prirodzenej beta-glukuronidázy a ktorý výhodne inhibuje aktivitu prirodzenej beta-glukuronidázy viac, ako je inhibovaná aktivita zavedenej beta-glukuronidázy. To môže prebiehať autoregulovaným alebo lokalizovaným spôsobom, napríklad lokalizáciou do špecifických kompartmentov, kde je lokalizovaný alebo nie je lokalizovaný zavedený gén GUS. Príkladom produktu hydrolýzy, ktorý inhibuje prirodzenú beta-glukuronidázu, je glukurónová kyselina, ktorá vzniká hydrolýzou glyccyrrizovej kyseliny alebo steryl-glukuronidov.
Prirodzená beta-glukuronidázová aktivita sa môže v populácii buniek ďalej znížiť tým, že sa do kultivačného média pridá inhibítor beta-glukuronidázy, najmä beta-glukuronid, ktorý v bunkách bez zavedeného génu beta-glukuronidázy inhibuje beta-glukuronidázovu aktivitu viac ako v bunkách so zavedeným génom beta-glukuronidázy. Môže to byť napríklad zlý beta-glukuronidázový substrát (glukuronid), ktorý má vyššiu afinitu k prirodzenej beta-glukuronidáze ako k zavedenej beta- glukuronidáze.
Beta-glukuronidáza kódovaná zavedeným beta-glukuronidázovým génom používaná na účely tohto vynálezu jc aktívna v relatívne širokom rozmedzí pH, zatiaľ čo prirodzená beta-glukuronidáza nachádzajúca sa v rade rôznych rastlinných druhov je aktívna len v relatívne úzkom rozmedzí hodnôt pH, typicky okolo pH 4 - 5 (pozri príklad 3). Prirodzená beta-glukuronidázová aktivita sa môže v tomto prípade znížiť tiež tým, že sa do kultivačného média pridá glukuronid, ktorý sa môže hydrolyzovať prirodzenou beta-gluuronidázou a ktorý po hydrolýze spôsobuje zvýšenie pH, napríklad o-kumaryl-glukuronid.
Pretože sa zistilo, že beta-glukuronidáza vyskytujúca sa prirodzene v rastlinách je všeobecne aktívna pri pH okolo 4 - 5, môže sa prirodzená beta-glukuronidázová aktivita znížiť tiež tým, že sa do kultivačného média pridá zlúčenina regulujúca pH, ktorá upravuje pH kultivačného média na hodnotu medzi približne 5,5 a 8,5, výhodne medzi približne 6,0 a 8,0, napríklad medzi približne 6,5 a 7,5, alebo zlúčenina regulujúca pH, ktorá zvyšuje pH v bunkách alebo v kompartmentoch buniek na pH v týchto rozmedziach. Pri týchto hodnotách pH je beta-glukuronidáza kódovaná zavedeným génom GUS aktívna, ale prirodzená betaglukuronidáza je v podstate neaktívna. Príkladom zlúčeniny regulujúcej pH, ktorá sa môže použiť, je amónna soľ alebo zlúčenina uvoľňujúca amoniak, napríklad dusičnan amónny.
Konečne sa môže prirodzená beta-glukuronidázová aktivita znížiť alebo podstatne eliminovať fyzikálnym ošetrením, ako je ošetrenie teplom, napríklad použitím teploty v rozmedzí 50 - 65 °C formou krátkych tepelných impulzov približne 1 - 2 dni pred prenesením na selekčný substrát a/alebo použitím teploty v rozmedzí 30 - 45 °C počas selekcie (pozri príklad 10).
Genetická transformácia rastlinných buniek sa často uskutočňuje použitím kmeňov Agrobacteria, najmä kmeňov Agrobacterium tumefaciens. Zistilo sa, že niektoré „odzbrojené“ kmene Agrobacteria indukujú tvorbu výhonkov tým, že počas kokultivácie produkujú látky indikujúce výhonky, a pokiaľ sa má na účely selekcie geneticky transformovaných buniek použiť hydrolýza cytokinín-glukuronidov pomocou GUS je treba sa týmto kmeňom vyhnúť. Genetická transformácia buniek použitím cytokinín-glukoronidu ako neaktívnej zlúčeniny sa teda výhodne uskutočňuje pomocou kmeňa Agrobacteria, ktorý neprodukuje cytokiníny alebo iné zlúčeniny, ktoré indukujú výhonky (rast), alebo ktorý produkuje len nepodstatné množstvo týchto látok, čím sa vylúči alebo podstatne zníži indukcia rastu výhonkov spôsobená prítomnosťou živých baktérií na alebo v bunkách.
V niektorých prípadoch, napríklad pokiaľ je vyžadovaná zlepšená selekčná frekvencia, môže byť výhodné, aby sa požadovaná nukleotidová sekvencia kointrodukovala s aspoň dvomi odlišnými selekčnými génmi. Ďalším selekčným génom môže byť ďalší gén kódujúci enzým (alebo iný proteín alebo polypeptid) vhodný na pozitívnu selekciu podľa vynálezu, alebo nim môže byť gén kódujúci enzým (alebo iný proteín alebo polypeptid) vhodný na tradičnú negatívnu selekciu, napríklad kódujúci rezistenciu proti toxínu, antibiotiku alebo herbicídu. Selekcia geneticky transformovaných buniek teda môže prebiehať pomocou kombinácie pozitívnej selekcie a negatívnej selekcie, pričom je požadovaná nukleotidová sekvencia v geneticky transformovaných bunkách ďalej kointrodukovaná so subsekvenciou kódujúcou rezistenciu proti aspoň jednému toxínu, antibiotiku alebo herbicídu a médium obsahuje aspoň jeden toxín, antibiotikum alebo herbicíd, proti ktorému sú transformované bunky rezistentné.
Ako už bolo uvedené, vynález sa podľa jedného uskutočnenia týka geneticky transformovaných buniek, ktoré boli vyselektované už uvedeným spôsobom, najmä rastlinných buniek, ich potomstva alebo semien získaných z týchto geneticky transformovaných rastlinných buniek. Výhodou je často najmä to, že tieto bunky sú geneticky transformované rastlinné bunky, ktorých genóm neobsahuje ako selekčný markér zavedenú (t. j. neprirodzenú) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu rezistenciu proti toxínu, antibiotiku alebo herbicídu. Ako už bolo vysvetlené, vyskytujú sa obavy, či je bezpečné začleňovať gény kódujúce napríklad rezistenciu proti antibiotiku napríklad do potravinárskych plodín. Z tohto hľadiska sú teda geneticky transformované rastlinné bunky vyselektované spôsobom podľa vynálezu, ktoré neobsahujú selekčné gény napríklad rezistencie proti antibiotiku, rovnako ako rastliny, ich potomstvo a semená získané z týchto buniek, jednoznačne výhodné.
Syntéza zlúčenín všeobecného vzorca (I)
Na syntézu cytokinín-glukoronidov zahrnutých všeobecným vzorcom (I) sú k dispozícii rôzne postupy, ktoré sú viac alebo menej všeobecné. Dva z týchto postupov, ktoré sú považované za najlepšie, sú opísané v nasledujúcom texte.
A) Oxidácia zodpovedajúceho cytokinín-D-glukozidu
V tomto prípade je za vhodných podmienok oxidovaná hydroxymetalová skupina, naviazaná na pyranózový kruh beta-D-glukozidu zodpovedajúceho danému glukuronidu, na karboxylovú skupinu. Pravdepodobne najlepším spôsobom, ako dosiahnuť túto oxidačnú reakciu jednoducho a vysoko selektívne je katalytická oxidácia kyslíkom, vhodne s použitím platinovej černe alebo platiny na uhlí ako katalyzátora, a použitie slabo zásaditého (pH 8 - 10) vodného alebo vodno-alkoholického (ako je vodno-etanolické) reakčného prostredia; reakcia sa môže výhodne uskutočňovať pri teplote v rozmedzí 60 - 100 °C počas 2 až 24 hodín. Môže sa tiež použiť oxidácia (všeobecne nekatalytická) bežnými oxidačnými činidlami inými ako kyslík, ale predpokladá sa, že výsledné oxidačné reakcie všeobecne poskytnú nižšie výťažky a budú mať nižšiu špecifickosť (t. j. vytvoria sa zmesi oxidačných produktov - najmä pokiaľ nie sú prijaté opatrenia na ochranu iných oxidovateľných skupín glukozidu ako východiskového materiálu zavedením vhodných chrániacich skupín, ako je opísané ďalej).
Príklad postupu katalytickej oxidácie je uvedený v spôsobe 1 v príklade 1C prihlášky, v ktorom sa Nf’-bcnzyladenín-9-beta-D-glukopyranozid (BA9G) oxiduje na N6-benzyladenín-9-D-glukopyranurónovú kyselinu (ktorá sa potom izoluje ako sodná soľ) oxidáciou kyslíkom v prítomnosti platinovej černe.
Predpokladá sa, že tento spôsob je všeobecne použiteľný na syntézu cytokinín-9-glukuronidov zo zodpovedajúcich 9-glukozidov. Ukázal sa tiež ako vhodný na syntézu napríklad zeatín-O-glukuronidu (pozri príklad 1G) zo zodpovedajúceho zeatín-O-glukozidu. Zeatín-O-glukuronid je príkladom zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu, v ktorej je glukuronidový zvyšok substituentom na zvyšku R6, ako je tu definovaný, typu alkenylovej skupiny obsahujúcej 2-8 atómov uhlíka, a predpokladá sa, že daný spôsob je dostatočne široko aplikovateľný na ostatné cytokinín-glukuronidy podľa vynálezu, v ktorých je O-glukuronidový zvyšok umiestnený ako substituent na skupine označenej symbolom R6, ktorý predstavuje jeden z nasledujúcich významov, ktoré sú definované v súvislosti s všeobecným vzorcom (I): benzylovú skupinu, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 atómov uhlíka alebo substituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 atómov uhlíka, alebo alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 8 atómov uhlíka, alebo substituovanú alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 8 atómov uhlíka.
Zdá sa však, že tento postup nie je všeobecne použiteľný, napríklad na syntézu cytokinín-3-glukuronidov.
Ako už bolo naznačené, je jasné, že pri postupe zahrnujúcom oxidáciu cytokinin-glukozidu musia byť ľubovoľné iné oxidovateľné funkčné skupiny (za daných oxidačných podmienok), ktoré môžu byť prítomné vo východiskovom cytokinín-glukozide a ktoré majú zostať nezmenené vo výslednom glukuronide všeobecného vzorca (I), chránené predchádzajúcim zavedením vhodnej chrániacej skupiny. Príklady potenciálne oxidovateľných skupín, ktoré môžu byť prítomné v zlúčeninách zodpovedajúcich definícií všeobecného vzorca (I) sú (s ohľadom na ich umiestnenie, ako je špecifikované v súvislosti so všeobecným vzorcom (I) (pozri vyššie): merkaptoskupina, ktorá môže byť prítomná ako skupina R2 a/alebo R8, hydroxylová skupina alebo glukozyloxyskupina, ktoré môžu byť prítomné ako substituenty na skupine R6, pokiaľ predstavuje substituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 atómov uhlíka alebo substituovanú alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 8 atómov uhlíka, a ribozylová, 5'-fosforibozylová alebo glukozylová skupina, ktoré môžu byť prítomné ako skupiny R9 alebo R7. Pokiaľ je napríklad nutné chrániť alifatické (alkoholické) hydroxylové skupiny, ako sú hydroxylové skupiny na sekundárnych atómoch ribozylovej, 5'-fosforibozylovej alebo glukozylovej skupiny, sú vhodnými ochrannými skupinami napríklad acetylovú skupiny, ktoré sa môžu zaviesť známymi spôsobmi a ktoré sa môžu po oxidačnom procese odstrániť alkalickou hydrolýzou.
No, keď sa použije už opísaný postup miernej katalytickej oxidácie, sú hydroxylové skupiny na primárnych alifatických atómoch uhlíka všeobecne citlivé na oxidáciu, zatiaľ čo hydroxylové skupiny na sekundárnych (a terciárnych) atómoch uhlíka nie sú, takže pri oxidácii zvyšku vzorca -CH2OH v polohe 5 glukopyranózového kruhu cytokinín-beta-D-glukozidu týmto spôsobom hydroxylové skupiny v polohách 2, 3 a 4 glukopyranózového kruhu všeobecne nevyžadujú chránenie. Merkaptoskupina, ktorá má byť prítomná ako skupina R2 alebo R8, však v priebehu tejto katalytickej oxidácie všeobecne vyžaduje chránenie a táto merkaptoskupina sa môže vhodne chrániť ako benzylový derivát (pozri ďalej v spojení so spôsobom B).
Komerčne je dostupný rad vhodných cytokinin-glukozidov, ktoré sa dajú použiť ako východiskové materiály v tomto spôsobe, napríklad sa dá ich široký sortiment získať od firmy Apex Organics Ltd., Leicester, Veľká Británia, a niektoré cytokinín-9-glukozidy sa dajú získať od firmy Sigma Chemical Company, poštová priehradka 14508, St. Louis, MO 63178, USA. Cytokinín-glukozidy sa dajú pripraviť známymi spôsobmi uvedenými v literatúre. Napríklad syntézu radu vhodných cytokinín-9-glukozidov, kto rých skupina R6 má význam zahrnutý v tu uvedenej definícii tohto symbolu, sa dá získať priamym rozšírením metódy, ktorú opísali Cowley a kol. (Aust. J. Chem. 31 (1978) 1095) pre syntézu 9-beta-D-glukopyranozidov zeatínu a NĎ-benzyladenínu.
B) Syntéza typu Koenigs-Knorr
Tento postup, založený na spôsobe, ktorý pôvodne opísali W. Koenigs a E. Knorr (Chem. Ber. 34 (1901) 957), zahrnuje reakciu metyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromidjuronátu (skratka MBTG; vhodný spôsob jeho prípravy opísali Bollenback a kol., J. Amer. Chem. Soc. 77 (1955) 3310) s alkoholickou alebo fenolickou hydroxylovou skupinou, tioskupinou (-SII) alebo kruhovým atómom dusíka v aromatickom alebo nenasýtenom heterocyklickom zvyšku.
Tento spôsob poskytuje pravdepodobne najvšeobecnejší použiteľný spôsob syntézy cytokinín-glukuronidov podľa vynálezu (alebo glukuronidov prekurzorov, ktoré sa môžu potom ľahko previesť na požadované cytokinín-glukuronidy), pričom sa vychádza z príslušných cytokinínov (alebo prekurzorov cytokinínov, pozri ďalej) a predpokladá sa, že je veľmi široko použiteľný na prípravu zlúčenín zahrnutých pod všeobecným vzorcom (I).
Všeobecný postup je nasledujúci: príslušný cytokinín alebo prekurzor cytokinínu (pozri ďalej), rozpustený v rozpúšťadle ako je N,N-dimetylformamid (DMF), chinolín, propylénkarbonát, metanol alebo dietyléter, sa nechá reagovať s 1,25-2 molárnymi ekvivalentmi metyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu (MBTG) pri teplote v rozmedzí 25 - 100 °C počas 3 až 96 hodín, výhodne v prítomnosti pridanej látky viažucej halogenidové (bromidové) ióny, ako je oxid strieborný alebo uhličitan strieborný (keď sa ako rozpúšťadlo použije napríklad DMF, rozpúšťadlo často samé pôsobí adekvátne ako látka viažuca halogenidové ióny a v takomto prípade nie je nutné pridávať ďalšiu látku viažucu halogenidové ióny). Touto reakciou sa získa metylester intermediárneho peracetylovaného glukuronidu, ktorý sa všeobecne izoluje a purifikuje, čo sa dá vhodne vykonať napríklad (i) odparením rozpúšťadla, nasledujúcou extrakciou odparku rozpúšťadlom ako je chloroform, odstránením naposledy uvedeného rozpúšťadla z extraktu a purifikáciou výsledného surového intermediárneho produktu pomocou rekryštalizácie a/alebo bežných techník stĺpcovej chromatografie, alebo napríklad (ii) oddelením intermediárneho produktu z reakčnej zmesi bežnou stĺpcovou chromatografiou uskutočňovanou priamo s reakčnou zmesou, nasledujúcim odstránením elučného rozpúšťadla z vymytej frakcie alebo frakcií, ktoré sú predmetom záujmu, a rekryštalizáciou surového produktu.
V prípadoch, keď má mať požadovaný konečný produkt všeobecného vzorca (I) glukuronidový zvyšok v anódovej (glukurónamidovej) forme, uskutočňuje sa v tejto fáze vhodne konverzia peracetylovanej metylesterovej formy glukuronidového zvyšku na amidovú formu, čo sa dá všeobecne uskutočniť ošetrením peracetylovaného metylesteru (výhodne purifikovaného, napríklad už uvedeným spôsobom) roztokom bezvodého amoniaku v bezvodom metanole pri nízkej teplote, napríklad pri teplote medzi 0 °C a -10 °C, alebo alternatívne koncentrovaným (vhodne nasýteným) vodným roztokom amoniaku približne pri teplote miestnosti počas 0,5 - 4 hodín. Glukurónamid sa môže potom izolovať odparením roztoku amoniaku, napríklad vo vákuu, a rekryštalizáciou z vhodného rozpúšťadla alebo rozpúšťadlovej zmesi, ako je 90 % vodný etanol. Príklad konverzie je uvedený v príklade 1B, v ktorom je zo zodpo vedajúceho metylesteru pripravený N6-benzyladenín-3-glukurónamid (BA3GNamid).
V prípade postupov vychádzajúcich z určitých typov prekurzorov cytokinínov sa môže, skôr ako sa prikročí k uvoľneniu voľného glukuronidu, uskutočniť najprv chemická transformácia na metylester, ktorá je nutná na premenu zvyšku tvoreného prekurzorom cytokinínu na zvyšok tvorený príslušným cytokinínom. Napríklad syntéza cytokinín9-glukuronidu (ktorého syntéza postupom katalytickej oxidácie už bola opísaná) sa môže normálne uspokojivo uskutočniť vychádzajúc zo substituovaného alebo nesubstituovaného purínu, ktorý má v polohe 6 atóm chlóru. Posledná spomenutá zlúčenina, obsahujúca v polohe 6 atóm chlóru, sa môže všeobecne premeniť na metylester zodpovedajúceho peracetylovaného 9-glukuronidu pomocou už opísaného všeobecného postupu s použitím MBTG, a skupina 6-chlór sa môže potom vhodne premeniť na požadovaný zvyšok vzorca -NH-R6 tak, že sa produkt poslednej uvedenej reakcie nechá reagovať so zodpovedajúcim amínom (R6-NH2), ktorý sa môže všeobecne vhodne vyrábať in situ z amin-hydrochloridu (R6-NH2.HC1) a nadbytku (výhodne 2 - 4 násobného molárneho nadbytku) vhodnej zásady, napríklad terciárneho alifatického amínu, ako je trietylamín, vo vhodnom polárnom rozpúšťadle, ako je alifatický alkohol obsahujúci 1 až 4 atómy uhlíka, pri teplote v rozmedzí 65 - 120 °C. Tento postup je opísaný v spôsobe 2 príkladu 1C, v ktorom je opísaná syntéza N6-benzyladenín-9-glukuronidu (BA9GN) (ako jeho sodnej soli) týmto spôsobom.
Acetylové skupiny na glukuronidovom zvyšku sa potom odstránia zásaditou hydrolýzou pomocou zásady, ako sú vodný hydroxid sodný, vodnometanolický alebo etanolický hydroxid sodný, alebo metanolický amoniak pri teplote v rozmedzí 0 - 25 °C počas 0,5 až 6 hodín. Ak sa ako zásada použije jeden z už spomenutých vodných alebo alkoholických roztokov hydroxidu sodného, tento postup poskytuje po neutralizácii nadbytku zásady soľ zodpovedajúceho cytokinín-glukuronidu, zatiaľ čo použitie reaktantu, ako je metanolický amoniak, a potom odstránenie amoniaku odparením poskytuje amidovú formu glukuronidu. Posledná spomenutá zlúčenina sa vhodne purifikuje bežnými spôsobmi, ako je chromatografia, najmä chromatografia na reverznej fáze, a/alebo rekryštalizácia z vhodného rozpúšťadla, ako je vodnoorganické rozpúšťadlo, napríklad 80 - 90 % vodný etanol.
Je jasné, že ak východiskový cytokinín alebo prekurzor cytokinínu obsahuje jednu alebo niekoľko funkčných skupín, ktoré sú schopné za daných reakčných podmienok reagovať s MBTG a ktoré majú byť prítomné nezmenené vo výslednom glukuronide všeobecného vzorca (I), musia sa takéto funkčné skupiny chrániť predchádzajúcim zavedením vhodných ochranných skupín. Medzi príklady takýchto reaktívnych funkčných skupín, ktoré môžu byť prítomné vo východiskových cytokinínoch poskytujúcich zlúčeniny v rozsahu definície všeobecného vzorca (I), patrí (s ohľadom na ich umiestnenie, ako je to špecifikované v súvislosti s všeobecným vzorcom (I):
hydroxylová skupina alebo merkaptoskupina prítomná ako skupina R2, hydroxylová skupina alebo merkaptoskupina prítomná ako skupina R8, hydroxylová skupina alebo aminoskupina prítomná ako substituent na fenylovom kruhu skupiny označenej symbolom R6, pokiaľ predstavuje substituovanú benzylovú skupinu, hydroxylové skupiny alebo glukozyloxyskupiny prítomné ako substituent alebo substituenty na skupine označenej symbolom R6, pokiaľ predstavuje substituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 atómov uhlíka alebo substituovanú alkenylovú skupinu ob
SK 280639 Β6 sahujúcu 2 až 8 atómov uhlíka, ribozylová skupina, 5'-fosforibozylová alebo glukozylová skupina, ktorá môže byť prítomná ako skupina R9 alebo R7, a aminoskupiny v skupine vzorca -Cl (CHĺNHiJCOOlI prítomné ako skupina R9.
Ďalej sú uvedené chrániace skupiny vhodné na chránenie už uvedených príkladov reaktívnych funkčných skupín, ktoré môžu byť prítomné vo východiskových cytokinínoch. Hydroxylová skupina sa môže všeobecne chrániť zavedením acetylovej skupiny (pozri v spojení s oxidatívnym spôsobom prípravy zlúčenín všeobecného vzorca (I)),čím sa vytvorí zodpovedajúca acetoxyskupina (-OOCCH3). Merkaptoskupina sa môže všeobecne veľmi vhodne chrániť ako benzyltioéterový derivát (-SCH2C6H5) zavedením benzylovej skupiny (napríklad reakciou s benzylchloridom podobným spôsobom, ako je podrobne opísaný ďalej v súvislosti s prekurzormi cytokinínov, ktoré obsahujú, aspoň formálne, oxoskupinu (=0) alebo tioxoskupinu (=S) v polohe 2 a 0xoskupinu v polohe 6 (pozri ďalej). Aminoskupina sa môže všeobecne vhodne chrániť nasledujúcou premenou na ftalimidoskupinu: cytokinín alebo prekurzor cytokinínu sa zohreje s prebytkom ftalanhydridu v relatívne inertnom rozpúšťadle, ako je chloroform alebo 1,2-dimetoxyetán, pri teplote v rozmedzí 70 - 100 °C počas niekoľkých hodín, často vhodne okolo 4 hodín. Aminoskupina sa môže po uskutočnení reakcie typu Koenigs-Knorr potom regenerovať ošetrením vodnoalkoholickým (ako je vodnoetanolický) roztokom hydrazínu.
Skupinou prekurzorov cytokinínov, ktoré sú obzvlášť vhodné na použitie v syntéze cytokinín-glukuronidov podľa vynálezu majúcich glukuronidový zvyšok (zodpovedajúci symbolu R10 vo všeobecnom vzorci (I) naviazaný ako skupinu -O-R10 alebo -S-R10 v polohe 2 purínového kruhu, sú prekurzory cytokinínov, ktoré obsahujú, aspoň formálne, oxoskupinu (=0) alebo tioxoskupinu (=S) v polohe 2 a 0xoskupinu v polohe 6. Tu je treba uviesť, že zlúčeniny daných typov, majúce 2-oxoskupiny a 2-tioxoskupiny, budú, aspoň v roztoku, všeobecne prítomné v tautomémej rovnováhe so zodpovedajúcimi zlúčeninami obsahujúcimi 2-hydroxyskupiny a 2-merkaptoskupiny (pričom 6-oxoskupina je potom prítomná ako 6-hydroxylová skupina), a naposledy spomenuté tautomérne formy budú všeobecne tvoriť podstatnú súčasť.
Naposledy uvedená hydroxylová skupina alebo merkaptoskupina v polohe 2 sa v záverečnej fáze celého procesu syntézy premení pomocou postupov typu Koenigs-Knorr na zodpovedajúcu skupinu vzorca -O-R10 respektíve -S-R10. Pred uskutočnením reakcie typu Koenigs-Knorr je vhodné premeniť 6-hydroxylovú skupinu cez intermediárny 6-halogénderivát (výhodne 6-chlór- derivát) na zvyšok vzorca -NH-R6, uvedený vo všeobecnom vzorci (I), čo všeobecne vyžaduje, aby bola počas tohto procesu hydroxylová skupina alebo merkaptoskupina v polohe 2 chránená vhodnou chrániacou skupinou. Pre obe tieto skupiny je vhodnou chrániacou skupinou benzylová skupina, ktorá sa môže normálne zaviesť ľahko reakciou zahŕňajúcou postupné pridanie mierneho nadbytku benzylchloridu k miešanému roztoku suspenzie daného prekurzora cytokinínu vo vodnej zásade (pH je typický okolo 12 - 13), ako je vodný hydroxid sodný alebo draselný, približne pri teplote miestnosti. Po miešaní, s ktorým sa pokračuje počas typicky 1 - 2 hodín, sa reakčná zmes neutralizuje pridaním napríklad ľadovej kyseliny octovej a nerozpustný produkt, obsahujúci chrániacu benzylovú skupinu, sa izoluje filtráciou.
6-Hydroxylová skupina výsledného 2-benzyloxy- alebo 2-benzyltio-6-purinolderivátu sa potom premení na 6-chlór skupinu, vhodne s použitím nadbytku chloračného činidla, ako je oxychlorid fosforečný v prítomnosti organickej zásady, ako je Ν,Ν-dietylanilín. Naposledy uvedená reakcia sa normálne vhodne uskutočňuje za varu pod spätným chladičom počas od asi 10 minút do približne 3 hodín.
6-Chlórskupina sa môže potom vhodne premeniť na požadovaný zvyšok vzorca -NH-R6 tak, že sa nechá produkt naposledy uvedenej reakcie reagovať so zodpovedajúcim amínom vzorca RS-NHZ, ktorý sa môže všeobecne vhodne vytvárať in situ z amín-hydrochloridu (R6-NH2.HC1) a nadbytku (vhodne 2 - 4 násobného molárneho nadbytku) vhodnej zásady, napríklad terciámeho alifatického amínu, ako je trietylamín, vo vhodnom polárnom rozpúšťadle, ako je alifatický alkohol obsahujúci 1 až 4 atómy uhlíka (napríklad 1-butanol), pri teplote v rozmedzí 65- 120 °C.
Po izolácii produktu sa chrániaca skupina odstráni, aby sa tak regenerovala voľná 2-hydroxylová skupina alebo 2-merkaptoskupina. V prípade, že je chrániacou skupinou benzylová skupina, dá sa to vhodne vykonať napríklad 0šetrením produktu nadbytkom sodíka v kvapalnom amoniaku.
V prípade produktov, ktoré majú v tejto fáze 2-merkaptoskupinu, sa predpokladá, že je všeobecne výhodné, predtým, ako sa pristúpi k zavedeniu glukuronidového zvyšku pomocou opísaného postupu typu Koenigs-Knorr, premeniť 2-merkaptoskupinu na formu soli (-S), napríklad na draselnú soľ. Príklad postupu vhodného na tento účel je opísaný v kroku 4 príkladu 1E a predpokladá sa, že opísané podmienky sú značne široko aplikovateľné. V niektorých prípadoch však je možné uskutočniť reakciu typu KoenigsKnorr s MBTG (pozri ďalej) priamo bez predchádzajúcej premeny 2-merkaptoskupiny na formu soli.
Na záver sa zavedie glukuronidový zvyšok reakciou s MBTG, ako je to opísané v súvislosti s postupom typu Koenigs-Knorr.
Príklad dokumentujúci postup opísanej syntézy je uvedený v príklade 1E na syntézu sodnej soli N6-(2 -izopentenyl)adenín-2-tioglukuronidu (IP2SGN), kde je východiskovou látkou 2-tioxantín, a predpokladá sa, že tam tiež uvedené ďalšie informácie týkajúce sa výberu rozpúšťadiel na rekryštalizáciu a extrakciu, výberu koncentrácií a množstva reaktantov atď., sú všeobecne použiteľné na uskutočnenie opísanej postupnosti reakcií, v ktorých je východisková látka prekurzor cytokinínu, ktorý má „2-tioxoskupinu“ (t. j. 2-merkaptoskupinu) a „6-oxoskupinu“ (t. j. 6-hydroxylovú skupinu).
Podobne tvoria skupinu prekurzorov cytokinínov, ktoré sú najmä vhodné na použitie pri syntéze cytokinín-glukuronidov podľa vynálezu majúcich glukuronidový zvyšok (zodpovedajúci symbolu R10 vo všeobecnom vzorci (I) naviazaný ako skupinu vzorca -O-R10 alebo -S-R10 v polohe 8 purínového kruhu, prekurzory cytokinínov, ktoré obsahujú, aspoň formálne (z podobných dôvodov ako sú opísané v súvislosti s prekurzormi cytokinínov obsahujúcich formálnu 2-oxoskupinu alebo 2-tioxoskupinu a formálnu 6-oxoskupinu), oxoskupinu (=0) alebo tioxoskupinu (=S) v polohe 8, a ktoré ďalej obsahujú hydroxylovú skupinu v polohe 6. Tieto prekurzory cytokinínov sa môžu všeobecne previesť na požadovaný konečný produkt všeobecného vzorca (I) s použitím postupnosti reakcií (zavedenie chrániacich skupín, zavedenie 6-chlórskupiny, zavedenie zvyšku vzorca -N-R6, odštiepenie chrániacich skupín, a konečne reakcia s MBTG), ktoré sú analogické s reakciami opísanými pri cytokinín-glukuronidoch majúcich glukuronidový zvyšok naviazaný ako skupinu vzorca -O-R10 alebo -S-R10 v polohe 2 purínového kruhu. Tento postup je dokumento vaný príkladom 1F opisujúcim syntézu N6-(2'-izopentenyl)adenín-8-tioglukuronidu (ako jeho sodnej soli).
Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorých je glukuronidový zvyšok vo forme karboxylovej kyseliny, sa môžu všeobecne pripraviť zo zodpovedajúcej soli, napríklad sodnej soli (pripravenej už uvedeným spôsobom) okyslením miešaného roztoku alebo roztoku/suspenzie soli vo vhodnom rozpúšťadle (napríklad vo vodnom alkohole, ako vodnom etanole), výhodne pri teplote nižšej ako 25 °C, minerálnou kyselinou, ako je kyselina chlorovodíková, na pH približne 2,5. Po miešaní počas niekoľkých minút sa rozpúšťadlo odstráni vo vákuu. Surový odparok sa môže výhodne podrobiť chromatografii s cieľom odstrániť anorganické soli (pozri napríklad príklad II uvádzajúci podrobnosti typického postupu a vhodný chromatografický substrát na tento účel), a potom sa môže produkt rekryštalizovať z vhodného rozpúšťadla, typicky polárneho rozpúšťadla, ako je metanol alebo etanol.
Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorých je glukuronidový zvyšok vo forme metylesteru alebo etylesteru, sa môžu všeobecne veľmi vhodne pripraviť s vysokým výťažkom, reakciou zodpovedajúceho cytokinín-glukuronidu vo forme karboxylovej kyseliny (pripraveného napríklad ako je už opísané) s diazometánom respektíve diazoetánom, za reakčných podmienok normálnych pre tento typ reakcie, ktoré sú v odbore dobre známe.
Komerčne je dostupný rad cytokinínov a prekurzorov cytokinínov vhodných na použitie ako východiskové materiály v súvislosti so spôsobom B), zatiaľ čo ďalšie sa dajú syntetizovať známymi spôsobmi uvedenými v literatúre. Napríklad syntéza mnohých vhodných N6-substituovaných adenínov majúcich skupinu označenú symbolom R6 v rámci tu uvedenej definície tohto symbolu sa môže previesť v literatúre uvedeným spôsobom, ktorý opísali Iwamura a kol. (Phytochemistry 19 (1980) 1309) a rad N6-(2'-izopentenyljadenínov substituovaných v polohe 2, 8 a 2,8 majúcich skupiny označené symbolmi R2 a/alebo R’ v rámci tu uvedených definícii týchto symbolov sa môže pripraviť ako opísali Dammann a kol. (Phytochemistry 13 (1974) 329).
Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca (I) sú nasledujúce zlúčeniny:
zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R2 predstavuje atóm vodíka, R3 znamená beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu alebo jej soľ na karboxylovej skupine, každý zo symbolov R9 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, R6 znamená benzylovú skupinu, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu a R8 znamená atóm vodíka;
zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R2 predstavuje atóm vodíka, R3 znamená amidový derivát beta-D-glukopyranuronozylovej skupiny na karboxylovej skupine, každý zo symbolov R9 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, R6 znamená benzylovú skupinu, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu a R8 znamená atóm vodíka;
zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R2 predstavuje atóm vodíka, každý zo symbolov R3 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, R9 znamená beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu alebo jej soľ na karboxylovej skupine, R6 znamená benzylovú skupinu, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, a R8 znamená atóm vodíka;
zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R2 predstavuje atóm vodíka, R3 znamená beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu alebo jej soľ na karboxylovej skupine, každý zo symbolov R9 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré do hromady tvoria väzbu, R6 znamená 2-izopentenylovú skupinu, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, a R8 znamená atóm vodíka;
zlúčenina všeobecného vzorca (1), v ktorom R2 predstavuje -S-beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu alebo jej soľ na kar- boxylovej skupine, R9 znamená atóm vodíka, každý zo symbolov R3 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, R6 znamená 2-izopentenylovú skupinu, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, a R8 znamená atóm vodíka;
zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R2 predstavuje atóm vodíka, R9 znamená atóm vodíka, každý zo symbolov R3 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, R6 znamená 2-izopentenylovú skupinu, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, a R8 znamená -S-beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu alebo jej soľ na karboxylovej skupine; a zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R2 predstavuje atóm vodíka, každý zo symbolov R3 a X predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, R9 znamená atóm vodíka,
R6 predstavuje skupinu vzorca
H ,CH2-------O >=<\ o — HjC CH3 ||
C-OH Éj HO’----í
OH alebo jej soľ, každý zo symbolov R7 a Y predstavuje polovicu väzby, ktoré dohromady tvoria väzbu, a R8 znamená atóm vodíka.
Syntéza zlúčenín všeobecného vzorca (II) podľa vynálezu
Zlúčeniny všeobecného vzorca (II) podľa vynálezu sa dajú ľahko pripraviť z ľahko pripraviteľného metylesteru kyseliny o-kumárovej (t. j. kyseliny 3-(2-hydroxyfenyl)-2-propénovej) ako východiskového materiálu. Naposledy uvedený ester sa môže pripraviť zahrievaním voľnej kyseliny (získanej napríklad od firmy Aldrich Chemical Company, Gillingham, Dorset, Veľká Británia, pod katalógovým číslom H2, 280-9) v metanole v prítomnosti kyseliny sírovej do varu pod spätným chladičom. Je nutné uviesť, že sa získa zmes cis- a trans- foriem (vzhľadom na etylénovú dvojnú väzbu). Predpokladá sa, že spočiatku je všeobecne prevládajúca forma trans-, bez ohľadu na spôsob prípravy. To však nevadí, pretože sa zistilo, že tak cis (kumarinyl-), ako aj trans (kumaryl-) glukuronidov sú po hydrolýze GUS nakoniec premenené na kumarín vďaka skutočnosti, že kumarová kyselina sa pomaly v priebehu niekoľkých dní premení (neenzymaticky, prevažne vďaka katalýze svetlom) na kumarín.
Vhodné postupy na syntézu zlúčenín všeobecného vzorca (II), v ktorom (a) R1 a Rln sú vo forme karboxylovej skupiny a (b) R1 a R10 sú v amidovej forme, sú podrobne opísané príkladoch 1H respektíve II. Zlúčeniny všeobecného vzorca (II), v ktorom je tak R, ako aj R10 vo forme sodnej soli, sa môžu vhodne získať zásaditou hydrolýzou metylesteru peracetylovaného glukuronidu (pripraveného (z metyl-o-kumarátu) a izolovaného, ako je to opísané v prvej časti postupu syntézy v príklade II) s použitím metanolického hydroxidu sodného, spôsobom opísaným na začiatku druhej časti postupu syntézy v príklade 11; miesto upravenia pH hydrolyzátu kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu približne 2,5, ako je opísané v príklade II, sa zmes kyselinou chlorovodíkovou len neutralizuje (na pH približne 7). Sodná soľ sa výhodne izoluje zo zmesi pomocou chromatografie, napríklad na neionogénnu živicu Amberlite XAD-2, pričom sa stĺpec premyje vodou na odstránenie neorganických soli, a potom sa uskutoční elúcia, typicky metanolom. Surová sodná soľ glukuronidu získaná odstránením metanolu sa môže potom vhodne rekryštalizovať, napríklad z absolútneho metanolu. Úzko analogickým postupom sa dá samozrejme pripraviť tiež draselná soľ s použitím napríklad metanolického hydroxidu draselného v procese hydrolýzy.
Zlúčeniny všeobecného vzorca (II), v ktorom sú symboly R1 a R10 buď oba vo forme metylesteru, alebo oba vo forme etylesteru, sa môžu pripraviť reakciou medzi diazometánom respektíve diazoetánom a zlúčeninou všeobecného vzorca (II), v ktorom sú oba zo symbolov R1 a R10 vo forme karboxylovej kyseliny. Reakčné podmienky sú výhodne také, ako sú opísané pri analogickej príprave metylesterovej alebo etylesterovej formy cytokinín-glukuronidov.
Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca (II) sú nasledujúce zlúčeniny:
zlúčenina všeobecného vzorca (II), v ktorom R1 predstavuje cis- a/alebo trans-2-amidoetenylovú skupinu (cisa/alebo trans- CH=CHCONH2), a R10 znamená amidový derivát beta-D-glukopyranuronozylovej skupiny a jej karboxylovej funkcii (2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranurónamid) a zlúčenina všeobecného vzorca (II), v ktorom R1 predstavuje cis-2-karboxyetenylovú skupinu (cis - CH=CHCOOH), a R10 znamená beta-D-glukopyranuronozylovú skupinu (2-hydroxycinamyl-beta-D-glukopyranurónová kyselina).
Nasledujúce príklady ilustrujú všeobecné princípy vynálezu v rastlinách, najmä použitie beta-glukuronidázy ako selekčného génu a použitie nových glukuronidových substrátov, ktoré sa môžu týmto génom hydrolyzovať. Na základe týchto prác sa predpokladá, že gény, ako je gén betaglukuronidázy, sa môžu použiť na rad súvisiacich cieľov. Tak sa môže gén beta-glukuronidázy použiť v postupe na dosiahnutie lokalizovaného alebo tkanivovo špecifického účinku regulujúceho rast rastliny alebo rastlinného tkaniva, ktorý exprimuje zavedený gén betaglukuronidázy vo vyššom množstve ako ostatné časti alebo tkanivá v rovnakej rastline, ktorého postup zahŕňa poskytnutie zlúčeniny, ktorá sa môže hydrolyzovať zavedeným génom beta-glukuronidázy, rastline, takže je táto zlúčenina hydrolyzovaná v tej časti alebo tkanive rastliny, ktorá obsahuje zavedený gén beta-glukuronidázy, čím sa uvoľni zlúčenina regulujúca rast a vedie to k regulácii rastu len v tejto časti alebo tkanive rastliny, alebo je regulácia rastu v tejto časti alebo tkanive väčšia ako účinok dosiahnutý v iných častiach alebo tkanivách rastliny. Predpokladá sa tiež, že sa môžu výhodne použiť regulátory rastu rastlín, ako sú cytokiníny, vo forme glukuronidov alebo derivátov glukuronidov, skôr tiež ako voľné cytokiníny, napríklad preto, aby sa využila výhoda, že budú pravdepodobne v rastlinách odlišne transportované a distribuované v porovnaní napríklad so zodpovedajúcimi voľnými alebo ribozylovanými cytokinínmi.
Podobne ďalej uvedené príklady naznačujú niektoré ďalšie spôsoby využitia beta-glukuronidázy. Jedným z nich je spôsob na in vitro vyhľadávanie a identifikáciu cytokinín-glukuronidov (alebo glukuronidových zlúčenín iných regulátorov rastu rastlín), ktoré sa môžu hydrolyzovať in vivo pomocou zavedeného génu beta-glukuronidázy. Beta-glukuronidáza sa môže tiež využiť pri vyhľadávaní zlúčenín, ktoré sú vhodné na použitie ako selekčné činidlá v tu opísanom spôsobe pozitívnej selekcie (pozri príklad 2). V príkladoch 3 a 12 sú opísané systémy, ktoré sa môžu použiť na vyhľadávanie zlúčenín, ktoré selektívne inhibujú prirodzený enzým beta-glukuronidázu v rastlinných bunkách bez toho, aby podstatne ovplyvňovali aktivitu enzýmu kódovaného zavedeným génom beta-glukuronidázy.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Syntéza glukuronidov
Ďalej je opísaná syntéza radu nových glukuronidov.
Príklad 1A
Sodná soľ 3-beta-D-glukopyranuronozyl-6-bcnzylaminopurínu
Synonymá: sodná soľ N6-benzyladenín-N3-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny sodná soľ Ns-benzyladenín-N3-glukuronidu
Skratka: sodná soľ BA3 GN
Kondenzácia N6-benzyladenínu (BA) a metyl(2,3,4-tri-O-acetyl alfa-D-glukopyranuronozylbromid)uronátu (MBTG)
12,6 mmol NĎ-benzyladenínu a 15,1 mmol mety 1(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranuronozylbromid)uronátu (Bollenback a kol., 1955, J. Amer. Chem. Soc., zväzok 77, str. 3310 - 3315) sa prevedie do suspenzie v 50 ml bezvodého Ν,Ν-dimetylformamidu (DMF) a zohrieva sa na 100 °C počas približne 10 hodín. Väčšina Ν,Ν-dimetylformamidu sa odstráni vo vákuu, surový produkt sa rozpustí v 300 ml chloroformu a pretrepe sa s 3 x 300 ml vody. Po vysušení nad bezvodým síranom horečnatým sa chloroformový extrakt odparí vo vákuu a tmavý sirupovitý zvyšok sa prekryštalizuje z etanolu. Surový produkt (zmes N6-benzyladenínu, BA9GN a BA3GN vo forme peracetylovaných metylesterov) sa vyčistí na stĺpci 100 g silikagélu pripraveného v chloroforme premývaním s použitím gradientu 0 - 4 % etanolu v chloroforme. Surový meíylester peracetylovaného BA3GN sa prekryštalizuje z etanolu. Výťažok: 280 mg bezfarebnej amorfnej pevnej látky
Metylester peracetylovaného BA3GN sa hydrolyzuje pomocou 5 % hydroxidu sodného v 50 % vodnom etanole pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa päť minút potom, čo sa pevná látka rozpustí, opatrne neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou za chladenia na ľade. Po vysušení vo vákuu sa surová sodná soľ BA3GN vyčistí chromatografiou na reverznej fáze (na stĺpci 100 g C18-silikagélu) pomocou elúcie 1 1 vody, a potom 20 % vodným metanolom, a potom sa prekryštalizuje z etanolu. Získa sa 150 mg čistej soli BA3GN vo forme bezfarebnej, mikrokryštalickej pevnej látky, ktorá sa vysuší na konštantnú hmotnosť nad chloridom vápenatým vo vákuu.
Analýza
UV:
etanol A max. 297 nm
etanol/kyselina octová A max. 291 nm
etanol/amoniak A max. 297 nm
Tieto hodnoty sú identické s hodnotami uvádzanými v literatúre pre N6-bcnzyladcnín-3-bcta-D-glukopyranozid a N3,N6- disubstituovaný adenín (N. J. Leonard, K. L. Carraway a J. P. Helgeson, J. Heterocyclic Chem. 1965, 2, 291 až 297).
Kvapalinová chromatografia s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HPLC):
HPLC sa uskutočňuje s použitím stĺpca 10 x 0,46 cm C18-silikagélu, premývaného izokraticky metanolom (60 %) obsahujúcom kyselinu octovú (10%), s prietokom 1 ml/min.
Uskutočňuje sa detekcia UV žiarením pri 290 nm.
Sodná soľ BA3GN má čistotu viac ako 95 % a obsah voľného N6-benzyladenínu sa odhaduje na menej ako 0,05 %.
Hydrolýza pomocou beta-glukuronidázy (GUS)
500 pg sodnej soli BA3GN v 500 pl 50 mM nátriumfosfátového pufra s pH 7,0 sa inkubuje s 2500 jednotkami Sigma „Fishman“ beta-glukuronidázy (GUS, Sigma typ G7896) počas 18 hodín pri teplote 37 °C. HPLC (za uvedených podmienok) ukáže v podstate úplne odstránenie piku MA3GN a vytvorenie piku, ktorý sa pri chromatografii v zmesi 1 : 1 správa zhodne ako autenticky N6-benzyladenín, čo potvrdzuje identitu produktu ako konjugátu N6-bcnzyladenínu a beta-D-glukurónovej kyseliny.
Nasledujúca analýza sa získa z druhej časti sodnej soli BA3GN pripravenej, ako je už opísané:
UV: etanol A max. 297 nm
HPLC:
Stĺpec 15 x 0,46 cm C18-silikagélu, premývaný s použitím gradientovej elúcie zmesou metanol (20 - 60 %) - kyselina octová (10 %) počas 30 minút pri prietoku 1 ml/min. Čistota stanovená pomocou HPLC je 99,5 %. Obsah voľného N6-benzyladenínu je nižší ako 0.05 % .
TLC:
Dosky so silikagélom vyvíjané sústavou 1-butanol/kyselina octová/voda (12/3/5). Čistota stanovená pomocou TLC jc 99,5 %. Obsah voľného N6-bcnzyladcnínu jc nižší ako 0,05 %.
Hydrolýza pomocou beta-glukuronidázy (GUS)
500 pg sodnej soli BA3GN v 500 μΐ 500 mM nátriumfosfátového pufra s pH 7,0 sa inkubuje s 2500 jednotkami Sigma „Fishman“ beta-glukuronidázy (GUS, Sigma typ G7896) počas 18 hodín pri teplote 37 °C. HPLC a TLC ukáže v podstate úplne (viac ako 99 %) odstránenie BA3GN za vzniku zlúčeniny, ktorá sa pri chromatografii v zmesi 1 : 1 chová zhodne ako autentický N6-benzyl-adenín.
Príklad 1B 3-Beta-D-glukopyranurónamido-6-benzylaminopurín Synonymá: N6-benzyladenín-N3-beta-D-glukopyranurónamid
N6-benzyladenín-3-glukuronamid
Skratka: BA3GNamid
OH
Syntéza
1,5 g prekryštalizovaného metylesteru peracetylovaného BA3GN pripraveného v príklade 1A sa prevedie do sus penzie v 200 ml bezvodého metanolu a ochladí sa na 0 °C. Pridá sa ďalších 400 ml bezvodého metanolu nasýteného bezvodým amoniakom pri -10 °C a zmes sa mieša na ľade. Pridáva sa ďalší bezvodý metanol s teplotou ľadu, pokiaľ sa pevná látka celkom nerozpustí a reakčná zmes sa mieša na ľade počas ďalších 3 hodín. Nadbytok amoniaku a metanolu sa odstráni vo vákuu a produkt sa dôkladne trituruje horúcim etanolom. Získa sa 1,3 g bezfarebnej pevnej látky.
BA3GNamid je, ako ostatné adenín-3-glykozidy, len obmedzene rozpustný vo vode alebo v alkohole, ale rozpúšťa sa v množstve 2,4 mg/ml v 50 % vodnom metanole obsahujúcom kyselinu octovú (25 %).
Analýza
TLC (silikagél - chloroform/metanol/ľadová kyselina octová, 50/50/5):
Pri nanesení 50 pg látky sa v UV svetle zistí jediná škvrna (Rf 0,36) a žiadne detegovateľné nečistoty. Čistota je viac ako 98 % . Metylester peracetylovaného BA3GN (Rf 0,89) i BA3GN (Rf 0,02) sú prítomné v nedetegovateľnom množstve (menej ako 1 %)
TLC (silikagél - chloroform/metanol, 9/1):
Používa sa na zistenie obsahu N6-benzyladenínu. Pri nanesení 192 pg BA3GNamidu sa nezistí detegovateľné množstvo 6-benzyladenínu. Obsah N6-benzyladenínu teda tvorí menej ako 0,2 %.
Príklad IC
Sodná soľ 9-beta-D-glukopyranuronozyl-6-benzylaminopurínu
Synonymá: sodná soľ N6-benzyladenín-N9-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny sodná soľ N6-benzyladenín-9-glukuronidu
Skratka: sodná soľ BA9GN
Syntéza Spôsob 1
Katalytická oxidácia N6-benzyladenínu-9-beta-D-glukopyranozidu (BA9G) mg BA9G sa prevedie do suspenzie v 25 ml 50 mM hydrogénuhličitanu sodného s 200 mg platinovej černe. Zmes sa zahrieva na 80 °C vo vodnom kúpeli, počas čoho sa necháva silne prebublávať kyslík. Po 4 hodinách sa pridá ďalších 100 ml platiny ako katalyzátora. Po 20 hodinách sa premení približne 95 alebo viac % BA9G na zodpovedajúcu 9-beta-glukopyranurónovú kyselinu a určité množstvo N6-benzyladenínu. Zmes sa neutralizuje a získaná sodná soľ BA9GN sa vyčistí pomocou chromatografie sa reverznej fáze (na stĺpci 20 g Cl8-silikagélu) elúciou 200 ml vody, a potom 20 % metanolom.
Čistá sodná soľ BA9GN, bez glukozidu a N6-benzyladenínu, sa vysuší nad chloridom vápenatým vo vákuu, čím sa získa bezfarebná pevná látka.
Spôsob 2
Kondenzácia 6-chlórpurínu a metyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu (MBTG)
1,13 g 6-chlórpurínu (vysušeného nad oxidom fosforečným), 3,87 g metyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu a 1,5 g čerstvo vysušeného uhličitanu draselného sa mieša v 30 ml bezvodého propylénkarbonátu pri teplote miestnosti počas 24 hodín. Tmavá zmes sa prefiltruje a vyčistí stĺpcovou chromatografíou na stĺpci 100 g silikagélu lak, že sa premyje s použitím gradientu 0 - 80 % etylacetátu v chloroforme. Hlavná frakcia (iná ako nezreagovaný 6-chlórpurín) sa vysuší a prekryštalizuje z vriaceho etanolu, čím sa získa 450 g metyl-6-chlórpurín-9-(2 ',3 ',4 '-tri-O-acetyl-beta-D-glukopyranuronátu) ako svetložltej pevnej látky, ktorá sa vysuší nad oxidom fosforečným vo vákuu. Čistota stanovená pomocou HPLC je viac ako 95 %.
312 mg metyl-6-chlórpurín-9-(2',3',4'-tri-O-acetylbeta-D-glukopyranuronátu) a 171 μΐ benzylamínu sa spoločne zahrieva v 13,5 ml 1-butanolu na 100 °C počas 1 hodiny. Pevná látka sa ľahko rozpúšťa a vzniká číry žltý roztok. Väčšina butanolu sa odstráni vo vákuu a získa sa belavá pevná látka, ktorá sa trepe počas 1 - 2 hodín pri teplote miestnosti s 5 % hydroxidom sodným v 50 % vodnom etanole (25 ml). Po neutralizácii sa produkt vysuší vo vákuu, aby sa odstránili stopy butanolu, a sodná soľ BA9GN sa vyčistí chromatografíou na reverznej fáze ako v spôsobe 1.
Surový produkt sa vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým a oxidom fosforečným a získa sa 210 mg bezfarebnej pevnej látky, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako BA9GN pripravený pomocou katalytickej oxidácie.
A max.
A max.
A max.
270 nm(17 400)
270 nm (16 200)
270 nm (17 400)
Analýza sodnej soli BA9GN pripravenej pomocou kondenzačnej reakcie, spôsob 2
UV:
% etanol % etanol/Ο,ΙΜ HC1 %etanol/0,lMNaOH
Tieto výsledky súhlasia so štruktúrou N6,N9-disubstituovaného adenínu. Extinkčné koeficienty sú prakticky rovnaké ako pri čistom BA9GN, čo svedčí o neprítomnosti znečisťujúcich látok neabsorbujúcich UV žiarenie. Čistota stanovená analýzou pomocou UV svetla je viac ako 95 %. HPLC:
Stĺpec C18-silikagélu 10 x 0,46 cm, detekcia UV žiarením pri 270 nm. Izokratická (zmes metanol (50 %) - kyselina octová (0,2 M), prietok 2 ml/min.) a gradientová HPLC (zmes metanol 0-60 %) - kyselina octová (0,2 M), prietok 2 ml/min.) ukazujú ostrý, symetrický pík pre BA9GN, ktorý sa vymyje tesne pred zodpovedajúcim glukozidom. BA9GN pripravený pomocou kondenzačnej reakcie sa pri chromatografii v zmesi 1 : 1 pri HPLC (gradientovej a izokratickej) správa zhodne ako BA9GN pripravený pomocou katalytickej oxidácie, čo potvrdzuje, že BA9GN pripravený pomocou kondenzačnej reakcie je beta-D-glukopyranozylový izomér. BA9GN obsahuje nedetegovateľné množstvo (menej ako 2 %) alfa-anoméru alebo iných nečistôt, vrátane N6- benzyladenínu. Čistota BA9GN stanovená pomocou HPLC je viac ako 98 % .
TLC (silikagél - chloroform/metanol, 9/1):
TLC sa použije na stanovenie kontaminácie BA9GN N6-benzyladenínom. BA9GN zostane v tomto rozpúšťadlovom systéme na štarte. Minimálne detegovateľné množstvo N6-benzyladenínu je 200 ng. Pri nanesení 200 pg BA9GN sa nezistí detegovateľné množstvo N6-bcnzyladenínu ani iných znečisťujúcich látok. Čistota stanovená pomocou TLC je viac ako 98 % . Obsah N6-benzyladenínu je nižší ako 0,1 %.
Kyslá hydrolýza
Minerálne kyseliny premieňajú cytokinín-glukozidy na zodpovedajúce voľné zásadité cytokiníny. Ošetrenie sodnej soli BA9GN (1 mg/ml) 1 M kyselinou chlorovodíkovou pri teplote 100 °C cez noc spôsobí vytvorenie jedinej škvrny zistenej pomocou TLC, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako autentický N6-benzyladenín. Tento test potvrdzuje, že B9GN je konjugátom N6-benzyladenínu nestabilným v kyslom prostredí.
Enzymatická hydrolýza
500 pg sodnej soli BA9GN v 500 pl 50 mM nátriumfosfátového pufra s pH 7,0 sa inkubuje s 2500 jednotkami „Fishman“ beta-glukuronidázy Sigma (GUS, typ G7896) počas 18 hodín pri teplote 37 °C. Nedochádza k tvorbe N6-benzyladcnínu v množstve detegovateľnom pomocou HPLC a TLC a ani ďalšia inkubácia pri teplote miestnosti počas 3 dní neukazuje žiadnu hydrolýzu. BA9GN teda nie je citlivý na hydrolýzu pomocou beta-gluluronidázy.
Príklad ID
Sodná soľ 3-beta-D-glukopyranuronozyl-6-(3-metylbut-2-enylamino)purínu
Synonymá: sodná soľ N6-(2'-izopentenyl)adenín-N:,-beta-D-glukopyranurónové kyseliny sodná soľ N6-(2'-izopentenyl)adenín-3-glukuronidu
Skratka: sodná sol’IP3GN
Syntéza
9,48 g N6-(2-izopentenyl)adenínu a 22,1 g mety 1(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu sa zohrieva v 170 ml bezvodého Ν,Ν-dimetylformamidu na 100 °C počas 12 hodín. Väčšina Ν,Ν-dimetylformamidu sa odstráni vo vákuu na vriacom vodnom kúpeli a ohladený sirupovitý' zvyšok sa vyberie 500 ml chloroformu. Chloroformový roztok sa extrahuje vodou (3 x 500 ml) a organický extrakt sa vysuší nad bezvodým síranom sodným. Väčšina chloroformu sa odstráni vo vákuu a sirupovitý zvyšok sa chromatograficky vyčistí na silikagéli s použitím gradientu 0 až 3,75 % metanolu v chloroforme. Surový metylester peracetylovaného 1P3GN sa prekryštalizuje z metanolu za odfarbenia aktívnym uhlím, a získa sa tak 3,2 g čistého bezfarebného metylesteru peracetylovaného IP3GN, ktorý sa vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým. Časť metylesteru peracetylovaného IP3GN s hmotnosťou 1,2 g sa hydrolyzuje rozpustením v približne 1 I 75 % vodného metanolu obsahujúcom hydroxid sodný (5 %) a miešaním zmesi počas 10 minút pri teplote miestnosti. Zmes sa ochladí v ľade, opatrne neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou a vo vákuu sa zníži jej objem, takže vznikne sirupovitý produkt. Tento surový produkt sa vyčistí postupnou chromatografíou na živici XAD-2 a C18-silikagélu, čím sa získa sodná soľ 1P3GN ako bezfarebná, mikrokryštalická pevná látka ktorá sa vysuší nad chloridom vápenatým (810 mg).
Sodná soľ IP3GN je rozpustná vo vode v množstve 2 mg/ml.
Analýza
TLC (silikagél- 1-butanol/ľadová kyselina octová/voda, 12/3/5):
Pri nanesení 100 gg sodnej soli 1P3GN sa zistí jediná ostrá škvrna (Rf = 0,32) a nezistí sa detcgovatcľné množstvo N6-(2-izopentenyl)adenínu (IP) (Rf = 0,66) ani iných znečisťujúcich látok. Stanovená čistota je viac ako 99,5 % .
Hydrolýza pomocou beta-glukuronidázy (GUS)
500 gg sodnej soli IP3GN v 500 gl 500 mM nátriumfosfátového pufra s pH 7,0 sa inkubuje s 2500 jednotkami Sigma „Fishman“ beta-glukuronidázy (GUS, Sigma typ G7896) počas 12 hodín pri teplote 37 °C. Pri TLC sa prejaví zmiznutie škvrny zodpovedajúcej IP3GN zistenej v UV svetle a vznik novej škvrny zistenej v UV svetle, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako autentický N6-(2-izopentenyljadenín.
Príklad 1E
Sodná soľ 6-(3-metylbut-2-enylamino)purín-2-yl-l-tio-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny
Synonymá: sodná soľ N6-(2'-izopentenyl)adenín-2-tioglykopyranurónovej kyseliny sodná soľ N6-(2'-izopentenyl(adenín-2-tioglukuronidu
Skratka: sodná soľ IP2SGN
Syntéza:
1. 2-Benzyltio-6-purinol
1,4 ml benzylchloridu sa pridá po kvapkách za intenzívneho miešania k roztoku 2 g 2-tioxantínu v 12 ml IM hydroxidu sodného, rozriedeného vodou na objem 140 ml. Po pridaní všetkého benzylchloridu sa vytvorí krémovo sfarbená zrazenina. Reakčná zmes sa mieša ďalšiu hodinu pri teplote miestnosti, a potom sa prefiltruje. Pevná látka sa dôkladne premyje vodou a vysuší sa cez noc vo vákuu nad chloridom vápenatým a na konštantnú hmotnosť nad oxidom fosforečným. Surový produkt (2 g) sa použije v nasledujúcom kroku priamo bez prekryštalizovania.
2. 2-Benzyltio-6-chlórpurín g 2-benzyltio-6-purinolu sa preleje zmesou 20 ml oxychloridu fosforečného a 2 ml dietylanilínu. Zmes sa za miešania zahrieva do varu pod spätným chladičom počas 1 hodiny, ochladí sa a naleje na 100 g ľadu. Vytvorí sa žltá zrazenina, ktorá sa prefiltruje, dôkladne premyje vodou a vysuší vo vákuu. Surový produkt sa prekryštalizuje z metanolu a získa sa 1,2 g svetlokrémovo sfarbenej pevnej látky, ktorá sa vysuší na konštantnú hmotnosť nad oxidom fosforečným.
3. 2-Benzyltio-N6-(2-izopentenyl)adenín
Zmes 1,2 g 2-benzyltio-6-chlórpurínu a 1,04 g izopentenylamín-hydrochloridu v 25 ml 1-butanolu obsahujúcich 2,2 ml trietylamínu sa zahrieva v uzavretých skúmavkách na teplotu 110 °C počas 2 hodín. Butanol sa odstráni vo vá kuu a zmes sa trepe so 100 ml ľadovej vody. Produkt sa prefiltruje, prekryštalizuje z etanolu za odfarbenia na aktívnom uhlí a vysuší vo vákuu oxidom fosforečným. Výťažok tvorí 0,64 g 2-benzyltio-N6-(2-izopentenyl)adenínu ako bezfarebnej pevnej látky. Surový produkt sa použije priamo v nasledujúcom kroku.
4. 2-Tio-N6-(2-izopentenyl)adenín
0,64 g 2-benzyltio-N6-(2’-izopentenyl)adenínu sa rozpustí v 62,6 ml kvapalného amoniaku, čím sa získa číry žltý roztok. Pridáva sa približne 200 g sodíka po malých častiach, až modré sfarbenie vydrží počas 10 minút. Opatrne sa pridá malé množstvo pevného chloridu amónneho, aby sa odstránil nadbytok sodíka, a amoniak sa nechá odpariť na malý objem. Pridá sa 65,5 ml dietyléteru a éterový extrakt sa extrahuje 62,5 ml vody. pH vodného extraktu sa upraví na hodnotu medzi 4 a 5 kyselinou octovou, až sa vyzráža krémovo sfarbená pevná látka. Po ochladení sa produkt prefiltruje a vysuší vo vákuu nad oxidom fosforečným. Výťažok je 340 mg.
Surový 2-tio-N6-(2-izopentenyl)adenín sa premení na draselnú soľ prevedením do suspenzie vo vode a pridaním ekvimolámeho množstva hydroxidu draselného spoločne s dostatkom alkoholu na vytvorenie roztoku. Roztok sa vysuší vo vákuu a nad oxidom fosforečným.
5. N6-(2-Izopentenyl)adenín-2-tioglukopyranuronid
2,89 mmol draselnej soli 2-tio-N6-(2-izopentenyl)-adeninu sa rozpustí v bezvodom metanole a pridá sa 5 mmol metyl(2,3,4-tri-0-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu. Zmes sa mieša počas 24 hodín pri teplote miestnosti a počas tohto času sa vytvorí krémovobiela pevná látka . Reakčná zmes sa vysuší vo vákuu a hydrolyzuje pri teplote miestnosti pridaním 50 ml 5 % vodného hydroxidu sodného, čím sa získa voľný glukopyranuronid vo forme sodnej soli. Zmes sa neutralizuje opatrným pridaním koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej za vonkajšieho chladenia a získa sa bezfarebná zrazenina surovej sodnej soli IP2SGN.
Surový produkt sa vyčistí pomocou chromatografie na reverznej fáze, rekryštalizuje z etanolu a vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým a získa sa tak 150 mg bezfarebnej, amorfnej pevnej látky. Produkt je obmedzene rozpustný v 50 % vodnom alkohole.
Analýza UV: voda, pH 1 A max. voda, pH 7 voda, pH 14
Sodná soľ IP2SGN má charakteristické UV spektrum 2-tio-substituovaných cytokinínov a toto jej spektrum je veľmi podobné spektru autentického 2-metyltio-N6-(2-izopentenyl)adenínu. Analýza pomocou UV žiarenia potvrdzuje, že produkt je 2-Ns-disubstituovaný adenín. HPLC:
HPLC sa uskutoční s použitím stĺpca CI8-silikagélu 15 x 0,46 cm. Premýva sa s použitím gradientovej elúcie 0 - 60 % metanolom obsahujúcom kyselinu octovú (0,2 M) počas 30 minút pri prietoku 1 ml/min. Uskutočňuje sa detekcia UV žiarením pri 270 nm.
Sodná soľ IP2SGN má čistotu viac ako 98 % a obsahuje nedetegovateľné množstvo (menej ako 0,1 %) voľného 2-tio-N6-(2-izopentenyl)adenínu.
Hydrolýza pomocou beta-glukuronidázy (GUS)
500 gg sodnej soli IP2SGN v 500 gl 50 mM nátriumfosfátového pufra s pH 7,0 sa inkubuje s 2500 jednotkami Sigma „Fishman“ beta-glukuronidázy (GUS, Sigma typ G7896) počas 48 hodín pri teplote 37 °C. HPLC (za už u284, 241,206 nm
278, 230 (rameno) nm
283, 227 nm vedených podmienok) ukazuje čiastočné odstránenie (65 %) IP2SGN za vytvorenia piku, ktorý sa pri chromatografii v zmesi 1 : 1 správa zhodne ako 2-tio-Nč-(2-izopentenyl)adenín. Tento test potvrdzuje identitu sodnej soli IP2SGN ako konjugátu 2-tio-N6-(2-izopentenyl)adenínu a beta-D-glukurónovej kyseliny, ktorý je čiastočne citlivý na hydrolýzu pomocou GUS.
Príklad 1F
Sodná soľ 6-(3-metylbut-2-enylamino)purín-8-yl-l-tio-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny
Synonymá: sodná soľ Nô-(2'-izopentenyl)adenin-8-tioglukopyranurónovej kyseliny sodná soľ N6-(2'-izopentenyl)adenín-8-tioglukuronidu
Skratka: sodná soľ IP8SGN
Reakcia 1
6-Hydroxy-8-tiopurín g 4,5-diamino-6-hydroxypyrimidín-sulfátu a 100 g tiomočoviny sa spoločne rozotrie a zohrieva na olejovom kúpeli na teplotu 200 °C počas 30 minút. Ochladený produkt vo forme pevnej látky sa rozpustí v 500 ml horúceho 1 M hydroxidu sodného, vari sa s aktívnym uhlím a prefiltruje. Horúci filtrát sa okyslí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a horúci roztok sa prefíltruje, čím sa získa červená pevná látka, ktorá sa znovu vyzráža z horúceho zásaditého roztoku, premyje dôkladne vodou a vysuší vo vákuu pri teplote 80 °C. Výťažok je 5,28 g.
Analýza
UV:
A max, pH 1 236, 292 nm (literatúra udáva 234, 290 nm) pH 11 234, 292 nm (literatúra udáva 234, 290 nm)
Reakcia 2
6-Hydroxy-8-benzyltiopurín
5,28 g 6-hydroxy-8-tiopurínu sa prevedie do suspenzie v 78,5 ml 1 M hydroxidu sodného a zriedi na objem 400 ml vodou. Pridá sa 3,7 ml benzyl-chloridu a reakčná zmes sa intenzívne mieša počas 3 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa upraví jej pH na hodnotu 5 ľadovou kyselinou octovou a zmes sa prefíltruje. Produkt sa dôkladne premyje vodou a vysuší sa cez noc vo vákuu pri teplote 80 °C, čim sa získa 7,33 g lososovoružovej pevnej látky, ktorá sa použije bez ďalšieho čistenia.
Reakcia 3
6-Chlór-8-benzyltiopurín
K zmesi 70 ml oxychloridu fosforečného a 7,5 ml N,N-dietylanilínu sa pridá 7,33 g 6-hydroxy-8-benzyltiopurínu a zmes sa zohrieva pod spätným chladičom počas 2 hodín, čím sa získa tmavočervený produkt. Zmes sa koncentruje vo vákuu a výsledná sirupovitá zmes sa za miešania pomaly vyleje na 400 g ľadu. Zmes sa nechá stáť počas
307 nm
291 nm
298 nm minút, a potom sa silno alkalizuje studeným koncentrovaným hydroxidom draselným. Zmes sa dôkladne trituruje, aby sa rozpustila väčšina sirupovitého zvyšku, a potom sa okyslí na pH pomalým pridaním studenej koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej, pričom je stále prítomný nadbytok ľadu.
Po státí počas 1 hodiny pri teplote miestnosti sa produkt odfiltruje, dôkladne premyje vodou a suší vo vákuu pri teplote 80 °C počas 2 hodín, čím sa získa 7,8 g produktu.
Reakcia 4
8-Benzy ltio-N6-(2' -izopentenyl)adenín
Zmes 3,9 g 6-chlór-8-benzyltiopurínu a 3,42 g izopentenylamín-hydrochloridu v 1-butanole (100 ml) obsahujúcom
7,5 ml trietylamínu sa zohrieva do varu pod spätným chladičom počas 2 hodín. Väčšina 1-butanolu sa odstráni vo vákuu, reakčná zmes sa ochladí na ľade a trepe so 400 ml vody.
Po chladení cez noc sa zmes prefíltruje, čím sa získa surový produkt, ktorý sa vyčistí pomocou chromatografie na 100 g silikagélu za elúcie gradientom 0 - 2,5 % metanole v chloroforme. Chromatograficky vyčistený produkt sa prekryštalizuje z metanolu, a získa sa 1,18 g bezfarebnej, amorfnej pevnej látky.
Analýza
TLC (silikagél - 2,5 % metanol/chloroform):
Čistota je viac ako 98 %. Nezistí sa detegovateľné množstvo nečistôt.
UV:
% etanol/kyselina chlorovodíková % etanol % etanol/amoniak
Reakcia 5 8-Tio-N6-(2'-izopentenyl)adenín
1,18 g 8-benzyltio-N6-(2'-izopentenyl)adeninu sa rozpustí v 125 ml kvapalného amoniaku, čím sa získa jasnožltý roztok. Po malých čiastkach sa pridáva sodík, až modré zafarbenie vydrží počas 15 minút. Potom sa opatrne pridá malé množstvo pevného chloridu amónneho, aby sa odstránil nadbytok sodíka. Amoniak sa odparí na malý objem a k zvyšku sa pridá 125 ml éteru.
Potom, čo sa uvoľní väčšina zvyšného amoniaku, extrahuje sa éterový extrakt 2 x 65 ml vody. Vodný extrakt (s pH 12 -13) sa ochladí na ľade a pH sa upraví na hodnotu 5 ľadovou kyselinou octovou. Vyzráža sa krémovobiela pevná látka, ktorá sa prefíltruje, dôkladne premyje vodou a vysuší cez noc nad chloridom vápenatým, čím sa získa v podstate biely, veľmi ľahký prášok. Výťažok je 760 mg.
Poznámka: 8-tio-N6-(2'-izopentenyl)adenin je ľahko oxidovaný v alkalickom roztoku.
Analýza
HPLC (15 cm 18-silikagélu, metanol (0 - 80 %) ľadová kyselina octová (0,2 M), počas 30 minút, prietok 1 ml/min., detekcia UV žiarením pri 300 nm):
Ostrý, symetrický pík bez detegovateľných nečistôt. Čistota je viac ako 98 %.
UV:
% etanol/HCl % etanol
Reakcia 6
Sodná soľ IP8SGN
600 mg 8-tio-N6-(2'-izopentenyl)adenínu sa prevedie do suspenzie v 102 ml 50 mM hydroxidu draselného obsahujúcich 1 % 2-merkaptoetanolu ako antioxidačného či15
245, 307 (rameno), 315 nm
241,305, 313 nm nidla. Pridá sa dostatočné množstvo etanolu, aby sa pevná látka rozpustila. Roztok sa vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým, a potom oxidom fosforečným. Suchý produkt sa rozpustí v 100 ml bezvodého metanolu obsahujúcich 50 μΐ 2-merkaptoetanolu a pridajú sa 2 g mety 1(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu. Zmes sa mieša počas 24 hodín pri teplote miestnosti, a potom sa vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým a oxidom fosforečným. Chránený ester sa nechá hydrolyzovať počas 1 hodiny pri teplote miestnosti v 50 ml 5 % hydroxidu sodného.
Po neutralizácii koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou sa surový produkt vyčisti pomocou chromatografie na reverznej fáze a chromatografie na normálnej fáze, čím sa získa bezfarebná pevná látka, ktorá sa vysuší na konštantnú hmotnosť nad chloridom vápenatým. Výťažok je 190 mg.
Analýza sodnej soli IP8SGN
UV:
A max. etanol/pH 1 300 nm etanol/pH neutrálne 285 (výrazné rameno), 291, 301 nm etanol/pH 12 283 (rameno), 290, 300 nm
TLC (silikagél - chloroform/metanol. 1/1):
Pri nanesení 34, 68, 102 a 134 pg sodnej soli 1P8SGN sa zistí jediná ostrá škvrna a žiadne detegovatel’né znečisťujúce látky. Čistota je viac ako 99,5 % . Obsah voľnej cytokinínovej zásady 8-tio-N6-(2'-izopentenyl)adenínu je nižší ako 0,1%.
HPLC (15 cm C18-silikagélu, metanol (0 - 80 %) (ľadová kyselina octová (0,2 M), 30 minút, 1 ml, 300 nm):
Zistí sa jediný široký pík, retenčný čas 18,2 minút. Nezistí sa detegovatel’né množstvo znečisťujúcich látok. Čistota je viac ako 99,5 % .
Hydrolýza pomocou GUS
Sodná soľ IP8SGN v množstve 1 mg/ml sa inkubuje s 2500 jednotkami GUS (Sigma) v 50 mM fosfátovom pufri, s pH 7, pri teplote 37 °C počas 24 hodín. TLC (1/1, metanol/chloroform) ukazuje úplnú (presahujúcu 95 %) premenu sodnej soli IP8SGN na zlúčeninu, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako 8-tio-(2'-izopentenyl)adenín. Sodná soľ IP8SGN je teda citlivá na hydrolýzu pomocou GUS.
Príklad 1G
Sodná soľ O-beta-D-glukopyranuronozylzeatínu
Synonymá: sodná soľ zeatín-O-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny, sodná soľ zeatín-O-glukuronidu
Skratka: sodná soľ ZOGN
Syntéza
Metylester kyseliny trans-2-metyl-4-flalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-beta-D-glukopyranurónovej)
1,87 g trans-l-hydroxy-2-metyl-4-ftalimidobut-2-enu (Corse a Kuhnle, 1972, Synthesis, str. 618 - 619) a 9 g čerstvo aktivovaného uhličitanu strieborného sa prevedie do suspenzie v 300 ml bezvodého éteru obsahujúcich molekulárne sito (9 g). Po miešaní počas 30 minút pri teplote miestnosti sa pridá 3,24 g metyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu a zmes sa mieša v tme po čas 2 dní pri teplote miestnosti. Potom sa pridá ďalšia dávka (1,62 g) metyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu a zmes sa mieša počas ďalších 2 dní. Reakčná zmes sa prefiltruje, vysuší vo vákuu, čím sa získa bezfarebný sirupovitý zvyšok, ktorý sa ďalej vysuší vo vákuu nad chloridom sodným a získa sa bezfarebný penovitý produkt. Zo surového produktu sa odstránia znečisťujúce cukry pomocou chromatografie na 200 g silikagélu, elúcia sa uskutočňuje chloroformom. Výťažok čistého produktu je 2,45 g (55,4 %).
Trans-2-metyl-4-aminobut-2-enyl-beta-D-glukopyranozyluronamid
2,45 g metyl-trans-2-metyl-4-ftalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl)-beta-D-glukopyranuronátu sa rozpustí v 150 ml bezvodého metanolu, ochladí na ľade a počas 6 hodín sa nechá roztokom s teplotou ľadu prebublávať kyslík. Po odstránení metanolu vo vákuu sa surový produkt vyčistí pomocou chromatografie na 200 g celulózy a vyvinie sústavou butanol - etanol - kyselina octová - voda (8:2:1 : 3, objem/objem). Eluát sa vysuší vo vákuu a získa sa tak hnedý sirupovitý zvyšok, ktorý sa použije v kondenzačnej reakcii bez ďalšieho čistenia.
Sodná soľzeatín-O-beta-D-glukurónovej kyseliny
Sirupovitý zvyšok z predchádzajúceho kroku sa zohrieva v uzatvorenej skúmavke s 0,8 g 6-chlórpurínu a 1,5 ml trietylamínu v 25 ml metanolu na 90 °C počas 4 hodín, aby sa vytvoril amid. Na prevedenie amidu na kyselinu sa metanol odstráni vo vákuu a pridá sa 25 ml 5 % vodného hydroxidu sodného. Po miešaní pri teplote miestnosti počas 6 hodín sa zmes opatrne neutralizuje 2 M kyselinou chlorovodíkovou a vyčistí pomocou chromatografie na reverznej fáze na 100 g silikagélu, elúcia sa prevádza vodou. Surová sodná soľ ZOGN obsahujúca nezreagovaný 6-chlórpurín sa vysuší vo vákuu a vyčistí pomocou chromatografie na 50 g silikagélu, elúcia sa prevádza gradientom 0 - 100 % metanolu v chloroforme. Po odstránení rozpúšťadla sa produkt, ako amorfná pevná látka, vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým. Výťažok je 158 mg.
Analýza
UV:
A max. vodný etanol vodný etanol/HCl vodný etanol/amoniak
276 nm, 270 nm (rameno),
283 nm (rameno)
279 nm
276 nm, 270 nm (rameno),
283 nm (rameno)
TLC (silikagél-l-butanol/ľadová kyselina octová/voda, 12/3/5):
Pri nanesení 50 pg sodnej soli ZOGN sa zistí jediná škvrna (Rf 0,16) a žiadne detegovatel’né nečistoty. Ani zeatín (Rf 0,66) ani 6-chlórpurín (Rf 0,70) nie sú prítomné v detegovateľnom množstve. Celková čistota je viac ako 98 %.
HPLC (stĺpec 15 x 0,46 cm C18-silikagélu, detekcia UV žiarenia pri 270 nm):
Gradientová elúcia (0 - 100 % etanol, počas 30 minút, pri prietoku 1 ml/min.):
Sodná soľ ZOGN sa vymýva ako dosť široký pík (retenčný čas 10,0 min.) s malým množstvom anorganickej nečistoty prítomnej spolu s píkom rozpúšťadla. Celková čistotaje viac ako 97 %.
Izokratická elúcia (50 % vodný metanol, prietok 1 ml/min.):
Izokratická elúcia sa použije na stanovenie obsahu zeatínu. Sodná soľ ZOGN má retenčný čas (tR) 1,1 minútu v porovnaní s retečným časom autentického trans-zeatínu,
TLC (silikagél - chloroform/metanol/ľadová kyselina octová, 50/50/5);
Zistí sa jediná ostrá škvrna (Rf 0,68). Čistota je viac ako 98 %. o-Kumarová kyselina (Rf 0,80) je prítomná v nedetegovateľnom množstve (menej ako 0,5 %).
Príklad II 2-Hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranurónová kyselina Synonymá: o-kumaryl-beta-D-glukopyranurónová kyselina o-kumaryl-glukuronid ktorý je 2,2 minúty. Pomocou HPLC až 96 pg sodnej soli ZOGN sa zistí neprítomnosť detegovateľného množstva zeatínu. Obsah zeatínu je teda nižší ako 0,1 %, čo sa potvrdí pomocou TLC na silikagéli v sústave chloroform/metanol (9/1), Sodná soľ ZOGN zostane v tomto rozpúšťadlovom systéme na štarte, no akýkoľvek znečisťujúci zeatín sa zreteľne oddelí s Rf 0,39. Pri chromatografii 200 pg sodnej soli ZOGN nie je detegovaný žiadny zeatín. Detekčný limit pre trans-zeatín pri TLC je 200 ng, ukazuje sa teda, že znečistenie trans-zeatínom je menšie ako 0,1 % .
Enzymatická hydrolýza
Vzorka sodnej soli ZOGN sa inkubuje s beta-glukuronidázou (Sigma G9387) v 50 mM nátriumfosfátovom pufri, s pH 7,0 pri teplote 37 °C. HPLC (50 % izokratický metanol) ukazuje prakticky úplnú premenu na trans-zeatín. Identita trans-zeatinu v enzýmovom hydrolyzáte sa potvrdí tým, že sa pri chromatografii pomocou troch odlišných chromatografických systémov správa hydrolyzát v zmesi 1 : 1 zhodne ako autentický trans-zeatín.
Príklad 1H
2-Hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranurónamid Synonymá: o-kumaryl-beta-D-glukopyranurónamid o-kumaryl-glukurónamid
Skratka: CouGNamid
Syntéza g metyl-o-kumarátu a 16,8 g metyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozylbromid)uronátu sa rozotrie spoločne s 25 ml chinolínu, aby sa vytvorila homogénna pasta. Za intenzívneho miešania sa po častiach pridá 10,7 g oxidu strieborného, počas čoho sa zmes chladí na ľade. Potom sa reakčná zmes nechá stáť pri teplote miestnosti počas 3 hodín. Zmes sa extrahuje 1 1 éteru a éterový extrakt sa premyje 1 1 vody. Éterový extrakt sa vysuší nad bezvodým síranom sodným, a potom vo vákuu, až vznikne červený sirupovitý zvyšok. Surový sirupovitý zvyšok sa extrahuje 300 ml petroléteru, aby sa odstránil nezreagovaný metyl-o-kumarát, a potom sa vysuší vo vákuu, čím sa odstránia stopy petroléteru. Surový produkt sa prekryštalizuje z etanolu za odfarbenia aktívnym uhlím a získa sa 3,5 g čistého peracetylovaného metyl-2-hydroxycinnamyl-O-beta-D-glukopyranuronátu.
3,5 g peracetylovaného metylesteru sa rozpustí v 250 ml bezvodého metanolu a hydrolyzuje sa pomocou miešania počas 3 hodín pri teplote 0 °C s ďalšími 250 ml bezvodého metanolu nasýteného suchým amoniakom pri -10 °C. Amoniak a metanol sa odstránia vo vákuu a surový produkt sa prekryštalizuje z etanolu a vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým, čím sa získa 1,7 g čistého CouGNamidu ako bezfarebnej páperistej pevnej látky.
Analýza
TLC (silikagél-chloroform/metanol, 1/1):
Zistí sa jediná ostrá škvrna (Rf 0,63). Pri nanesení až 50 pg látky sa nezdetekujú žiadne znečisťujúce látky, čistota je viac ako 98 % . Obsah nečistôt je menej ako 0,5 % metyl-o-kumarátu alebo kumarínu.
Syntéza
17,8 g metyl-o-kumarátu a 20 g metyl(2,3,4-tri-O-acetyl-alfa-D-glukopyranozyIbromid)uronátu sa rozotrie spoločne s 20 ml chinolínu na rovnomernú pastu. Za intenzívneho miešania sa po častiach pridá 13 g oxidu strieborného, počas čoho sa zmes chladí na ľade. Potom sa reakčná zmes nechá stáť pri teplote miestnosti počas 3 hodín. Zmes sa extrahuje 1 1 éteru a éterový extrakt sa premyje 1 I vody. Éterový extrakt sa vysuší nad bezvodým síranom sodným, a potom vo vákuu, až vznikne sirupovitý zvyšok. Surový sirupovitý zvyšok sa extrahuje 300 ml petroléteru, aby sa odstránil nezreagovaný metyl-o-kumarát, a potom sa vysuší vo vákuu, čím sa odstránia stopy petroléteru. Surový produkt sa prekryštalizuje z etanolu za odfarbenia aktívnym uhlím a získa sa 2,9 g čistého peracetylovaného mctylCouGN.
2,9 g peracetylovaného metylesteru sa prevedie do suspenzie v 250 ml metanolu a za miešania sa pridá 250 ml 2 M hydroxidu sodného, počas čoho sa reakčná zmes chladí na ľade. Zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 1,5 hodiny a pH sa upraví na hodnotu 2,5 kyselinou chlorovodíkovou. Metanol sa odstráni vo vákuu a surový produkt sa vyčistí chromatografiou (XAD-2). Chromatografická živica sa najprv premyje vodou, aby sa odstránili anorganické soli, a produkt sa vymyje metanolom.
Po vysušení vo vákuu sa produkt prekryštalizuje z etanolu a vysuší vo vákuu nad chloridom vápenatým, čím sa získa 1,5 g čistej CouGN ako bezfarebnej, amorfnej pevnej látky.
CouGN je rozpustná v množstve 5 mg/ml vo vodnom pufri, pH 7 a v 50 % vodnom alkohole. Získa sa číry, bezfarebný roztok.
Analýza
TLC (silikagél - chloroform/metanol/ľadová kyselina octová, 50/50/1):
Zistí sa hlavná škvrna s Rf 0,12 a menším množstvom nečistoty s Rf 0,24. Čistota je viac ako 90 %. Kumarín (Rf 0,90), metyl-o-kumarát (Rf 0,91) alebo kyselina o-kumarová (Rf 0,80) sú prítomné v nedetegovateľnom množstve (menej ako 1 %). Hlavný produkt sa pri chromatografii správa zhodne ako autentická CouGN pripravená pomocou katalytickej oxidácie 2-hydroxycinnamyl-O-beta-D-glukopyranozidu.
Hydrolýza pomocou GUS mg CouGN sa rozpustí v 1 ml 50 mM nátriumfosfátového pufra s pH 7,0 a inkubuje sa s GUS (1000 jednotiek Sigma typ G5897) počas 12 hodín pri teplote 37 °C. TLC ukazuje z 93,4 % premenu na zlúčeninu, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako o-kumarová kyselina. o-Kumarová kyselina sa v priebehu niekoľkých dní pomaly premieňa (nccnzymaticky) na kumarín.
Príklad 2
Hydrolýza cytokinín-glukuronidov pomocou beta-glukuronidázy za uvoľnenia nemodifikovaných cytokinínov
Vyvinul sa test na identifikáciu tých cytokinín-glukuronidov, ktoré sa môžu hydrolyzovať pomocou beta-glukuronidázy z Escherichia coli. (Rôzne charakteristiky enzýmu beta-glukuronidázy a jeho génu sú opísané napríklad v nasledujúcich prácach: Blonco a Nemoz, Biochimie 69, str. 157 - 161, 1987; Jefferson a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zv. 83, str. 8447 - 8451, 1986; Levvy a Marsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, str. 381 - 428; US 4 721 671).
Zlúčenina, ktorá sa má testovať, sa inkubuje v 50 mM nátriumfosfátovom pufri, s pH 7,0 (všeobecne 500 pg zlúčeniny v 500 pl pufra) s beta-glukuronidázou (všeobecne Sigma typ G7896, 2500 jednotiek Sigma „Fishman“) počas 12-24 hodín pri teplote 37 °C. Prítomnosť produktov hydrolýzy sa potom stanoví s použitím HPLC a TLC.
Tabuľka 1 znázorňuje výsledky opísaného testu uskutočňovaného s radom cytokinín-beta-D-glukuronidov a jedným cytokinín-beta-D-glukuronamidom.
Tabuľka 1
Cytokinín-beta-D-glukuronidy (a cytokinín-beta-D-glukuronamid) ako substráty beta-glukuronidázy z Escherichia coli
Hydrolýza Zlúčenina
+ sodná soľ BA3GN
- BA3GNamid
- sodná soľ BA9GN
-l· sodná soľ ZOGN
sodná soľ IP3GN
4- sodná soľ IP2SGN
+ sodná soľ IP8SGN
Vzhľadom na to, že ako substráty na testovanie enzýmu GUS z Escherichia coli v transgénnych organizmoch sa používali len O-glukuronid, a že sa skôr uvádzalo (Jefferson, „The GUS reportér gene systém“, Náture, zv. 342, str. 837 - 838, 1989), že substráty beta-glukuronidázy pozostávajú z D-glukurónovej kyseliny spojenej beta-O-glykozidovou väzbou s aglykonom, je prekvapujúce, že sa zistilo, že niektoré N-glukuronidy sú tiež dobrými substrátmi tohto enzýmu. Predpokladá sa teda tiež, že tieto N- a S-glukuronidy sa dajú použiť pri testovaní enzýmu beta-glukuronidázy z Escherichia coli a rastlín, napríklad podobným spôsobom ako je test X-gluc, uvedený ďalej.
V GB 2 197 653 A je uvedené, že s použitím beta-glukuronidázového systému a nových substrátov je možná pozitívna a negatívna selekcia využívajúca aktivity GUS. Táto hypotéza sa však nikdy neskúmala a enzymatická hydrolýza týchto zlúčenín sa nikdy neukázala ako pravdepodobná ani na základe teoretických úvah týkajúcich sa chemických charakteristík substrátov pre beta-glukuronidázu z Escherichia coli. Ako je tu preukázané, nie všetky glukuronidy sú substráty pre enzým beta-glukuronidázu z Escherichia coli a neočakáva sa, že by väčšina glukuronidov bola substrátmi pre enzým GUS.
Ako spôsob na zhodnotenie, či sa môžu určité glukuronidy (vrátane prekurzorov rastlinných hormónov) hydrolyzovať enzýmom beta-glukuronidázou z Escherichia coli in vivo, sa použili odpovede v rastlinných tkanivách exprimujúcich gén beta-glukuronidázy z Escherichia coli (Jefferson, „The GUS gene fusion systém as a versatile tool for agricultural molecular biology“, abstrakt z kongresu International Congress on Genetic Manipulation in Plánt Breeding, konaného v Elsinore, Dánsko, 11. - 16. septembra 1988). Tento postup však bohužiaľ nie je uskutočniteľný kvôli prítomnosti silnej endogénnej beta-glukuronidázovej aktivity v rastlinných tkanivách (pozri napríklad ďalej uvedený príklad 3, rovnako ako článok Hodal a kol., „Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants“, určený do tlače v Plánt Science). Prítomnosť tejto endogénnej beta-glukuronidázovej aktivity tiež znamená, že s použitím postupu, ktorý opísal Jefferson, nie je možné stanoviť, či sa účinky vyvolané glukuronidom v skutočnosti prejavujú vďaka hydrolýze zlúčeniny, alebo či ich možno vysvetliť tým, že aktívny je samotný glukuronid. Aby bola zlúčenina vhodná na selekčné účely, musí sa aktivovať enzýmom GUS a musí byť vo forme glukuronidu bez podstatnej aktivity.
Opísaný test sa môže použiť na vyhľadávanie cytokinín-glukuronidov, ktoré sa môžu hydrolyzovať danou beta-glukuronidázou. Ako príklad tohto enzýmu je tu uvedená beta-glukuronidáza z Escherichia coli.
S použitím HPLC a TLC sa ďalej stanovilo, že produktom hydrolýzy pomocou GUS sú nemodifikované aktívne cytokiníny (pozri už uvedené príklady týkajúce sa prípravy a analýzy nových cytokinín-glukuronidov). Tak sa napríklad zistilo, že hydrolýza sodnej soli BA3GN beta-glukuronidázou z Escherichia coli má za následok prakticky úplne (z viac ako 99 %) odstránenie sodnej soli BA3GN za vzniku zlúčeniny, ktorá sa pri chromatografii v zmesi 1:1 správa zhodne ako autentický N6- benzyladenín. Podobne pri inkubácii sodnej soli ZOGN s beta-glukuronidázou z Escherichia coli dochádza k prakticky úplnej premene na trans-zeatín, ako bolo stanovené pomocou HPLC (s použitím 50 % izokratického metanolu) a v prípade inkubácie sodnej soli IP8SGN s beta-glukuronidázou počas 24 hodín sa zistilo pomocou TLC (1:1, metanol/chloroform), že dochádza k takmer úplnej (z viac ako z 96 %) premene IP8SGN na zlúčeninu, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako 8-tio-(2-izopentenyl)adenin.
Podobne sa môže testovaná možnosť hydrolýzy ďalších typov glukuronidov danou beta-glukuronidázou. Napríklad pri stanovení pomocou TLC sa zistilo, že pri inkubácii 5 mg o-kumaryl-beta-D-glukuronidu v 1 ml pufra počas 12 hodín s beta-glukuronidázou (Sigma typ G5897, 1000 jednotiek) dochádza v 93,4 % k premene na zlúčeninu, ktorá sa pri chromatografii správa zhodne ako o-kumarová kyselina. Inkubáciou ďalších zlúčenín uvedených v tabuľke I (s výnimkou dvoch zlúčenín, ktoré sa nesprávali ako substráty pre beta-glukuronidázu z Escherichia coli) sa dosiahli podobné výsledky, t. j. vznikli produkty hydrolýzy zodpovedajúce očakávaným výsledkom po hydrolýze beta-glukuronidázou (pozri už uvedené príklady týkajúce sa prípravy rôznych glukuronidov). Na druhej strane, BA9GN, ktorý nie je substrátom pre beta-glukuronidázu z Escherichia coli, ako je uvedené v tabuľke 1, a ktorý má po inkubácii s beta-glukuronidázou počas 18 hodín pri teplote 37 °C nedetegovateľnú (t. j. menej ako 1 %) tvorbu N6-benzyladenínu, neindukuje tvorbu výhonkov v listových terčíkoch tabaku (pozri tabuľku 2).
SK 280639 Β6
Príklad 3
Indukcia tvorby výhonkov z rastlinného tkaniva s a bez zavedeného génu beta-glukuronidázy pomocou cytokinín-glukuronidov
Uskutočňovali sa pokusy s cieľom stanoviť, či sú cytokinín-glukuronidy (rovnako ako cytokinín-glukurónamid) schopné indukovať tvorbu výhonkov in vivo v rastlinnom materiáli obsahujúcom, respektíve neobsahujúcom zavedený gén beta-glukuronidázy.
Semená z GUS-negatívnej a GUS-pozitívnej rastliny tabaku (Nicotiana iabacum „Wisconsin 38“) sa nechala vyklíčiť na substráte MSO (substrát Murashige a Skoog bez hormónov, ako ho opísali Murashige a Skoog, Phisiol. Plánt. 15: 473 - 497, 1962, ktorý sa dá dostať od firmy Sigma, USA). GUS-pozitívny rastlinný materiál obsahoval zavedený gén beta-glukuronidázy z Escherichia coli (uidA), riadený promótorom 35S z vírusu mozaiky karfiolu, ako opísali napríklad Jefferson a kol., The EMBO Joumal, zv. 6, č. 13, str. 3901 - 3907, 1987. Pôvodné transgénne GUS-pozitívnej rastliny sa získali s použitím tradičného systému negatívnej selekcie založeného na kanamycíne, ako opísali napríklad Burow a kol., Plánt Molccular Biology Reportér, zv. 8 (2), str. 124 - 139, 1990. GUS-Pozitívne semenáčiky sa identifikovali s použitím testu X-gluc, ako je opísané ďalej v tomto príklade.
Po 4 - 5 týždňoch sa vrcholové časti rastlín alebo výhonkov preniesli na nový substrát MSO a tento postup sa v prípade nutnosti opakoval. Týmto spôsobom sa rastlinný materiál (tak GUS-pozitívny, ako aj GUS-negativny) udržoval vo forme sterilných kultúr výhonkov (pozri Burow a kol., Plánt Molecular Biology Reportér, zv. 8 (2), str. 124 - 139, 1990). Z najväčších listov (3 až 5 týždňov starých) sa vyrezali terčíky a tie sa preniesli na ďalej uvedené substráty (pozri tabuľku 2). Základným použitým substrátom bol MSO s prídavkom rôznych testovaných zlúčenín v niekoľkých koncentráciách až do 250 μΜ. Použili sa malé Petriho misky (s priemerom 5 cm) obsahujúce približne 6 ml substrátu, pričom sa na každú Petriho misku umiestnili tri listové terčíky. Každý testovaný variant sa opakoval aspoň v troch opakovaniach.
S použitím opísaného postupu sa zistilo, že niektoré cytokinín-glukuronidy indukujú v rastlinných tkanivách obsahujúcich beta-glukuronidázu tvorbu výhonkov. Výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke.
Tabuľka 2
Tvorba výhonkov indukovaná cytokinín-beta-D-glukuronidmi (a cytokinín-glukurónamidom) na listových terčikoch tabaku s (GUS+) alebo bez (GUS-) zavedeného génu beta-glukuronidázy
GUS- GUS+ Zlúčenina
- - Žiadna (kontrola)
4- 4- N6-benzyladenín (kontrola)
+ 4- Zeatín (kontrola)
- - Kyselina glukurónová (kontrola)
4- 4- Sodná soľ BA3GN
4- + BA3GNamid
- - Sodná soľ BA9GN
4- + Sodná soľ ZOGN
4- + Sodná soľ IP3GN
4- 4- Sodná soľ IP2SGN
4- + Sodná soľ IP8SGN
Legenda k tabuľke 2:
+ označuje tvorbu výhonkov pri koncentráciách pod
250 pM
- znamená, že pri koncentráciách pod 250 pM nedochádza k tvorbe výhonkov (250 pM zodpovedá približne 100 mg/ml)
Z predchádzajúcej tabuľky je vidieť, že všetky cytokinín-glukuronidy, ktoré pri koncentrácii pod 250 pM indukovali tvorbu výhonkov na listových terčíkoch tabaku obsahujúcich zavedený gén beta-glukuronidázy sú s použitím podobnej koncentrácie tiež schopné indukovať tvorbu výhonkov na zodpovedajúcich listových terčíkoch neobsahujúcich zavedený gén beta-glukuronidázy. Na druhej strane cytokinín-glukuronid BA9GN, o ktorom sa zistilo, že nepôsobí ako substrát pre beta-glukuronidázu z Escherichia coli (pozri príklad 2), nespôsoboval tvorbu výhonkov ani na listových terčíkoch obsahujúcich ani neobsahujúcich zavedený gén beta-glukuronidázy. Cytokinín-glukurónamid BAGN-amid, ktorý, ako sa zistilo v príklade 2, nepôsobí ako substrát pre beta-glukuronidázu z Escherichia coli, však indukoval tvorbu výhonkov ako pri GUS-pozitívnych, tak aj pri GUS-negatívnych listových terčíkov, čo svedčí o tom, že cytokinín-glukuronamidy sú v rastlinnom tkanive premieňané na odpovedajúce cytokinin-glukurónové kyseliny. Zdá sa teda, že prekurzory cytokinin-glukuronidov môžu in vivo pôsobiť rovnakým spôsobom ako samotné cytokinín-glukuronidy.
Uvedené výsledky svedčia o tom, že vyššie rastliny, v tomto prípade tabak, majú endogénnu beta-glukuronidázovú aktivitu. Toto zistenie je v súlade s tým, čo v poslednom čase uviedli Hu a kol. (Plánt Celí Reports 9, str. 1 - 5, 1990), ktorí skúmali výskyt aktivity podobnej GUS pri 52 druhoch semenných rastlín, a s tým, čo zistili Hodal a kol. (určené do tlače v Plánt Science). Hu a kol. zistili, že druhy exprimujúce pozitívnu aktivitu podobnú GUS sú prítomné vo všetkých kľúčových skupinách krytosemenných rovnako ako pri niektorých nahosemenných. (Hu a kol. nedetegovali aktivitu GUS v tabaku, tento výsledok sa však dá vysvetliť skutočnosťou, že ich test sa uskutočňoval in vitro pri pH 7. Ako je uvedené ďalej, zdá sa, že enzým zodpovedný za prirodzenú aktivitu GUS v tabaku nie je aktívny pri pH 7, zistilo sa však, že je aktívny pri pH 4 a 5).
Tieto zistenia sú v protiklade s tým, čo je uvedené v GB 2 197 653 A, kde sa uvádza, že vyššie rastliny, vrátane tabaku, nemajú detegovateľnú aktivitu beta-glukuronidázy. GB 2 197 653 A, ktorý sa týka, okrem iného, spôsobu sledovania expresie želaného génu s použitím génu GUS, uvádza, že prítomnosť aktivity GUS vyjadruje prítomnosť želaného génu, a tak sa predpokladá, že keďže vo vyšších rastlinách sa nezistila aktivita GUS, je relatívne ľahké sledovať expresiu želaného génu s použitím génu GUS. Z už uvedených výsledkov však vyplýva, že to tak nie je a že použitie génu GUS na sledovanie prítomnosti želaného génu nie je vôbec jednoduché alebo ľahké, vzhľadom na to, že vyššie rastliny v skutočnosti majú podstatnú vnútornú (ako pozadie) aktivitu beta-glukuronidázy.
S cieľom študovať vlastnosti pozorovanej aktivity GUS v rastlinnom materiáli s a bez zavedeného génu bcta-glukuronidázy sa stanovila závislosť aktivity GUS od pH pomocou štandardného histochemického testu GUS s použitím „X-gluc“ (5-bróm-4-chlór-3-indolyl-beta-glukuronidu).
Pri teste X-gluc sa najprv pripraví testovacie médium tak, že sa rozpusti 50 mg X-gluc v roztoku obsahujúcom 25 ml 0,2 M fosfátového pufra, typicky s pH 7,0, 24 ml destilovanej vody, 0,25 ml 0,1 M K3(Fe(CN)6), 0,25 ml 0.1 M K4(Fe(CN)6) a 0,5 ml 1,0 M sodnej soli kyseliny etyléndiamintetraoctovej, pričom sa vykonáva miešanie až do rozpus tenia (približne 30 minút). Čerstvo narezané alebo formaldehydom fixované rezy (hrúbka menej ako 0,5 mm) alebo tkanivá sa potom inkubujú v médiu X-gluc pri teplote 37 °C počas niekoľkých minút až 24 hodín. Po inkubácii sa rezy premyjú v nátriumfosfátovom pufri alebo vo vode a skúmajú sa mikroskopom. Aktivita GUS sa pozoruje ako modré zafarbenie ošetreného rastlinného materiálu v mieste aktivity enzýmu (Jefferson, Plánt Molecular Biology Reportér, zv. 5, č. 4, str. 387 - 405, 1987). Na účely vynálezu sa typicky používal čas inkubácie 20 hodín. Po inkubácii sa terčíky ošetrili 96 % etanolom, aby sa odstránil chlorofyl.
Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Tabuľka 3
Závislosť aktivity GUS v listových terčíkoch tabaku s (+) a bez (-) zavedeného génu GUS od pH
pH 3 4 5 6 7 8
GUS (-) 0 4- + í) 0 0
GUS (+) 0 4- 4- + + 4-
Legenda:
žiadna reakcia v teste X-gluc + modré zafarbenie v teste X-gluc
Je vidieť, že enzým zodpovedný za beta-glukuronidázovú aktivitu prejavujúci sa ako pozadie v listových terčíkoch tabaku bez zavedeného génu beta-glukuronidázy je aktívny len v úzkom rozmedzí pH, ktoré zodpovedá vnútornému pH rastlín (okolo pH 5), zatiaľ čo beta-glukuronidáza exprimovaná zavedeným génom je aktívna v širokom rozmedzí pH od hodnoty 4 do hodnoty 8. Táto závislosť od pH vysvetľuje, prečo boli predchádzajúce snahy detegovať aktivitu GUS v rastlinách prevažne neúspešné a viedli k nesprávnym záverom (napríklad v GB 2 197 653 A), že rastliny nemajú vnútornú aktivitu GUS.
Skutočnosť, že beta-glukuronidázová aktivita zistená v rastlinnom materiáli bez zavedeného génu GUS je výsledkom hydrolýzy cytokinín-glukuronidu ako substrátu beta-glukuronidázou a nie výsledkom nešpecifickej reakcie, ktorá štiepi substrát, napríklad neenzymatickej kyslej hydrolýzy glukuronidov (o ktorých je známe, že sú štiepené pri nízkych hodnotách pH), sa preukázala testovaním účinku inhibítorov rôznych enzýmov pri pH 5 v geneticky netransformovanom rastlinnom materiáli (t. j. rastlinnom materiáli len s prirodzenou aktivitou GUS). Testovanie sa uskutočňovalo s použitím už opísaného testu X-gluc pri pH 5,0 počas 20 hodín.
Tabuľka 4
Test inhibítorov pri pH = 5,0 pri netransťormovanom materiáli
Koncentrácia (mM)
0 o,l 1 10 50
sacharo-1,4-laktón + + 0 0 0
glukonolaktón 4- + + 4- 4-
UPD-glukuronid + + 4- 4- 4-
kyselina glukurónová 4- + 4- 0 0
galaktóza 4- 4- 4- 4- 4-
metylumbelliferyl-glukuronid 4- + + + 0
kyselina etyléndiamíntetraoctová 4- 4- 4- 4- 4-
Legenda:
žiadna reakcia, t. j. celkom biely listový terčik + modré zafarbenie s X-gluc
Šesť testovaných inhibítorov malo nasledujúce účinky:
Sacharo-l,4-laktón je inhibítor, ktorý je špecifický pre beta-glukuronidázy (inými slovami, inhibuje len beta-glukuronidázy a inhibuje všetky beta-glukuronidázy). Všeobecne je uznávané, že aktivita GUS, ktorá sa môže inhibovať touto zlúčeninou, je výsledkom aktivity enzýmu beta-glukuronidázy.
Glukonolaktón je inhibítorom beta-glukozidáz. Zodpovedá sacharo-l,4-laktónu, s tým rozdielom, že je špecifický pre beta-glukuronidázy.
UPD-glukuronid je substrátom pre UPD-glukuronid-transferázy.
Kyselina glukurónová je produktom každej beta-glukuronidázovej reakcie, a teda je produktom inhibujúcim beta-glukuronidázy a iné enzýmy tvoriace kyselinu glukuronovú.
Galaktóza je inhibítorom reakcií závislých od UDP-glukuronid-transferázy.
Metylumbelliferyl-glukuronid je substrátom pre všetky doposiaľ preskúmané beta-glukuronidázy, aje teda kompetitívnym inhibítorom enzýmov GUS.
Pretože sa tiež zistilo, že kyselina etyléndiamíntetraoctová (ktorá inhibuje UDP-glukuronid-transferázy) nemá žiadny vplyv, je nepravdepodobné, že by sa tieto transferázy podieľali na pozorovanej aktivite GUS. Uvedená tabuľka znázorňuje, žc zlúčeniny, ktoré by mali inhibovať transferázu nemali žiadny účinok ani pri veľmi vysokých koncentráciách. Ďalej je z tabuľky možno vidieť, že glukonolaktón nemal žiadny inhibičný účinok, a je teda nepravdepodobné, že aktivita GUS súvisí s beta-glukozidázovou aktivitou.
Ďalej je možné vidieť, že inhibítor špecifický pre GUS, sacharo-l,4-laktón, je silným inhibítorom, že kyselina glukurónová (produkt inhibujúci beta-glukuronidázu) je stredne silným inhibítorom a že metylumbelliferyl-glukuronid (substrát GUS, a teda kompetitívny substrát s X-gluc, pokiaľ je za hydrolýzu X-gluc zodpovedný enzým beta-glukuronidáza) je slabým inhibítorom. Aktivita GUS v tabaku teda spĺňa všetky nutné kritéria, aby sa klasifikovala ako výsledok enzýmu beta-glukuronidázy. Môže sa teda utvoriť záver, že rastliny obsahujú enzým beta-glukuronidázu.
Uskutočnil sa zodpovedajúci rad pokusov s cieľom stanoviť, či bol účinok inhibítorov dostatočne rýchly na umožnenie inhibície enzýmu. V týchto pokusoch sa rastlinný materiál preinkuboval v testovaných zlúčeninách (inhibítoroch) 24 hodín pred testom X-gluc s rovnakými testovanými zlúčeninami. Získané výsledky boli zhodné s výsledkami bez preinkubácie, čo svedčí o tom, že inhibítory prenikajú do rastlinného tkaniva dostatočne rýchlo, aby spôsobovali inhibíciu v teste X-gluc predtým, ako môže dôjsť k modrému zafarbeniu.
Podobné výsledky sa získali ďalším výskumom výskytu aktivity GUS v rastlinách. V tomto prípade sa skúmala závislosť histologickej reakcie GUS od pH pri mnohých rastlinných druhoch pri hodnotách pH medzi 3 a 8, tak bez, ako aj s GUS-špecifickým inhibítorom, sacharo-1,4-laktónom.
Použitým testom je už opísaný test X-gluc, ktorý sa uskutočňuje pri teplote 37 °C počas 20 hodín. Listy sa rozrezali (sterilnými žiletkami), takže sa každý z listov testoval pri niekoľkých odlišných hodnotách pH.
Ako ukazuje nasledujúca tabuľka, tento výskum potvrdil, žc rastliny skutočne majú prirodzenú GUS aktivitu, že táto aktivita je výsledkom enzymatickej reakcie (v prítomnosti inhibítora špecifického pre GUS nedochádzalo k žiadnej reakcii) a že je tento enzým primáme aktívny pri hodnotách pH okolo 4-5.
Tabuľka 5
Histologická reakcia GUS pri rôznych hodnotách pH pH počas testu 3 4 sacharo-1,4-laktón (mM) Rastlinný druh Cukrová repa, divoký typ Cukrová repa, transgénna 1) Cukrová repa, transgénna 2) Pšenica Pšenica (albino) Repka olejná Tabak Tabak, transgénny 1) Tabak, transgénny 2) Smrek sitka Rebarbora 3) Hrach 3) Oxalis 3) Peľ Chenopodiumquinoaímrítk)
5 6 7 8 3-8
0 0 0 0 10
+ + (+) 0 0
+ + + + (+)
+ (+) 0 0
+ 0 0 0
+ + 0 0 0
(+) (+) 0 0
+ 0 0 0 0
+ + + + 0
+ 0 0 0 0
4- 0 0 0 0
+ + + + 0
+ 0 0 0 0
n n (+) n 0
n 0 + n n
++ ++ ++
0+
0+ ++ o+ o+ o+ o+ nn
0+ nn nn
Legenda:
1. listové tkanivo exprimujúce gén GUS z Escherichia coli
2. transgénne listové tkanivo obsahujúce len gén rezistencie proti kanamycínu (NPT), bez zavedeného génu GUS
3. tkanivo stonky alebo listovej stopky
4. tkanivo embryogénneho kalusu + modré zafarbenie (+) nízka frekvencia aktivity GUS (slabomodré zafarbenie) žiadna reakcia n nestanovené
Skutočnosť, že rastliny majú všeobecnú vnútornú aktivitu GUS, umožňuje použiť gén kódujúceho glukuronid-permeázu na pozitívnu selekciu bez použitia ďalšieho selekčného génu tým, že sa využije výhoda zvýšeného prijmú glukuronidu transformovanými bunkami. Zistilo sa, že príjem glukuronidov do rastlinných buniek cez plazmatické membrány nie je ľahký. Ak sa do bunky zavedie gén glukuronid-permeázy, môžu glukuronidy ľahšie prejsť cez plazmatickú membránu a preniknúť do bunky. Glukuronidy sú potom v transformovaných bunkách dostupné na štiepenie pomocou vnútorného enzýmu GUS. Naproti tomu, pre netransformované bunky nebude daný glukuronid dostupný, čim sa dosiahne pozitívny selekčný efekt. Podobne sa môže pozitívna selekcia uskutočňovať s použitím ďalších permeáz a ďalších typov zlúčenín, ktoré sú buď aktivované v transformovaných bunkách vnútorným enzýmom, alebo sú inak biologicky účinné v transformovaných bunkách, do ktorých sú transportované.
Príklad 4
Cytokinín-glukuronidy sú stabilné a neaktívne
Účinok sodnej soli cytokinin-glukuronidu BA3GN je blokovaný, pokiaľ je v rastlinnom tkanive obsahujúcom tento cytokinín-glukuronid inhibovaná aktivita GUS. Inými slovami, samotný cytokinín-glukuronid je neaktívny. Ďalej sa ukázalo, že je tento cytokinín-glukuronid stabilný v rastovom médiu rovnako ako v rastlinnom tkanive, pokiaľ nie je prítomná beta-glukuronidáza, čo je doložené skutočnosťou, že špecifický inhibítor GUS, sacharo-l,4-Iaktón (SL), silno inhibuje tvorbu výhonkov indukovanú sodnou soľou cytokinin-glukuronidu BA3GN, ale len slabo inhibuje tvorbu výhonkov indukovanú voľným cytokinínom N* 1 2 3 4 * 6-benzyladenínom (s použitím základného postupu opísaného v príklade 3):
Tabuľka 6
Inhibícia tvorby výhonkov indukovanej N6-benzyladenínom 0,5 mg/1) a sodnou soľou BA3GN (15 mg/1) pomocou sacharo-l,4-laktónu (SL)
Počet a relatívny pomer regenerovaných výhonkov na listový terčík
SL (mM) BA sodná soľ BA3GN
0 4,3 100% 5,6 100%
16 3,6 84% 1,4 25%
Z porovnania výsledkov v tabuľke s výsledkami v tabuľke 2 je vidieť, že sodná soľ BA3GN, ktorá indukuje tvorbu výhonkov tak pri GUS-pozitívnych, ako aj pri GUS-negatívnych listových terčíkov, neindukuje tvorbu výhonkov na zodpovedajúcich listových terčíkoch v prítomnosti inhibítora špecifického pre beta-glukuronidázu, sacharo-1,4-laktónu.
Sacharo-1,4-laktón nie je pri pH používanom v tomto príklade stabilný, vytvára sa rovnováha medzi sacharo-1,4-laktónom a kyselinou cukrovou (SA). Tá rovnováha sa dosahuje pomaly, a premena sacharo-1,4-laktónu na kyselinu cukrovú je sprevádzaná poklesom pH. pH sa preto musí počas jedného týždňa pred použitím sacharo-1,4-laktónu niekoľkokrát upravovať, až sa pH v substráte obsahujúcom sacharo-l,4-laktón stabilizuje.
Skutočnosť, že sú cytokinín-glukuronidy stabilné a neaktívne, pokiaľ nie sú v prítomnosti beta-glukuronidázy, je ďalej doložená tým, že BA3GN, ktorý sa nemôže hydrolyzovať beta-glukuronidázou, nemôže indukovať tvorbu výhonkov v rastlinnom materiáli vykazujúcom beta-glukuronidázovú aktivitu (pozri príklady 2 a 3).
Je dôležité, že cytokinín-glukuronidy sú neaktívne a stabilné v substrátoch, ktoré neobsahujú enzým beta-glukuronidázu, pretože táto je stabilita nevyhnutná na správne fungovanie systému pozitívnej selekcie, ktorý ich využíva.
Nie pri všetkých derivátoch glukurónovej kyseliny však môže byť očakávaná stabilita. Napríklad glukuronidy v esterovej forme nebudú stabilné v rastlinnom tkanive, ktoré obsahuje nešpecifické esterázy. To znamená, že cytokinín-glukuronidy pripravené a používané podľa predloženého vynálezu (beta-Ď-glukuronidy spojené s aglykonom cez glykozidový atóm O, S a N) spĺňajú predpoklad stability. Na druhej strane, pri zlúčeninách s inými typmi glukuronidových väzieb, napríklad pri beta-D-glukuronidoch v amidovej alebo esterovej forme, sa neočakáva ich selektívna hydrolýza pomocou beta-glukuronidáz vďaka výskytu nešpecifikovaných esteráz a amidáz v rastlinách.
V súvislosti s príkladom 3 sa teda zistilo, že testované cytokinín-glukuronidy, ktoré, ako je uvedené v tomto príklade, samé osebe nemajú cytokinínovú aktivitu, sa in vivo štiepia účinkom beta-glukuronidázy, buď vo forme endogénnej beta-glukuronidázy pôsobiacej ako pozadie, alebo v dôsledku zavedeného génu beta-glukuronidázy, pričom sa uvoľňuje voľný cytokinin.
Príklad 5
Indukcia tvorby výhonkov z rastlinného tkaniva obsahujúceho zavedený gén beta-glukuronidázy s použitím sterol-glukuronidov
Zistilo sa, že ďalšie glukuronidy, vrátane glukuronidov sterolov, glycyrrizovej kyseliny a hydroxychinolínu, sú hydrolyzované beta-glukuronidázou a majú za následok tvorbu výhonkov na modifikovaných substrátoch, na ktorých sú produkty hydrolýzy potrebné na tvorbu výhonkov, čo je uvedené v príkladoch 5 a 6.
Uskutočnili sa pokusy na stanovenie účinku dvoch sterol-glukuronidov, beta-sitosteryl-beta-D-glukuronidu (SG) a cholesteryl-beta-D-glukuronidu (CG) na indukciu tvorbu výhonkov, pokiaľ je v tkanivách inhibovaná syntéza sterolov. Základné použité postupy v podstate zodpovedajú postupom opísaným v príklade 3. Okrem jedného alebo oboch už spomenutých sterol-glukuronidov však substrát obsahoval tridemorf (0, 1 mM) a 5 mg/1 sodnej soli BA3GN. Počet výhonkov sa zisťoval po 30 dňoch.
Tridemorf (4-tridecyl-2,6-dimetylmorfolín) je fungicíd, ktorý inhibuje syntézu sterolov a podobných zlúčenín. Pokiaľ nie sú rastlinným tkanivám dodávané stcroly, má tridemorf inhibičný účinok na regeneráciu výhonkov (hoci nemá smrtiaci účinok na cxplantáty). V neprítomnosti voľných sterolov je teda účinne zabránené tvorbe výhonkov.
Cholesteryl-beta-D-glukuronid (CG) sa získal od firmy Sigma, USA, a beta-sitosteryl-beta-D-glukuronid (SG) sa syntetizoval postupom, ktorý opísali Ando a kol. v J. Antibiotics 73, str. 408, 1970.
Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Tabuľka 7
Počet regenerovaných výhonkov na listový terčík tabaku na substráte doplnenom tridemorfom (0,1 mM) a sodnou soľou BA3GN (5 mM)
Zlúčenina Koncentrácia (mg/1)
Sitosteryl-beta-D-glukuronid 0 0 12,5 12,5
Cholesteryl-beta-D-glukuronid 0 50 0 50
Výhonkov na listový terčík 0,3 0,3 2,8 4,0
Z predchádzajúcej tabuľky vyplýva, že sitosteryl-beta-D-glukuronid je schopný pôsobiť proti inhibičnému účinku tridemorfu na tvorbu výhonkov a že kombinácia sitosteryl-beta-D-glukuronidu a cholesteryl-beta-D-glukuronidu spôsobuje väčšiu tvorbu výhonkov. Tak je pozitívna selekcia podľa vynálezu pomocou zavedeného génu beta-glukuronidázy možná s použitím napríklad jedného alebo oboch uvedených sterol-glukuronidov spoločne so zlúčeninou inhibujúcu tvorbu výhonkov, ako je tridemorf. Tieto výsledky svedčia o tom, že na pozitívnu selekciu z tkaniva obsahujúceho zavedený gén beta-glukuronidázy sa môžu použiť tiež ďalšie steroly a sterolom podobné zlúčeniny.
Výhodou použitia týchto veľmi málo rozpustných zlúčenín na pozitívnu selekciu je skutočnosť, že ich účinok bude pravdepodobne veľmi lokálny, pretože tieto zlúčeniny nedifundujú z bunky do bunky po odštiepení hydrofilného glukuronidového zvyšku enzýmom beta-glukuronidázou. Inými slovami, tieto zlúčeniny sa môžu použiť na zabránenie „cross feedingu“ počas selekčného procesu.
Tento pokus ďalej naznačuje, že proti inhibičnému účinku tridemorfu, a teda tiež ostatných zlúčenín, ktoré inhibujú syntézu sterolov, na tvorbu výhonkov, sa dá pôsobiť pridaním sterolov a derivátov sterolov k substrátu, čím sa môže vytvoriť selekčný systém s už spomenutými výhoda mi, založený na poskytovaní sterolov a sterolom podobných zlúčenín transgénnym bunkám.
Príklad 6
Indukcia tvorby výhonkov z rastlinného tkaniva s a bez zavedeného génu beta-glukuronidázy s použitím sitosteryl-beta-D-glukuronidu
Uskutočnil sa podobný pokus ako v príklade 5 na transformovaných aj na netransformovaných listových terčíkoch tabaku s použitím sitosteryl-bcta-D-glukuronidu a buď N6-benzyladenínu, alebo sodnej soli BA3GN.
Použité postupy boli v podstate také, ako v príklade 5. V tomto pokuse sa tridemorf pridal k substrátu v koncentrácii 0,1 mM a sitosteryl-beta-D-glukuronid sa pridal v koncentrácii 121 mg/1. Okrem toho substrát obsahoval buď 1,88 mg/1 sodnej soli BA3GN, alebo 0,1 mg/1 N6-benzyladenínu. Počet výhonkov sa zisťoval po 40 dňoch.
Získalo sa nasledujúce množstvo výhonkov:
Počet regenerovaných výhonkov na listový terčík
N6-benzyl- Sodná soľ
Zlúčenina adenín BA3GN
GUS+ GUS- GUS+ GUS-
Sitosteryl-beta-D-glukuronid
Ukázalo sa, že rovnako ako v príklade 5, prítomnosť sitostryl-beta-D-glukuronidu pôsobila proti inhibičnému účinku tridemorfu. Navyše, keď sa sitosteryl-beta-D-glukuronid a tridemorf použijú spolu so sodnou soľou BA3GN, dosiahla sa selektívna tvorba výhonkov na GUS-pozitívnych listových terčíkoch, zatiaľ čo na GUS-negatívnych listových terčíkoch na substráte obsahujúcom sodnú soľ BA3GN v podstate nedochádzalo k tvorbe výhonkov.
Tieto výsledky svedčia tiež o tom, že použitie kombinácie odlišných glukuronidov (tu BA3GN a sitosteryl-beta-D-glukuronidu miesto N6-benzyladenínu a sitosteryl-beta-D-glukuronidu) môže zlepšiť selektívnu odpoveď pri transgénnych tkanivách.
Pretože steroly a steroidy sú tiež dôležitými regulátormi rastu v živočíšnych bunkách, môžu sa zodpovedajúce selekčné postupy použiť tiež na selekciu živočíšnych buniek, ktoré exprimujú beta-glukuronidázu.
Príklad 7 „Odzbrojené“ kmene Agrobacteria produkujú cytokiníny
Zistilo sa, že niektoré kmene Agrobacteria indukujú tvorbu výhonkov vďaka produkcii látok indukujúcich tvorbu výhonkov počas kokultivácie. Ak sa má na selekciu geneticky transformovaných buniek použiť hydrolýza cytokinín-glukuronidov pomocou GUS, treba sa takýmto kmeňom vyhnúť, pretože tieto kmene môžu samé indukovať tvorbu výhonkov, a tým prekážať selekčnému procesu.
Ako príklad sú v nasledujúcej tabuľke znázornené výsledky pokusu s dvomi odlišnými kmeňmi Agrobacteria, z ktorých jeden indukuje tvorbu výhonkov na listových terčíkoch tabaku po kokultivácii.
Použité postupy zodpovedajú v podstate postupom opísaným v príklade 13, ale po kokultivácii sa listové terčíky preniesli na substrát MSO bez hormónov obsahujúci 300 mg/1 cefotaxímu a 300 mg/1 karbenicillínu.
Počet regenerovaných výhonkov sa zisťoval 4 týždne po kokultivácii.
Tabuľka 8
Indukcia tvorby výhonkov na listových terčíkoch tabaku na substráte bez hormónov po kokultivácii s „odzbrojeným“ Agrobacteriom
kmeň Agrobacteria Plazmid Gény v T-DNA Počet výhonkov na listový terčík
1. C58X T37 GUS a NPT 9,3
2. LBA4404X PAL4404 GUS a NPT 0
3. C58Y T37 Žiadny 4,8
4. LBA4404Y PAL4404 Žiadny 0
5. Žiadny - - 0
Je vidieť, že schopnosti niektorých kmeňov Agrobacteria indukovať tvorbu výhonkov nezávisí od génov obsiahnutých v T-DNA. To znamená, že za indukciu tvorby výhonkov sú zodpovedné gény zvonku oblasti T-DNA.
Gén zvonku oblasti T-DNA zodpovedný za tvorbu cytokinínov bol pomenovaný tzs (Morris R. O., Ann. Rev. Plánt Physiol. 37, str. 509 - 538, 1986). Kmeň C58 obsahuje gén tzs, neprenosný gén, ktorý kóduje syntézu zeatínu počas kokultivácie. Kmeň LBA4404 neobsahuje gén tzs. Skutočnosť, že kmene indukujúce tvorbu výhonkov obsahujú plazmid obsahujúci gén tzs svedčí o tom, že tento gén môže byť zodpovedný za schopnosť indukovať tvorbu výhonkov, ktorá bola pozorovaná v týchto pokusoch, a že je kmeňom Agrobacteria obsahujúcim gén tzs potrebné sa vyhnúť v prípade selekčných systémov založených na cytokiníne. Normálne je potrebné vyhnúť sa tiež ľubovoľným ďalším kmeňom Agrobacteria, ktoré indukujú tvorbu výhonkov.
Príklad 8
Pozitívna selekcia transgénnych výhonkov s použitím cytokinín-glukuronidu sodnej soli BA3GN
Geneticky transformované výhonky sa môžu selektovať pomocou cytokinín-glukuronidov
Uskutočnil sa rad pokusov testujúcich efektivitu systému pozitívnej selekcie s použitím cytokinin-glukuronidu sodnej soli BA3GN v koncentráciách 7,5 a 15 mg/1. Pokusy sa uskutočňovali na listových terčíkoch divého typu tabaku s použitím dvoch odlišných kmeňov Agrobacteria, rovnako ako rôznych kokultivačných substrátov. Použil sa spôsob transformácie, je opísaný v príklade 13, s tou výnimkou, že sa miesto MSO použil substrát Gamborg B5 (Gamborg a kol., Exp. Celí Res. 50: 151 - 158, 1968; dá sa získať od firmy Sigma, USA). Nasledujúce výsledky sú uvádzané ako priemerné hodnoty získané z dvoch nezávislých pokusov, pričom v oboch z nich sa každý typ ošetrenia uskutočnil na 27 listových terčíkoch.
Tabuľka 9
Pozitívna selekcia geneticky transformovaných výhonkov s použitím cytokinin-glukuronidu sodnej soli BA3GN
7,5 mg/1 sodnej soli BA3GN
Kmeň Agrobacteria Kokultivačný substrát GUS+ výhonkov na listový terčík %GUS+ výhonkov z celkového počtu výhonkov
BS10 B5 0,1 6,6
BS10 B5 + ammon. 0,02 0,7
BS10 B5 + ammon. + SL 0,3 6,1
BS10 priemer o,l 4,4
LDH1 B5 0,2 7,8
LDH1 B5 + ammon. 0,2 5,3
LDH1 B5 + ammon. + SL 0,2 4,7
LDH1 priemer 0,2 5,9
Oba priemer 0,2 5,1
BS10 B5 0,3 6,0
BS10 B5 + ammon. 0,4 8,7
BS10 B5 + ammon. + SL 0,3 5,5
BS10 priemer 0,3 6,7
LDH1 B5 0,4 9,0
LDH1 B5 + ammon. 0,3 7,6
LDH1 B5 + ammon. + SL 0,3 7,7
LDH1 priemer 0,3 8,1
Oba priemer 0,3 7,4
Legenda:
B5 Substrát Gamborg B5, ph 5,4
Ammon, Kokultivačný substrát s dusičnanom amónnym (75 mM)
SL Kokultivačný substrát s kyselinou cukrovou (25 mM) + sacharo-1,4-laktónom (25 mM) zo stabilizovaného roztoku
GUS + Výhonky exprimujúce aktivitu GUS pri skúmaní pri pH 7, ako je opísané v príklade 3
Kmeň BS10 zavádza gén GUS riadený modifikovaným promótorom 35S, ktorý nie je aktívny v Agrobacteriu, ako opísali Janssen a Gardner v Plánt Molecular biology, 14, str. 61 - 72, 1989. Kmeň LDH1 zavádza gén GUS riadený nemodifikovaným promótorom 35S.
Výsledky uvedené v tabuľke 9 ukazujú, že je možná pozitívna selekcia transgénnych výhonkov exprimujúcich zavedený gén beta-glukuronidázy s použitím sodnej soli BA3GN. Tieto výsledky sú veľmi významné a boli neočakávané, pretože sa zistilo, ako je opísané v príklade 3, že cytokinín-glukuronidy sú schopné indukovať tvorbu výhonkov na listových terčíkoch, ktoré neobsahujú zavedený gen bcta-glukuronidázy. Zdá sa, že odlišné ošetrenia počas kokultivácie nemajú na selekciu podstatný vplyv.
Uvedené výsledky svedčia rovnako o tom, že použitie kmeňa Agrobacteria s aktívnym génom beta-glukuronidázy (kmeň LDH1 exprimuje v baktériách aktivitu GUS) neovplyvňuje v porovnaní s kmeňom, ktorý nemá aktívny gén beta-glukuronidázy (kmeň BS10 neexprimuje v baktériách aktivitu GUS), transformačný systém.
Príklad 9
Selekcia geneticky transformovaných výhonkov s použitím cytokinin-glukuronidu kyseliny zeatín-O-beta-glukurónovej
S použitím v podstate rovnakého postupu ako v príklade 13 sa pripravili a selektovali transgénne výhonky tabaku s použitím cytokinin-glukuronidu kyseliny zeatín-O-beta-glukurónovcj (ZOGN) ako činidla pozitívnej selekcie.
Kokultivácia sa prevádzala počas 3 dní, hustota inokula zodpovedala hodnote OD 1,5 pri 660 nm. Substrátom použitým po kokultivácii bol substrát MSO obsahujúci 300 mg/1 karbenicillínu, 300 mg/1 cefotaxímu a 0,1 mg/1 kyseliny indoloctovej (IAA). Po troch týždňoch sa ušku- Sedem týždňov po kokultivácii sa výhonky preniesli na točnila subkultivácia do rovnakého substrátu, ale bez kyse- substrát MSO obsahujúci 300 mg/1 kanamycín-sulfátu, liny indoloctovej. pH používané pri všetkých substrátoch 350 mg/1 cefotaxímu, 350 mg/1 karbcnicillínu, 0,1 mg/1 kybolo 8,0. Na každé ošetrenie sa použilo 18 listových terči- seliny indol- octovej a 10 mg/1 6-(m-hydroxybenzylamikov. nojpurínu (OH-BA) a umiestnili sa do teploty 25 °C. 6-(MPäť týždňov po kokultivácii sa výhonky preniesli na -hydroxybenzylamino)purín sa môže pripraviť, ako opísali substrát MSO obsahujúci 200 mg/1 kanamycín-sulfátu, Kaminek a kol. (Plánt Growth Reg. 6, str. 113 - 120, 1987).
mM kyseliny cukrovej, 300 mg/1 cefotaxímu a 300 mg/1 Po šiestich týždňoch sa na substráte obsahujúcom kakarbenicillínu, pH 8,0. Kyselina cukrová, inhibítor enzý- namycín zistil počet zelených výhonkov. Rezistencia proti mov beta-glukuronidáz, sa pridala, aby zastavila ďalšiu kanamycinu svedčí o tom, že je výhonok transgénny, lebo premenu zeatín-glukuronidu na zeatín. Spoločne s génom spoločne s génom beta-glukuronidázy sa preniesol gén beta-glukuronidázy sa preniesol gén NPT spôsobujúci re- NPT spôsobujúci rezistenciu proti kanamycinu. Na danom zistenciu proti kanamycinu. Netransformované výhonky substráte neprežili žiadne netransformované výhonky (ne(negativne kontroly) prežili, ale rast týchto výhonkov sa na gativne kontroly), zatiaľ čo všetky transformované výhontomto substráte spomalil, zatiaľ čo všetky transformované ky (pozitívne kontroly), obsahujúce aktívny gén NPT, prevýhonky (pozitívne kontroly) obsahujúce aktívny gén NPT žili.
prežili bez akéhokoľvek spomalenia rastu. Percento výhonkov rezistentných proti kanamycinu z týždne po poslednej subkultivácii (8 týždňov po ko- celkového počtu regenerovaných výhonkov sa vypočítalo kultivácii) sa zistil počet výhonkov a podiel GUS-po- delením počtu zelených výhonkov, ktoré prežili na subzitívnych výhonkov v celkovom počte výhonkov sa stano- stráte obsahujúcom kanamycín, počtom výhonkov prenesevil pomocou testu X-gluc (príklad 3). Výsledky sú nasle- ných na substrát obsahujúci kanamycín. Výsledky sú uvedujúce: dené v nasledujúcej tabuľke:
Tabuľka 10
Pozitívna selekcia geneticky transformovaných výhonkov s použitím sodnej soli ZOGN
ZOGN mg/1 GUS-pozitívnych výhonkov na listový terčík % GUS-pozitívnych výhonkov z celkového počtu výhonkov
0,07 0,3 18,5
1,0 2,6 40,3
15,0 0,2 5,1
0,07 + SL* 0 0
Legenda:
* SL sacharo-l,4-laktón (2 mM)
Výsledky v tabuľke ukazujú, že sa dosiahla úspešná pozitívna selekcia geneticky transformovaných výhonkov s použitím ZOGN. Indukcia tvorby transgénnych výhonkov bola inhibovaná v prípade, že sa do substrátu pridal špecifický inhibítor beta-glukuronidáz, sacharo-l,4-laktón, čo svedčí o tom, že rast transgénnych výhonkov, a teda úspešnosť pozitívnej selekcie, je závislý od premeny ZOGN na zeatín, ktorá je katalyzovaná beta-glukuronidázou.
Príklad 10
Selekcia geneticky transformovaných výhonkov použitím kyseliny zeatín-O-beta-glukurónovej pri rôznych teplotách
Závislosť systému pozitívnej selekcie používajúceho cytokinín-glukuronidy od teploty sa skúmala s použitím kyseliny zeatín-O-beta-glukurónovej (ZOGN) ako činidla pozitívnej selekcie pri teplotách 25 °C, 30 °C a 35 °C.
Transgénne výhonky tabaku sa pripravili v podstate rovnakým postupom ako v príklade 13. Kokultivácia sa uskutočňovala počas 3 dní, hustota inokula zodpovedala hodnote OD 1,5 pri 660 nm. Substrátom použitým po kokultivácii bol substrát MSO obsahujúci 10 mg/1 2-(2-hydroxy-etylamino)-6-benzylamino-9-metylpurínu (9-mct), 350 mg/1 karbenicillínu, 350 mg/1 cefotaxímu a 0,1 mg/1 kyseliny indoloctovej (IAA) a sodnú soľ ZOGN v uvedenom množstve. 9-Met (získaný od Apex Organics Ltd., Veľká Británia) sa pridal, aby inhiboval glykozyláciu zeatínu a derivátov zeatínu. Na každé ošetrenie sa použilo 18 listových terčíkov.
Tabuľka 11
Pozitívna selekcia geneticky transformovaných výhonkov s použitím sodnej soli ZOGN pri rôznych teplotách
T °C ZOGN mg/1 Počet kanamycín-rezistentných výhonkov na listový terčík % kanamycín-rezistentných výhonkov z celkového počtu výhonkov
25 1 0,3 4,3
30 1 1,3 14,8
35 1 0,2 26,7
25 15 0 0
30 15 2,4 26,2
35 15 0,2 18,2
Test opísaný v tomto príklade sa uskutočnil s pripojeným spoločne prenášaným génom. To znamená, že na selekciu sa použil gén beta-glukuronidázy, zatiaľ čo sa testovala rezistencia, ktorá je následkom zavedenia spoločne prenášaného génu NPT (génu rezistencie proti kanamycínu).
Uvedené výsledky ukazujú, že keď sa na selekciu používa gén beta-glukuronidázy, okrem génu beta-glukuronidázy sa exprimuje tiež spoločne prenášaný gén. Okrem toho je vidieť, že selekcia pri zvýšených teplotách (t. j. okolo 30 - 35 °C) zvyšuje počet vybraných výhonkov z celkového počtu regenerovaných výhonkov.
Pri uskutočňovaní testu X-gluc pri rôznych teplotách sa v súvislosti s vynálezom pozorovalo, že vnútorná beta-glukorinidázová aktivita vyskytujúca sa v rastlinách je pri vysokých teplotách inhibovaná, zatiaľ čo aktivita zavedenej beta-glukuronidázy nie je ovplyvnená. Tak sa zistilo, že sa aktivita vnútornej beta-glukuronidázy postupne znižuje so zvyšujúcou sa teplotou až do približne 60 °C a pri tejto teplote nebola pozorovaná v podstate žiadna aktivita vnútornej beta-glukuronidázy (ako sa stanovilo pomocou testu X-gluc). To môže lepšie vysvetliť výsledky selekčného procesu pri zvýšených teplotách.
Príklad 11
Pozitívna selekcia v porovnaní a v kombinácii s negatívnou selekciou
SK 280639 Β6
Ukázalo sa, že tu opísaný systém pozitívnej selekcie je veľmi účinný a výhodný v porovnaní s tradičnou negatívnou selekciou založenou na kanamycíne. Dobré výsledky sa môžu však tiež dosiahnuť, keď sa systém pozitívnej selekcie použije spoločne s tradičnou negatívnou selekciou.
Nasledujúca tabuľka teda znázorňuje výsledky, vyjadrené tak počet GUS-pozitívnych výhonkov tabaku na listový terčík a percento GUS-pozitívnych výhonkov z celkového počtu výhonkov, získané pri pozitívnej selekcii s použitím sodnej soli BA3GN, tradičnej negatívnej selekcii s použitím kanamycínu a N6-benzyladenínu (BA), rovnako ako pri kombinácii pozitívnej selekcie a negatívnej selekcie. Okrem toho sa do pokusu zaradila i selekcia s použitím sodnej soli BA3GN spoločne so sacharo-l,4-laktónom (SL) (silným špecifickým inhibítorom zavedenej beta-glukuronidázy).
Používali sa v podstate tie iste postupy, ako sú opísané v príklade 13, ale miesto substrátu MSO sa použil substrát Gamborg B5.
Tabuľka 12 Pozitívna selekcia v kombinácii s negatívnou selekciou
G0S* * výhonkov n* listový terčík lelvkéný Xoflc.'* Kone.** v porovnaní a suoatrit kanaayeinu Poíat BA » kanaeycin GUS» výhonkov z celkovího počtu výhonkov V porovnaní <
M 1 300 O,O1 Jx ÍAJOh’ IS 300 0,1 1OX 4 BA3OM* 13 IOO 0,2 20« BA)GH* 15 33 0,4 40x BA1GH* 15 0 0,3 3Oi BA3GN* * IS 0 0,02 2x .3 Ix ,2 0.1* ,7 1,1« ,4 l,7x ,9 0,2x
SL <10 HK1
Legenda:
* sodná soľ ** koncentrácia v mg/1
Pokus s N6-benzyladenínom spoločne s kanamycínom, ktorý predstavuje tradičný systém negatívnej selekcie, sa uskutočnil v dvoch nezávislých opakovaniach, pričom v každom opakovaní sa použilo 54 listových terčíkov. V celkovom počte 23 vybraných výhonkov sa našiel jediný GUS-pozitívny výhonok. Výsledky pokusov používajúcich sodnú soľ BA3GN sa získali s použitím 324 listových terčíkov. Pokus so sacharo-l,4-laktónom sa uskutočnil raz s použitím celkového počtu 162 listových terčíkov.
Predchádzajúca tabuľka ukazuje, že pomocou pozitívnej selekcie s použitím 15 mg/1 sodnej soli BA3GN (bez kanamycínu) sa získalo tridsaťkrát viac GUS-pozitívnych výhonkov na listový terčík v porovnaní s tradičným systémom negatívnej selekcie s použitím 1 mg/1 N6-benzyladenínu a 300 mg/1 kanamycín-sulfátu. Pri pozitívnej selekcii bolo ďalej vyššie percento GUS-pozitívnych výhonkov z celkového počtu výhonkov (7,4 %) ako pri negatívnej selekcii (4,3 %).
Výhodné výsledky sa dosiahli tiež s použitím kombinácie pozitívnej a negatívnej selekcie, t. j. pri nahradení cytokinínu v tradičnom systéme negatívnej selekcie, založenom na kanamycíne, cytokinín-glukuronidom (sodnou soľou BA3GN). Tak v prípade, že sa 15 mg/1 sodnej soli kombinovalo s 300 mg/1 kanamycín-sulfátu, bolo percento získaných GUS-pozitívnych výhonkov jedenásťkrát vyššie ako s použitím N6-benzyladeninu a kanamycínu a v prípade, že sa 15 mg/1 sodnej soli BA3GN kombinovalo s 33 mg/1 kanamycín-sulfátu, bol počet získaných GUS-pozitívnych výhonkov na listový terčík štyridsaťkrát vyšší ako pri použití NĎ-benzyladenínu a kanamycínu.
S použitím 15 mg/1 sodnej soli BA3GN v kombinácii s inhibítorom GUS, sacharo-l,4-laktónom (10 mM), bol v porovnaní s použitím samotnej sodnej soli BA3GN (15 mg/1) niekoľkonásobne znížený ako počet GUS-pozitivnych výhonkov na listový terčík, tak aj percento GUSpozitívnych výhonkov. Táto skutočnosť svedčí o tom, že za výhodné výsledky získané s použitím systému pozitívnej selekcie zodpovedá zavedený gén GUS, pretože pridanie sacharo-l,4-laklónu do rastového média silno inhibuje beta-glukuronidázou katalyzovanú premenu inaktívneho cytokinín-glukuronidu (sodná soľ BA3GN) na aktívny cytokinín v bunkách pestovaných na tomto substráte, čo vedie k pozorovanému zníženiu počtu indukovaných výhonkov. Systém pozitívnej selekcie teda funguje ako sa predpokladalo, t. j. tak, že sa využije zavedená beta-glukuronidáza na rozštiepenie cytokinin-glukuronidu v geneticky transformovaných bunkách, čím sa v týchto bunkách uvoľní voľný cytokinín, čo vedie k tvorbe výhonkov.
Príklad 12
Modifikácia systému pozitívnej selekcie na zlepšenie selekčného účinku cytokinín-glukuronidov
Ako sa už uviedlo (pozri tabuľku 3, príklad 3), betaglukuronidáza prirodzene sa vyskytujúca v rastlinách je neaktívna pri relatívne vysokých hodnotách pH, t. j. pri pH okolo 6 alebo viac, zatiaľ čo zavedená beta-glukuronidáza je aktívna až do pH 8. Pridaním zlúčeniny, ktorá môže zvýšiť vnútorné pH buniek, napríklad dusičnanu amónneho, do rastového média, sa môže ďalej zlepšiť selektivita tvorby výhonkov z GUS-pozitívnych buniek, pretože sa tým umožní blokovať akúkoľvek beta-glukuronidázovú aktivitu prejavujúcu sa ako pozadie, ktorá je dôsledkom prirodzene sa vyskytujúcej beta-glukuronidázy v netransformovaných bunkách.
Nasledujúca tabuľka uvádza počet výhonkov získaných z GUS-pozitívnych a GUS-negativnych listových terčíkov tabaku s použitím rôznych koncentrácií sodnej soli BA3GN a dusičnanu amónneho. Použili sa rovnaké postupy, ako sú opísané v príklade 3, s tou výnimkou, že miesto substrátu MSO sa použil substrát Gamborg B5.
Tabuľka 13
Účinok dusičnanu amónneho na selektivitu tvorby výhonkov z listových terčíkov ošetrených sodnou soľou BAGN3 (pH = 7)
Tvorha výhonkov Ipoéet výhonkov a fattor svivkt ivi t/·> z GUS» a GtIS- listových taiŕilnv
Legenda:
* Faktor selektivity je pomer počtu GUS-pozitívnych výhonkov a počtu GUS-negativnych výhonkov, a je teda známkou selektivity daného ošetrenia.
Je vidieť, že použitie sodnej soli BA3GN a dusičnanu amónneho vo vhodných koncentráciách má za následok selektívnu tvorbu výhonkov z GUS-pozitívnych listových terčíkov. Napríklad pri kombinácii 15 mg/1 sodnej soli BA3GN a 55 mM dusičnanu amónneho sa získalo z GUS pozitívnych listových terčíkov 34 výhonkov, zatiaľ čo na zodpovedajúcich GUS-negativnych listových terčíkoch podrobených rovnakému ošetreniu sa nevytvorili žiadne výhonky.
Ďalšie možnosti na zlepšenie selektivity systému pozitívnej selekcie s použitím cytokinín-glukuronidov je pridanie substrátu, ktorý po rozštiepení beta-glukuronidázou spôsobuje zvýšenie pH, do rastového média, čím sa v netransformovaných bunkách inhibuje hydrolýza cytokinínglukuronidov, bez toho, aby bol inhibovaný účinok voľných cytokinínov.
Tento princíp je doložený pokusom skúmajúcim účinok rôznych koncentrácií kyseliny o-kumaryl-beta-D-glukurónovej (CouGN) na tvorbu výhonkov z GUS-negatívnych listových terčíkov tabaku za indukcie pomocou sodnej soli BA3GN alebo N* 1 2 3 * * 6-benzyladenínu. Pri štiepení kyseliny o-kumaryl-beta-D-glukopyranurónovej pôsobením betaglukuronidázy sa uvoľňuje kyselina o-kumarová. Ako už bolo uvedené (pozri príklad II), kyselina o-kumarová sa spontánne premieňa na kumarín. Tento proces zahrnuje odstránenie karboxylovej skupiny (pozri ďalej), čím sa zvyšuje pH na hodnotu, pri ktorej, ako sa predpokladá, sa zníži aktivita prirodzenej rastlinnej beta-glukuronidázy.
Vykonal sa pokus s použitím N6-benzyladenínu (BA) s koncentráciou 0,5 mg/1 a sodnej soli BA3GN s koncentráciou 10,0 mg/1. Na každé ošetrenie sa použilo 12 terčíkov a počet výhonkov sa zaznamenal po 19 dňoch. Výsledky nasledujú.
Tabuľka 14
Účinok kyseliny o-kumaryl-beta-D-glukopyranourónovej (CouGN) na tvorbu výhonkov N6-benzyladenínom (BA) alebo sodnou soľou BAGN3
Počet cecjenercvanych výhonkov Poaer ce la t í vny cl, * rellUvn· » audni «of BAJGN relatívne 1 are βλ k lodrui iot
Predchádzajúca tabuľka ukazuje, že prítomnosť o-kumaryl-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny v rastovom médiu inhibuje regeneráciu výhonkov indukovanú pomocou sodnej soli BA3GN, ale nie pri indukcii pomocou N6-benzyladenínu. Najlepšie výsledky sa v tomto pokuse dosiahli s použitím o-kumaryl-beta-D-glukopyranurónovej kyseliny s koncentráciou okolo 3 - 4 mM. Na obmedzení tvorby výhonkov indukovanej pomocou Ba3GN sa môže podieľať niekoľko mechanizmov, vrátane nasledujúcich:
1. zvýšenie pH vďaka uvoľneniu o-kumovej kyseliny, ako už bolo vysvetlené,
2. substrátová kompeticia medzi CouGN a BA3GN, majúca za následok nižšiu frekvenciu hydrolýzy BA3GN a
3. znížený transport BA3GN do buniek.
Hoci nebol stanovený presný mechanizmus spôsobujúci pozorované obmedzenia tvorby výhonkov v prítomnosti
CouGN, predpokladá sa, že je za to pravdepodobne aspoň čiastočne zodpovedné zvýšenie pH. V každom prípade tento pokus svedčí o tom, že selektivitá systému pozitívnej selekcie sa môže zlepšiť použitím zavedeného génu betaglukuronidázy na vytvorenie samoregulačného mechanizmu, ktorý môže podstatne znížiť účinok ľubovoľného enzýmu prejavujúceho sa ako pozadie.
Príklad 13
Príprava geneticky transformovaných rastlín
V tomto príklade je uvedený všeobecný spôsob, ktorý sa môže použiť na prípravu geneticky transformovaných rastlín.
Rastlinný materiál
Listy (Nicotiana tabacum „Wisconsin 38“) sa získajú z rastlín pestovaných in vitro alebo in vivo. V prípade in vivo pestovania sa listy pred transformáciou sterilizujú. Sterilizácia sa môže uskutočňovať umiestnením listov počas 20 minút do roztoku 5% chlórnanu vápenatého obsahujúceho 0,1 ml povrchovo aktívneho činidla Tween 80 ma 1 a nasledujúcim päťnásobným premytím v sterilnej vode. Rastliny pestované in vitro sa pestujú v nádobách na substráte 1/2 MSO (substrát 1/2 MSO je rovnaký substrát ako MSO s 50 % koncentráciou s výnimkou agaru, cukru a vitamínov).
Listy sa po jednom umiestnia do Petriho misiek s priemerom 14 cm. Potom sa narežú na časti s plochou približne 1 cm2 neobsahujúcou hlavné žilky tak, aby okraje časti boli tvorené orezaným tkanivom. Všetky rezané tkanivá, ktoré boli odfarbené sterilizáciou pomocou chlórnanu, sa odstránia.
Kultivácia baktérií
Jeden deň pred transformáciou sa založí kultúra baktérií pridaním 2 - 3 ml baktérií do 200 ml média LB v Ľrlenmeyerovej banke. Baktérie sa pestujú pri teplote 28 °C za miešania (300 otáčok za minútu).
Transformácia
Kultúra baktérií sa bezprostredne pred transformáciou rozriedi päťdesiatkrát alebo na hodnotu OD 0,1 (pri 660 nm) médiom 1/2 MSO. Približne 10 ml rozriedenej suspenzie baktérií sa naleje na Petriho misku s priemerom 9 cm a do tejto suspenzie sa ponoria približne na 15 minút časti listov. Časti listov sa potom vyberú a nadbytok suspenzie baktérií sa odstráni s použitím sterilného filtračného papiera.
Kokultivácia
Deň pred transformáciou sa na kokultivačné misky (typicky obsahujú substrát MSO) umiestni filtrační papier a časti listov, ktoré boli ponorené do suspenzie baktérií, sa umiestnia vrchnou stranou dole na filtračný papier. Listové časti sa inkubujú v rastovej komore počas dvoch dni za svetelného cyklu 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.
Selekcia a regenerácia
Listové časti sa prenesú na Petriho misky obsahujúce cytokinín-glukuronidy v uvedenom množstve a buď 350 mg/1 karbenicillínu + 350 mg/1 cefotaxímu, alebo len 800 mg/1 karbenicillínu, v niektorých prípadoch v kombinácii s kanamycín- sulfátom. Listové časti sa po troch týždňoch subkultivujú na rovnaké médium, ktoré však neobsahuje cytokinín-glukuronidy.
Test
Regenerované výhonky sa prenesú do nádob obsahujúcich substrát 1/2 MSO. Približne po dvoch týždňoch sa na zelených výhonkoch vykoná test X-gluc. Výhonky sa subkultivujú podľa potreby.
SK 280639 Β6
Výsadba
Geneticky transformované výhonky, ktoré vytvorili korene (a ktoré sú GUS-pozitívne), sa vysádzajú do rastovej komory. Výhonky sa zasadia do vhodného rastového média, napríklad rašelinníka. Potom sa prikryjú plastovými vreckami a pestujú sa približne počas jedného týždňa, a potom sa odstrihnú dva rohy plastového vrecka. Po ďalšom týždni sa plastové vrecká odstránia.
Príklad 14
Indukcia tvorby výhonkov z rastlinného tkaniva s a bez zavedeného génu beta-glukuronidázy s použitím sterolov a di-beta-D-glukuronidu
Na GUS-pozitívnych a GUS-negatívnych listových terčíkoch tabaku sa uskutočnili podobné testy, ako sú opísané v príkladoch 5 a 6, s použitím substrátov obsahujúcich 100 mg/1 beta-sitosterolu, 100 mg/1 cholesterolu, 10 mg/1 kampesterolu, 1,88 mg/1 sodnej soli BA3GN a rôzne koncentrácie kyseliny di-beta-G-glukuronid-glycyrrizovej vo forme diamóniovej soli. Okrem toho polovica suhstrátov obsahovala tridemorf (0,1 mM). Počet výhonkov sa zistil po 17 dňoch.
Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
Tabuľka 15
Počet regenerovaných výhonkov na listový terčik
Diamóniova soľ kyseliny glycyrrizovej Bez tridemorfu S tridemorfom (0,1 mM)
Koncentrácia (mM) GUS+ GUS- GUS+ GUS-
0,00125 1,6 0 0,4 0
0,0125 M 0 2,3 0
0,125 1,3 0,1 7,7 0,4
1,25 0 0 0 0
6,25 0 0 0 0
Je vidieť, že kombinácia sterolov a diamóniovej soli kyseliny glycyrrizovej má za následok selektívnu tvorbu výhonkov v listových terčikoch obsahujúcich zavedený gén beta-glukuronidázy. (Ako už bolo uvedené (pozri príklad 5), tridemorf inhibuje syntézu sterolov, a teda má inhibičný účinok na regeneráciu výhonkov, pokiaľ nie sú rastlinnému tkanivu dodávané steroly). Hoci sa dá selektívna indukcia tvorby výhonkov pozorovať s použitím substrátov tak obsahujúcich, ako aj neobsahujúcich tridemorf, získa sa väčší počet výhonkov s použitím substrátov obsahujúcich tridemorf, a najmä pri koncentrácii diamóniovej soli kyseliny glycyrrizovej 0,125 mM.
Príklad 15
Selektívna inhibícia tvorby výhonkov z listových terčíkov divého typu tabaku (GUS-) indukovanej BA3GN
Uskutočnili sa pokusy ako v príklade 3 s použitím odrody tabaku „Burley“ miesto odrody „Wisconsis 38“. Do substrátu sa pridával v rôznych koncentráciách metyl-beta-D-glukuronid (MG), ktorý je pomocou GUS hydrolyzovaný na metanol a kyselinu glukurónovú, a to spoločne buď s 1 mg/1 N6- benzyladeninu (BA), alebo s 15 mg/1 sodnej soli BA3GN. Zistilo sa, že metanol inhibuje prirodzený enzým GUS bez toho, aby príliš ovplyvňoval zavedený gén získaný z Escherichia coli (Kosugi a kol., 1990, Plánt Sci., 133 až 120), zatiaľ čo kyselina glukurónová, ktorá sa uvoľňuje z metyl-beta-D-glukuronidu je produktom inhibujúcim enzýmy GUS. Pokiaľ sa miesto nezávislého pridania týchto dvoch zlúčenín pridá metyl-beta-D-glukuronid, sú produkty hydrolýzy vytvárané lokálne a sú koncentrované v kom partmente, v ktorom je lokalizovaný enzým. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 16.
Tabuľka 16
Zlúčenina Koncentrácia mg/1 Výhonky na listový terčik Pomer BA/BA3 -GN
BA BA3GN
Metyl-beta- 0 1,00 0,50 2,0
-glukuronid 1000 1,91 1,00 1,9
2,25 0 -
Kyselina 0 1,00 0,50 2,0
glukurónová 1000 0,33 0,08 4,1
3300 0,83 0 -
10 000 0,42 0 -
Legenda k tabuľke 16: koncentrácia BA je 1 mg/1 koncentrácia BA3GN je 15 mg/1
Uvedené výsledky ukazujú, že pridanie buď metylbeta-D-glukuronidu, alebo kyseliny glukurónovej má za následok zníženie počtu výhonkov získaných na substráte obsahujúcom BA3GN v porovnaní s počtom výhonkov získaných na substráte obsahujúcom N6-benzyladenin. Pomocou ošetrenia tkaniva metyl-beta-D-glukuronidom pred expresiou zavedeného enzýmu GUS sa môže teda selektívne odstrániť alebo znížiť aktivita alebo účinky prirodzeného enzýmu GUS počas selekčného procesu. Za účinky metyl-beta-D-glukuronidu a iných zlúčenín, ktoré majú podobný účinok na tkanivá divého typu ošetrených glukuronidmi, môžu byť tiež zodpovedné rozdiely medzi zavedeným a prirodzeným enzýmom GUS týkajúce sa inhibície pomocou substrátovej kompetície, senzitivity proti substrátovej inhibícii, množstva (aktivity) enzým, a senzitivity proti inhibícii produktom.
Je tiež možné, že metyl-beta-D-glukuronid pôsobí prostredníctvom kompetície s príjmom iných glukuronidov, ako je BA3GN. Pokiaľ je to tak, mohol by sa metyl-beta-D-glukuronid použiť na zníženie alebo elimináciu príjmu ostatných glukuronidov do buniek divého typu. Zavedenie génu kódujúceho enzým GUS, ktorý je vylučovaný, alebo génu kódujúceho glukuronid-permeázu sa môže použiť na selekciu transgénnych buniek v prípade, že je príjem inhibovaný napríklad pridaním metyl-beta-D-glukuronidu do substrátu. V prípade glukuronid-permeázy budú prijímať glukuronid (napríklad BA3GN) len transgénne bunky a vďaka všeobecnej prítomnosti prirodzeného enzýmu v rastlinách (pozri príklad 3) sa bude zlúčenina aktivovať vnútri buniek exprimujúcich permeázu (alebo iný proteín, ktorý uľahčuje príjem glukuronidov).
Je tiež zaujímavé, že samotná glukurónová kyselina je schopná selektívne inhibovať účinok BA3GN, pravdepodobne pomocou blokovania účinku N6-benzyladenínu uvoľňovaného štiepením BA3GN pomocou GUS.
Príklad 16
Použitie pozitívnej selekcie a kombinácie pozitívnej a negatívnej selekcie na zlepšenie účinnosti selekcie transgénnych buniek, tkanív alebo výhonkov pri rekalcitrantných druhoch
Cukrová repa je vzhľadom na produkciu transgénnych rastlín veľmi rekalcitrantným druhom. V bežných transformačných systémoch sa za podmienok, ktoré vyvolávajú vznik transgénnych výhonkov, „vyberie“ mnoho netransformovaných výhonkov. To isté sa zistilo v prípade poku sov s pozitívnou selekciou (bez pridania kanamycínu) s použitím 5-15 mg/1 sodnej soli BA3GN za podmienok opísaných v nasledujúcom texte.
V príklade 11 (pozri Tabuľku 12) sa zistilo, že kombinácia pozitívnej a negatívnej selekcie redukuje počet „vybraných“ netransformovaných výhonkov. Kombinácia pozitívnej a negatívnej selekcie sa preto testovala na cukrovej repe a zistilo sa, že poskytuje výhodné výsledky.
Transformácia sa uskutočnila s použitím klíčnych cxplantátov, ako je opísané ďalej.
Semená sa nechali klíčiť počas 4 dní v tme na substráte obsahujúcom 0,7 g/1 agarózy a 2 g/1 sacharózy. Semenáčiky sa potom preniesli do nádoby (Nunc) obsahujúcej substrát 1/2 x MSO a pestovali sa počas 3 dní na svetle. Zo semenáčikov sa odstránili klíčky, a klíčne explantáty sa potom na listovej stonke odreli malou kefkou obsahujúcou suspenziu Agrobacteria, ktoré obsahovalo 35S-NPTII a 35S-GUS (OD 660 = 0,1). Klíčky sa potom kokultivovali počas 4 dní na substráte obsahujúcom substrát 1/10 MSO a 200 μΜ acetosyringónu. Transformované explantáty sa preniesli na substrát MSO doplnený 0,25 mg/1 BA alebo 15 mg/1 sodnej soli BA3GN (miesto BAP), 0,025 mg/1 kyseliny naftyloctovej, 400 mg/1 kanamycínu, 800 mg/1 karbenicillínu a 25 mg/1 vancomycínu a explantáty sa na tomto substráte inkubovali počas 21 dní. Regenerované výhonky sa potom preniesli do nádob obsahujúcich rovnaký substrát. Po 52 dňoch na tomto substráte sa všetky výhonky preniesli na substrát MSO doplnený 800 mg/1 karbenicillínu, 25 mg/1 vancomycínu a 0,1 mg/1 N6-benzyladenínu. Po 14 dňoch sa na vyselektovanom rastlinnom materiáli uskutočnili testy GUS ako v príklade 3.
Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
Tabuľka 17
Transformácia cukrovej repy
Kombinácia pozitívnej a negatívnej selekcie
Počet explantátov GUS+ výhonky % GUS+ výhonkov
Negatívna sekcia Pozitívna a 100 0 0%
negatívna selekcia 177 4 2,3 %
Legenda:
Negatívna selekcia: 400 mg/1 kanamycín-sulfátu + 1 mg/1 BAP
Pozitívna a negatívna selekcia: 400 mg/1 kanamycín-sulfátu + 15 mg/1 BA3GN
Je vidieť, že pri kombinácii pozitívnej a negatívnej selekcie sa vytvárajú transgénne výhonky za podmienok, za ktorých sa s použitím tradičného systému negatívnej selekcie žiadne transgénne výhonky vytvárajú, čo svedčí o tom, že použitie systému pozitívnej selekcie je pri cukrovej repe veľmi výhodné v porovnaní s použitím samotných systémov negatívnej selekcie.
Táto skutočnosť ďalej znamená, že použitie pozitívnej selekcie (samotnej v kombinácii s negatívnou selekciou) môže umožniť vytváranie transgénnych rastlín ostatných rekalcitrantných druhov, pri ktorých sa dosahujú len nízke transformačné a selekčné frekvencie alebo pri ktorých nie je s použitím systémov negatívnej selekcie vôbec možné vyselektovať transgénne rastliny.
Príklad 17
Systémy pozitívnej selekcie založené na použití neaktívnych zdrojov dusíka, ktoré sa urobili dostupnými pomocou zavedenia metabolizujúcich génov.
Uskutočnili sa pokusy ako v príklade 3, s tým, že normálny obsah dusíka v substráte MSO sa znížil na nulu. Miesto toho sa pridali dusíkaté zlúčeniny uvedené v tabuľke 18. Substrát obsahoval 1 mg/1 N6-benzyladenínu. Ako pozitívne kontroly sa použili substráty obsahujúce dusičnan amónny.
Tieto pokusy sa vykonávali na zistenie, či sú opíny neaktívne alebo či môžu byť rastlinnými bunkami využité ako zdroje dusíka na substrátoch neobsahujúcich žiadny ďalší zdroj dusíka. Pretože sú gény kódujúce enzýmy, ktoré metabolizujú opíny, dobre známe, je hlavným predpokladom použitia opínov v systéme pozitívnej selekcie identifikácia opínov, ktoré sa nemôžu použiť ako zdroje dusíka pre rastlinné tkanivá a bunky, ktoré neobsahujú zavedené gény umožňujúce rastlinným bunkám využiť dané opíny. Výsledky sú uvedené ďalej.
Tabuľka 18
Účinok opínov na tvorbu výhonkov z listových terčíkov tabaku na substrátoch bez dusíka (počet výhonkov na 9 listových terčíkov)
Zlúčenina 0 Koncentrácia (mM) 10 20 40 80
Octopín 13 11 15 15 6
Mannopín 13 >50 >50 >50 >50
Nopalín 13 18 19 11 8
Dusičnan amónny (kontrola) 13 >50 >50 >50 >50
Na testovaných substrátoch neobsahujúcich žiadny dusík sa regenerovalo niekoľko výhonkov, čo je možné, pretože dusík sa môže mobilizovať z tkaniva explantátu. Úplne sa vyhnúť tvorbe výhonkov v pokusoch s nulovým obsahom dusíka je možné, pokiaľ sa explantáty nechajú trpieť nedostatkom dusíka pomocou pestovania rodičovských kultúr pred použitím na substrátoch bez dusíka alebo pokiaľ sa explantáty predbežne ošetria na substráte bez dusíka, napríklad bez hormónov indukujúcich tvorbu výhonkov.
Prekvapivo sa zistilo, že octopín a nopalín nemôžu podporovať tvorbu výhonkov, zatiaľ čo mannopín môže slúžiť ako dobrý zdroj dusíka a podporovať tvorbu výhonkov z listových terčíkov.
Je pravdepodobné, že dôvodom, prečo nopalín a octopin nemôžu slúžiť ako zdroje dusíka je, že tieto zlúčeniny nie sú prijímané, metabolizované alebo hydrolyzované na využiteľné zlúčeniny. Je dobre známe, že organizmy obsahujúce gény podieľajúce sa na transporte a metabolizme opínov, napríklad Agrobacterium, sú schopné využiť opíny ako zdroje dusíka, zatiaľ čo kmene Agrobacteria alebo iných baktérii neobsahujúce gény kódujúce metabolizmus opínov nie sú schopné rastu na substrátoch obsahujúcich ako zdroj dusíka len opíny.
Na základe týchto výsledkov sa môžu systémy pozitívnej selekcie vytvoriť pomocou zavedenia jedného alebo viacerých génov metabolizmu alebo transportu opínov do transgénnych rastlinných buniek s použitím selekčných substrátov, ktoré neobsahujú alebo majú znížený obsah iných zdrojov dusíka, ako je napríklad nopalín alebo octopín. Identifikácia alebo izolácia génov alebo genetického materiálu poskytujúceho príjemcovi schopnosť využiť octopín a nopalín je opísaná v literatúre: pozri napríklad C. Beaulieu a kol., 1988, Can. J. Microbiol., 38: 843 - 849; P. M. Klapwijk a kol., 1976, J. Gen. Microbiol., 96: 155 - 163; C. L. Schardl a C. I. Kado, 1983, Mol. Gen. Ge net., 191: 10 - 16 alebo H. Wabiko a kol., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97 až 103. Po izolácii genetického materiálu kódujúceho metabolizmus opínov sa môžu transformovať eukaryotické organizmy pomocou štandardných postupov opísaných v literatúre s použitím vhodných sekvencií nutných na fungovanie génov pre metabolizmus opínov.
Na základe uvedených výsledkov je pravdepodobné, že podobným spôsobom sa môžu použiť ďalšie opíny a zodpovedajúce katabolizujúce gény, a ďalej sa zdá pravdepodobné, že sa môžu podobne použiť ďalšie neaktívne zdroje dusíka identifikované podobným spôsobom a im zodpovedajúce gény, napríklad amidy v kombinácii s amidázami, peptidy v kombinácii so špecifickými peptidázami atď.
Príklad 18
Tvorba transgénneho kalusu z rekalcitrantných druhov s použitím pozitívnej selekcie v kombinácii s negatívnou selekciou
S určitými modifikáciami sa vykonávali pokusy ako v príklade ll. Použitými rastlinnými druhmi boli veľmi rekalcitrantné línie „V486“ ozimnej repky olejnej a „S487“ jarnej repky olejnej. Semená sa sterilizovali a nechali klíčiť, ako je opísané v príklade 16. Ako explantáty sa použili hypokotyly, ktoré sa inokulovali a kokultivovali, ako je opísané v príklade 11. Po kokultivácii sa explantáty preniesli na substrát MSO obsahujúci 0,1 mg/1 kyseliny naftyloctovej, 0,01 mg/1 kyseliny gibberellovej (GA3), 500 mg/1 karbenicillínu, 50 mg/1 kanamycín-sulfátu a 0,6 g/1 agarózy. Substrát okrem toho obsahoval buď 1 mg/1 N6-benzyladenínu, alebo 3,75, 7,5 alebo 15,0 mg/1 sodnej soli BA3GN. pH sa upravilo na hodnotu 5,8. Použité Agrobacterium obsahovalo vo svojom T-DNA gén GUS a gén neomycínfosfotransferázy II riadenej promótormi 35S. Testy GUS sa vykonali po 8 týždňoch a kalus, ktorý mal intenzívne modré zafarbenie vo väčšine kalusových buniek, sa označil ako GUS+.
Tabuľka 19
Tvorba transgénneho kalusu z repky olejnej s použitím pozitívnej selekcie v kombinácii s negatívnou selekciou
Repka olejná, ozimný typ „V486“
BA3GN (mg/1) BA (m ig/l)
3,75 7,5 15 1
Explantátov s kalusom 19,0% 23,0% 30,6 % 0%
GUS+ kalusov na explantát 1,4% 1,4% 2,3 % 0%
GUS+ kalusov na kalus 7,1 % 5,9 % 7,5 % 0%
Repka olejná, jamy typ „S487“
BA3GN (mg/1) BA (mg/1)
3,75 7,5 15 1
Explantátov s kalusom 5,2 % 9,2 % 6,3 % 0%
GUS+ kalusov na explantát 1,7% 2,3 % 0,9 % 0%
GUS+ kalusov na kalus 33,3 % 25,0 % 14,2% 0%
Tieto pokusy ukazujú, že v prípade týchto veľmi rekalcitrantných typov repky olejky len pozitívna selekcia v kombinácii s negatívnou selekciou umožňuje selekciu transgénneho kalusu, pretože s použitím tradičnej negatívnej selekcie (substráty s N6-benzyladenínom miesto sodnej soli BA3GN) sa nezískal žiadny GUS-pozitívny kalus.
Táto skutočnosť svedčí o tom, že zavedenie systému pozitívnej selekcie je tiež v kalusových systémoch veľmi výhodné v porovnaní so samotnými systémami negatívnej selekcie. Svedčí tiež o tom, že použitie pozitívnej selekcie (samotnej alebo v kombinácii s negatívnou selekciou) môže umožňovať vytvorenie transgénnych rastlín ďalších rekalcitrantných druhov, pri ktorých sa dosahujú len nízke transformačné a selekčné frekvencie alebo pri ktorých nie je s použitím, systémov negatívnej selekcie vôbec možné vyselektovať transgénne rastliny.
Potom, čo sa transgénny kalus vyselektoval, môže sa regenerovať do transgénnych výhonkov, napríklad na substráte obsahujúcom cytokinin v kombinácii s nízkou koncentráciou auxínu. Počas tohto procesu nie je nutná žiadna selekcia.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob selekcie geneticky transformovaných rastlinných buniek z populácie buniek, vyznačujúci sa tým, že sa populácii buniek dodá zlúčenina, ktorá môže byť metabolizovaná produktom expresie nukleotidovej sekvencie, ktorá bola introdukovaná do transformovaných buniek, na poskytnutie fyziologickej výhody transformovaným bunkám oproti netransformovaným bunkám, pričom touto zlúčeninou nie je antibiotikum ani herbicíd.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina dodaná transformovaným bunkám, je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej cytokiníny, auxíny, giberelíny, vitamíny, glycidy, zlúčeniny obsahujúce dusík, steroly a saponíny.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že nukleotidovú sekvencia kóduje
    i) beta-glukorinidázu, keď zlúčeninou je cytokinín-glukuronid, ii) manóza-6-fosfátizomerázu, keď zlúčeninou je manóza, iii) UDP-galaktóza-4-epimerázu, keď zlúčeninou je galaktóza alebo zlúčenina obsahujúca galaktózu, iv) permeázu,
    v) gén metabolizmu alebo transportu opínov.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa populácia buniek kultivuje na alebo v médiu obsahujúcom cytokinín-glukuronid, ktorý je v transformovaných bunkách štiepený beta-glukuronidázou, čím sa uvoľňuje voľný cytokinin a v transformovaných bunkách dochádza k indukcii tvorby výhonkov.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že cytokinín-glukuronid je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej: 3-beta-D-glukopyranuronozyl-6-benzylaminopurín a jeho soli na karboxylovej skupine, 3-beta-D-glukopyranurónamido-6-benzylaminopurín,
    9-beta-D-glukopyranurónozyl-6-benzylaminopurín a jeho soli na karboxylovej skupine, 3-beta-D-glukopyranurónozyl-6-(3-metylbut-2-enylamino)-purín a jeho soli na karboxylovej skupine, 6-(3-metylbut-2-enylamino)purín-2-yl-1 -tio-beta-D-glukopyranurónovú kyselinu a jej soli na karboxylovej skupine, 6-(3-metylbut-2-enylamino)purín-8-yl-1 -tio-beta-D-glukopyranurónovú kyselinu a jej soli na karboxylovej skupine a O-beta-D-glukopyranurónozylzeatín a jeho soli na karboxylovej skupine.
  6. 6. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 4 a 5, vyznačujúci sa tým, že sa akákoľvek prirodzená beta-glukuronidázová aktivita zníži tak, že sa do kultivačného média pridá glukuronid, ktorý sa môže hydrolyzovať prirodzenou beta-glukuronidázou a ktorý po hydrolýze spôsobuje zvýšenie pH, napríklad 2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranurónová kyselina alebo 2-hydroxycinnamyl-beta-D-glukopyranurónamid, alebo že sa akákoľvek prirodzená beta-glukuronidazová aktivita zníži tak, že sa do kultivačného média pridá zlúčenina regulujúca pH, ktorá udržuje pH kultivačného média, buniek alebo kom- partmentov buniek medzi hodnotami 5,5 a 8,5, výhodne medzi 6,0 a 8,0, napríklad medzi 6,5 a 7,5.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa populácia buniek kultivuje na alebo v médiu obsahujúcom aspoň jednu zlúčeninu, pričom táto zlúčenina je dostupná transformovaným bunkám expresiou alebo transkripciou kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie, a táto zlúčenina nie je dostupná netransformovaným bunkám alebo jc menej dostupná netransformovaným bunkám, takže je transformovaným bunkám poskytovaná selektívna výhoda, ktorá umožňuje ich selekciu z populácie buniek.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že neaktívnou zlúčeninou je opín, ktorý nepôsobí alebo len nedostatočne pôsobí ako zdroj dusíka a/alebo glycidov pre netransformované bunky, napríklad nopalín alebo octopín, a introdukovaná nukleotidová sekvencia obsahuje gén metabolizmu alebo transportu opínov, ktorý po expresii umožňuje opínu pôsobiť ako zdroj dusíka a/alebo glycidov v transformovaných bunkách.
  9. 9. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa selekcia geneticky transformovaných buniek vykonáva pomocou kombinácie pozitívnej selekcie a negatívnej selekcie, pričom je požadovaná nukleotidová sekvencia v geneticky transformovaných bunkách ďalej kointrodukovaná s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou rezistenciu proti aspoň jednému toxínu, antibiotiku alebo herbicídu, a médium obsahuje aspoň jeden toxín, antibiotikum alebo herbicíd, proti ktorému sú transformované bunky rezistentné
  10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jediná zlúčenina pridaná do kultivačného média a aspoň jedna nukleotidová sekvencia v transformovaných bunkách sú komponentmi systému kombinovanej pozitívnej a negatívnej selekcie, pričom uvedená zlúčenina má negatívny účinok na netransformované bunky a pozitívny účinok na transformované bunky.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že expresia alebo transkripcia kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie spôsobuje zvýšenie aktivity enzýmu, ktorý sa nachádza endogénne v populácii buniek, takže aktivita enzýmu v transformovaných bunkách je väčšia ako aktivita enzýmu v netransformovaných bunkách, alebo že expresia alebo transkripcia kointrodukovanej nukleotidovej sekvencie alebo požadovanej nukleotidovej sekvencie spôsobuje blokovanie metabolizmu zlúčeniny dodávanej populácii buniek alebo blokovanie syntézy zlúčeniny v transformovaných bunkách, čo umožňuje identifikáciu alebo selekciu transformovaných buniek z netransformovaných buniek.
SK222-94A 1991-08-28 1992-08-27 Spôsob selekcie geneticky transformovaných rastlin SK280639B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK911522A DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
PCT/DK1992/000252 WO1993005163A1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK22294A3 SK22294A3 (en) 1994-07-06
SK280639B6 true SK280639B6 (sk) 2000-05-16

Family

ID=8105710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK222-94A SK280639B6 (sk) 1991-08-28 1992-08-27 Spôsob selekcie geneticky transformovaných rastlin

Country Status (16)

Country Link
EP (3) EP0896063B9 (sk)
JP (1) JPH06511146A (sk)
AT (2) ATE181963T1 (sk)
AU (1) AU664200B2 (sk)
CA (1) CA2110401C (sk)
CY (1) CY2217B1 (sk)
CZ (2) CZ284828B6 (sk)
DE (2) DE69233771D1 (sk)
DK (2) DK152291D0 (sk)
ES (1) ES2135415T5 (sk)
GR (1) GR3031279T3 (sk)
HU (1) HU227979B1 (sk)
NZ (1) NZ244135A (sk)
RU (1) RU2126834C1 (sk)
SK (1) SK280639B6 (sk)
WO (1) WO1993005163A1 (sk)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994629A (en) * 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
GB9304200D0 (en) † 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DE4305295B4 (de) * 1992-03-04 2006-05-18 Volkswagen Ag Kraftfahrzeug mit einem Sitz, der zumindest eine zwischen einer Ruhestellung und einer Betriebsstellung bewegbare Seitenwange besitzt
US5608147A (en) * 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
EP0820518B1 (en) * 1995-04-06 2005-12-07 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Process for selection of transgenic plant cells
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
WO1999002703A1 (en) * 1997-07-07 1999-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
DE60140996D1 (de) 2000-02-11 2010-02-25 Metabolix Inc Intein enthaltende multigen-expressionskonstrukte
DK1276885T3 (da) 2000-04-21 2007-10-15 Martek Biosciences Corp Trofisk omdannelse af obligate fototrofe alger ved metabolisk teknik
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
AU2001268523A1 (en) 2000-06-16 2001-12-24 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
ATE461273T1 (de) 2000-11-17 2010-04-15 Metabolix Inc Herstellung von polyhydroxyalkanoaten mittlerer kettenlänge aus fettsäure-biosynthesewegen
US7186887B2 (en) 2001-04-06 2007-03-06 Syngenta Participations Ag Nucleic acids encoding oryza sativa nuclear cap binding protein 80 and methods of use
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
CA2493364A1 (en) 2002-07-26 2004-02-12 Basf Plant Science Gmbh Inversion of the negative-selective effect of negative marker proteins using selection methods
US20060253917A1 (en) 2002-12-26 2006-11-09 Bret Cooper Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
EP1781784A2 (en) 2004-08-02 2007-05-09 BASF Plant Science GmbH Method for isolation of transcription termination sequences
EP1645633B1 (en) 2004-10-05 2011-09-21 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP1669455B1 (en) 2004-12-08 2009-10-28 SunGene GmbH Expression cassettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
EP2184361A3 (en) 2005-02-09 2010-07-14 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
CA2598307C (en) 2005-02-26 2014-12-30 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
CN101137752B (zh) 2005-03-08 2013-04-03 巴斯福植物科学有限公司 增强表达的内含子序列
BRPI0608637A2 (pt) 2005-03-16 2010-01-19 Metabolix Inc vetor recombinante para expressço de enzimas, cÉlula de planta transformada, mÉtodo para produÇço de produto biossintÉtico
EP1874938B1 (en) 2005-04-19 2012-04-04 BASF Plant Science GmbH Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP2159289A3 (en) 2005-06-23 2010-03-24 BASF Plant Science GmbH Improved methods for the production of stably transformed plants
EP2980220A1 (en) 2005-09-20 2016-02-03 BASF Plant Science GmbH Improved methods controlling gene expression
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
CN102471777B (zh) 2009-07-10 2014-09-24 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚乳-特异性表达的表达盒
EP2275564A1 (en) 2009-07-17 2011-01-19 Freie Universität Berlin Means and method for the production of transgenic plants that are resistant to clubroot
WO2011034946A1 (en) 2009-09-15 2011-03-24 Metabolix, Inc. Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
AU2010325563B2 (en) 2009-11-27 2017-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
WO2011064736A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
CN102762726A (zh) 2009-11-27 2012-10-31 巴斯夫植物科学有限公司 嵌合内切核酸酶及其用途
EP2507375A4 (en) 2009-12-03 2013-04-24 Basf Plant Science Co Gmbh EXPRESSION CASSETTES FOR EMBRYOSPECIFIC EXPRESSION IN PLANTS
JP6164657B2 (ja) 2011-06-10 2017-07-19 シュティッヒティング・テクノロジッシュ・トップインスティテュート・グレーネ・ジェネティカ・（ファウンデーション・テクノロジカル・トップ・インスティテュート・グリーン・ジェネティクス） テルペン生合成を調節する転写因子
EP2734035A4 (en) 2011-07-22 2015-03-25 Basf Plant Science Co Gmbh PLANT CONVERSION METHOD
US20140259223A1 (en) 2011-10-19 2014-09-11 Keygene N.V. Methods for producing cinnamolide and/or drimendiol
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
WO2014028426A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
CN104531656B (zh) * 2015-01-05 2018-02-09 安徽省农业科学院水稻研究所 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
WO2017136668A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative bicarbonate transporter protein of an edible eukaryotic algae
AU2018224065B2 (en) 2017-02-22 2021-11-11 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
CA3111368A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield rna
CN114829612A (zh) 2019-12-16 2022-07-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用配对切口酶的改进的基因组编辑
CN114846144A (zh) 2019-12-16 2022-08-02 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 将dna或突变精确引入小麦基因组
WO2021226261A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors
AU2022388555A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ajax Therapeutics, Inc. 6-he tero aryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
GB8725402D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Jefferson R A Gene fusion
GB8626862D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Jefferson R A Gene fusion
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase

Also Published As

Publication number Publication date
ES2135415T5 (es) 2007-06-01
GR3031279T3 (en) 1999-12-31
CZ284828B6 (cs) 1999-03-17
HU9400570D0 (en) 1994-05-30
HUT69606A (en) 1995-09-28
AU664200B2 (en) 1995-11-09
CZ292882B6 (cs) 2003-12-17
EP0601092A1 (en) 1994-06-15
HU227979B1 (en) 2012-07-30
EP0530129A1 (en) 1993-03-03
CA2110401A1 (en) 1993-03-18
JPH06511146A (ja) 1994-12-15
EP0896063A2 (en) 1999-02-10
DE69229556D1 (de) 1999-08-12
NZ244135A (en) 1995-04-27
ATE443771T1 (de) 2009-10-15
EP0896063A3 (en) 2000-02-09
DE69233771D1 (de) 2009-11-05
DK0601092T3 (da) 2000-02-07
WO1993005163A1 (en) 1993-03-18
CA2110401C (en) 2006-02-21
EP0896063B9 (en) 2010-05-26
ATE181963T1 (de) 1999-07-15
EP0601092B2 (en) 2006-11-15
DE69229556T2 (de) 1999-11-11
AU2556792A (en) 1993-04-05
SK22294A3 (en) 1994-07-06
ES2135415T3 (es) 1999-11-01
DK152291D0 (da) 1991-08-28
EP0601092B1 (en) 1999-07-07
RU2126834C1 (ru) 1999-02-27
CZ44494A3 (en) 1994-06-15
DK0601092T4 (da) 2007-02-26
EP0896063B1 (en) 2009-09-23
CY2217B1 (en) 2003-04-18
DE69229556T3 (de) 2007-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK280639B6 (sk) Spôsob selekcie geneticky transformovaných rastlin
US5994629A (en) Positive selection
EP0827532B1 (en) Regeneration of both plant tissues and transgenic plant tissues using a new plant hormone, 5-bromoindole-3-acetic acid
SK107095A3 (en) Method of positive selection of genetically transformated cells based on using of mannose or xylose
US6815205B2 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
DE4013099A1 (de) Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
BRPI0202855B1 (pt) método de transformação de células de planta de palma oleaginosa com material genético, e método de produção de planta de palma oleaginosa geneticamente modificada
Baranski et al. Genetic engineering of carrot
WO1997020034A9 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
WO1997020034A1 (en) Auxinic analogues of indole-3-acetic acid
Zhang et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation system of Amorpha fruticosa using callus from the cotyledonary node.
Lim et al. Agrobacterium mediated transformation of Rehmannia glutinosa L. with glutathione S-transferase gene (Gh-5)
EP1265484A1 (en) Materials and methods for the regeneration of plants from cultured plant tissue
Australia GENETIC TRANSFORMATION OF WHEAT
JP2000501395A (ja) インドール―３―酢酸のオーキシンアナログ

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20120827