DE602004010682T2

DE602004010682T2 - Verfahren zur entgiftung von mykotoxinen

Info

Publication number: DE602004010682T2
Application number: DE602004010682T
Authority: DE
Inventors: Brigitte Poppenberger; Gerhard Adam; Franz Berthiller; Rudolf Krska; Karl Kuchler; Christian Luschnig; Josef Glössl; Doris Lucyshyn; Rainer Schuhmacher; Tobias Sieberer
Original assignee: Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Current assignee: Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Priority date: 2003-09-01
Filing date: 2004-09-01
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2024-09-02
Also published as: RU2006110557A; ATE380862T1; DE602004010682D1; EP1660649B1; MXPA06002128A; EP1510585A1; CA2536467A1; NZ546027A; RU2008143112A; US20060183202A1; EP1510573A1; EP1660649A1; WO2005021740A1; RU2347810C2; AU2004269152A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entgiftung von Mykotoxinen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten von Mykotoxinen.
Ein Komplex nah verwandter Spezies der Gattung Fusarium ist für destruktive und wirtschaftlich höchst wichtige Krankheiten bei Getreide-Feldfrüchten verantwortlich („Fusarium Head Blight" (Ausbleichen der Ähren) FHB von Weizen und Gerste) und Mais (Fusarium-Kolbenfäule, „Fusarium Ear Rot"). In Jahren mit klimatischen Bedingungen, die die Entwicklung der Pilze begünstigen, können Fusarium-Infektionen epidemische Proportionen erreichen (1). Krankheiten, die durch Pflanzen-Pathogene verursacht werden, verringern nicht nur ganz beträchtlich die Ausbeute, sondern führen auch zur Kontamination von Getreide mit unannehmbar großen Mengen von Mykotoxinen, einem Problem von weltweiter Bedeutung. Eine Toxin-Klasse, die für die Gesundheit von Mensch und Tier besonders besorgniserregend ist, sind Trichothecene, sesquiterpenoide Epoxide, die starke Inhibitoren der eukaryontischen Proteinsynthese sind. Mehr als 180 Verbindungen dieser Klasse wurden aus natürlichen Quellen isoliert, vorwiegend aus der Fusarium-Spezies (2). Je nach der Konzentration und dem Substitutionsmuster des Trichothecen, werden vorzugsweise entweder die translatorische Initiierung, Elongation oder Termination inhibiert (3).
F. graminearum und F. culmorum sind die beiden am meisten relevanten Verursacher des FHB von Zerealien. Während F. graminearum-Abstammungslinien, die in Europa und Nordamerika vorhanden sind, vorwiegend Desoxynivalenol (DON) und die acetylierten Derivate 3-Acetyl-desoxynivalenol (3-ADON) und 15-Acetyl-desoxynivalenol (15-ADON) erzeugen, dominieren in Asien die Erzeuger von Nivalenol (NIV), welches eine zusätzliche Hydroxylgruppe (1A) enthält (4). Obwohl die Toxizität dieser Trichothecene in Tiersystemen (5) gut untersucht ist, ist nur wenig bekannt über die Unterschiede in der Phytotoxizität. Es hat sich gezeigt, dass die Einwirkung von DON (das auch als Vomitoxin bekannt ist) bei Tieren nachteilige Auswir kungen auf die Gesundheit hat, wobei das Nerven- und Immunsystem die empfindlichsten Ziele sind (6). Im Gegensatz zu hohen DON-Dosen, die die Antikörper-Produktion inhibieren, wirken geringe Dosen von DON mit bakteriellem Lipopolysaccharid synergistisch und stimulieren proinflammatorische Prozesse (6). Um Konsumenten zu schützen, wurden von der US Food and Drug Administration empfohlene Level für Nahrungsmittel erstellt, und kürzlich wurden Wirkungs-Level für DON von der Europäischen Gemeinschaft empfohlen (7).
Die Rolle von DON bei Pflanzenkrankheiten ist noch immer umstritten (8), doch sprechen die meisten Beweise für eine Funktion als Virulenz-Faktor. Fusarium-Mutanten mit einem aufgebrochenen Gen, die an der Trochothecen-Biosynthese beteiligt sind (Trichodien-Synthase, Tri5) sind noch immer pathogen, weisen jedoch bei Weizen (9) eine verringerte Virulenz auf aufgrund ihrer Unfähigkeit, sich von der Infektionsstelle aus zuverbreiten (10). DON kann sich bei befallenen Pflanzen vor dem Pilz verbreiten, was eine Rolle bei der Konditionierung von Wirtsgewebe für die Besiedlung nahelegt (11). Die Ergebnisse mehrerer Studien zeigen, dass die in vitro-Resistenz von Weizen-Sorten gegenüber DON mit der FHB-Resistenz im Feld korreliert (12), was auch für die Segregation von Versuchs-Populationen zutrifft.
Eine erhöhte Resistenz gegen toxische Substanzen kann durch mehrere Mechanismen bewirkt werden, die von einer verringerten Aufnahme bis zu einer Umgehung („bypass"), Überexpression oder Mutation des Toxin-Targets reichen. Ein sehr bedeutender Prozess scheint jedoch die metabolische Transformation zu sein, auf die häufig eine Kompartimentierung folgt (13). Eine beobachtete Abnahme der Konzentration von DON, die bei mit Fusarium infiziertem Weizen auf dem Feld auftrat (14), deutete darauf hin, dass das Toxin metabolisiert sein könnte.
Die Acetylierung von Trichothecenen (z. B. DON) wurde als potentielle Resistenz-Strategie vorgeschlagen ( US 6,346,655 B1 ), jedoch sind die resultierenden acetylierten Trichothecene (z. B. Acetyl-DON = ADON) in ihrer Gesamt-Toxizität der nicht-acetylierten Form (z. B. DON) äquivalent, wie von Eudes et al. in einem Coleoptil-Elongations-Test bewiesen (53). Daher führt die Acetylierung nicht zu einer Verringerung der Trichothecen-Toxizität.
Zwei Weizen-Sorten, die sich in der Fusarium-Resistenz unterschieden, wiesen Unterschiede in ihrer Fähigkeit, einen DON-Metaboliten zu bilden, auf, von welchem vermutet wurde, dass er ein Glucosid sei (15). Seewald et al. (16) inkubierten eine Mais-Suspensions-Kultur mit radioaktiv markiertem DON und bewiesen, dass es hauptsächlich mit 3-β-D-Glucopyranosyl-4-desoxynivalenol konjugiert war. Es wurden bisher noch keine Pflanzen-Enzyme beschrieben, die fähig sind, die Trichothecene oder andere Mykotoxine durch Transfer eines Zuckeranteils zu modifizieren.
Projekte zur Genom-Sequenzierung offenbarten die Existenz einer großen Anzahl von Genen in Pflanzen, die für putative UDP-Glycosyltransferasen (UGT) codieren, von welchen vorausgesagt wurde, dass sie kleine Moleküle konjugieren. Z. B. wurde gezeigt, dass Arabidopsis thaliana mehr als 100 Mitglieder dieser Multigen-Familie hat (17), deren Funktionen weitgehend unbekannt sind.
Die WO 98/34471 offenbart eine DNA-Sequenz, die für Solanidin-UDP-Glucose-Glucosyltransferase (SGT) codiert. Diese DNA-Sequenz kann verwendet werden, um Inhibitoren zu identifizieren, insbesondere Antisense-Inhibitoren, die auf Solanidinerzeugende Pflanzen, wie Kartoffeln, angewendet werden können, um die Biosynthese von SGT und folglich die Erzeugung von Solanidin zu inhibieren.
In der WO 97/45546 ist ein Gen geoffenbart, welches für eine Glucosyltransferase codiert, die für die Induktion der Pflanzenverteidigung und Resistenz-Antworten sowie regulierende Pflanzenentwicklungs-Vorgänge verantwortlich ist.
Die WO 00/00626 betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Glykosylierung spezifischer aromatischer Derivate, wie Coumarin.
In der wissenschaftlichen Veröffentlichung von Von Rad U. et al. (Plant Journal (2001), 28:633–642) ist die Charakterisierung von zwei Glucosyltransferasen, die an der Entgiftung von Benzoxazinoiden in Mais beteiligt sind, beschrieben. Infolge einer Glucosylierung dieser Substanzen kann die Autotoxizität der Pflanze verringert werden, weil glucosylierte Produkte eine verringerte chemische Reaktivität aufweisen.
In Yamazaki M. et al. (J. Biol. Chem. (1999)274:7405–7411) ist die Charakterisierung einer UDP-Glucose-Glucosyltransferase beschrieben, die in Pflanzen synthetisiertes Anthocyanin glucolisieren kann.
In Eng-Kiat L. et al. (Biochem. J. (2003)373:987–992) werden Glucosyltransferasen geoffenbart, die heterolog in Arabidopsis-Pflanzenzellen exprimiert werden können, welche zur Glucosylierung von Kaffeesäure verwendet werden können.
In Jackson R. G. et al. (Plant. J. (2002):473–583) wird die Charakterisierung einer Glucosyltransferase von Arabidopsis thaliana beschrieben, die Indo1-3-Essigsäure in vitro glucosylieren kann.
In Yamazaki M. et al. (Plant. Mol. Biol. (2002)48:401–411) ist die Klonierung und Glucosylierung von zwei Flavonoid-Glucosyltransferasen der Pflanze Petunia hybrida beschrieben. Diese Glucosyltransferasen sind für die Glucosylierung von Anthocyaniden verantwortlich.
In Okubara P. A. et al. (Theor. Appl. Genet. (2002)106:74–83) ist eine Acetyltransferase eines Fusarium-Stamms beschrieben, welcher die Toxizität von Desoxynivalenol (DON) durch Transferieren einer Acetylgruppe an dieser Verbindung verringern kann.
In Sewald N. et al. (Tetrahedron Asymmetry (1992) 3:953–960) ist die Isolierung von glucosyliertem Desoxynivalenol aus Zea mays geoffenbart, welches den Haupt-Metaboliten von Desoxynivalenol in Maiszellen darstellt.
In Meßner B. et al. (Planta (2003) 217:138–146) ist eine UDP-Glucose-abhängige Glucosyltransferase von Arabidopsis thaliana geoffenbart. Diese Glucosyltransferasen können die Toxizität von Xenobiotika in einer Pflanze sowie in vitro verringern.
In Miller J. D. et al. (Canad. J. Plant. Pathol. (1996) 8:147–150) ist die Inkubation von Desoxynivalenol in einer Suspension von Fusarium-resistentem Weizen beschrieben, wobei entdeckt wurde, dass im Laufe dieser Inkubation Desoxynivalenin teilweise glucosyliert wird.
In Gorst-Allman C. P. et al. (J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1985) 7:1553–1556) wird die Erläuterung von Trichothecen-Glycosiden bei mit Fusarium infizierten Maispflanzen beschrieben. Der Zuckerrest der Glycoside wurde als Glucose identifiziert.
Schäffner A. et al. (Acta Biotechnol (2002) 22:141–152) beschreiben allgemeine Entgiftungswege bei Pflanzen, um die Pflanze vor endogenen und xenobiotischen Substanzen zu schützen.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Entgiftung von Mykotoxinen vorzusehen.
Es ist oft schwierig, geeignete Präparate von Mykotoxinen oder Derivaten davon, insbesondere Zucker-Konjugat-Derivate von Mykotoxinen, vorzusehen. Da die Stereoselektivität für diese Art von Produkten wesentlich ist, sind rein chemische Synthesen auf Basis von allgemeinen Massen-Mykotoxinen oft schwierig, wenn nicht unmöglich, zumindest in großtechnischem Maßstab. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren zur Synthetisierung von Zucker-Konjugat-Derivaten von Mykotoxinen vorzusehen.
Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Entgiftung von Mykotoxinen vor, wobei ein Mykotoxin mit einer Glucosyltransferase in Anwesenheit einer aktivierten Glucose in Kontakt gebracht wird.
Wie voranstehend erwähnt, wurde bisher im Stand der Technik noch kein Bericht in Bezug auf (Pflanzen-)Enzyme, die Mykotoxine durch Transfer eines Zuckermoleküls modifizieren können, veröffentlicht, und natürlich nicht in Bezug auf solche Enzyme, die Mykotoxine entgiften können, d. h. die Toxizität von Mykotoxinen in beträchtlichem Ausmaß verringern, z. B. um mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, insbesondere mehr als 95%, wie mittels spezifischer Mykotoxin-Tests wie der Inhibierung der in vitro-Proteinsynthese, bestimmt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass Glucosyltransferasen ein sehr spezifisches Werkzeug zur Entgiftung von Mykotoxinen sind. Die Spezifität ist einerseits durch eine gewisse Spezifität bestimmter Glucosyltransferasen für nur eine begrenzte Anzahl von Mykotoxinen und anderseits auch durch die Spezifität in Bezug auf die Art der Entgiftung, nämlich durch Stellen-spezifische Glucosylierung der Mykotoxine, gegeben. Obwohl diese Spezifität den Umfang der Anwendung auf eine bestimmte einzelne Glucosyltransferase einschränkt, sieht die vorliegende Erfindung Werkzeuge vor, um die Spezifitäten jeder Glucosyltransferase in Bezug auf jedes Mykotoxin, insbesondere Trichothecen-Mykotoxine, leicht zu bestimmen. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung eine direkte Identifizierung von spezifitäten für andere Glucosyltransferasen und Mykotoxine, wenn ein bestimmtes Enzym für einen bestimmten Satz Mykotoxine spezifisch ist.
Da Uridin-Diphosphat-Glucose (UDP-Glucose, z. B. Glucose, die von Enzymen, wie Pyrophosphorylasen, erzeugt wird) eine bevorzugte aktivierte biologische Form der Glucose ist, wird bei einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens UDP-Glucosyltransferase als Glucosyltransferase und eine UDP-Glucose als aktivierte Glucose (= Cosubstrat) benützt; es kann jedoch jede Form von Glucose, die von einer Glucosyltransferase benützt werden kann (z. B. ADP-Glucose, CDP-Glucose oder jede andere Form einer biologisch und synthetisch aktivierten Glucose, die geeignete Substrate für den Transfer zu Mykotoxinen durch Glucosyltransferasen sind) gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine Glucosyltransferase gemäß der vorliegenden Erfindung ist als ein (natürlich) vorkommendes oder synthetisch (rekombinant) entworfenes oder erzeugtes Enzym definiert, welches (als seine Haupt- oder als eine Nebenaktivität) fähig ist, einen Glucoseanteil unter Verwendung einer aktivierten Glucose als Cosubstrat zu einem Substrat-Molekül zu transferieren, wobei ein glucosyliertes Substrat-Molekül erzeugt wird.
Bevorzugte Mykotoxine zur Entgiftung durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind – infolge ihrer wirtschaftlichen Bedeutung – Trichothecene, insbesondere Tri chothecene mit einer freien Hydroxygruppe an der Position C₃ und zwei Wasserstoffgruppen an C₄. Insbesondere die letzteren Trichothecene sind entweder an ihrer Position 3 oder – falls vorhanden – an einer freien Hydroxyguppe an Position 7 oder an beiden Positionen spezifisch glucosyliert. Daher sind bevorzugte Mykotoxine Desoxynivalenol, 15-Acetyl-desoxynivalenol, 15-Acetoxyscirpendiol oder Mischungen davon.
Ein bevorzugter Weg zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist der in vivo-Modus. Dies kann unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie und/oder von Verbindungen, die die Glucosyltransferase-Expression verstärken, erfolgen. Bevorzugte Beispiele umfassen die Expression einer Glucosyltransferase in einer transgenen Pflanzenzelle (oder Pflanzengewebe oder ganzen Pflanze), die eine rekombinante Glucosyltransferase und/oder eine rekombinante regulierende Region für eine Glucosyltransferase enthält, insbesondere einen Mykotoxin-induzierbaren Promotor, insbesondere von einer Glucosyltransferase. Bevorzugte Beispiele für Verbindungen, die die Glucosyltransferase-Expression verstärken, sind Substanzen, die die Glucosyltransferase hinauf regulieren, z. B. Toxine (wenn die Expression der Transferase durch Toxininduzierbare Promotoren gesteuert wird). Im Prinzip kann jede Zelle, die genetisch manipulierbar ist, so dass sie ein rekombinantes Pflanzen-Glucosyltransferase-Gen exprimiert (d. h. ein Gen, welches künstlich in diese Zelle eingeführt wurde, oder dessen Vorläufer, und welches von Natur aus nicht an dieser Stelle des Genoms der Zelle vorhanden ist), für diesen Zweck verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen sind transgene Bakterien, Hefen, mit Baculovirus infizierte Insektenzellen usw., die ein Pflanzen-Glucosyltransferase-Gen exprimieren.
Bei einem industriellen Verfahren zur Entgiftung von Mykotoxinen kann die Glucosyltransferase vorteilhaft an einer festen Oberfläche immobilisiert sein (gemäß Standard-Immobilisierungstechniken), und eine Mykotoxin enthaltende Lösung oder Suspension kann dann mit dieser immobilisierten Glucosyltransferase in Kontakt gebracht werden.
Bevorzugte Beispiele für gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Glucosyltransferasen sind UDP-Glucosyltransferasen, die der Unterfamilie 73C von Arabidopsis thaliana entsprechen, insbesondere die UDP-Glucosyltransferasen 73C4 und 73C5.
Gemäß einem anderen Aspekt ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von glucosylierten Mykotoxinen, wobei ein Mykotoxin mit einer Glucosyltransferase in Gegenwart einer aktivierten Glucose in Kontakt gebracht wird. Damit können die voranstehend erwähnten Enzym-Spezifitäten richtig verwendet werden, um spezifisch glucosylierte Mykotoxin-Derivate herzustellen. Wenn ein Mykotoxin auf nicht-enzymatischem („chemischem") Weg glucosyliert wird, wird eine rohe Mischung glucosylierter Produkte erhalten (jede freie Hydroxy-Gruppe ist im Prinzip eine Akzeptor-Stelle für Glucosyl-Reste). Die Acetylierung als Schutzmittel für solche Gruppen hat auch ihre Nachteile in Bezug auf die Spezifität (auch alle Hydroxy-Gruppen werden acetyliert). Durch die Verwendung von Substrat- und Stellen-Spezifität sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung gut definierter glucosylierter Derivate vor. Wenn mehr als eine Hydroxy-Gruppe glucosyliert ist oder wenn mehr als eine Position durch eine bestimmte Glucosyltransferase glucosyliert werden kann, kann eine begrenzte Anzahl von Produkten (z. B. 2 bis 5) durch geeignete Trennungsmittel, wie HPLC, leicht getrennt werden (z. B. DON, das an Position Nr. 3 glucosyliert ist, kann leicht von DON, das an Position 7 glucosyliert ist, getrennt werden).
Die voranstehend beschriebenen bevorzugten Verfahrensschritte sind auch auf diesen Aspekt der Erfindung anwendbar.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen oder transgene (Pflanzen-)Zellen, die eine rekombinante Glucosyltransferase und/oder ein rekombinantes Expressions-regulierendes Element, insbesondere eine Promotor-Region für eine Glucosyltransferase, enthalten. Diese Pflanzen oder (Pflanzen-)Zellen können bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine genetisch modifizierte Zelle oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, die eine nicht von Natur aus vorkommende (transgene) Glucosyltransferase in ihrem Genom aufweist und, auf Grund des Vorhandenseins einer solchen Glucosyltransferase als Transgen, Mykotoxin-resistent, insbesondere Trichothecen-resistent ist. Alternativ kann eine endogene Glucosyltransferase in einer Zelle einer anderen, transgenen Expressions-regulierenden Region oder einem Element, wie einem Promotor, ausgesetzt werden, was zu einer verstärkten Expression der endogenen Glucosyltransferase führt (d. h. einer verstärkten Expressionsaktivität einer homologen Glucosyltransferase infolge eines transgenen Promotors). Auch solche Zellen zeigen eine verstärkte Resistenz gegen Mykotoxine, wie hierin beschrieben. Solche Zellen und Pflanzen können durch Anwendung von Standardmethoden an die Lehre der vorliegenden Erfindung hergestellt werden (vgl. z. B. 6B und die Beispiele wie z. B. (54)).
Bevorzugte Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung sind auch Hefezellen. Da Hefezellen eine begrenzte Aufnahmefähigkeit haben können, sind bevorzugte Hefezellen gemäß der vorliegenden Erfindung für eine erhöhte Mykotoxin-Aufnahmefähigkeit im Vergleich zum Wildtyp- oder Ausgangsstamm entworfen oder ausgewählt.
Die genetisch modifizierten Zellen weisen einen oder mehr, vorzugsweise drei oder mehr ABC-Transporter auf, die in ihrer Aktivität reduziert oder inaktiviert sind, insbesondere pdr5. Solche ABC-Transporter-Mutanten sind durch eine verstärkte Aufnahme von Mykotoxinen gekennzeichnet. Vorzugsweise weisen die Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Deletion in pdr5, pdr10, pdr15, snq2, yor1, ayt1 oder Kombinationen dieser Deletionen auf.
Diese Zellen können vorzugsweise zur Entgiftung von Mykotoxin-hältigen Lösungen oder Suspensionen, insbesondere zur Entgiftung von Trichothecenen in der Landwirtschaft und Bierproduktion verwendet werden; und bei der Produktion von glucosylierten Mykotoxinen, insbesondere von glucosyliertem DON oder 15-ADON.
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Beispie le und die Figuren weiter veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.
FIGUREN:
1: Spektrum der Trichothecen-Resistenz von Hefe, die Arabidopsis thaliana UDP-Glucosyltransferasen der Unterfamilie UGT73C exprimiert.
A, Struktur und Nummerierung des Ringsystems von Trichothecenen der Klasse B, die zum Testen der Resistenz verwendet wurden. Die verschiedenen Reste an variablen Positionen R1-R4 sind in der Tabelle angegeben (OAc: -OCOCH₃, OBe: -OCOCH=CHCH₃ (Z)). Das relevante R₁ ist unterstrichen (OH in DON, bereits durch Acetylierung in 3-ADON blockiert). Eine durch die DOGT1-Expression übertragene erhöhte Resistenz ist durch plus angezeigt, ein Fehlen des Schutzes durch minus. B, Genom-Organisation des UGT-Gen-Clusters am Chromosom II (Unterfamilie 73C), enthaltend DOGT1 (UGT73C5, Locus At2g36800). Das DON-entgiftende DOGT1 und 73C4 sind grau schattiert. C, Hefestämme wurden auf YPD-Platten, die die angegebene Menge Toxin (ppm: mg/l) enthielten, aufgetüpfelt (gespotted). Die Stämme sind Wildtyp YZGA515 ohne Plasmid (wt), dieser Stamm, mit leerem Vektor transformiert (c) und die Transformanten, die die mit myc-tag versehenen 73C UGTs exprimieren (CSDOGT1, unterstrichen, im Duplikat aufgetüpfelt). Die Resistenz wird durch Plasmide übermittelt, was zur Überexpression von C5 und C4 führt. D, Western Blot-Analyse der Hefestämme, die zum Testen der Resistenz verwendet wurden. Das N-terminale c-Myc-Epitoptag, das in die entsprechenden 73C UGT-Familienmitglieder eingeführt wurde, ist detektiert (C5=DOGT1, unterstrichen). Eine den leeren Expressionsvektor enthaltende Transformante wurde als Kontrolle verwendet.
2. Aminosäure-Ausrichtung („alignment") von Pflanzen-UDP-Glucosyltransferasen mit hoher Aminosäure-Ähnlichkeit mit DOGT1. Die in der Akzeptorsubstrat-Bindung implizierten Regionen (punktiert) (Ref. 38) und das UGT-Consensus-Sequenz-Motiv (strichliert) sind unter den Sequenzen durch Kästchen angegeben. Das Dreieck über der Sequenz in der hypothetischen Akzeptor-Bindungsregion kennzeichnet das Lysin 136 in DOGT1, wel ches durch in vitro-Mutagenese verändert wurde. Die Genbank-Hinterlegungsnummern der vorhergesagten Proteine sind: ADGT-9, Glucosyltransferase-9 von Vigna angularis (A3070752); TOGT1, Phenylpropanoid:glucosyltransferase 1 von Nicotiana tabacum (AF346431); IS5a von Nicotiana tabacum (U32644); putative Glucosyltransferase von Oryza sativa (AP002523); Twi1 von Lycopersicon esculentum (X85138); Betanidin-5-O-glucosyltransferase von Dorothenatus bellidiformis (Y18871).
3. Die DOGT1-Expression wird in ihrer Entwicklung reguliert und induziert von DON und von Verbindungen, die mit der Antwort auf Stress in Verbindung stehen. A, GUS-Färbung von Sämlingen, die für eine transkriptionelle DOGT1 Promotor-GUS-Fusion homozygot sind. Obere Reihe: drei Tage nach der Keimung (3 DAG) ist die Expression des Fusionsproteins auf das Gefäßsystem von Wurzel und Hypokotyl und die meristematische Region der Wurzelspitze eingeschränkt. Mitte: Später in der Entwicklung (10 DAG) nimmt die Färbung im Wurzel-Gefäßsystem ab, außer in jenen Regionen, in welchen Seitenwurzeln gebildet werden. Untere Reihe: In den oberirdischen Teilen adulter Pflanzen ist die DOGT1-Expression auf die Blätter von Blüten und die Abszissionszonen beschränkt. B, DON-Behandlung (5 ppm, 4 Stunden lang) von Sämlingen (14 DAG), die die translationale GUS-Fusion exprimieren, induziert die Expression des GUS-Reporters. Beide Proben wurden 2 Stunden lang gefärbt. C, Semiquantitative Reverse-Transkriptase-PCR-Analyse der Induktion der Expression von DOGT1, UGT73C4 und UGT73C6 nach Behandlung mit DON (5 ppm), SA (100 μM), JA (50 μM) und ACC (2 μM). UBQ5 wurde als innere Kontrolle verwendet.
4. Der N-terminale Teil von DOGT1 ist für seine Fähigkeit, DON zu entgiften, wesentlich. A, Aminosäure-Ausrichtung („alignment") von DOGT1 und seinem nächsten Homolog, UGT73C6, welches nicht gegen DON schützt (schwarz: Aminosäure-Identität). Die konservierte EcoRI-Restriktionsstelle wurde verwendet, um chimäre UGTs zu erzeugen, die aus dem N-Terminus von einem und dem C-Terminus des jeweiligen anderen Gens bestehen. B, Hefe-Transformanten wurden im Duplikat auf YPD-Medium getüpfelt, das die angegebenen Konzentrationen von DON enthielt. Oben links: Transformanten, die das chimäre Enzym exprimieren, bestehend aus dem UGT73C6-N-Terminus und dem DOGT1-C-Terminus (kurz: C6-DOG). Oben rechts: Stämme, die das chimäre Protein exprimieren, bestehend aus dem DOGT1-N-Terminus und dem UGT73C6-C-Terminus (DOG-C6). Untere Reihe: Transformanten, die das Resistenz vermittelnde DOGT1 exprimieren (links), und inaktives 73C6 (rechts). Die den N-terminalen Teil von DOGT1 enthaltende Hybride ist resistent gegen höhere DON-Konzentrationen als der Stamm, der die andere Hybride (C6-DOG) exprimiert oder UGT73C6.
5. Fragmentierungsmuster von synthetisierten DON-Glucosiden und einem DON-Metaboliten, der in Hefezellen gebildet wurde, die DOGT1 exprimieren, in der Massenspektrometrie. A, das synthetisierte DON-3-O-Glucosid ergibt ein Fragment von 427,2 m/z in der linearen Ionenfalle (MS/MS/MS). B, Dieses Fragment wurde nicht erzeugt von der synthetisierten DON-15-O-Glucosid-Probe, da eine Trennung der -CH₂OH-Gruppe an C₆ verhindert wird durch den Glucose-Anteil, der an der Hydroxylgruppe vorhanden ist. C, Der DON-Metabolit, der in Hefe gebildet wurde, die DOGT1 exprimiert, eluierte in der HPLC mit derselben Retentionszeit wie das DON-3-O-Glucosid und wies das der DON-3-O-Glucosid-Referenzsubstanz entsprechende Fragmentationsmuster auf.
6. Glucosylierung von DON verringert die Toxizität in vitro und in vivo. A, Struktur des vorgeschlagenen Reaktionsprodukts: DOGT1 katalysiert den Transfer von Glucose von UDP-Glucose zur 3-OH-Position von DON. B, Vergleich der Inhibition der in vitro-Proteinsynthese von Weizen-Ribosomen durch DON und DON-3-O-Glucosid, bestimmt unter Verwendung eines Weizenkeimextrakts auf Basis eines gekoppelten Transkriptions-/Translations-Systems. Die Lumineszenz wurde gemessen und als Luciferase-Aktivität der Kontrollproben ohne Toxin ausgedrückt. C, Western Blot-Analyse von A.thaliana-Linien, die für ein Überexpressions-Konstrukt homozygot waren, das ein mit einem c-Myc-tag versehenes DOGT1 codiert. Eine schematische Zeichnung des Pflanzen-Transformationsvektors ist darunter gezeigt (GENT: Gentamycin-Resistenz als selektierbarer Marker verwendet; 2×35S duplizierter Promotor des Blumenkohl-35S-Transkripts (für Details siehe Versuchsmethoden)). Col-0 wurde als negative Kontrolle verwendet. 2 Linien mit hohen und 2 Linien mit niedrigen Level des c-Myc-DOGT1-Proteins sind gezeigt. D, Samenkeimung auf DON enthaltendem MS-Medium. Im Vergleich zum Wildtyp (Col-0) weisen transgene Arabidopsis-Linien, die große Mengen an DOGT1 exprimieren (z. B. die Linie 1319/2), eine verstärkte Resistenz auf.
BEISPIELE
Zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung sind in den nachfolgenden Beispielen das Klonieren einer Arabidopsis-UGT durch funktionelle Expression in Hefe und ihre Charakterisierung beschrieben. Dieses Enzym kann das Fusarium-Mykotoxin DON und sein acetyliertes Derivat 15-ADON entgiften. Die in diesen Beispielen verwendeten Methoden sind auch auf andere Glucosyltransferasen und Mykotoxine ohne übermäßige Belastung durch Versuche direkt anwendbar.
VERSUCHSMETHODEN
Hefestämme. Die bei dieser Arbeit verwendeten Hefestämme stammen von YPH499 (Mat a, ade2-101oc, his3-Δ200, leu2-Δ1, lys2-801a, trp-1-Δ1, ura3-52) (18). Der relevante Genotyp von YZGA452 ist pdr5Δ::TRP1, pdr10Δ::hisG, sng2Δ::hisG, yor1Δ::hisG. YZGA515 (pdr5Δ::TRP1, pdr10Δ::hisG, pdr15Δ::loxP-KanMX-loxP, ayt1Δ::URA3) wurde durch Disruption der Acetyltransferase AYT1 im Stamm YHW10515 konstruiert.
Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen. A. thaliana-Versuche wurden mit dem Wildtyp-Ökotyp columbia-0 (Col-0) durchgeführt. Zur Vermehrung wurden die Samen sterilisiert, auf Standard-MS-Wachstumsmedium (19), ergänzt mit 1,0% Saccharose und 1,0% Phytagar (Life Technologies) ausplattiert und einer zweitägigen Behandlung mit Dunkelheit und 4°C zum Synchronisieren der Keimung unterzogen. Die Sämlinge wurden 2 Wochen lang in einer kontrollierten Umgebung mit einem Zyklus von 16h/8h Licht/Dunkelheit (140 μmol m^–2 sec^–1 weißes Licht) bei 22°C gezogen, bevor sie in Erde transferiert und bei 20°C und 55% Luftfeuchtigkeit unter kontinuierlichem weißen Licht gezogen wurden.
Arabidopsis thaliana cDNA-Bibliothek-Screen in Hefe. Der ATP-Eindungs-Kassetten(ABC) -Transporter-defiziente Saccharomyces cerevisiae-Stamm YZGA452, welcher überempfindlich gegen DON ist, wurde mit einer A. thaliana-cDNA-Bibliothek transformiert, die unter der Kontrolle des Phosphoglucerat-Kinase(PGK1)-Promotors (20) konstitutiv exprimiert worden war. Insgesamt 10⁷ Transformanten wurden auf Minimalmedium, welchem Uracil fehlte, selektiert und in Medien transferiert, die 180 ppm DON enthielten, was ausreichte, um das Wachstum von Hefe, die mit dem Plasmid mit leerer Bibliothek transformiert worden war, vollständig zu inhibieren. Kolonien, die eine Resistenz aufwiesen, wurden isoliert, und aus Anwärtern, die einzelne Kolonien auf toxin-hältigen Medien bildeten, wurde die Plasmid-Abhängigkeit des Phänotyps getestet durch die Herstellung von Plasmid-DNA und Retransformation von YZGA452. Das NotI-Fragment, welches das cDNA-Insert des Anwärters enthielt (genannt DON Glucosyltransferase 1, DOGT1), wurde in pBluescript SKII+ (Stratagene) subkloniert und sequenziert.
Konstitutive Expression und Immundetektion der DON- Glucosyltransferase (DOGT1) und naher Homologe in Hefe. Die Intron-losen offenen Leserahmen (ORFs) von DOGT1 (UGT73C5, Locus At2g36800) und 5 seiner nächsten Homologe (UGT73C1, At2g36750; UGT73C2, At2g36760; UgT73C3, At2g36780; UGT73C4, At2g36770; UGT73C6, At2g36790) wurden aus genomischer DNA mittels PCR amplifiziert (Triele Master PcR System, Eppendorf), wobei Gen-spezifische Primer verwendet wurden, die die flankierenden HindIII- und NotI-Restriktionsstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden enhielten (DOGT1, vorwärts: 5'-ACTAAGCTTGGAATCATGGTTTCCGAAACA-3', rückwärts: 5'-AAGCGGCCGCATACTCAATTATTGG-3'; 73C1, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCATCGGAATTTCG-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCATTTCTTGGGTTGTTC-3'; 73C2, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCTTTCGAGAAGACC-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCAACTCTTGGATTCTAC-3'; 73C3, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCTACGGAAAAAACC-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCATTCTTGAATTGTGC-3'; 73C4, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCTTCCGAAAAATC-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCAGTTCTTGGATTTCA-3'; 73C6: 5'-CTAAGCTTGGAACATGTGTTCTCATGATCCT-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCAATTATTGGACTGTGC-3'). Die PCR-Produkte wurden in die HindIII + NotI-Klonierungsstellen des Hefe-Expressionsvektors pYAK7 (PADH1-c-Myc-PDR5 LEU2 2μ) kloniert, wobei das PDR5-Gen ersetzt wurde. Der Vektor pYAK7 wurde konstruiert, indem zuerst der doppelsträngige Linker 5'-GGATGCCCGAACAAAAGTTAATTTCAGAAGAGGACTTATCAAAGCTTGAGGCCTCGCGA in die SmaI-Stelle des Vektors pAD4Δ (21), insertiert wurde, wodurch das N-terminale c-Myc-Epitop und eine HindIII-Stelle erzeugt wurden, in welche ein genomisches HindIII-Fragment, das die Hefe PDR5 enthielt, in frame insertiert wurde.
Die mit einem Tag versehenen UGT-Konstrukte wurden durch Sequenzieren verifiziert und zum Transformieren des Hefe-Stamms YZGA515 verwendet. Der leere Vektor (HindIII + NotI-verdautes und religiertes pYAK7) wurde als Kontrolle verwendet. Die Transformanten wurden auf Minimalmedien, welchen Leucin fehlte, selektiert. Exponentiell wachsende Kulturen wurden auf OD600 0,05 verdünnt und auf YPD-Medien, die zunehmende Konzentrationen verschiedener Trichothecene enthielten, aufgetüpfelt. Die verwendeten Toxine waren: DON, 3-ADON, 15-ADON, NIV, Trichothecin (TTC), T-2-Toxin, HT-2-Toxin, Diacetoxyscirpenol (DAS) und Veruccarin A (Va). Mit Ausnahme von DON, 3-ADON und NIV, die von Biopure Referenzsubstanzen GmbH (Tulln, Österreich) erhalten wurden, wurden die Mykotoxine von Sigma gekauft und bei –20°C, in 70% Ethanol gelöst, gelagert.
Für die Immundetektion wurde die Extraktion von Proteinen aus Hefezellen, wie von Egner et al. (22) beschrieben, durchgeführt. Die Western Blot-Analyse wurde mit einem primären Maus-anti-c-Myc-Antikörper durchgeführt (1:5000, Klon 9E10, Invitrogen).
Domänen-"shuffling". Die ORFs einschließlich dem N-terminalen c-Myc-tag von DOGT1 und seinem nächsten Homolog UGT73C6 wurden aus den Hefe-Expressionsvektoren durch SmaI + NotI-Verdau isoliert, in den Vektor pBluescript SKII+ kloniert (welcher mit XhoI geschnitten und mit Klenow-Enzym behandelt und danach mit NotI verdaut worden war). Die resultierenden Plasmide wurden mit HindIII und einer konservierten EcoRI-Stelle, die in beiden Genen vorhanden ist, die DOGT1 an der Nukleotid-Position 565 (73C6 an 568) schneidet, verdaut. Hybriden wurden durch Ligation des N-terminalen Teils des einen Gens an den C-terminalen Teil des anderen konstruiert. Die resultierenden Gene wurden in den Hefe-Expressionsvektor pYAK7 unter Verwendung der HindIII und NotI-Restriktionsstellen zurück bewegt. Der Hefe-Stamm YZGA515 wurde als Wirt verwendet, um die Konstrukte auf veränderte Entgiftungsfähigkeiten zu testen.
Stellengerichtete Mutagenese. Mutationen wurden durch Überlappungs-Verlängerungs-PCR („overlap extension PCR") (23) konstruiert, wobei die überlappenden mutierten Primer DOG-K136E-vorwärts (5'-TACAAGCGAAATCGCCAAGAAGTTCA-3') und DOG-K136E-rückwärts (5'-CTTCTTGGCGATTTCGCTTGTATAAG-3') und die flankierenden Primer DOGIpYAK7-vorwärts-(5'-ACTAAGCTTGGAATCATGGTTTCCGAAACA-3') und DOG-EcoRI-rückwärts (5'-TCTTGTGAATTCAACTCTATC AGGA-3') für die Mutagenese von DOGT1, und die mutierten Primer 73C6-E137K-vorwärts (5'-TACAAGCAAAATCGCC AAGAAGTTCAA-3') und 73C6-E137K-rückwärts (5'-ACTTCTTGGCGATTTTGCTTGTATT-3') und die flankierenden Primer 73C6pYAK7-vorwärts (5'-TAAGCTTGGAATCATGTGTTCTCATGATCCT-3') und DOG-EcoRI-rückwärts für die 73C6-Mutagenese verwendet wurden. Die resultierenden PCR-Produkte wurden als HindIII + EcoRI-Fragmente in die korrespondierenden Gene kloniert, die im Vektor pBluescript SKII+ vorhanden waren. Nach der Sequenzierung wurden die ORFs als HindIII + NotI-Fragmente in den Hefe-Expressionsvektor pYAK7 (das PDR5-Gen ersetzend) zurück bewegt, und die resultierenden Plasmide wurden in den Stamm YZGA515 transformiert, um die Entgiftungseigenschaften der hergestellten UGTs zu analysieren.
Synthese von 3-β-D-Glucopyranosy1-4-desoxynivalenol und 15-β-D-Glucopyranosy1-4-desoxynivalenol. Um Referenz-Material für HPLC und TLC zu erhalten, wurden DON-3-Glucosid und DON-15-Glucosid in 2-Schritt-Reaktionen synthetisiert. Im ersten Schritt wurden 15-Acetyl-DON oder 3-Acetyl-DON mit 1ββ-Brom-1-desoxy-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glucopyranose (Acetobromglucose) in Toluol mit CdCO₃ als Katalysator modifiziert, was die DON-Glucosid-Acetate (24) ergab. Im zweiten Schritt wurde eine sanfte Hydrolyse der Acetate zu den Glucosiden unter Verwendung eines stark basischen Anionen-Austauschers (DOWEX1x2-400, Aldrich, USA) durchgeführt. Nach Überprüfung des Fortschreitens der Reaktion mit TLC (mobile Phase Toluol/Ethylacetat 1:1, V/V) wurden die DON-Glucoside unter Verwendung von Flash-Chromatographie über Silikagel mit 1-Butanol/1-Propanol/Ethanol/Wasser (2:3:3:1, V/V/V/V) aufgereinigt. Eine weitere Reinigung der Substanzen wurde mit HPLC mittels einer RP-18 Aquasil-Säule (Keystone, Waltham, USA) unter Verwendung von Acetonitril/Wasser (10:90, V/V) bei 22°C durchgeführt.
Die synthetisierten DON-Derivate wurden im negativen Elektrospray-Interface(ESI)-Modus charakterisiert. Die LC-MS/MS-Analyse wurde auf einem QTrap-LC-MS/MS-System (Applied Biosystems, Foster City, USA), das mit ESI ausgestattet war, und mit einem 1100 Series HPLC-System (Agilent, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt. Die chromatographische Trennung wurde auf einer 150 mm × 4,6 mm i. d., 3 μm, Aquasil RP-18-Säule (Keystone, Waltham, USA) bei 22°C unter Verwendung von Methanol/Wasser (28:72, V/V) erreicht. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 0,3 ml/min eingestellt. Die ESI-Interface wurde im negativen Ionen-Modus bei 400°C mit CUR 20 psi, GS1 30 psi, GS2 75 psi, IS –4200 V, DP –46 V, EP –9 V, CE –30 eV, CAD hoch, LIT Füllzeit 50 ms, Q3 Eintrittsbarriere 8 V benützt.
Isolierung und Analyse von DON-Metaboliten in vivo. Um die chemische Struktur von DON-Metaboliten, die sich aus der enzymatischen Transformation des Mykotoxins durch DOGT1 ergeben, aufzuklären, wurde ein hoch toleranter Stamm konstruiert, und der DON-Metabolit wurde aus mit Toxin behandelten Zellen für die nachfolgende HPLC-Analyse extrahiert.
Der Hefe-Stamm YZGA515 wurde mit mit einem c-Myc-tag versehenem DOGT1 unter der Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors und zusätzlich mit dem Plasmid pRM561 transformiert. Dieses Plasmid enthält eine mutierte Version des ribosomalen Proteins L3 (RPL3) von Saccharomyces cerevisiae, die die DON-Resistenz bei einer Expression in Hefe wesentlich erhöht. Die Transformanten wurden auf Minimalmedien, welchen Leucin und Adenin fehlte, selektiert.
Der erhaltene Hefe-Stamm wurde auf eine OD₆₀₀ von 0,7 in selektivem Medium (SC-LEU-ADE) gezüchtet. Die Zellen wurden auf YPD-Medium (10% Glucose), das mit zusätzlichem Adenin ergänzt worden war, transferiert, 2 h lang bei 30°C gezüchtet, durch Zentrifugieren geerntet und auf eine OD₆₀₀ von 3,0 in YPD verdünnt. DON wurde auf 5 ml Kultur zugegeben, wobei mit 200 ppm DON begonnen wurde. Nach 3 h wurde die Konzentration auf 400 ppm erhöht, nach 6 h auf 600 ppm, und nach 9 h auf 1000 ppm. Die Zellen wurden weitere 15 h lang bei 30°C inkubiert, bevor sie geerntet, drei Mal mit eiskaltem Wasser gewaschen, in 2,5 ml Methanol/Wasser (4:1) extrahiert und mit Ultraschall behandelt wurden. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand durch ein Glas-Mikrofaser-Filter (Whatman 1822 025) filtriert. 500 μl der Hefeextrakte wurden unter einem konstanten Stickstoffstrom zur Trockene konzentriert und in 100 μl Wasser von HPLC-Qualität gelöst.
Heterologe Expression von DOGT1 in Escherichia coli. Das DOGT1-Protein wurde in Escherichia coli XL1-blue als GST-Fusion exprimiert. Das DOGT1-Gen wurde aus dem Hefe-Expressionsvektor freigesetzt durch HindIII-Verdau und Klenow-Auffüllung, gefolgt von einem NotI-Verdau. Das resultierende Fragment wurde in die SmaI + NotI-Stellen des GST-Genfusionsvektors pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia) kloniert. Das rekombinante Fusionsprotein wurde unter Verwendung von mit Glutathion gekoppelter Sepharose (Amersham Pharmacia) gemäß den Instruktionen des Herstellers gereinigt.
Um die Auswirkung des N-terminalen GST-tag auf die Aktivität zu testen, wurde das das Fusionsprotein codierende Gen mittels PCR amplifiziert, wobei DNA-Polymerase mit Korrekturleseaktivität („proofreading activity") (Pfu Polymerase, MBI) und die Fusionsprotein-spezifischen Primer GSTDOGpYAK7-vorwärts (5'-TCACCCGGGAAACAGTAATCATGTCC-3') und GSTDOGpYAK7-rückwärts (5'-CGAGGCAGATCGTCAGTCAGTC-3') verwendet wurden. Das PCR-Produkt wurde HindIII + NotI in den Hefe-Expressionsvektor pYAK7 kloniert. Die DON-Entgiftungsfähigkeit wurde durch Expression in YZGA515 und Aufbringen auf Toxin-hältige Medien getestet, wie früher beschrieben.
Enzym-Tests. Die Glucosyltransferase-Aktivitäts-Testmischung enthielt 1 μg rekombinantes GST-Fusionsprotein, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM Tris/HCl, pH 7,0, 0,5 mM radioaktiv markierte UDP [¹⁴C] -Glucose (4,4·10³ cpm, NEN Life Science Products, USA), 0,01% BSA und 1 mM Akzeptor-Substrat (aufgelöst in DMSO in 20 mM Stammlösungen). Die Umsetzungen wurden in Volumina von 20 μl bei 30°C 1 h lang durchgeführt, durch Zugabe von 2 μl Trichlor-essigsäure (240 mg/ml) gestoppt, gefroren und bei –20°C gelagert.
Eine Analyse der Reaktionsprodukte wurde mittels TLC durchgeführt. Ein Aliquot von jeder Probe wurde auf eine Siligagel-Platte (Kieselgel 60; Merck) aufgetüpfelt und mit einer Mischung aus 1-Butanol/1-Propanol/Ethanol/Wasser (2:3:3:1, V/V/V/V) entwickelt. Die Intensität jedes radioaktiven Spots wurde unter Verwendung eines Phospoimagers (STORM 860 System, Molecular Dynamics) bestimmt. Die Platten wurden zusätzlich mit p-Anisaldehyd (0,5% in Methanol/H₂SO₄/Essigsäure, 85:5:10, V/V/V) gefärbt.
Inhibierung von Weizen-Ribosomen in vitro. Um zu analysieren, ob das 3-β-D-Glucopyranosyl-4-desoxynivalenol weniger phytotoxhisch ist als sein Aglucon, wurde ein mit Weizenkeim-Extrakt in vitro gekoppeltes Transkriptions-/Translations-System (TNT Coupled Wheat Germ Extrakt, T3, Promega) verwendet. Nach 25-minütiger Durchführung der Transkriptions-/Translations-Reaktionen gemäß der Instruktionen des Herstellers in Anwesenheit von entweder, DON, gereinigtem DON-Glucosid (1 μM, 2,5 μM, 5 μM, 10 μM und 20 μM) oder Wasser als Kontrolle wurde die Aktivität der Leuchtkäfer-Luciferase-Reporters bestimmt (Luciferase Assay System, Promega), wobei ein Luminometer (Victor 2, Wallac) verwendet wurde.
Pflanzenbehandlung mit verschiedenen, mit Stressantwort verbundenen Verbindungen zur Expressionsanalyse. Für die Reverse Transkriptions(RT)-PCR-Analyse der mRNA-Expression von DOGT1 nach Behandlungen mit DON, Salicylsäure (SA), Jasmonsäure (JA) und 1-Aminocyclopropylcarbonsäure (ACC) wurden Sämlinge 2 Wochen lang auf vertikal-MS-Platten (0,8% Phytagar) gezüchtet, bevor sie in flüssige MS-Medien transferiert wurden. Die Pflanzen wurden 48 h lang auf einem Kreisschüttler („orbital shaker") (50 U/min) inkubiert, bevor 5 ppm DON, 200 μM SA, 2 μM ACC oder 50 μM JA zugegeben wurden. Die Verbindungen wurden in Stammlösungen gehalten, die entweder in 70% Ethanol oder in DMSO gelöst waren. Behandlungen mit Ethanol und DMSO wurden als Kontrollen durchgeführt. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet, in flüssigem Stickstoff gemahlen und bei –70°C gelagert, bis eine RNA-Extraktion durchgeführt wurde.
Analyse der mRNA-Expression von DOGT1 und nahen Homologen durch Reverse-Transkriptase-PCR. Gesamt-RNA wurde aus Pflanzengewebe, das in flüssigem Stickstoff mit Trizol Reagent gemahlen worden war, wie von den Herstellern empfohlen (Gibco BRL Life Technologies) isoliert. Die RNA wurde photometrisch und visuell auf einem denaturierenden RNA-Gel quantifiziert, wobei 5 μg der gesamten RNA analysiert wurden.
cDNA wurde aus 1 μg Gesamt-RNA (mit DNaseI verdaut) mit 500 ng eines 18-meren oligo(dT) und der Reverse-Transcriptase SuperScript (Gibco BRL Life Technologies) synthetisiert. Die PCR wurde mit etwa 2 μl der 1:20 verdünnten cDNA durchgeführt, wobei Primer verwendet wurden, die 200 bis 400 bp große Fragmente amplifizieren, die sich im C-terminalen Teil der zu analysierenden Gene befinden (DOGRT-vorwärts: 5'-ATCCGGGGTTGAACAGCCT-3',
DOGRT-rückwärts: 5'-TCAATTATTGGGTTCTGCC-3';
73C4RT-vorwärts: 5'-GGAGAAAATAGGAGTGTTA-3',
73C4RT-rückwärts: 5'-TCAGTTCTTGGATTTCACT-3';
73C6RT-vorwärts: 5'-GAGAAACTGGTCGTACAA-3',
73C6RT-rückwärts: 5'-TCAATTATTGGACTGTGCT-3';
UBQ5-U: 5'-GTCCTTCTTTCTGGTAAACGT-3',
UBQ5-D: 5'-AACC CTTGAGGTTGAATCATC-3'). Um relative Mengen der Transkripte in den Proben zu vergleichen, wurden DNA-Fragmente der UBQ5 zuerst amplifiziert, und normalisierte Proben-Volumina, basierend auf der Menge der Produkte, die den UBQ5-Transkripten entsprachen, wurden für die PCR verwendet.
Klonieren von Pflanzen-Überexpressions-Konstrukten und GUS-Fusions-Konstrukten. Für die konstitutive Überexpression von mit c-Myc-tag versehenem DOGT1-Protein in Arabidopsis wurde der Vektor pBP1319 konstruiert. Er stammt von einer modifizierten Version des Pflanzen-Expressionsvektors pPZP221 (25). Die Promotor-Kassette, die aus zwei Kopien des 35S-Promotors und dem Polyadenylierungssignal von CaMV, Stamm Cabb B-D bestand, wurde aus dem Vektor p2RT, einer modifizierten Version von pRTl00 (26), verwendet.
Das mit c-Myc-tag versehene DOGT1-Fragment wurde durch SmaI + NotI-Verdau (Klenow-Auffüllung) aus dem Hefe-Expressionsvektor freigesetzt und in pBluescript SKII+, welcher mit ClaI + SmaI geschnitten und mit Klenow-Enzym behandelt worden war, kloniert. Im nächsten Schritt wurde das Gen aus dem resultierenden Plasmid als SalI + BamHI-Fragment herausgeschnitten und in die XhoI + BamHI-Stellen von p2RT insertiert. Die erhaltene 2×35S c-Myc-DOGT1-Kassette wurde durch PstI-Verdau isoliert und in die unike PstI-Stelle von pPZP221 kloniert, nachdem die multiple Klonierungsstelle in diesem Vektor durch Verdauen des Plasmids mit EcoRI + SalI, Auffüllen der Stellen mit Klenow und Religation derselben zerstört worden war. Im resultierenden Vektor pBP1319 ist die 2×35S c-Myc-DOGT1-Kassette in der entgegengesetzten Richtung ausgerichtet wie der 2×35S Gentamycin-Resistenz-Marker.
Zur Konstruktion einer transkriptionellen DOGT1-GUS-Fusion wurde der GUS-Vektor pPZP-GUS.1, der aus pPZP200 herrührt und das GUS-Gen aus pBI101.1 (HindIII + EcoRI in die MCS insertiert) enthält, verwendet (27). Die DOGT1-Promotor-Region wurde aus der Genom-DNA mit PCR amplifiziert unter Verwendung der DNA-Polymerase mit Korrekturlese-Aktivität (Pfu Polymerase, MBI) und den spezifischen Primern (DOGP-GUS-vorwärts: 5'-GTTAAAAGCTTACATGTGCATTACGGTCTGTGTGAATA, DOGP-GUS-rückwärts: 5'-TTTCGGATCCCATG ATTCAACCTTAGTAAGAAACTCTC). Das resultierende Produkt wurde in frame mit dem GUS-Gen HindIII + BamHI in den pPZP-GUS.1-Vektor kloniert. Die Konstrukte wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
Herstellung und Analyse von transgener A. thaliana. Für alle Pflanzen-Transformationen wurde der recA-defiziente Agrobacterium tumefaciens, Stamm UTA143 (28) verwendet, der das Helfer-Plasmid pMP90 (29) enthält. A. thaliana wurde unter Anwendung der Blütentauch(„floral dip")-Technik transformiert (30). Die Nachkommenschaft von 15 unabhängigen Transformanten wurde durch drei Generationen hindurch selektiert, um homozygote Linien zu erhalten.
Zur Immundetektion von mit c-Myc-tag versehenem DOGT1 wurden etwa 200 mg–500 mg Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff homogenisiert. 300 μl Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,9; 200 mM KCl; 35 mM MgCl₂; 12,5 mM EGTA; 15 mM DTT; 0,6 mM Sorbit) und 15 μl Proteasen-Inhibitor Cocktail (Sigma, # 9599) wurden den noch gefrorenen Proben zugesetzt, und die Mischung wurde unter heftigem Schütteln 15 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Nach dem Zentrifugieren (14.000 U/min, 15 Minuten lang bei 4°C) wurden 200 μl der Überstände in frische Röhrchen transferiert und bei –20°C gelagert. Äquivalente Mengen an Protein (50 μg) wurden für die Western Blot-Analyse verwendet, die durchgeführt wurde, indem primärer anti-c-Myc-Antikörper, der aus Hybridom-Überstand gereinigt worden war (Klon 9E10), verwendet wurde.
Zur Analyse der DON-Resistenz wurden Samen homozygoter Linien, die eine hohe DOGT1-Expression aufwiesen, und Col-0 als Kontrolle auf MS-Medien, die verschiedene Konzentrationen von DON (5–30 ppm) enthielten, gekeimt. Die Sämlinge wurden 5 Wochen lang gezogen, bevor der Phänotyp dokumentiert wurde. Die GUS-Aktivität wurde durch 2- bis 4-stündiges Färben der Sämlinge oder Organe von adulten Pflanzen in X-Gluc-Lösung bei 37°C analysiert (31).
ERGEBNISSE
Isolierung der DON-Glucosyltransferase (DOGT1) durch heterologe Expression in Hefe. Ein funktioneller („unbiased functional”) Screen auf Basis der heterologen Expression von cDNAs in Hefe wurde mit dem Ziel erstellt, Pflanzengene zu identifizieren, die zur Resistenz gegen Mykotoxine beitragen. Wildtyp-Saccharomyces cerevisiae ist gegen Desoxynivalenol (DON) sehr resistent. Um die Menge des für den Screen nötigen Toxins zu verringern wurde ein Stamm erzeugt, dem alle vier ABC-Transporter fehlten, die weitgehend für pleiotrope Arzneimittel-Resistenz in Hefe verantwortlich sind (32). Der Stamm YZGA452 (sng2Δ::hisG pdr5Δ::TRP1 pdr10Δ::hisG yor1Δ::hisG) ist gegen ein breites Spektrum verschiedener xenobiotischer Substanzen und natürlicher Produkte, einschließlich DON, überempfindlich. YZGA452 wurde mit einer cDNA-Expressions-Bibliothek von A. thaliana (20) transformiert, wo cDNAs unter der Kontrolle des Hefe-Phosphoglucerat-Kinase-Promotors konstitutiv exprimiert sind. Zehn Millionen Transformanten wurden erzeugt, und verdünnte Pools von Transformanten wurden auf DON-enthaltendem Medium ausplattiert. Nach der Selektion DON-resistenter Hefe-Kolonien und Bestätigung der Plasmid-Abhängigkeit des Phänotyps wurde das Insert subkloniert und sequenziert.
DOGT1 ist ein Mitglied der UDP-Glucosyltransferase-Familie von A. thaliana und weist eine große Ähnlichkeit mit Salicylsäure- und Wund-induzierbaren Genen anderer Spezies auf. Die eine Resistenz übertragende cDNA hatte eine Größe von 1,75 kb und enthielt einen offenen Leserahmen von 1488 bp Länge, der für eine putative Uridin-Diphosphat(UDP)-Glucosyltransferase codiert. Die identifizierte DON-Glucosyltransferase (DOGT1) entspricht dem Gen UGT73C5 und gehört zur Unterfamilie 73C, einem Teil der Gruppe D der UDP-Glucosyltransferasen (UGTs) von A. thaliana (33). Arabidopsis-UGTs stellen eine sehr große Gen-Familie dar, die in 14 einzelne Gruppen unterteilt wurde, von welcher man annimmt, dass sie von gemeinsamen Vorfahren („common ancestors") herrührten (17). DOGT1 ist in einem Cluster (1B) zusammen mit fünf anderen Mitgliedern der Unterfamilie 73C auf dem Chromosom II (BAC Klon F13K3, At2g36800) lokalisiert. Alle sechs im Tandem wiederholten Gene enthalten keine Introns und sind einander stark ähnlich (77–89% Identität auf Aminosäure-Ebene). Die Ähnlichkeit ist auch in den intergenetischen Promotor-Regionen sehr groß.
Eine Datenbank-Abfrage mit der DOGT1-Aminosäuresequenz offenbarte eine große Ähnlichkeit mit Glucosyltransferasen von Tabak (TOGT1, ref. 34; Is5a und Is10a, ref. 35) und Tomate (Twi-1, ref. 36), deren Expression sich als erhöht nach Behandlung mit Salicylsäure (SA), Pilz-Auslösern oder Verwundung (34, 36, 37) erwies, und mit der Betanidin-5-O-Glucosyltransferase von Dorotheanthus bellidiformis (38). Zwei putative, uncharakterisierte Glucosyltransferasen von Vigna angularis (ADGT-9) und Oryza sativa mit einer Homologie mit DOGT1 wurden ebenfalls in der in 2 gezeigten Aminosäuren-Ausrichtung („alignment") inkludiert. Regionen von großer Ähnlichkeit wurden sowohl in den Amino- als auch in den carboxyterminalen Domänen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen beobachtet. In 2 angegeben sind die hypothetische Akzeptor-Substrat-bindende Region (38) und die UGt-Consensus-Sequenz (33).
Die Expression von DOGT1 ist entwicklungsmäßig reguliert und wird von DON und anderen, mit der Stress-Antwort verbundenen Verbindungen induziert. Um zu untersuchen, ob die Expression von DOGT1 auf ähnliche Weise reguliert ist, wie für die verwandten Gene anderer Pflanzen-Spezies beschrieben ist, wurde der ORF des β-Glucuronidase-Reporter-Gens hinter den DOGT1-Promotor platziert (P_DOGT1-GUS). Die Gewebe-spezifische Expression der transkriptionellen GUS-Fusion wurde histochemisch in transgener Arabidopsis, die für das Fusions-Gen homozygot war, untersucht. Die in 3 gezeigten Ergebnisse beweisen, dass die DOGT1-Expression entwicklungsmäßig reguliert und insgesamt ziemlich gering ist. Bei Sämlingen wurde beobachtet, dass die GUS-Aktivität Wurzel- und Hypokotyl-spezifisch ist, wobei die stärkste Expression im Gefäßsystem, im meristematischen Gewebe der Wurzelspitzen (in der Hauptwurzel sowie in den Seitenwurzeln) und im Gefäßsystem des Hypokotyls direkt nach der Keimung vorliegt. Zu einem späteren Zeitpunkt in der Entwicklung nahm die Färbung im Gefäßsystem stark ab, und ein fleckenförmiges Färbungsmuster trat in den epidermalen Wurzelzellen auf. Bei adulten Pflanzen wurde GUS-Aktivität in späten Stadien der Blütenentwicklung in den Blütenblättern und in den Abszissionszonen nachgewiesen (3A).
Es zeigte sich, dass die Einwirkung entweder von DON (5 ppm, 4 h lang) oder vom Ethylenvorläufer Aminocyclopropylcarbonsäure (ACC, 2 μM, 1 h lang) auf Sämlinge die P_DOGT1-GUS-Expression induziert (3). Keine Induktion einer Expression des Reporters wurde nach SA-Behandlung (200 μM, 12 h lang) oder Behandlung mit Jasmonsäure (JA, 50 μM, 1 h lang) nachgewiesen. Semiquantitative Reverse-Transkriptase-PCR wurde angewendet, um die aus den GUS-Reporter-Analysen erhaltenen Ergebnisse zu validieren, durch Detektion von Veränderungen in den mRNA-Levels von DOGT1, 73C4 und 73C6 nach Behandlung mit denselben Konzentrationen von DON, SA, ACC und JA, wie sie zuvor verwendet worden waren.
Wie in 3C gezeigt, bestätigen die Ergebnisse der Reverse-Transkriptase-PCR die DON-induzierbare Expression von DOGT1, welche zuvor mit dem Reporter-Konstrukt beobachtet worden war, und zeigen weiters, dass auch die anderen beiden getesteten UGTs durch DON induzierbar sind. Eine Erhöhung der Mengen der Transkripte wurde bereits nach einstündiger Inkubation mit dem Toxin beobachtet, erreichte einen Höhepunkt nach 4 h und nahm zwischen 6 und 12 h wieder ab. Interessanterweise wies 73C6 eine stärkere Induktion der Expression durch DON als DOGT1 oder 73C4 auf, obwohl die nachstehend gezeigten Daten anzeigen, dass es das Toxin nicht als Substrat annimmt. Nach SA-Behandlung, war eine DOGT1-, 73C4- und 73C6-Expression in geringen Höhen zum Zeitpunkt 4 h und etwas stärker zum Zeitpunkt 12 h evident. Es muss festgehalten werden, dass die aufgetragene Konzentration von 200 μM SA die Expression der 3 Gene ziemlich schwach induzierte. Jasomonsäure sowie die Behandlung mit ACC führen auch zu einer schwachen Induktion der Expression von DOGT1 und UGT73C6, die schon nach 1-stündiger Behandlung offensichtlich ist, jedoch rasch abfällt, wobei nach 2-stündiger Einwirkung auf die Verbindungen keine Transkript-Akkumulation mehr nachweisbar war (3C).
Phänotypische Bestimmung des Spektrums der Trichothecen-Resistenz in Hefe. Die Trichothecen-Toxizität bei Tieren hängt vom Hydroxylierungsmuster sowie von der Position, Anzahl und Komplexität der Veresterungen ab (5). Die grundlegende Trichothecen-Struktur und das Nummerierungssystem der Kohlenstoffatome sind in 1A gezeigt. Die Mitglieder der Unterklasse B (z. B. DON und NIV) enthalten eine Keto-Gruppe an Kohlenstoff C-8, die Trichothecene vom Typ A (z. B. das von F. sporotrichoides produzierte hoch toxische T-2-Toxin) jedoch nicht. Extrem toxisch sind auch makrozyklische Trichothecene, wie Veruccarin A, welche einen makrozyklischen Ring mit Esterbindungen enthalten, die den Kohlenstoff 4 und den Kohlenstoff 15 überbrücken. Hefe pdr5-Mutanten sind gegen alle bisher getesteten Trichothecene überempfindlich, was es ermöglicht, die Fähigkeit von DOGT1 und anderen Genen im Cluster, eine Resistenz gegen verschiedene Mitglieder der Trichothecene zu vermitteln, zu untersuchen.
Die große Ähnlichkeit von UGT73C1, C2, C3, C4, C5 (DOGT1) und C6 und ihr dicht zusammengedrängtes („clustered") Auftreten am Chromosom lässt vermuten, dass sie sich über Gen-Duplikation aus einem Stamm-Gen („ancestral gene") entwickelt haben und daher verwandte enzymatische Eigenschaften besitzen könnten. Um mögliche Ähnlichkeiten ihrer Funktion zu analysieren wurden sechs ORFs mit spezifischen Primers amplifiziert und in Hefe als Fusionsproteine mit einem N-terminalen c-Myc-Epitop-tag exprimiert. Ein Vergleich von Transformanten, die DOGT1 mit tags oder ohne tags exprimierten, zeigte, dass das Epitop mit der DON-schützenden Aktivität nicht interferiert. Die das vollständige Gen-Set des Clusters darstellenden Hefe-Transformanten wurden auf Medien, die steigende Konzentrationen verschiedener Trichothecene enthielten, aufgetüpfelt. Transformanten, die den leeren Expressionsvektor enthielten, wurden als Kontrollen verwendet.
Die in 1 gezeigten Ergebnisse offenbarten, dass UGT73C4 – so wie DOGT1 – eine DON-Resistenz vermittelt. Obwohl C4 nur die zweitgrößte Ähnlichkeit aufweist (79% Identität mit DOGT1), besaß es die Fähigkeit, DON und 15-ADON zu entgiften (1C), konnte jedoch keine Resistenz gegen 3-ADON, NIV, TTC, HT-2-Toxin, T2-Toxin, DAS und VA vermitteln. Dagegen schützte UGT73C6, das mit einer 89% Identität auf Aminosäure-Level die größte Ähnlichkeit aufweist, gegen keines der getesteten Trichothecene. In ähnlicher Weise konnte 73C3 keine Resistenz gegen die getesteten Mykotoxine vermitteln, obwohl alle vier Proteine in ähnlichem Ausmaß in Hefe exprimiert waren. Die Konstrukte 73C1 und 73C2 verstärkten auch nicht die Toxin-Resistenz, doch könnte dies auf geringere Level an rekombinantem Protein, die in den Hefe-Transformanten vorhanden waren, zurückzuführen sein (1D).
Die DON-Entgiftungs-Spezifität befindet sich im N- terminalen Teil von DOGT1. Die trotz ihrer hohen Sequenzähnlichkeit verschiedenen Merkmale der nah verwandten Enzyme machten es möglich, Merkmale der Proteine, die für die DON-Erkennung wesentlich sind, aufzuklären. Eine sowohl in DOGT1 als auch in 73C6 vorhandene EcoRI-Stelle (vgl. 4A) wurde verwendet, um Hybriden zu konstruieren, die den N-terminalen Teil des einen und den C-terminalen Teil des jeweiligen anderen Gens enthielten. Die Expression in Hefe und die Einwirkung von DON-hältigen Medien zeigte, dass der N-Terminus von DOGT1 (bestehend aus den ersten 189 AS) für die Fähigkeit, DON zu entgiften, wesentlich ist (4B).
Ein Lysin-Rest an Position 136 in DOGT1 ist im Entgifter 73C4 konserviert, aber in den beiden nicht-entgiftenden Homologen C3 und C6 durch andere Aminosäuren ersetzt. Die stellengerichtete Mutagenese wurde verwendet, um Mutationen in DOGT1 und das UGT73C6 einzuführen, was zu einem Tausch des Lysin-Rests 136 in DOGT1 zu Glutaminsäure führt, welche an der korrespondierenden Position in C6 vorhanden ist (Aminosäure 137). Das mutierte DOGT1^K136E-Protein schützte genauso effizient wie DOGT1, was beweist, dass K136 für die DON-Entgiftungsfähigkeit nicht wesentlich ist. Auch das umgekehrte Konstrukt 73C6^E137K blieb inaktiv.
In vivo- und In vitro-Analyse beweisen, dass DOGT1 den Transfer von Glucose von UDP-Glucose an die 3-OH-Position von DON spezifisch katalysiert. Der Schutz gegen 15-ADON und die Unfähigkeit, eine Resistenz gegen 3-ADON zu vermitteln, legten nahe, dass DOGT1 die Bildung von DON-3-O-Glucosid katalysieren könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden zuerst chemisch synthetisierte DON-Derivate hergestellt, bei welchen der Glucose-Teil entweder an der C3- oder C15-Hydroxy-Gruppe von DON gebunden war. Die beiden Produkte wurden mit LC-MS/MS charakterisiert. Das DON-3-O-Glucosid und das DON-15-O-Glucosid eluierten bei 12,43 min bzw. 12,68 min. Die Massenspektren der Glucoside wiesen charakteristische Unterschiede in ihrem Fragmentierungsmuster auf (5). Während das DON-3-O-Glucosid zu einem Ion von 427,2 m/z unter den gegebenen Umständen fragmentierte, wurde dasselbe Ion bei DON-15-O-Glucosid nicht nachgewiesen. Der Verlust von 30 Atom-Masse-Einheiten kann durch die Spaltung der -CH₂OH-Gruppe an C6 erklärt werden, welche verhindert wird, wenn die Hydroxyl-Gruppe mit Glucose konjugiert ist, wie bei DON-15-O-Glucosid. Ein weiterer Aufschluss ("breakdown") (MS) der DON-Glucoside in der linearen Ionenfalle zeigte ein fast identisches Fragmentierungsmuster wie jenes des [DON-H]-Ions (295,3 m/z, nicht fragmentiert in Q2), was das Vorhandensein von DON-Entitäten in den Reaktionsprodukten bestätigte.
Mit diesen Werkzeugen in der Hand war es möglich, direkt festzustellen, welches Glucosid in Hefezellen gebildet wurde. Der Hefestamm YZGA515, der infolge einer Deletion des Hefe-Acetyltransferase-Gens AYT1 unfähig war, DON in 3-ADON umzuwandeln, wurde sowohl mit dem DOGT1-Expressionsvektor als auch mit einem Plasmid transformiert, das ein Gen enthielt, welches für ein gegen Trichothecen unempfindliches mutiertes Ribosomen-Protein L3, das Ziel von Trichothecenen, codiert, um die DON-Toleranz von Hefezellen zu erhöhen. Nachdem der resultierende Stamm mit großen Mengen an DON, die eine Endkonzentration von 1000 ppm im Medium erreichten, inkubiert worden war, wurde der DON-Metabolit aus den Zellen extrahiert und mittels HPLC und Massenspektroskopie als das erwartete 3-O-Glucopyranosyl-4-Desoxynivalenol identifiziert (6A). 5 zeigt das Fragmentierungsmuster der synthetisierten Referenzsubstanzen und den Produkt-Peak von Hefe, die DOGT1 exprimiert. Wie erwartet war der Metabolit im Kontrollstamm, dem die DOGT1-Aktivität fehlte, nicht vorhanden.
Um die Substrat-Spezifität weiter zu verifizieren, wurde eine GST-DOGT1-Fusion konstruiert. Das GST-DOGT1-Fusions-Gen wurde ebenfalls in Hefe exprimiert, wo es eine DON-Resistenz wie Wildtyp-DOGT1 vermittelte. Das Gen-Produkt wurde in E. coli exprimiert und Affinitäts-gereinigt. Die während der Inkubation von entweder dem DOGT1-Fusions-Protein oder dem GST mit UDP[¹⁴C]-Glucose und DON in vitro erzeugten Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von TLC analysiert. Ein Spot mit demselben Rf-Wert wie das synthetisierte DON-Glucosid wurde bei der das GST-DOGT1-Fusions-Protein enthaltenden Reaktion beobachtet, jedoch nicht in der Kontrolle.
Glucosylierung von 4-Desoxynivalenol verringert dessen Toxizität stark. Um zu analysieren, ob das 3-β-D-Glucopyranosyl-4-Desoxynivalenol weniger phytotoxisch ist als DON, wurde ein in vitro gekoppeltes Weizenkeimextrakt-Transkriptions-/Translations-System verwendet. Wie in 6B gezeigt, inhibierte das Vorhandensein von 1 μM DON in der Reaktion die Protein-Translation signifikant, was zu 36,8% Reporter-Enzymaktivität im Vergleich zur Kontrolle (100%) führte. 5 μM des Toxins führten dazu, dass nur 3,1% Lumineszenz verblieb, wogegen 20 μM des synthetisierten DON-3-Glucosids die Luciferase-Aktivität zu nur 8% inhibierten. Diese Ergebnisse beweisen, dass die Glucosylierung von DON ein Entgiftungsprozess ist.
Überexpression von DOGT1 in Arabidopsis thaliana erhöht die DON-Resistenz. Transgene A. thaliana, die DOGT1 unter der Kontrolle eines Tandem-35S-Promotors exprimieren, wurden erzeugt und die Menge des rekombinanten Proteins in den Transformanten mittels Western Blot unter Verwendung des N-terminalen c-Myc-Epitop-tag bestimmt. Samen der homozygoten Linie 1319/2, von welcher es sich zeigte, dass sie einen hohen DOGT1-Expressions-Level hatte (6C), und von Wildtyp-Col-O als Kontrolle wurden auf MS-Medien, die 5–30 ppm DON enthielten, angekeimt und 5 Wochen lang gezogen, bevor der Phänotyp analyisert wrude.
Die wichtigste phytotoxische Wirkung, die beobachtet wurde, war eine langsame Keimung der Wildtyp-Pflanzen. Wurzelbil dung fand überhaupt nicht statt, Kotyledone entwickelten sich, begannen jedoch auszubleichen, bevor echte Blätter gebildet werden konnten. Nach dreiwöchiger Einwirkung von DON hatten die meisten Wildtyp-Sämlinge die gesamte grüne Farbe verloren und aufgehört, zu wachsen. DOGT1-Überexpressions-Linien wiesen auch eine klare Verzögerung in ihrer Entwicklung auf. Im Vergleich zum Wildtyp trat die Keimung früher ein, wurden Wurzeln gebildet, kam es zu keinem Ausbleichen von Kotyledonen und erschienen echte Blätter. Die beobachteten Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen DON waren auf Medien, die 15 ppm Toxin enthielten, am meisten offensichtlich (6D). Kontroll-Transformanten mit leerem Vektor (der nur das Gentamycin-Resistenz-Gen enthielt), und Linien, die geringe Mengen an DOGT1 exprimierten, waren genauso empfindlich wie Wildtyp Col-0.
DISKUSSION
Biotechnologische Relevanz. Fusarium-Krankheiten von Weizen und Gerste sind für die Länder auf der ganzen Welt von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Die Vereinigten Staaten wurden beispielsweise im letzten Jahrzehnt von Fusarium-Epidemien schwer getroffen. Direkte Verluste infolge von FHB für die Weizen-Produzenten der USA wurden auf durchschnittlich etwa $260 Millionen jährlich geschätzt, und im Zeitraum 1998–2000 wurden die kombinierten wirtschaftlichen Verluste für kleinkörnige Zerealien auf $2,7 Milliarden geschätzt (39). Eine Desoxynivalenol-Kontaminierung großer Mengen der Ernte kann zu einer großen Aufnahme des Mykotoxins führen. Kinder sind die Bevölkerungsgruppe mit dem höchsten Risiko einer Überschreitung des tolerierbaren täglichen Aufnahme-Levels ("tolerable daily intake", TDI) für DON. Im Problem-Jahr 1998 überschritten 80% der einjährigen Kinder in den Niederlanden den TDI (7).
Die große Bedeutung der Fusarium-Krankheiten rechtfertigt die Forschung betreffend eine Mykotoxin-Inaktivierung, obwohl eine Resistenz gegen das Pathogen höchstwahrscheinlich ein polygenes Merkmal bei Feldfrüchten und die Toxin-Resistenz nur eine ihrer Komponenten ist. Die Produktion von Trichothecenen ist der einzige Virulenzfaktor des Pilz-Pathogens, der bisher experimentell bestätigt wurde, mit Ausnahme von pleiotropen Mutationen in MAP-Kinasen, die nicht ausschließlich die Virulenz beeinflussen, sondern auch die Konidiation, Perithecien-Bildung, das vegetative Wachstum und die Mykotoxin-Produktion (40, 41). Die vorliegende Erkenntnis, dass eine Überexpression von DOGT1 zu erhöhter Desoxynivalenol-Resistenz bei transgener Arabidopsis führt, ergibt neue Möglichkeiten für biotechnologische Ansätze mit dem Ziel, den Pilzvirulenzfaktor zu antagonisieren. Das bisher einzige veröffentlichte Ergebnis beruht auf einer Fusarium-Acetyltransferase (42), die DON zu 3-ADON umwandelt, welches für Labortiere etwa zweimal weniger toxisch und somit keine Entgiftung in der Bedeutung der vorliegenden Erfindung ist. Der Phänotyp von transformierter Hefe und von Arabidopsis sowie Daten, die unter Verwendung von in vitro-Translations-Tests erhalten wurden, zeigen, dass das DON-Glucosid eine verringerte Toxizität aufweist. Im Allgemeinen führt die Glucosylierung reaktive und toxische Aglucone in stabile und nicht-reaktive Lager-Formen über, wodurch ihre Interaktion mit anderen Zellkomponenten beschränkt wird. Der Zusatz eines Zuckers blockiert die reaktive Stelle der Substanz und verringert folglich die Toxizität für die Pflanze. Solche Modifikationen werden weiters in Erwägung gezogen, um einen Zugang zu Membran-gebundenen Transportern vorzusehen, was Ausgangswege aus dem Cytosol beispielsweise zur Zellwand oder der Vakuole eröffnet (43).
Die Glucosylierung von Trichothecenen stellt einen Entgiftungsprozess für Pflanzen dar. Doch im Verdauungstrakt von Menschen und Tieren könnten die Mykotoxin-Glucokonjugate leicht hydrolysiert werden, wobei das Toxin regeneriert würde. Das Ausmaß, in welchem das DON-Glucosid zur Vakuole oder zum Apoplast transportiert wird, ist derzeit unbekannt. Bevor man versucht, transgene Pflanzen zu verwenden, die eine DON-Glucosyltransferase überexprimieren, sollte untersucht werden, ob nur das vakuoläre Glucosid oder auch Toxin, das an Zellwandmaterial als „unlöslicher Rest" gebunden ist, eine Quelle für „maskiertes Mykotoxin" (44) ist, welches traditionellen Analyse-Techniken entgeht und von viel stärkerer toxikologischer Relevanz sein könnte, als derzeit angenommen wird. Die während dieser Arbeit entwickelten Analyse-Werkzeuge und Referenzmaterialien sind geeignet, diese Fragen zu untersuchen.
Die Inaktivierung von Toxinen durch Glucosylierung scheint ein vorherrschender natürlicher Mechanismus für die Resistenz zu sein, der es Pflanzen ermöglicht, mit der enormen Vielfalt toxischer mikrobieller Metaboliten, auf die sie in der Natur treffen können, fertig zu werden. DOGT1 ist eines von 118 UGT-Genen in A. thaliana, welche voraussagegemäß kleine Moleküle konjugieren.
Die Expression von UGT-Genen in Hefe ist ein wertvoller komplementärer Ansatz zur weit verbreiteten Expression in E. coli, insbesondere wenn die entsprechenden Chemikalien nur in Eukaryonten Ziele haben. Ein Problem ist, dass Wildtyp-Hefe-Zellen häufig für die Substanzen, an welchen ein Interesse besteht, „undurchlässig" sind. Die Inaktivierung von mehreren ABC-Transportern im vorliegenden Wirtsstamm war eine Voraussetzung für den Ansatz, Resistenz-vermittelnde cDNAs auszuwählen. Im Fall von Trichothecenen ermöglichte dies die phänotypische Detektion der Aktivität der exprimierten Gene in einem einfachen Platten-Test. Im Prinzip könnte dieser Ansatz für viele andere Substanzen verwendet werden.
Gen-Evolution und Substrat-Spezifität. DOGT1 befindet sich in einem Cluster (1B) mit 5 anderen Mitgliedern der Familie 73C auf dem Chromosom II (At2g36800), was eine Gen-Duplizierung durch ungleiche Rekombinationsereignisse (32) anzeigt. Man könnte mutmaßen, dass ein solches Gen-Amplifikationsereignis einen selektiven Vorteil unter Toxin-Stress vorsieht. DOGT1 und andere Mitglieder im Cluster haben sehr ähnliche Proteinsequenzen, was eine Redundanz in der enzymatischen Funktion vermuten lässt. Beim Testen der Homologen zur Entgiftung von Trichothecenen stellte sich jedoch heraus, dass Hefe, die das Gen mit der größten Sequenzähnlichkeit, UGT73C6, exprimiert, gegen alle getesteten Toxine genauso empfindlich war wie der Wildtyp (sowie auch UGT73C3), während das zweitnächste Homolog UGT73C4 dieselben Eigenschaften aufwies wie DOGT1. Die enzymatische Aktivität gegenüber verschiedenen Hydroxycoumarinen wurde für alle Mitglieder des 73C-Clusters gezeigt (45), was darauf hinweist, dass die UGTs, welchen die schützende Aktivität gegen DON fehlt, nicht einfach Allele mit Funktionsverlust sind. Das Cluster ist daher ein Beispiel, das die Hypothese stützt, dass duplizierte UGT-Gene neue Substrat-Spezifitäten und Funktionen während der Evolution erwerben können.
Pflanzen-UDP-Glucosyltransferasen sind strukturell in ihrem Carboxy-terminalen Signatur-Motiv den Säuger-UGTs sehr ähnlich, die UDP-Glucuronsäure anstelle von UDP-Glucose als Donor-Substrat benützen. Die Säuger-Enzyme spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus und der Entgiftung von Chemikalien, wie Karzinogenen oder hydrophoben Arzneistoffen. Es zeigte sich, dass die UGTs von höheren Pflanzen an einem parallelen Bereich von Aktivitäten beteiligt sind, wobei auch xenobiotische Substanzen, wie Herbizide und andere Pestizide, modifiziert werden (46, 47). [Eine offene Frage ist, ob diese Entgiftungsreaktionen Nebenwirkungen von UGTs sind, die endogene Pflanzen-Verbindungen konjugieren. Obwohl jüngste Veröffentlichungen die Hypothese unterstützen, dass für die Umwandlung endogener Substrate verantwortliche UGTs auch für die Kapazität von Pflanzen, xenobiotische Substanzen zu entgiften, verantwortlich sein könnten (48), bedarf diese Frage zu ihrer Lösung noch weiterer Arbeit.]
Die Feststellung, dass DOGT1 einen Schutz gegen DON, jedoch nicht gegen NIV, welches eine zusätzliche Hydroxyl-Gruppe am Rest 4 besitzt (1A), schützt, zeigt, dass die Variation des Hydroxylierungsmusters des Trichothecen-Gerüsts ein wichtiger Mechanismus des Pilzes sein könnte, um solchen Entgiftungsreaktionen zu entgehen. Es ist unbekannt, ob Pflanzen auch NIV, das eine größere Toxizität als DON in Tier-Systemen hat (5), konjugieren kann. Das Fehlen der Aktivität gegen NIV ist ein starkes Argument gegen die Verwendung eines einzigen DOGT1-artigen Gens in transgenen Pflanzen, da NIV-produzierende Chemotypen von F. graminearum einen selektiven Vorteil erhalten könnten.
Die Konstruktion von hybriden Genen durch Umstellen („shuffling") des N- und C-terminalen Teils von DOGT1 und UGT73C6 und deren Expression in Hefe bewies, dass die N-terminalen 189 Aminosäuren von DOGT1 für deren Fähigkeit, DON zu entgiften, wesentlich sind, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass eine Substratbindung auf einem konservierten hydrophoben Gebiet zwischen Aminosäure 130 und 150 stattfinden könnte (38). Ein Vergleich von zwei Genen mit Schutzwirkung und zwei Genen ohne Aktivität, jedoch ähnlichem Expressions-Level, lieft vermuten, dass ein Lysin, das an Aminosäure-Position 136 in DOGT1 (und an der entsprechenden Position in UGT73C4) vorhanden ist, jedoch in den beiden UGTs, die Trichothecene nicht entgiften können, ersetzt ist, könnte für die Entgiftung von DON wichtig sein. Diese Hypothese wurde unter Verwendung von Stellen-gerichteter Mutagenese und Expression des erzeugten Proteins in Hefe als falsch bewiesen.
Informationen über spezifische Domänen oder Aminosäuren, die an der Akzeptor-Bindung von DOGT1 beteiligt sind, könnten potentiell nützlich sein für die Suche nach Glucosyltransferasen, die DON in Feldfrüchten, wie Weizen oder Mais, entgiften können. Man sollte jedoch bedenken, dass Versuche, UGTs ausschließlich auf Grund von Aminosäure-Ähnlichkeit Funktionen zuzuordnen, sehr fehleranfällig sind, wie im Fall des 73C-Clusters gezeigt wurde. Trotzdem kann die Funktionalität von Anwärter-Genen durch Expression in Hefe leicht getestet werden. Eine Möglichkeit, die nicht ausgeschlossen werden kann, ist, dass Glucoside von Trichothecenen in Feldfrüchten durch strukturell ziemlich unähnliche UGTs gebildet werden. Z. B. zeigte sich, dass UGT84B1 die höchste In vitro-Aktivität gegen das Auxin Indol-3-Essigsäure (IAA) von allen getesteten A. thaliana-UGTs hatte, dieses Enzym jedoch nicht die größte Sequenz-Ähnlichkeit mit dem funktionellen Homolog in Mais, dem Iaglu-Gen (49), aufweist.
Regulierung der Gen-Expression. Es zeigte sich, dass Gene mit großer Sequenz-Ähnlichkeit zu DOGT1 aus Tabak und Tomate durch Salicylsäure oder Verwundung induziert werden (34, 36, 37). Die Analyse der Expression von DOGT1 und 73C6 nach SA- und JA-Behandlung zeigte, dass sie mit erhöhten mRNA-Level auf SA, JA und den Ethylen-Vorläufer ACC schwach reagierten. Die Induzierbarkeit der Gen-Expression durch SA, JA oder Ethylen wird als Anzeichen für eine mögliche Rolle des hinaufregulierten Gen-Produkts bei Pflanzen-Stress- oder Verteidigungs-Reaktionen (50) angesehen.
Unter Verwendung einer Analyse der mRNA-Level und eines GUS-Reporter-Konstrukts war es möglich zu zeigen, dass DOGT1-Transkription bei Wildtyp-A.thaliana entwicklungsmäßig reguliert ist und als Antwort auf die Einwirkung von DON rasch und signifikant induziert wird. Die Induktion der Expression durch das Mykotoxin wurde auch bei anderen Mitgliedern des 73C-Clusters beobachtet, unabhängig von ihrer gegen DON schützenden Aktitivät. Es wäre interessant zu klären, ob die Induzierbarkeit Verbindungs-spezifisch oder ein allgemeines Phänomen bei Protein-Biosynthese-Inhibitoren ist. Die „ribotoxische Stress-Antwort" wird derzeit von Forschern an Humanzellen (51) aktiv untersucht, wo das Mykotoxin die Expression von Cyclooxigenase-2, einem Schlüssel-Enzym bei der Synthese von Vermittlern der Entzündungsreaktion, über die MAP-Kinasevermittelte Signalgebung, induziert. Die DON-induzierbare Expression von DOGT1 ist ein attraktiver Ausgangspunkt für die Untersuchung, ob es ähnliche Mechanismen in Pflanzen gibt.
Mit der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass die riesige Gen-Familie der Glucosyltransferasen, insbesondere – wie in den Beispielen gezeigt, UGTs, eine wichtige Rolle bei der Pflanzen-Pathogen-Interaktion spielen, indem sie an der Entgiftung von Metaboliten teilnehmen, die durch Mikroben erzeugt wurden, um ihre Virulenz an Wirten zu erhöhen. Ähnlich der großen Familie der Resistenz-Gene vom Leucin-reichen Repeat-Typ (52), die an der Pathogen-Erkennung beteiligt sind, könnten die Gen-Amplifikation und diversifizierende Selektion von UGTs zu einem breiten Schutzspektrum gegen Pilz-Toxine führen. Der selektive Druck, solchen Glucosylierungsreaktionen zu entkommen, könnte eine treibende Kraft in der Evolution mikrobieller biosynthetischer Reaktionen sein, was zu einem großen Spektrum an Toxin-Strukturen führt, wie für Trichothe cene beoachtet.
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54. Potrykus, I. und Spangenberg, G. (Eds.): Gene Transfer to Plants. Springer Verlag Berlin (1995), ISBN 3-54058406-4

Abkürzungen:

FHB: Fusarium Head Blight; DON: Desoxynivalenol; 15-ADON: 15-Acetyl-desoxynivalenol; NIV: Nivalenol; UGT: UDP-Glucosyltransferase; ABC: ATP-Bindungskassette; DOGT1: DON-Glucosyltransferase; ORF: Offener Leserahmen; GUS: β-Glucuronidase; SA: Salicylsäure; JA: Jasmonsäure; ACC: 1-Aminocyclopropylcarbonsäure; TDI („tolerable daily intake"): tolerierbare tägliche Einnahme; IAA: Indol-3-essigsäure; DAG („days after germination"): Tage nach Keimung.

Claims

Verfahren zur Entgiftung von Mykotoxinen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mykotoxin mit einer Glucosyltransferase in Gegenwart einer aktivierten Glucose in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucosyltransferase UDP-Glucosyltransferase ist und dass die aktivierte Glucose UDP-Glucose ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mykotoxin ausgewählt ist aus Trichothecenen, insbesondere Trichothecenen mit einer freien Hydroxy-Gruppe an Position C3 und zwei Wasserstoff-Gruppen an C4.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mykotoxin Desoxynivalenol, 15-Acetyldesoxynivalenol, 15-Acetoxyscirpendiol oder Mischungen davon ist (sind).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in vivo unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie und/oder Glucosyltransferase-Expression verstärkenden Verbindungen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucosyltransferase in einer transgenen Pflanzenzelle exprimiert wird, die eine rekombinante Glucosyltransferase und/oder einen rekombinanten Regulierungsbereich für eine Glucosyltransferase enthält.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mykotoxin-induzierbarer Promotor einer Glucosytransferase verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass die Glucosyltransferase an einer festen Oberfläche immobilisiert wird und eine Mykotoxin enthaltende Lösung oder Suspension mit der immobilisierten Glucosyltransferase in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucosyltransferase eine UDP-Glucosyltransferase ist, die der Unterfamilie 73C von Arabidopsis thaliana entspricht, insbesondere UDP-Glucosyltransferasen 73C5 und 73C4.
Rekombinante Zelle, die gegen Mykotoxine, insbesondere gegen Trichothecene, resistent ist, umfassend eine heterologe Glucosyltransferase oder eine verstärkte Expressionsaktivität einer endogenen Glucosyltransferase aufgrund von eine transgene Expression regulierenden Elementen und mindestens einen, vorzugsweise drei oder mehr, ABC-Transportern, die in ihrer Aktivität reduziert oder inaktiviert sind, insbesondere durch pdr5-Deletionen.
Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Pflanzenzelle oder eine Hefezelle ist.
Zelle nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Deletion in pdr5, pdr10, snq2, yor1, pdr15, ayt1 oder Kombinationen dieser Deletionen aufweist.
Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12 bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze oder Pflanzenzelle gegen Fusarium resistent ist.
Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Entgiftung von Mykotoxinen in Mykotoxin-hältigen Lösungen oder Suspensionen, insbesondere zur Entgiftung von Tri chothecenen in der Landwirtschaft oder in der Biererzeugung.
Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Herstellung glucosylierter Mykotoxine, insbesondere von glucosyliertem DON oder 15-ADON.
Verfahren zur Herstellung von glucosylierten Mykotoxinen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mykotoxin in vivo oder in vitro mit einer Glucosyltransferase in Gegenwart einer aktivierten Glucose in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Schritt nach einem der Ansprüche 2 bis 9 durchgeführt wird.