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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entgiftung von
Mykotoxinen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten von
Mykotoxinen.
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Ein
Komplex nah verwandter Spezies der Gattung Fusarium ist für destruktive
und wirtschaftlich höchst
wichtige Krankheiten bei Getreide-Feldfrüchten verantwortlich („Fusarium
Head Blight" (Ausbleichen
der Ähren)
FHB von Weizen und Gerste) und Mais (Fusarium-Kolbenfäule, „Fusarium
Ear Rot"). In Jahren
mit klimatischen Bedingungen, die die Entwicklung der Pilze begünstigen,
können
Fusarium-Infektionen epidemische Proportionen erreichen (1). Krankheiten,
die durch Pflanzen-Pathogene verursacht
werden, verringern nicht nur ganz beträchtlich die Ausbeute, sondern
führen
auch zur Kontamination von Getreide mit unannehmbar großen Mengen
von Mykotoxinen, einem Problem von weltweiter Bedeutung. Eine Toxin-Klasse,
die für
die Gesundheit von Mensch und Tier besonders besorgniserregend ist,
sind Trichothecene, sesquiterpenoide Epoxide, die starke Inhibitoren
der eukaryontischen Proteinsynthese sind. Mehr als 180 Verbindungen
dieser Klasse wurden aus natürlichen
Quellen isoliert, vorwiegend aus der Fusarium-Spezies (2). Je nach
der Konzentration und dem Substitutionsmuster des Trichothecen,
werden vorzugsweise entweder die translatorische Initiierung, Elongation oder
Termination inhibiert (3).
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F.
graminearum und F. culmorum sind die beiden am meisten relevanten
Verursacher des FHB von Zerealien. Während F. graminearum-Abstammungslinien,
die in Europa und Nordamerika vorhanden sind, vorwiegend Desoxynivalenol
(DON) und die acetylierten Derivate 3-Acetyl-desoxynivalenol (3-ADON)
und 15-Acetyl-desoxynivalenol (15-ADON)
erzeugen, dominieren in Asien die Erzeuger von Nivalenol (NIV),
welches eine zusätzliche
Hydroxylgruppe (1A) enthält (4).
Obwohl die Toxizität
dieser Trichothecene in Tiersystemen (5) gut untersucht ist, ist
nur wenig bekannt über
die Unterschiede in der Phytotoxizität. Es hat sich gezeigt, dass
die Einwirkung von DON (das auch als Vomitoxin bekannt ist) bei
Tieren nachteilige Auswir kungen auf die Gesundheit hat, wobei das
Nerven- und Immunsystem die empfindlichsten Ziele sind (6). Im Gegensatz
zu hohen DON-Dosen, die die Antikörper-Produktion inhibieren,
wirken geringe Dosen von DON mit bakteriellem Lipopolysaccharid
synergistisch und stimulieren proinflammatorische Prozesse (6).
Um Konsumenten zu schützen,
wurden von der US Food and Drug Administration empfohlene Level für Nahrungsmittel
erstellt, und kürzlich
wurden Wirkungs-Level für
DON von der Europäischen
Gemeinschaft empfohlen (7).
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Die
Rolle von DON bei Pflanzenkrankheiten ist noch immer umstritten
(8), doch sprechen die meisten Beweise für eine Funktion als Virulenz-Faktor.
Fusarium-Mutanten mit einem aufgebrochenen Gen, die an der Trochothecen-Biosynthese
beteiligt sind (Trichodien-Synthase, Tri5) sind noch immer pathogen,
weisen jedoch bei Weizen (9) eine verringerte Virulenz auf aufgrund
ihrer Unfähigkeit,
sich von der Infektionsstelle aus zuverbreiten (10). DON kann sich
bei befallenen Pflanzen vor dem Pilz verbreiten, was eine Rolle
bei der Konditionierung von Wirtsgewebe für die Besiedlung nahelegt (11).
Die Ergebnisse mehrerer Studien zeigen, dass die in vitro-Resistenz
von Weizen-Sorten gegenüber
DON mit der FHB-Resistenz im Feld korreliert (12), was auch für die Segregation
von Versuchs-Populationen
zutrifft.
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Eine
erhöhte
Resistenz gegen toxische Substanzen kann durch mehrere Mechanismen
bewirkt werden, die von einer verringerten Aufnahme bis zu einer
Umgehung („bypass"), Überexpression
oder Mutation des Toxin-Targets reichen. Ein sehr bedeutender Prozess
scheint jedoch die metabolische Transformation zu sein, auf die
häufig
eine Kompartimentierung folgt (13). Eine beobachtete Abnahme der
Konzentration von DON, die bei mit Fusarium infiziertem Weizen auf
dem Feld auftrat (14), deutete darauf hin, dass das Toxin metabolisiert
sein könnte.
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Die
Acetylierung von Trichothecenen (z. B. DON) wurde als potentielle
Resistenz-Strategie vorgeschlagen (
US 6,346,655 B1 ), jedoch sind die resultierenden
acetylierten Trichothecene (z. B. Acetyl-DON = ADON) in ihrer Gesamt-Toxizität der nicht-acetylierten Form
(z. B. DON) äquivalent,
wie von Eudes et al. in einem Coleoptil-Elongations-Test bewiesen
(53). Daher führt
die Acetylierung nicht zu einer Verringerung der Trichothecen-Toxizität.
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Zwei
Weizen-Sorten, die sich in der Fusarium-Resistenz unterschieden,
wiesen Unterschiede in ihrer Fähigkeit,
einen DON-Metaboliten zu bilden, auf, von welchem vermutet wurde,
dass er ein Glucosid sei (15). Seewald et al. (16) inkubierten eine Mais-Suspensions-Kultur
mit radioaktiv markiertem DON und bewiesen, dass es hauptsächlich mit 3-β-D-Glucopyranosyl-4-desoxynivalenol konjugiert war.
Es wurden bisher noch keine Pflanzen-Enzyme beschrieben, die fähig sind,
die Trichothecene oder andere Mykotoxine durch Transfer eines Zuckeranteils
zu modifizieren.
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Projekte
zur Genom-Sequenzierung offenbarten die Existenz einer großen Anzahl
von Genen in Pflanzen, die für
putative UDP-Glycosyltransferasen (UGT) codieren, von welchen vorausgesagt
wurde, dass sie kleine Moleküle
konjugieren. Z. B. wurde gezeigt, dass Arabidopsis thaliana mehr
als 100 Mitglieder dieser Multigen-Familie hat (17), deren Funktionen
weitgehend unbekannt sind.
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Die
WO 98/34471 offenbart eine
DNA-Sequenz, die für
Solanidin-UDP-Glucose-Glucosyltransferase (SGT) codiert. Diese DNA-Sequenz
kann verwendet werden, um Inhibitoren zu identifizieren, insbesondere
Antisense-Inhibitoren, die auf Solanidinerzeugende Pflanzen, wie
Kartoffeln, angewendet werden können,
um die Biosynthese von SGT und folglich die Erzeugung von Solanidin
zu inhibieren.
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In
der
WO 97/45546 ist
ein Gen geoffenbart, welches für
eine Glucosyltransferase codiert, die für die Induktion der Pflanzenverteidigung
und Resistenz-Antworten sowie regulierende Pflanzenentwicklungs-Vorgänge verantwortlich
ist.
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Die
WO 00/00626 betrifft ein
Verfahren zur enzymatischen Glykosylierung spezifischer aromatischer
Derivate, wie Coumarin.
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In
der wissenschaftlichen Veröffentlichung von
Von Rad U. et al. (Plant Journal (2001), 28:633–642) ist die Charakterisierung
von zwei Glucosyltransferasen, die an der Entgiftung von Benzoxazinoiden
in Mais beteiligt sind, beschrieben. Infolge einer Glucosylierung
dieser Substanzen kann die Autotoxizität der Pflanze verringert werden,
weil glucosylierte Produkte eine verringerte chemische Reaktivität aufweisen.
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In
Yamazaki M. et al. (J. Biol. Chem. (1999)274:7405–7411) ist
die Charakterisierung einer UDP-Glucose-Glucosyltransferase beschrieben, die
in Pflanzen synthetisiertes Anthocyanin glucolisieren kann.
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In
Eng-Kiat L. et al. (Biochem. J. (2003)373:987–992) werden Glucosyltransferasen geoffenbart,
die heterolog in Arabidopsis-Pflanzenzellen exprimiert werden können, welche
zur Glucosylierung von Kaffeesäure
verwendet werden können.
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In
Jackson R. G. et al. (Plant. J. (2002):473–583) wird die Charakterisierung
einer Glucosyltransferase von Arabidopsis thaliana beschrieben,
die Indo1-3-Essigsäure
in vitro glucosylieren kann.
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In
Yamazaki M. et al. (Plant. Mol. Biol. (2002)48:401–411) ist
die Klonierung und Glucosylierung von zwei Flavonoid-Glucosyltransferasen
der Pflanze Petunia hybrida beschrieben. Diese Glucosyltransferasen
sind für
die Glucosylierung von Anthocyaniden verantwortlich.
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In
Okubara P. A. et al. (Theor. Appl. Genet. (2002)106:74–83) ist
eine Acetyltransferase eines Fusarium-Stamms beschrieben, welcher
die Toxizität von
Desoxynivalenol (DON) durch Transferieren einer Acetylgruppe an
dieser Verbindung verringern kann.
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In
Sewald N. et al. (Tetrahedron Asymmetry (1992) 3:953–960) ist
die Isolierung von glucosyliertem Desoxynivalenol aus Zea mays geoffenbart,
welches den Haupt-Metaboliten von Desoxynivalenol in Maiszellen
darstellt.
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In
Meßner
B. et al. (Planta (2003) 217:138–146) ist eine UDP-Glucose-abhängige Glucosyltransferase
von Arabidopsis thaliana geoffenbart. Diese Glucosyltransferasen
können
die Toxizität von
Xenobiotika in einer Pflanze sowie in vitro verringern.
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In
Miller J. D. et al. (Canad. J. Plant. Pathol. (1996) 8:147–150) ist
die Inkubation von Desoxynivalenol in einer Suspension von Fusarium-resistentem Weizen
beschrieben, wobei entdeckt wurde, dass im Laufe dieser Inkubation
Desoxynivalenin teilweise glucosyliert wird.
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In
Gorst-Allman C. P. et al. (J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1985) 7:1553–1556) wird
die Erläuterung
von Trichothecen-Glycosiden
bei mit Fusarium infizierten Maispflanzen beschrieben. Der Zuckerrest der
Glycoside wurde als Glucose identifiziert.
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Schäffner A.
et al. (Acta Biotechnol (2002) 22:141–152) beschreiben allgemeine
Entgiftungswege bei Pflanzen, um die Pflanze vor endogenen und xenobiotischen
Substanzen zu schützen.
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Es
ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Entgiftung von Mykotoxinen vorzusehen.
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Es
ist oft schwierig, geeignete Präparate
von Mykotoxinen oder Derivaten davon, insbesondere Zucker-Konjugat-Derivate
von Mykotoxinen, vorzusehen. Da die Stereoselektivität für diese
Art von Produkten wesentlich ist, sind rein chemische Synthesen auf
Basis von allgemeinen Massen-Mykotoxinen oft schwierig, wenn nicht
unmöglich,
zumindest in großtechnischem
Maßstab.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren
zur Synthetisierung von Zucker-Konjugat-Derivaten von Mykotoxinen vorzusehen.
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Daher
sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Entgiftung von
Mykotoxinen vor, wobei ein Mykotoxin mit einer Glucosyltransferase
in Anwesenheit einer aktivierten Glucose in Kontakt gebracht wird.
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Wie
voranstehend erwähnt,
wurde bisher im Stand der Technik noch kein Bericht in Bezug auf (Pflanzen-)Enzyme,
die Mykotoxine durch Transfer eines Zuckermoleküls modifizieren können, veröffentlicht,
und natürlich
nicht in Bezug auf solche Enzyme, die Mykotoxine entgiften können, d.
h. die Toxizität
von Mykotoxinen in beträchtlichem
Ausmaß verringern,
z. B. um mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, insbesondere mehr
als 95%, wie mittels spezifischer Mykotoxin-Tests wie der Inhibierung der
in vitro-Proteinsynthese, bestimmt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurde festgestellt, dass Glucosyltransferasen ein sehr
spezifisches Werkzeug zur Entgiftung von Mykotoxinen sind. Die Spezifität ist einerseits
durch eine gewisse Spezifität
bestimmter Glucosyltransferasen für nur eine begrenzte Anzahl
von Mykotoxinen und anderseits auch durch die Spezifität in Bezug
auf die Art der Entgiftung, nämlich
durch Stellen-spezifische Glucosylierung der Mykotoxine, gegeben.
Obwohl diese Spezifität
den Umfang der Anwendung auf eine bestimmte einzelne Glucosyltransferase
einschränkt, sieht
die vorliegende Erfindung Werkzeuge vor, um die Spezifitäten jeder
Glucosyltransferase in Bezug auf jedes Mykotoxin, insbesondere Trichothecen-Mykotoxine,
leicht zu bestimmen. Daher ermöglicht
die vorliegende Erfindung eine direkte Identifizierung von spezifitäten für andere
Glucosyltransferasen und Mykotoxine, wenn ein bestimmtes Enzym für einen
bestimmten Satz Mykotoxine spezifisch ist.
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Da
Uridin-Diphosphat-Glucose (UDP-Glucose, z. B. Glucose, die von Enzymen,
wie Pyrophosphorylasen, erzeugt wird) eine bevorzugte aktivierte biologische
Form der Glucose ist, wird bei einer bevorzugten Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens UDP-Glucosyltransferase als Glucosyltransferase
und eine UDP-Glucose als aktivierte Glucose (= Cosubstrat) benützt; es
kann jedoch jede Form von Glucose, die von einer Glucosyltransferase
benützt
werden kann (z. B. ADP-Glucose, CDP-Glucose oder jede andere Form einer
biologisch und synthetisch aktivierten Glucose, die geeignete Substrate für den Transfer
zu Mykotoxinen durch Glucosyltransferasen sind) gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Eine
Glucosyltransferase gemäß der vorliegenden
Erfindung ist als ein (natürlich)
vorkommendes oder synthetisch (rekombinant) entworfenes oder erzeugtes
Enzym definiert, welches (als seine Haupt- oder als eine Nebenaktivität) fähig ist,
einen Glucoseanteil unter Verwendung einer aktivierten Glucose als
Cosubstrat zu einem Substrat-Molekül zu transferieren, wobei ein
glucosyliertes Substrat-Molekül
erzeugt wird.
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Bevorzugte
Mykotoxine zur Entgiftung durch das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung sind – infolge
ihrer wirtschaftlichen Bedeutung – Trichothecene, insbesondere
Tri chothecene mit einer freien Hydroxygruppe an der Position C3 und zwei Wasserstoffgruppen an C4. Insbesondere die letzteren Trichothecene
sind entweder an ihrer Position 3 oder – falls vorhanden – an einer
freien Hydroxyguppe an Position 7 oder an beiden Positionen spezifisch glucosyliert.
Daher sind bevorzugte Mykotoxine Desoxynivalenol, 15-Acetyl-desoxynivalenol,
15-Acetoxyscirpendiol oder Mischungen davon.
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Ein
bevorzugter Weg zur Durchführung
des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung ist der in vivo-Modus. Dies kann unter Verwendung von
rekombinanter DNA-Technologie und/oder von Verbindungen, die die
Glucosyltransferase-Expression verstärken, erfolgen. Bevorzugte
Beispiele umfassen die Expression einer Glucosyltransferase in einer transgenen
Pflanzenzelle (oder Pflanzengewebe oder ganzen Pflanze), die eine
rekombinante Glucosyltransferase und/oder eine rekombinante regulierende
Region für
eine Glucosyltransferase enthält, insbesondere
einen Mykotoxin-induzierbaren Promotor, insbesondere von einer Glucosyltransferase.
Bevorzugte Beispiele für
Verbindungen, die die Glucosyltransferase-Expression verstärken, sind
Substanzen, die die Glucosyltransferase hinauf regulieren, z. B.
Toxine (wenn die Expression der Transferase durch Toxininduzierbare
Promotoren gesteuert wird). Im Prinzip kann jede Zelle, die genetisch
manipulierbar ist, so dass sie ein rekombinantes Pflanzen-Glucosyltransferase-Gen
exprimiert (d. h. ein Gen, welches künstlich in diese Zelle eingeführt wurde,
oder dessen Vorläufer,
und welches von Natur aus nicht an dieser Stelle des Genoms der
Zelle vorhanden ist), für
diesen Zweck verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen sind transgene
Bakterien, Hefen, mit Baculovirus infizierte Insektenzellen usw.,
die ein Pflanzen-Glucosyltransferase-Gen exprimieren.
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Bei
einem industriellen Verfahren zur Entgiftung von Mykotoxinen kann
die Glucosyltransferase vorteilhaft an einer festen Oberfläche immobilisiert sein
(gemäß Standard-Immobilisierungstechniken), und
eine Mykotoxin enthaltende Lösung
oder Suspension kann dann mit dieser immobilisierten Glucosyltransferase
in Kontakt gebracht werden.
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Bevorzugte
Beispiele für
gemäß der vorliegenden
Erfindung zu verwendende Glucosyltransferasen sind UDP-Glucosyltransferasen,
die der Unterfamilie 73C von Arabidopsis thaliana entsprechen, insbesondere
die UDP-Glucosyltransferasen
73C4 und 73C5.
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Gemäß einem
anderen Aspekt ermöglicht die
vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von glucosylierten
Mykotoxinen, wobei ein Mykotoxin mit einer Glucosyltransferase in
Gegenwart einer aktivierten Glucose in Kontakt gebracht wird. Damit
können
die voranstehend erwähnten
Enzym-Spezifitäten
richtig verwendet werden, um spezifisch glucosylierte Mykotoxin-Derivate
herzustellen. Wenn ein Mykotoxin auf nicht-enzymatischem („chemischem") Weg glucosyliert
wird, wird eine rohe Mischung glucosylierter Produkte erhalten (jede
freie Hydroxy-Gruppe ist im Prinzip eine Akzeptor-Stelle für Glucosyl-Reste).
Die Acetylierung als Schutzmittel für solche Gruppen hat auch ihre
Nachteile in Bezug auf die Spezifität (auch alle Hydroxy-Gruppen werden
acetyliert). Durch die Verwendung von Substrat- und Stellen-Spezifität sieht
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung gut definierter glucosylierter
Derivate vor. Wenn mehr als eine Hydroxy-Gruppe glucosyliert ist
oder wenn mehr als eine Position durch eine bestimmte Glucosyltransferase
glucosyliert werden kann, kann eine begrenzte Anzahl von Produkten
(z. B. 2 bis 5) durch geeignete Trennungsmittel, wie HPLC, leicht
getrennt werden (z. B. DON, das an Position Nr. 3 glucosyliert ist,
kann leicht von DON, das an Position 7 glucosyliert ist, getrennt
werden).
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Die
voranstehend beschriebenen bevorzugten Verfahrensschritte sind auch
auf diesen Aspekt der Erfindung anwendbar.
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Gemäß einem
anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen
oder transgene (Pflanzen-)Zellen, die eine rekombinante Glucosyltransferase
und/oder ein rekombinantes Expressions-regulierendes Element, insbesondere
eine Promotor-Region für
eine Glucosyltransferase, enthalten. Diese Pflanzen oder (Pflanzen-)Zellen
können
bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine genetisch modifizierte
Zelle oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze oder eine
Pflanzenzelle, die eine nicht von Natur aus vorkommende (transgene)
Glucosyltransferase in ihrem Genom aufweist und, auf Grund des Vorhandenseins
einer solchen Glucosyltransferase als Transgen, Mykotoxin-resistent,
insbesondere Trichothecen-resistent ist. Alternativ kann eine endogene
Glucosyltransferase in einer Zelle einer anderen, transgenen Expressions-regulierenden
Region oder einem Element, wie einem Promotor, ausgesetzt werden,
was zu einer verstärkten
Expression der endogenen Glucosyltransferase führt (d. h. einer verstärkten Expressionsaktivität einer
homologen Glucosyltransferase infolge eines transgenen Promotors).
Auch solche Zellen zeigen eine verstärkte Resistenz gegen Mykotoxine,
wie hierin beschrieben. Solche Zellen und Pflanzen können durch
Anwendung von Standardmethoden an die Lehre der vorliegenden Erfindung
hergestellt werden (vgl. z. B. 6B und
die Beispiele wie z. B. (54)).
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Bevorzugte
Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung
sind auch Hefezellen. Da Hefezellen eine begrenzte Aufnahmefähigkeit
haben können,
sind bevorzugte Hefezellen gemäß der vorliegenden
Erfindung für
eine erhöhte
Mykotoxin-Aufnahmefähigkeit
im Vergleich zum Wildtyp- oder Ausgangsstamm entworfen oder ausgewählt.
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Die
genetisch modifizierten Zellen weisen einen oder mehr, vorzugsweise
drei oder mehr ABC-Transporter auf, die in ihrer Aktivität reduziert oder
inaktiviert sind, insbesondere pdr5. Solche ABC-Transporter-Mutanten
sind durch eine verstärkte
Aufnahme von Mykotoxinen gekennzeichnet. Vorzugsweise weisen die
Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Deletion in pdr5, pdr10, pdr15, snq2, yor1, ayt1
oder Kombinationen dieser Deletionen auf.
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Diese
Zellen können
vorzugsweise zur Entgiftung von Mykotoxin-hältigen Lösungen oder Suspensionen, insbesondere
zur Entgiftung von Trichothecenen in der Landwirtschaft und Bierproduktion verwendet
werden; und bei der Produktion von glucosylierten Mykotoxinen, insbesondere
von glucosyliertem DON oder 15-ADON.
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Die
vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Beispie le und die
Figuren weiter veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.
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FIGUREN:
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1:
Spektrum der Trichothecen-Resistenz von Hefe, die Arabidopsis thaliana
UDP-Glucosyltransferasen der Unterfamilie UGT73C exprimiert.
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A,
Struktur und Nummerierung des Ringsystems von Trichothecenen der
Klasse B, die zum Testen der Resistenz verwendet wurden. Die verschiedenen
Reste an variablen Positionen R1-R4 sind in der Tabelle angegeben
(OAc: -OCOCH3, OBe: -OCOCH=CHCH3 (Z)).
Das relevante R1 ist unterstrichen (OH in
DON, bereits durch Acetylierung in 3-ADON blockiert). Eine durch
die DOGT1-Expression übertragene
erhöhte
Resistenz ist durch plus angezeigt, ein Fehlen des Schutzes durch
minus. B, Genom-Organisation
des UGT-Gen-Clusters am Chromosom II (Unterfamilie 73C), enthaltend DOGT1
(UGT73C5, Locus At2g36800). Das DON-entgiftende DOGT1 und 73C4 sind
grau schattiert. C, Hefestämme
wurden auf YPD-Platten, die die angegebene Menge Toxin (ppm: mg/l)
enthielten, aufgetüpfelt
(gespotted). Die Stämme
sind Wildtyp YZGA515 ohne Plasmid (wt), dieser Stamm, mit leerem
Vektor transformiert (c) und die Transformanten, die die mit myc-tag
versehenen 73C UGTs exprimieren (CSDOGT1, unterstrichen, im Duplikat
aufgetüpfelt).
Die Resistenz wird durch Plasmide übermittelt, was zur Überexpression
von C5 und C4 führt.
D, Western Blot-Analyse der Hefestämme, die zum Testen der Resistenz
verwendet wurden. Das N-terminale c-Myc-Epitoptag, das in die entsprechenden
73C UGT-Familienmitglieder eingeführt wurde, ist detektiert (C5=DOGT1,
unterstrichen). Eine den leeren Expressionsvektor enthaltende Transformante
wurde als Kontrolle verwendet.
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2.
Aminosäure-Ausrichtung
(„alignment") von Pflanzen-UDP-Glucosyltransferasen
mit hoher Aminosäure-Ähnlichkeit
mit DOGT1. Die in der Akzeptorsubstrat-Bindung implizierten Regionen (punktiert)
(Ref. 38) und das UGT-Consensus-Sequenz-Motiv (strichliert) sind
unter den Sequenzen durch Kästchen
angegeben. Das Dreieck über
der Sequenz in der hypothetischen Akzeptor-Bindungsregion kennzeichnet
das Lysin 136 in DOGT1, wel ches durch in vitro-Mutagenese verändert wurde.
Die Genbank-Hinterlegungsnummern
der vorhergesagten Proteine sind: ADGT-9, Glucosyltransferase-9 von
Vigna angularis (A3070752); TOGT1, Phenylpropanoid:glucosyltransferase
1 von Nicotiana tabacum (AF346431); IS5a von Nicotiana tabacum (U32644); putative
Glucosyltransferase von Oryza sativa (AP002523); Twi1 von Lycopersicon
esculentum (X85138); Betanidin-5-O-glucosyltransferase von Dorothenatus
bellidiformis (Y18871).
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3.
Die DOGT1-Expression wird in ihrer Entwicklung reguliert und induziert
von DON und von Verbindungen, die mit der Antwort auf Stress in
Verbindung stehen. A, GUS-Färbung
von Sämlingen,
die für
eine transkriptionelle DOGT1 Promotor-GUS-Fusion homozygot sind. Obere Reihe:
drei Tage nach der Keimung (3 DAG) ist die Expression des Fusionsproteins
auf das Gefäßsystem
von Wurzel und Hypokotyl und die meristematische Region der Wurzelspitze
eingeschränkt.
Mitte: Später
in der Entwicklung (10 DAG) nimmt die Färbung im Wurzel-Gefäßsystem
ab, außer
in jenen Regionen, in welchen Seitenwurzeln gebildet werden. Untere
Reihe: In den oberirdischen Teilen adulter Pflanzen ist die DOGT1-Expression
auf die Blätter
von Blüten
und die Abszissionszonen beschränkt.
B, DON-Behandlung (5 ppm, 4 Stunden lang) von Sämlingen (14 DAG), die die translationale
GUS-Fusion exprimieren, induziert die Expression des GUS-Reporters. Beide
Proben wurden 2 Stunden lang gefärbt.
C, Semiquantitative Reverse-Transkriptase-PCR-Analyse der Induktion
der Expression von DOGT1, UGT73C4 und UGT73C6 nach Behandlung mit
DON (5 ppm), SA (100 μM),
JA (50 μM)
und ACC (2 μM).
UBQ5 wurde als innere Kontrolle verwendet.
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4.
Der N-terminale Teil von DOGT1 ist für seine Fähigkeit, DON zu entgiften,
wesentlich. A, Aminosäure-Ausrichtung („alignment") von DOGT1 und seinem
nächsten
Homolog, UGT73C6, welches nicht gegen DON schützt (schwarz: Aminosäure-Identität). Die
konservierte EcoRI-Restriktionsstelle wurde verwendet, um chimäre UGTs
zu erzeugen, die aus dem N-Terminus
von einem und dem C-Terminus des jeweiligen anderen Gens bestehen.
B, Hefe-Transformanten wurden im Duplikat auf YPD-Medium getüpfelt, das
die angegebenen Konzentrationen von DON enthielt. Oben links: Transformanten, die
das chimäre
Enzym exprimieren, bestehend aus dem UGT73C6-N-Terminus und dem
DOGT1-C-Terminus (kurz: C6-DOG). Oben rechts: Stämme, die das chimäre Protein
exprimieren, bestehend aus dem DOGT1-N-Terminus und dem UGT73C6-C-Terminus
(DOG-C6). Untere Reihe: Transformanten, die das Resistenz vermittelnde
DOGT1 exprimieren (links), und inaktives 73C6 (rechts). Die den
N-terminalen Teil von DOGT1 enthaltende Hybride ist resistent gegen
höhere
DON-Konzentrationen als der Stamm, der die andere Hybride (C6-DOG) exprimiert oder
UGT73C6.
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5.
Fragmentierungsmuster von synthetisierten DON-Glucosiden und einem DON-Metaboliten,
der in Hefezellen gebildet wurde, die DOGT1 exprimieren, in der
Massenspektrometrie. A, das synthetisierte DON-3-O-Glucosid ergibt
ein Fragment von 427,2 m/z in der linearen Ionenfalle (MS/MS/MS).
B, Dieses Fragment wurde nicht erzeugt von der synthetisierten DON-15-O-Glucosid-Probe, da
eine Trennung der -CH2OH-Gruppe an C6 verhindert wird durch den Glucose-Anteil,
der an der Hydroxylgruppe vorhanden ist. C, Der DON-Metabolit, der
in Hefe gebildet wurde, die DOGT1 exprimiert, eluierte in der HPLC
mit derselben Retentionszeit wie das DON-3-O-Glucosid und wies das
der DON-3-O-Glucosid-Referenzsubstanz entsprechende Fragmentationsmuster
auf.
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6.
Glucosylierung von DON verringert die Toxizität in vitro und in vivo. A,
Struktur des vorgeschlagenen Reaktionsprodukts: DOGT1 katalysiert den
Transfer von Glucose von UDP-Glucose
zur 3-OH-Position von DON. B, Vergleich der Inhibition der in vitro-Proteinsynthese
von Weizen-Ribosomen durch DON und DON-3-O-Glucosid, bestimmt unter Verwendung
eines Weizenkeimextrakts auf Basis eines gekoppelten Transkriptions-/Translations-Systems.
Die Lumineszenz wurde gemessen und als Luciferase-Aktivität der Kontrollproben
ohne Toxin ausgedrückt.
C, Western Blot-Analyse von A.thaliana-Linien, die für ein Überexpressions-Konstrukt
homozygot waren, das ein mit einem c-Myc-tag versehenes DOGT1 codiert.
Eine schematische Zeichnung des Pflanzen-Transformationsvektors
ist darunter gezeigt (GENT: Gentamycin-Resistenz als selektierbarer Marker verwendet;
2×35S
duplizierter Promotor des Blumenkohl-35S-Transkripts (für Details siehe Versuchsmethoden)).
Col-0 wurde als negative Kontrolle verwendet. 2 Linien mit hohen
und 2 Linien mit niedrigen Level des c-Myc-DOGT1-Proteins sind gezeigt. D,
Samenkeimung auf DON enthaltendem MS-Medium. Im Vergleich zum Wildtyp
(Col-0) weisen transgene Arabidopsis-Linien, die große Mengen an DOGT1 exprimieren
(z. B. die Linie 1319/2), eine verstärkte Resistenz auf.
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BEISPIELE
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Zur
Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung sind in den nachfolgenden
Beispielen das Klonieren einer Arabidopsis-UGT durch funktionelle Expression in
Hefe und ihre Charakterisierung beschrieben. Dieses Enzym kann das
Fusarium-Mykotoxin DON und sein acetyliertes Derivat 15-ADON entgiften.
Die in diesen Beispielen verwendeten Methoden sind auch auf andere
Glucosyltransferasen und Mykotoxine ohne übermäßige Belastung durch Versuche
direkt anwendbar.
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VERSUCHSMETHODEN
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Hefestämme. Die
bei dieser Arbeit verwendeten Hefestämme stammen von YPH499 (Mat
a, ade2-101oc, his3-Δ200,
leu2-Δ1,
lys2-801a, trp-1-Δ1,
ura3-52) (18). Der relevante Genotyp von YZGA452 ist pdr5Δ::TRP1, pdr10Δ::hisG, sng2Δ::hisG, yor1Δ::hisG. YZGA515
(pdr5Δ::TRP1, pdr10Δ::hisG, pdr15Δ::loxP-KanMX-loxP, ayt1Δ::URA3) wurde
durch Disruption der Acetyltransferase AYT1 im Stamm YHW10515 konstruiert.
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Pflanzenmaterial
und Wachstumsbedingungen. A. thaliana-Versuche wurden mit dem Wildtyp-Ökotyp columbia-0
(Col-0) durchgeführt.
Zur Vermehrung wurden die Samen sterilisiert, auf Standard-MS-Wachstumsmedium
(19), ergänzt
mit 1,0% Saccharose und 1,0% Phytagar (Life Technologies) ausplattiert
und einer zweitägigen
Behandlung mit Dunkelheit und 4°C
zum Synchronisieren der Keimung unterzogen. Die Sämlinge wurden
2 Wochen lang in einer kontrollierten Umgebung mit einem Zyklus
von 16h/8h Licht/Dunkelheit (140 μmol
m–2 sec–1 weißes Licht)
bei 22°C
gezogen, bevor sie in Erde transferiert und bei 20°C und 55%
Luftfeuchtigkeit unter kontinuierlichem weißen Licht gezogen wurden.
-
Arabidopsis
thaliana cDNA-Bibliothek-Screen in Hefe. Der ATP-Eindungs-Kassetten(ABC)
-Transporter-defiziente Saccharomyces cerevisiae-Stamm YZGA452,
welcher überempfindlich
gegen DON ist, wurde mit einer A. thaliana-cDNA-Bibliothek transformiert,
die unter der Kontrolle des Phosphoglucerat-Kinase(PGK1)-Promotors (20) konstitutiv
exprimiert worden war. Insgesamt 107 Transformanten
wurden auf Minimalmedium, welchem Uracil fehlte, selektiert und
in Medien transferiert, die 180 ppm DON enthielten, was ausreichte, um
das Wachstum von Hefe, die mit dem Plasmid mit leerer Bibliothek
transformiert worden war, vollständig
zu inhibieren. Kolonien, die eine Resistenz aufwiesen, wurden isoliert,
und aus Anwärtern,
die einzelne Kolonien auf toxin-hältigen Medien bildeten, wurde
die Plasmid-Abhängigkeit
des Phänotyps
getestet durch die Herstellung von Plasmid-DNA und Retransformation
von YZGA452. Das NotI-Fragment, welches das cDNA-Insert des Anwärters enthielt
(genannt DON Glucosyltransferase 1, DOGT1), wurde in pBluescript
SKII+ (Stratagene) subkloniert und sequenziert.
-
Konstitutive
Expression und Immundetektion der DON- Glucosyltransferase (DOGT1) und naher Homologe
in Hefe. Die Intron-losen offenen Leserahmen (ORFs) von DOGT1 (UGT73C5,
Locus At2g36800) und 5 seiner nächsten
Homologe (UGT73C1, At2g36750; UGT73C2, At2g36760; UgT73C3, At2g36780;
UGT73C4, At2g36770; UGT73C6, At2g36790) wurden aus genomischer DNA
mittels PCR amplifiziert (Triele Master PcR System, Eppendorf),
wobei Gen-spezifische Primer verwendet wurden, die die flankierenden
HindIII- und NotI-Restriktionsstellen an den 5'- bzw.
3'-Enden enhielten
(DOGT1, vorwärts:
5'-ACTAAGCTTGGAATCATGGTTTCCGAAACA-3', rückwärts: 5'-AAGCGGCCGCATACTCAATTATTGG-3'; 73C1, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCATCGGAATTTCG-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCATTTCTTGGGTTGTTC-3'; 73C2, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCTTTCGAGAAGACC-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCAACTCTTGGATTCTAC-3'; 73C3, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCTACGGAAAAAACC-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCATTCTTGAATTGTGC-3'; 73C4, vorwärts: 5'-CTAAGCTTGGAATCATGGCTTCCGAAAAATC-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCAGTTCTTGGATTTCA-3'; 73C6: 5'-CTAAGCTTGGAACATGTGTTCTCATGATCCT-3', rückwärts: 5'-TAGCGGCCGCATTCAATTATTGGACTGTGC-3'). Die PCR-Produkte
wurden in die HindIII + NotI-Klonierungsstellen des Hefe-Expressionsvektors
pYAK7 (PADH1-c-Myc-PDR5 LEU2 2μ) kloniert,
wobei das PDR5-Gen ersetzt wurde. Der Vektor pYAK7 wurde konstruiert,
indem zuerst der doppelsträngige
Linker 5'-GGATGCCCGAACAAAAGTTAATTTCAGAAGAGGACTTATCAAAGCTTGAGGCCTCGCGA in die
SmaI-Stelle des Vektors pAD4Δ (21),
insertiert wurde, wodurch das N-terminale c-Myc-Epitop und eine
HindIII-Stelle erzeugt wurden, in welche ein genomisches HindIII-Fragment,
das die Hefe PDR5 enthielt, in frame insertiert wurde.
-
Die
mit einem Tag versehenen UGT-Konstrukte wurden durch Sequenzieren
verifiziert und zum Transformieren des Hefe-Stamms YZGA515 verwendet. Der leere
Vektor (HindIII + NotI-verdautes und
religiertes pYAK7) wurde als Kontrolle verwendet. Die Transformanten
wurden auf Minimalmedien, welchen Leucin fehlte, selektiert. Exponentiell
wachsende Kulturen wurden auf OD600 0,05 verdünnt und auf YPD-Medien, die
zunehmende Konzentrationen verschiedener Trichothecene enthielten,
aufgetüpfelt.
Die verwendeten Toxine waren: DON, 3-ADON, 15-ADON, NIV, Trichothecin
(TTC), T-2-Toxin, HT-2-Toxin, Diacetoxyscirpenol (DAS) und Veruccarin
A (Va). Mit Ausnahme von DON, 3-ADON
und NIV, die von Biopure Referenzsubstanzen GmbH (Tulln, Österreich)
erhalten wurden, wurden die Mykotoxine von Sigma gekauft und bei –20°C, in 70% Ethanol
gelöst,
gelagert.
-
Für die Immundetektion
wurde die Extraktion von Proteinen aus Hefezellen, wie von Egner
et al. (22) beschrieben, durchgeführt. Die Western Blot-Analyse
wurde mit einem primären
Maus-anti-c-Myc-Antikörper
durchgeführt
(1:5000, Klon 9E10, Invitrogen).
-
Domänen-"shuffling". Die ORFs einschließlich dem
N-terminalen c-Myc-tag
von DOGT1 und seinem nächsten
Homolog UGT73C6 wurden aus den Hefe-Expressionsvektoren durch SmaI
+ NotI-Verdau isoliert, in den Vektor pBluescript SKII+ kloniert
(welcher mit XhoI geschnitten und mit Klenow-Enzym behandelt und
danach mit NotI verdaut worden war). Die resultierenden Plasmide
wurden mit HindIII und einer konservierten EcoRI-Stelle, die in beiden Genen vorhanden
ist, die DOGT1 an der Nukleotid-Position 565 (73C6 an 568) schneidet,
verdaut. Hybriden wurden durch Ligation des N-terminalen Teils des
einen Gens an den C-terminalen Teil des anderen konstruiert. Die
resultierenden Gene wurden in den Hefe-Expressionsvektor pYAK7 unter Verwendung
der HindIII und NotI-Restriktionsstellen zurück bewegt. Der Hefe-Stamm YZGA515
wurde als Wirt verwendet, um die Konstrukte auf veränderte Entgiftungsfähigkeiten
zu testen.
-
Stellengerichtete
Mutagenese. Mutationen wurden durch Überlappungs-Verlängerungs-PCR („overlap
extension PCR")
(23) konstruiert, wobei die überlappenden
mutierten Primer DOG-K136E-vorwärts (5'-TACAAGCGAAATCGCCAAGAAGTTCA-3') und DOG-K136E-rückwärts (5'-CTTCTTGGCGATTTCGCTTGTATAAG-3') und die flankierenden Primer
DOGIpYAK7-vorwärts-(5'-ACTAAGCTTGGAATCATGGTTTCCGAAACA-3') und DOG-EcoRI-rückwärts (5'-TCTTGTGAATTCAACTCTATC
AGGA-3') für die Mutagenese
von DOGT1, und die mutierten Primer 73C6-E137K-vorwärts (5'-TACAAGCAAAATCGCC AAGAAGTTCAA-3') und 73C6-E137K-rückwärts (5'-ACTTCTTGGCGATTTTGCTTGTATT-3') und die flankierenden
Primer 73C6pYAK7-vorwärts
(5'-TAAGCTTGGAATCATGTGTTCTCATGATCCT-3') und DOG-EcoRI-rückwärts für die 73C6-Mutagenese
verwendet wurden. Die resultierenden PCR-Produkte wurden als HindIII
+ EcoRI-Fragmente in die korrespondierenden Gene kloniert, die im
Vektor pBluescript SKII+ vorhanden waren. Nach der Sequenzierung
wurden die ORFs als HindIII + NotI-Fragmente in den Hefe-Expressionsvektor
pYAK7 (das PDR5-Gen ersetzend) zurück bewegt, und die resultierenden
Plasmide wurden in den Stamm YZGA515 transformiert, um die Entgiftungseigenschaften
der hergestellten UGTs zu analysieren.
-
Synthese
von 3-β-D-Glucopyranosy1-4-desoxynivalenol
und 15-β-D-Glucopyranosy1-4-desoxynivalenol.
Um Referenz-Material für
HPLC und TLC zu erhalten, wurden DON-3-Glucosid und DON-15-Glucosid in 2-Schritt-Reaktionen
synthetisiert. Im ersten Schritt wurden 15-Acetyl-DON oder 3-Acetyl-DON
mit 1ββ-Brom-1-desoxy-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glucopyranose
(Acetobromglucose) in Toluol mit CdCO3 als
Katalysator modifiziert, was die DON-Glucosid-Acetate (24) ergab.
Im zweiten Schritt wurde eine sanfte Hydrolyse der Acetate zu den
Glucosiden unter Verwendung eines stark basischen Anionen-Austauschers
(DOWEX1x2-400, Aldrich, USA) durchgeführt. Nach Überprüfung des Fortschreitens der
Reaktion mit TLC (mobile Phase Toluol/Ethylacetat 1:1, V/V) wurden
die DON-Glucoside unter Verwendung von Flash-Chromatographie über Silikagel mit 1-Butanol/1-Propanol/Ethanol/Wasser (2:3:3:1,
V/V/V/V) aufgereinigt. Eine weitere Reinigung der Substanzen wurde
mit HPLC mittels einer RP-18 Aquasil-Säule (Keystone, Waltham, USA)
unter Verwendung von Acetonitril/Wasser (10:90, V/V) bei 22°C durchgeführt.
-
Die
synthetisierten DON-Derivate wurden im negativen Elektrospray-Interface(ESI)-Modus
charakterisiert. Die LC-MS/MS-Analyse
wurde auf einem QTrap-LC-MS/MS-System (Applied Biosystems, Foster
City, USA), das mit ESI ausgestattet war, und mit einem 1100 Series
HPLC-System (Agilent, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt. Die
chromatographische Trennung wurde auf einer 150 mm × 4,6 mm i.
d., 3 μm,
Aquasil RP-18-Säule (Keystone, Waltham,
USA) bei 22°C
unter Verwendung von Methanol/Wasser (28:72, V/V) erreicht. Die
Fließgeschwindigkeit
wurde auf 0,3 ml/min eingestellt. Die ESI-Interface wurde im negativen
Ionen-Modus bei 400°C
mit CUR 20 psi, GS1 30 psi, GS2 75 psi, IS –4200 V, DP –46 V, EP –9 V, CE –30 eV,
CAD hoch, LIT Füllzeit
50 ms, Q3 Eintrittsbarriere 8 V benützt.
-
Isolierung
und Analyse von DON-Metaboliten in vivo. Um die chemische Struktur
von DON-Metaboliten, die sich aus der enzymatischen Transformation
des Mykotoxins durch DOGT1 ergeben, aufzuklären, wurde ein hoch toleranter
Stamm konstruiert, und der DON-Metabolit wurde aus mit Toxin behandelten
Zellen für
die nachfolgende HPLC-Analyse extrahiert.
-
Der
Hefe-Stamm YZGA515 wurde mit mit einem c-Myc-tag versehenem DOGT1
unter der Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors und zusätzlich mit dem Plasmid pRM561
transformiert. Dieses Plasmid enthält eine mutierte Version des
ribosomalen Proteins L3 (RPL3) von Saccharomyces cerevisiae, die
die DON-Resistenz
bei einer Expression in Hefe wesentlich erhöht. Die Transformanten wurden auf
Minimalmedien, welchen Leucin und Adenin fehlte, selektiert.
-
Der
erhaltene Hefe-Stamm wurde auf eine OD600 von
0,7 in selektivem Medium (SC-LEU-ADE) gezüchtet. Die Zellen wurden auf
YPD-Medium (10% Glucose), das mit zusätzlichem Adenin ergänzt worden
war, transferiert, 2 h lang bei 30°C gezüchtet, durch Zentrifugieren
geerntet und auf eine OD600 von 3,0 in YPD
verdünnt.
DON wurde auf 5 ml Kultur zugegeben, wobei mit 200 ppm DON begonnen
wurde. Nach 3 h wurde die Konzentration auf 400 ppm erhöht, nach
6 h auf 600 ppm, und nach 9 h auf 1000 ppm. Die Zellen wurden weitere
15 h lang bei 30°C inkubiert,
bevor sie geerntet, drei Mal mit eiskaltem Wasser gewaschen, in
2,5 ml Methanol/Wasser (4:1) extrahiert und mit Ultraschall behandelt
wurden. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand durch ein Glas-Mikrofaser-Filter
(Whatman 1822 025) filtriert. 500 μl der Hefeextrakte wurden unter
einem konstanten Stickstoffstrom zur Trockene konzentriert und in
100 μl Wasser
von HPLC-Qualität
gelöst.
-
Heterologe
Expression von DOGT1 in Escherichia coli. Das DOGT1-Protein wurde
in Escherichia coli XL1-blue als GST-Fusion exprimiert. Das DOGT1-Gen wurde
aus dem Hefe-Expressionsvektor
freigesetzt durch HindIII-Verdau und Klenow-Auffüllung,
gefolgt von einem NotI-Verdau. Das resultierende Fragment wurde
in die SmaI + NotI-Stellen des GST-Genfusionsvektors pGEX-4T-3 (Amersham
Pharmacia) kloniert. Das rekombinante Fusionsprotein wurde unter
Verwendung von mit Glutathion gekoppelter Sepharose (Amersham Pharmacia)
gemäß den Instruktionen
des Herstellers gereinigt.
-
Um
die Auswirkung des N-terminalen GST-tag auf die Aktivität zu testen,
wurde das das Fusionsprotein codierende Gen mittels PCR amplifiziert,
wobei DNA-Polymerase mit Korrekturleseaktivität („proofreading activity") (Pfu Polymerase,
MBI) und die Fusionsprotein-spezifischen Primer GSTDOGpYAK7-vorwärts (5'-TCACCCGGGAAACAGTAATCATGTCC-3') und GSTDOGpYAK7-rückwärts (5'-CGAGGCAGATCGTCAGTCAGTC-3') verwendet wurden.
Das PCR-Produkt wurde HindIII + NotI in den Hefe-Expressionsvektor
pYAK7 kloniert. Die DON-Entgiftungsfähigkeit wurde durch Expression
in YZGA515 und Aufbringen auf Toxin-hältige Medien getestet, wie
früher
beschrieben.
-
Enzym-Tests.
Die Glucosyltransferase-Aktivitäts-Testmischung enthielt
1 μg rekombinantes GST-Fusionsprotein,
10 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM Tris/HCl, pH 7,0, 0,5 mM radioaktiv
markierte UDP [14C] -Glucose (4,4·103 cpm, NEN Life Science Products, USA), 0,01%
BSA und 1 mM Akzeptor-Substrat (aufgelöst in DMSO in 20 mM Stammlösungen).
Die Umsetzungen wurden in Volumina von 20 μl bei 30°C 1 h lang durchgeführt, durch
Zugabe von 2 μl
Trichlor-essigsäure
(240 mg/ml) gestoppt, gefroren und bei –20°C gelagert.
-
Eine
Analyse der Reaktionsprodukte wurde mittels TLC durchgeführt. Ein
Aliquot von jeder Probe wurde auf eine Siligagel-Platte (Kieselgel
60; Merck) aufgetüpfelt
und mit einer Mischung aus 1-Butanol/1-Propanol/Ethanol/Wasser (2:3:3:1,
V/V/V/V) entwickelt. Die Intensität jedes radioaktiven Spots wurde
unter Verwendung eines Phospoimagers (STORM 860 System, Molecular
Dynamics) bestimmt. Die Platten wurden zusätzlich mit p-Anisaldehyd (0,5%
in Methanol/H2SO4/Essigsäure, 85:5:10, V/V/V)
gefärbt.
-
Inhibierung
von Weizen-Ribosomen in vitro. Um zu analysieren, ob das 3-β-D-Glucopyranosyl-4-desoxynivalenol
weniger phytotoxhisch ist als sein Aglucon, wurde ein mit Weizenkeim-Extrakt in vitro
gekoppeltes Transkriptions-/Translations-System (TNT Coupled Wheat Germ Extrakt,
T3, Promega) verwendet. Nach 25-minütiger Durchführung der Transkriptions-/Translations-Reaktionen
gemäß der Instruktionen
des Herstellers in Anwesenheit von entweder, DON, gereinigtem DON-Glucosid (1 μM, 2,5 μM, 5 μM, 10 μM und 20 μM) oder Wasser
als Kontrolle wurde die Aktivität
der Leuchtkäfer-Luciferase-Reporters bestimmt
(Luciferase Assay System, Promega), wobei ein Luminometer (Victor
2, Wallac) verwendet wurde.
-
Pflanzenbehandlung
mit verschiedenen, mit Stressantwort verbundenen Verbindungen zur
Expressionsanalyse. Für
die Reverse Transkriptions(RT)-PCR-Analyse der mRNA-Expression von DOGT1
nach Behandlungen mit DON, Salicylsäure (SA), Jasmonsäure (JA)
und 1-Aminocyclopropylcarbonsäure
(ACC) wurden Sämlinge
2 Wochen lang auf vertikal-MS-Platten (0,8% Phytagar) gezüchtet, bevor
sie in flüssige
MS-Medien transferiert wurden. Die Pflanzen wurden 48 h lang auf
einem Kreisschüttler
(„orbital
shaker") (50 U/min)
inkubiert, bevor 5 ppm DON, 200 μM
SA, 2 μM
ACC oder 50 μM
JA zugegeben wurden. Die Verbindungen wurden in Stammlösungen gehalten,
die entweder in 70% Ethanol oder in DMSO gelöst waren. Behandlungen mit Ethanol
und DMSO wurden als Kontrollen durchgeführt. Die Pflanzen wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten geerntet, in flüssigem Stickstoff gemahlen und
bei –70°C gelagert,
bis eine RNA-Extraktion durchgeführt
wurde.
-
Analyse
der mRNA-Expression von DOGT1 und nahen Homologen durch Reverse-Transkriptase-PCR.
Gesamt-RNA wurde aus Pflanzengewebe, das in flüssigem Stickstoff mit Trizol
Reagent gemahlen worden war, wie von den Herstellern empfohlen (Gibco
BRL Life Technologies) isoliert. Die RNA wurde photometrisch und
visuell auf einem denaturierenden RNA-Gel quantifiziert, wobei 5 μg der gesamten RNA
analysiert wurden.
-
cDNA
wurde aus 1 μg
Gesamt-RNA (mit DNaseI verdaut) mit 500 ng eines 18-meren oligo(dT) und
der Reverse-Transcriptase SuperScript (Gibco BRL Life Technologies)
synthetisiert. Die PCR wurde mit etwa 2 μl der 1:20 verdünnten cDNA
durchgeführt,
wobei Primer verwendet wurden, die 200 bis 400 bp große Fragmente
amplifizieren, die sich im C-terminalen Teil der zu analysierenden
Gene befinden (DOGRT-vorwärts:
5'-ATCCGGGGTTGAACAGCCT-3',
DOGRT-rückwärts: 5'-TCAATTATTGGGTTCTGCC-3';
73C4RT-vorwärts: 5'-GGAGAAAATAGGAGTGTTA-3',
73C4RT-rückwärts: 5'-TCAGTTCTTGGATTTCACT-3';
73C6RT-vorwärts: 5'-GAGAAACTGGTCGTACAA-3',
73C6RT-rückwärts: 5'-TCAATTATTGGACTGTGCT-3';
UBQ5-U: 5'-GTCCTTCTTTCTGGTAAACGT-3',
UBQ5-D: 5'-AACC CTTGAGGTTGAATCATC-3'). Um relative Mengen
der Transkripte in den Proben zu vergleichen, wurden DNA-Fragmente
der UBQ5 zuerst amplifiziert, und normalisierte Proben-Volumina, basierend
auf der Menge der Produkte, die den UBQ5-Transkripten entsprachen, wurden für die PCR
verwendet.
-
Klonieren
von Pflanzen-Überexpressions-Konstrukten
und GUS-Fusions-Konstrukten. Für die
konstitutive Überexpression
von mit c-Myc-tag versehenem DOGT1-Protein in Arabidopsis wurde der
Vektor pBP1319 konstruiert. Er stammt von einer modifizierten Version
des Pflanzen-Expressionsvektors pPZP221 (25). Die Promotor-Kassette,
die aus zwei Kopien des 35S-Promotors und dem Polyadenylierungssignal
von CaMV, Stamm Cabb B-D bestand, wurde aus dem Vektor p2RT, einer
modifizierten Version von pRTl00 (26), verwendet.
-
Das
mit c-Myc-tag versehene DOGT1-Fragment wurde durch SmaI + NotI-Verdau
(Klenow-Auffüllung)
aus dem Hefe-Expressionsvektor
freigesetzt und in pBluescript SKII+, welcher mit ClaI + SmaI geschnitten
und mit Klenow-Enzym behandelt worden war, kloniert. Im nächsten Schritt
wurde das Gen aus dem resultierenden Plasmid als SalI + BamHI-Fragment
herausgeschnitten und in die XhoI + BamHI-Stellen von p2RT insertiert.
Die erhaltene 2×35S c-Myc-DOGT1-Kassette
wurde durch PstI-Verdau isoliert
und in die unike PstI-Stelle von pPZP221 kloniert, nachdem die multiple
Klonierungsstelle in diesem Vektor durch Verdauen des Plasmids mit
EcoRI + SalI, Auffüllen
der Stellen mit Klenow und Religation derselben zerstört worden
war. Im resultierenden Vektor pBP1319 ist die 2×35S c-Myc-DOGT1-Kassette in der entgegengesetzten
Richtung ausgerichtet wie der 2×35S
Gentamycin-Resistenz-Marker.
-
Zur
Konstruktion einer transkriptionellen DOGT1-GUS-Fusion wurde der
GUS-Vektor pPZP-GUS.1, der aus pPZP200 herrührt und das GUS-Gen aus pBI101.1
(HindIII + EcoRI in die MCS insertiert) enthält, verwendet (27). Die DOGT1-Promotor-Region
wurde aus der Genom-DNA mit PCR amplifiziert unter Verwendung der
DNA-Polymerase mit Korrekturlese-Aktivität (Pfu Polymerase, MBI) und
den spezifischen Primern (DOGP-GUS-vorwärts: 5'-GTTAAAAGCTTACATGTGCATTACGGTCTGTGTGAATA,
DOGP-GUS-rückwärts: 5'-TTTCGGATCCCATG ATTCAACCTTAGTAAGAAACTCTC).
Das resultierende Produkt wurde in frame mit dem GUS-Gen HindIII
+ BamHI in den pPZP-GUS.1-Vektor kloniert. Die Konstrukte wurden mittels
DNA-Sequenzierung
bestätigt.
-
Herstellung
und Analyse von transgener A. thaliana. Für alle Pflanzen-Transformationen
wurde der recA-defiziente Agrobacterium tumefaciens, Stamm UTA143
(28) verwendet, der das Helfer-Plasmid pMP90 (29) enthält. A. thaliana
wurde unter Anwendung der Blütentauch(„floral
dip")-Technik transformiert
(30). Die Nachkommenschaft von 15 unabhängigen Transformanten wurde
durch drei Generationen hindurch selektiert, um homozygote Linien
zu erhalten.
-
Zur
Immundetektion von mit c-Myc-tag versehenem DOGT1 wurden etwa 200
mg–500
mg Pflanzenmaterial in flüssigem
Stickstoff homogenisiert. 300 μl
Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl,
pH 8,9; 200 mM KCl; 35 mM MgCl2; 12,5 mM
EGTA; 15 mM DTT; 0,6 mM Sorbit) und 15 μl Proteasen-Inhibitor Cocktail
(Sigma, # 9599) wurden den noch gefrorenen Proben zugesetzt, und
die Mischung wurde unter heftigem Schütteln 15 Minuten lang bei 4°C inkubiert.
Nach dem Zentrifugieren (14.000 U/min, 15 Minuten lang bei 4°C) wurden
200 μl der Überstände in frische
Röhrchen
transferiert und bei –20°C gelagert. Äquivalente
Mengen an Protein (50 μg)
wurden für die
Western Blot-Analyse verwendet, die durchgeführt wurde, indem primärer anti-c-Myc-Antikörper, der
aus Hybridom-Überstand
gereinigt worden war (Klon 9E10), verwendet wurde.
-
Zur
Analyse der DON-Resistenz wurden Samen homozygoter Linien, die eine
hohe DOGT1-Expression aufwiesen, und Col-0 als Kontrolle auf MS-Medien,
die verschiedene Konzentrationen von DON (5–30 ppm) enthielten, gekeimt.
Die Sämlinge wurden
5 Wochen lang gezogen, bevor der Phänotyp dokumentiert wurde. Die
GUS-Aktivität
wurde durch 2- bis 4-stündiges
Färben
der Sämlinge
oder Organe von adulten Pflanzen in X-Gluc-Lösung bei 37°C analysiert (31).
-
ERGEBNISSE
-
Isolierung
der DON-Glucosyltransferase (DOGT1) durch heterologe Expression
in Hefe. Ein funktioneller („unbiased
functional”)
Screen auf Basis der heterologen Expression von cDNAs in Hefe wurde
mit dem Ziel erstellt, Pflanzengene zu identifizieren, die zur Resistenz
gegen Mykotoxine beitragen. Wildtyp-Saccharomyces cerevisiae ist gegen Desoxynivalenol
(DON) sehr resistent. Um die Menge des für den Screen nötigen Toxins
zu verringern wurde ein Stamm erzeugt, dem alle vier ABC-Transporter fehlten,
die weitgehend für
pleiotrope Arzneimittel-Resistenz in Hefe verantwortlich sind (32).
Der Stamm YZGA452 (sng2Δ::hisG
pdr5Δ::TRP1 pdr10Δ::hisG yor1Δ::hisG) ist
gegen ein breites Spektrum verschiedener xenobiotischer Substanzen und
natürlicher
Produkte, einschließlich
DON, überempfindlich.
YZGA452 wurde mit einer cDNA-Expressions-Bibliothek von A. thaliana
(20) transformiert, wo cDNAs unter der Kontrolle des Hefe-Phosphoglucerat-Kinase-Promotors
konstitutiv exprimiert sind. Zehn Millionen Transformanten wurden
erzeugt, und verdünnte
Pools von Transformanten wurden auf DON-enthaltendem Medium ausplattiert. Nach
der Selektion DON-resistenter
Hefe-Kolonien und Bestätigung
der Plasmid-Abhängigkeit
des Phänotyps
wurde das Insert subkloniert und sequenziert.
-
DOGT1
ist ein Mitglied der UDP-Glucosyltransferase-Familie von A. thaliana
und weist eine große Ähnlichkeit
mit Salicylsäure-
und Wund-induzierbaren Genen anderer Spezies auf. Die eine Resistenz übertragende
cDNA hatte eine Größe von 1,75
kb und enthielt einen offenen Leserahmen von 1488 bp Länge, der
für eine
putative Uridin-Diphosphat(UDP)-Glucosyltransferase codiert. Die
identifizierte DON-Glucosyltransferase (DOGT1) entspricht dem Gen
UGT73C5 und gehört
zur Unterfamilie 73C, einem Teil der Gruppe D der UDP-Glucosyltransferasen
(UGTs) von A. thaliana (33). Arabidopsis-UGTs stellen eine sehr
große
Gen-Familie dar, die in 14 einzelne Gruppen unterteilt wurde, von
welcher man annimmt, dass sie von gemeinsamen Vorfahren („common
ancestors") herrührten (17).
DOGT1 ist in einem Cluster (1B) zusammen
mit fünf
anderen Mitgliedern der Unterfamilie 73C auf dem Chromosom II (BAC
Klon F13K3, At2g36800) lokalisiert. Alle sechs im Tandem wiederholten
Gene enthalten keine Introns und sind einander stark ähnlich (77–89% Identität auf Aminosäure-Ebene).
Die Ähnlichkeit
ist auch in den intergenetischen Promotor-Regionen sehr groß.
-
Eine
Datenbank-Abfrage mit der DOGT1-Aminosäuresequenz offenbarte eine
große Ähnlichkeit
mit Glucosyltransferasen von Tabak (TOGT1, ref. 34; Is5a und Is10a,
ref. 35) und Tomate (Twi-1, ref. 36), deren Expression sich als
erhöht nach
Behandlung mit Salicylsäure
(SA), Pilz-Auslösern
oder Verwundung (34, 36, 37) erwies, und mit der Betanidin-5-O-Glucosyltransferase
von Dorotheanthus bellidiformis (38). Zwei putative, uncharakterisierte
Glucosyltransferasen von Vigna angularis (ADGT-9) und Oryza sativa
mit einer Homologie mit DOGT1 wurden ebenfalls in der in 2 gezeigten Aminosäuren-Ausrichtung („alignment") inkludiert. Regionen
von großer Ähnlichkeit
wurden sowohl in den Amino- als auch in den carboxyterminalen Domänen der
abgeleiteten Aminosäuresequenzen
beobachtet. In 2 angegeben sind die hypothetische Akzeptor-Substrat-bindende
Region (38) und die UGt-Consensus-Sequenz (33).
-
Die
Expression von DOGT1 ist entwicklungsmäßig reguliert und wird von
DON und anderen, mit der Stress-Antwort verbundenen Verbindungen
induziert. Um zu untersuchen, ob die Expression von DOGT1 auf ähnliche
Weise reguliert ist, wie für
die verwandten Gene anderer Pflanzen-Spezies beschrieben ist, wurde
der ORF des β-Glucuronidase-Reporter-Gens
hinter den DOGT1-Promotor
platziert (PDOGT1-GUS). Die Gewebe-spezifische
Expression der transkriptionellen GUS-Fusion wurde histochemisch
in transgener Arabidopsis, die für
das Fusions-Gen homozygot war, untersucht. Die in 3 gezeigten
Ergebnisse beweisen, dass die DOGT1-Expression entwicklungsmäßig reguliert
und insgesamt ziemlich gering ist. Bei Sämlingen wurde beobachtet, dass
die GUS-Aktivität
Wurzel- und Hypokotyl-spezifisch ist, wobei die stärkste Expression im
Gefäßsystem,
im meristematischen Gewebe der Wurzelspitzen (in der Hauptwurzel
sowie in den Seitenwurzeln) und im Gefäßsystem des Hypokotyls direkt
nach der Keimung vorliegt. Zu einem späteren Zeitpunkt in der Entwicklung
nahm die Färbung
im Gefäßsystem
stark ab, und ein fleckenförmiges
Färbungsmuster
trat in den epidermalen Wurzelzellen auf. Bei adulten Pflanzen wurde
GUS-Aktivität
in späten
Stadien der Blütenentwicklung
in den Blütenblättern und
in den Abszissionszonen nachgewiesen (3A).
-
Es
zeigte sich, dass die Einwirkung entweder von DON (5 ppm, 4 h lang)
oder vom Ethylenvorläufer
Aminocyclopropylcarbonsäure
(ACC, 2 μM,
1 h lang) auf Sämlinge
die PDOGT1-GUS-Expression induziert (3).
Keine Induktion einer Expression des Reporters wurde nach SA-Behandlung
(200 μM,
12 h lang) oder Behandlung mit Jasmonsäure (JA, 50 μM, 1 h lang)
nachgewiesen. Semiquantitative Reverse-Transkriptase-PCR wurde angewendet,
um die aus den GUS-Reporter-Analysen erhaltenen Ergebnisse zu validieren,
durch Detektion von Veränderungen
in den mRNA-Levels von DOGT1, 73C4 und 73C6 nach Behandlung mit
denselben Konzentrationen von DON, SA, ACC und JA, wie sie zuvor
verwendet worden waren.
-
Wie
in 3C gezeigt, bestätigen die
Ergebnisse der Reverse-Transkriptase-PCR die DON-induzierbare Expression
von DOGT1, welche zuvor mit dem Reporter-Konstrukt beobachtet worden
war, und zeigen weiters, dass auch die anderen beiden getesteten
UGTs durch DON induzierbar sind. Eine Erhöhung der Mengen der Transkripte
wurde bereits nach einstündiger
Inkubation mit dem Toxin beobachtet, erreichte einen Höhepunkt
nach 4 h und nahm zwischen 6 und 12 h wieder ab. Interessanterweise
wies 73C6 eine stärkere
Induktion der Expression durch DON als DOGT1 oder 73C4 auf, obwohl
die nachstehend gezeigten Daten anzeigen, dass es das Toxin nicht
als Substrat annimmt. Nach SA-Behandlung, war eine DOGT1-, 73C4-
und 73C6-Expression in geringen Höhen zum Zeitpunkt 4 h und etwas
stärker zum
Zeitpunkt 12 h evident. Es muss festgehalten werden, dass die aufgetragene
Konzentration von 200 μM
SA die Expression der 3 Gene ziemlich schwach induzierte. Jasomonsäure sowie
die Behandlung mit ACC führen
auch zu einer schwachen Induktion der Expression von DOGT1 und UGT73C6, die
schon nach 1-stündiger
Behandlung offensichtlich ist, jedoch rasch abfällt, wobei nach 2-stündiger Einwirkung
auf die Verbindungen keine Transkript-Akkumulation mehr nachweisbar war (3C).
-
Phänotypische
Bestimmung des Spektrums der Trichothecen-Resistenz in Hefe. Die Trichothecen-Toxizität bei Tieren
hängt vom
Hydroxylierungsmuster sowie von der Position, Anzahl und Komplexität der Veresterungen
ab (5). Die grundlegende Trichothecen-Struktur und das Nummerierungssystem
der Kohlenstoffatome sind in 1A gezeigt.
Die Mitglieder der Unterklasse B (z. B. DON und NIV) enthalten eine
Keto-Gruppe an Kohlenstoff C-8, die Trichothecene vom Typ A (z.
B. das von F. sporotrichoides produzierte hoch toxische T-2-Toxin) jedoch
nicht. Extrem toxisch sind auch makrozyklische Trichothecene, wie
Veruccarin A, welche einen makrozyklischen Ring mit Esterbindungen
enthalten, die den Kohlenstoff 4 und den Kohlenstoff 15 überbrücken. Hefe
pdr5-Mutanten sind gegen alle bisher getesteten Trichothecene überempfindlich,
was es ermöglicht,
die Fähigkeit
von DOGT1 und anderen Genen im Cluster, eine Resistenz gegen verschiedene
Mitglieder der Trichothecene zu vermitteln, zu untersuchen.
-
Die
große Ähnlichkeit
von UGT73C1, C2, C3, C4, C5 (DOGT1) und C6 und ihr dicht zusammengedrängtes („clustered") Auftreten am Chromosom
lässt vermuten,
dass sie sich über
Gen-Duplikation
aus einem Stamm-Gen („ancestral
gene") entwickelt
haben und daher verwandte enzymatische Eigenschaften besitzen könnten. Um
mögliche Ähnlichkeiten
ihrer Funktion zu analysieren wurden sechs ORFs mit spezifischen
Primers amplifiziert und in Hefe als Fusionsproteine mit einem N-terminalen c-Myc-Epitop-tag exprimiert.
Ein Vergleich von Transformanten, die DOGT1 mit tags oder ohne tags exprimierten,
zeigte, dass das Epitop mit der DON-schützenden Aktivität nicht
interferiert. Die das vollständige
Gen-Set des Clusters darstellenden Hefe-Transformanten wurden auf Medien, die
steigende Konzentrationen verschiedener Trichothecene enthielten,
aufgetüpfelt.
Transformanten, die den leeren Expressionsvektor enthielten, wurden
als Kontrollen verwendet.
-
Die
in 1 gezeigten Ergebnisse offenbarten, dass UGT73C4 – so wie
DOGT1 – eine
DON-Resistenz vermittelt. Obwohl C4 nur die zweitgrößte Ähnlichkeit
aufweist (79% Identität
mit DOGT1), besaß es
die Fähigkeit,
DON und 15-ADON zu entgiften (1C),
konnte jedoch keine Resistenz gegen 3-ADON, NIV, TTC, HT-2-Toxin,
T2-Toxin, DAS und VA vermitteln. Dagegen schützte UGT73C6, das mit einer
89% Identität
auf Aminosäure-Level die größte Ähnlichkeit
aufweist, gegen keines der getesteten Trichothecene. In ähnlicher
Weise konnte 73C3 keine Resistenz gegen die getesteten Mykotoxine
vermitteln, obwohl alle vier Proteine in ähnlichem Ausmaß in Hefe
exprimiert waren. Die Konstrukte 73C1 und 73C2 verstärkten auch
nicht die Toxin-Resistenz, doch
könnte
dies auf geringere Level an rekombinantem Protein, die in den Hefe-Transformanten
vorhanden waren, zurückzuführen sein
(1D).
-
Die
DON-Entgiftungs-Spezifität
befindet sich im N- terminalen
Teil von DOGT1. Die trotz ihrer hohen Sequenzähnlichkeit verschiedenen Merkmale der
nah verwandten Enzyme machten es möglich, Merkmale der Proteine,
die für
die DON-Erkennung wesentlich
sind, aufzuklären.
Eine sowohl in DOGT1 als auch in 73C6 vorhandene EcoRI-Stelle (vgl. 4A) wurde verwendet, um Hybriden zu konstruieren,
die den N-terminalen Teil des einen und den C-terminalen Teil des
jeweiligen anderen Gens enthielten. Die Expression in Hefe und die
Einwirkung von DON-hältigen
Medien zeigte, dass der N-Terminus von DOGT1 (bestehend aus den
ersten 189 AS) für
die Fähigkeit,
DON zu entgiften, wesentlich ist (4B).
-
Ein
Lysin-Rest an Position 136 in DOGT1 ist im Entgifter 73C4 konserviert,
aber in den beiden nicht-entgiftenden Homologen C3 und C6 durch
andere Aminosäuren
ersetzt. Die stellengerichtete Mutagenese wurde verwendet, um Mutationen
in DOGT1 und das UGT73C6 einzuführen,
was zu einem Tausch des Lysin-Rests
136 in DOGT1 zu Glutaminsäure
führt,
welche an der korrespondierenden Position in C6 vorhanden ist (Aminosäure 137).
Das mutierte DOGT1K136E-Protein schützte genauso
effizient wie DOGT1, was beweist, dass K136 für die DON-Entgiftungsfähigkeit
nicht wesentlich ist. Auch das umgekehrte Konstrukt 73C6E137K blieb inaktiv.
-
In
vivo- und In vitro-Analyse beweisen, dass DOGT1 den Transfer von
Glucose von UDP-Glucose an die 3-OH-Position von DON spezifisch
katalysiert. Der Schutz gegen 15-ADON und die Unfähigkeit, eine
Resistenz gegen 3-ADON zu vermitteln, legten nahe, dass DOGT1 die
Bildung von DON-3-O-Glucosid katalysieren könnte. Um diese Hypothese zu
testen, wurden zuerst chemisch synthetisierte DON-Derivate hergestellt,
bei welchen der Glucose-Teil entweder an der C3- oder C15-Hydroxy-Gruppe
von DON gebunden war. Die beiden Produkte wurden mit LC-MS/MS charakterisiert.
Das DON-3-O-Glucosid und das DON-15-O-Glucosid eluierten bei 12,43
min bzw. 12,68 min. Die Massenspektren der Glucoside wiesen charakteristische
Unterschiede in ihrem Fragmentierungsmuster auf (5).
Während
das DON-3-O-Glucosid zu einem Ion von 427,2 m/z unter den gegebenen
Umständen
fragmentierte, wurde dasselbe Ion bei DON-15-O-Glucosid nicht nachgewiesen.
Der Verlust von 30 Atom-Masse-Einheiten kann durch die Spaltung
der -CH2OH-Gruppe an C6 erklärt werden,
welche verhindert wird, wenn die Hydroxyl-Gruppe mit Glucose konjugiert
ist, wie bei DON-15-O-Glucosid. Ein weiterer Aufschluss ("breakdown") (MS) der DON-Glucoside
in der linearen Ionenfalle zeigte ein fast identisches Fragmentierungsmuster
wie jenes des [DON-H]-Ions (295,3 m/z, nicht fragmentiert in Q2),
was das Vorhandensein von DON-Entitäten in den Reaktionsprodukten
bestätigte.
-
Mit
diesen Werkzeugen in der Hand war es möglich, direkt festzustellen,
welches Glucosid in Hefezellen gebildet wurde. Der Hefestamm YZGA515, der
infolge einer Deletion des Hefe-Acetyltransferase-Gens
AYT1 unfähig
war, DON in 3-ADON umzuwandeln, wurde sowohl mit dem DOGT1-Expressionsvektor
als auch mit einem Plasmid transformiert, das ein Gen enthielt,
welches für
ein gegen Trichothecen unempfindliches mutiertes Ribosomen-Protein
L3, das Ziel von Trichothecenen, codiert, um die DON-Toleranz von
Hefezellen zu erhöhen.
Nachdem der resultierende Stamm mit großen Mengen an DON, die eine
Endkonzentration von 1000 ppm im Medium erreichten, inkubiert worden
war, wurde der DON-Metabolit aus den Zellen extrahiert und mittels HPLC
und Massenspektroskopie als das erwartete 3-O-Glucopyranosyl-4-Desoxynivalenol identifiziert (6A). 5 zeigt
das Fragmentierungsmuster der synthetisierten Referenzsubstanzen
und den Produkt-Peak von Hefe, die DOGT1 exprimiert. Wie erwartet
war der Metabolit im Kontrollstamm, dem die DOGT1-Aktivität fehlte,
nicht vorhanden.
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Um
die Substrat-Spezifität
weiter zu verifizieren, wurde eine GST-DOGT1-Fusion konstruiert.
Das GST-DOGT1-Fusions-Gen wurde ebenfalls in Hefe exprimiert, wo
es eine DON-Resistenz wie Wildtyp-DOGT1 vermittelte. Das Gen-Produkt
wurde in E. coli exprimiert und Affinitäts-gereinigt. Die während der
Inkubation von entweder dem DOGT1-Fusions-Protein oder dem GST mit
UDP[14C]-Glucose und DON in vitro erzeugten
Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von TLC analysiert. Ein
Spot mit demselben Rf-Wert wie das synthetisierte DON-Glucosid wurde
bei der das GST-DOGT1-Fusions-Protein enthaltenden Reaktion beobachtet,
jedoch nicht in der Kontrolle.
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Glucosylierung
von 4-Desoxynivalenol verringert dessen Toxizität stark. Um zu analysieren,
ob das 3-β-D-Glucopyranosyl-4-Desoxynivalenol
weniger phytotoxisch ist als DON, wurde ein in vitro gekoppeltes
Weizenkeimextrakt-Transkriptions-/Translations-System
verwendet. Wie in 6B gezeigt, inhibierte
das Vorhandensein von 1 μM
DON in der Reaktion die Protein-Translation signifikant, was zu 36,8%
Reporter-Enzymaktivität im Vergleich
zur Kontrolle (100%) führte.
5 μM des
Toxins führten
dazu, dass nur 3,1% Lumineszenz verblieb, wogegen 20 μM des synthetisierten
DON-3-Glucosids die Luciferase-Aktivität zu nur 8% inhibierten. Diese
Ergebnisse beweisen, dass die Glucosylierung von DON ein Entgiftungsprozess
ist.
-
Überexpression
von DOGT1 in Arabidopsis thaliana erhöht die DON-Resistenz. Transgene
A. thaliana, die DOGT1 unter der Kontrolle eines Tandem-35S-Promotors
exprimieren, wurden erzeugt und die Menge des rekombinanten Proteins
in den Transformanten mittels Western Blot unter Verwendung des
N-terminalen c-Myc-Epitop-tag
bestimmt. Samen der homozygoten Linie 1319/2, von welcher es sich
zeigte, dass sie einen hohen DOGT1-Expressions-Level hatte (6C), und von Wildtyp-Col-O als Kontrolle
wurden auf MS-Medien, die 5–30
ppm DON enthielten, angekeimt und 5 Wochen lang gezogen, bevor der
Phänotyp
analyisert wrude.
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Die
wichtigste phytotoxische Wirkung, die beobachtet wurde, war eine
langsame Keimung der Wildtyp-Pflanzen. Wurzelbil dung fand überhaupt nicht
statt, Kotyledone entwickelten sich, begannen jedoch auszubleichen,
bevor echte Blätter
gebildet werden konnten. Nach dreiwöchiger Einwirkung von DON hatten
die meisten Wildtyp-Sämlinge
die gesamte grüne
Farbe verloren und aufgehört,
zu wachsen. DOGT1-Überexpressions-Linien
wiesen auch eine klare Verzögerung
in ihrer Entwicklung auf. Im Vergleich zum Wildtyp trat die Keimung
früher
ein, wurden Wurzeln gebildet, kam es zu keinem Ausbleichen von Kotyledonen
und erschienen echte Blätter. Die
beobachteten Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen DON waren
auf Medien, die 15 ppm Toxin enthielten, am meisten offensichtlich
(6D). Kontroll-Transformanten mit leerem Vektor (der
nur das Gentamycin-Resistenz-Gen
enthielt), und Linien, die geringe Mengen an DOGT1 exprimierten,
waren genauso empfindlich wie Wildtyp Col-0.
-
DISKUSSION
-
Biotechnologische
Relevanz. Fusarium-Krankheiten von Weizen und Gerste sind für die Länder auf
der ganzen Welt von großer
wirtschaftlicher Bedeutung. Die Vereinigten Staaten wurden beispielsweise
im letzten Jahrzehnt von Fusarium-Epidemien schwer getroffen. Direkte
Verluste infolge von FHB für
die Weizen-Produzenten der USA wurden auf durchschnittlich etwa
$260 Millionen jährlich
geschätzt,
und im Zeitraum 1998–2000
wurden die kombinierten wirtschaftlichen Verluste für kleinkörnige Zerealien
auf $2,7 Milliarden geschätzt
(39). Eine Desoxynivalenol-Kontaminierung großer Mengen der Ernte kann zu
einer großen
Aufnahme des Mykotoxins führen.
Kinder sind die Bevölkerungsgruppe
mit dem höchsten
Risiko einer Überschreitung
des tolerierbaren täglichen
Aufnahme-Levels ("tolerable
daily intake", TDI)
für DON.
Im Problem-Jahr 1998 überschritten
80% der einjährigen
Kinder in den Niederlanden den TDI (7).
-
Die
große
Bedeutung der Fusarium-Krankheiten rechtfertigt die Forschung betreffend
eine Mykotoxin-Inaktivierung, obwohl eine Resistenz gegen das Pathogen
höchstwahrscheinlich
ein polygenes Merkmal bei Feldfrüchten
und die Toxin-Resistenz nur eine ihrer Komponenten ist. Die Produktion
von Trichothecenen ist der einzige Virulenzfaktor des Pilz-Pathogens,
der bisher experimentell bestätigt wurde,
mit Ausnahme von pleiotropen Mutationen in MAP-Kinasen, die nicht
ausschließlich
die Virulenz beeinflussen, sondern auch die Konidiation, Perithecien-Bildung, das vegetative
Wachstum und die Mykotoxin-Produktion (40, 41). Die vorliegende
Erkenntnis, dass eine Überexpression
von DOGT1 zu erhöhter
Desoxynivalenol-Resistenz bei transgener Arabidopsis führt, ergibt
neue Möglichkeiten
für biotechnologische
Ansätze
mit dem Ziel, den Pilzvirulenzfaktor zu antagonisieren. Das bisher
einzige veröffentlichte Ergebnis
beruht auf einer Fusarium-Acetyltransferase (42), die DON zu 3-ADON
umwandelt, welches für Labortiere
etwa zweimal weniger toxisch und somit keine Entgiftung in der Bedeutung
der vorliegenden Erfindung ist. Der Phänotyp von transformierter Hefe und
von Arabidopsis sowie Daten, die unter Verwendung von in vitro-Translations-Tests
erhalten wurden, zeigen, dass das DON-Glucosid eine verringerte Toxizität aufweist.
Im Allgemeinen führt
die Glucosylierung reaktive und toxische Aglucone in stabile und nicht-reaktive
Lager-Formen über,
wodurch ihre Interaktion mit anderen Zellkomponenten beschränkt wird.
Der Zusatz eines Zuckers blockiert die reaktive Stelle der Substanz
und verringert folglich die Toxizität für die Pflanze. Solche Modifikationen
werden weiters in Erwägung
gezogen, um einen Zugang zu Membran-gebundenen Transportern vorzusehen, was
Ausgangswege aus dem Cytosol beispielsweise zur Zellwand oder der
Vakuole eröffnet
(43).
-
Die
Glucosylierung von Trichothecenen stellt einen Entgiftungsprozess
für Pflanzen
dar. Doch im Verdauungstrakt von Menschen und Tieren könnten die
Mykotoxin-Glucokonjugate leicht hydrolysiert werden, wobei das Toxin
regeneriert würde.
Das Ausmaß,
in welchem das DON-Glucosid zur Vakuole oder zum Apoplast transportiert
wird, ist derzeit unbekannt. Bevor man versucht, transgene Pflanzen
zu verwenden, die eine DON-Glucosyltransferase überexprimieren,
sollte untersucht werden, ob nur das vakuoläre Glucosid oder auch Toxin,
das an Zellwandmaterial als „unlöslicher
Rest" gebunden ist,
eine Quelle für „maskiertes
Mykotoxin" (44)
ist, welches traditionellen Analyse-Techniken entgeht und von viel stärkerer toxikologischer
Relevanz sein könnte,
als derzeit angenommen wird. Die während dieser Arbeit entwickelten
Analyse-Werkzeuge und Referenzmaterialien sind geeignet, diese Fragen
zu untersuchen.
-
Die
Inaktivierung von Toxinen durch Glucosylierung scheint ein vorherrschender
natürlicher
Mechanismus für
die Resistenz zu sein, der es Pflanzen ermöglicht, mit der enormen Vielfalt
toxischer mikrobieller Metaboliten, auf die sie in der Natur treffen können, fertig
zu werden. DOGT1 ist eines von 118 UGT-Genen in A. thaliana, welche voraussagegemäß kleine
Moleküle
konjugieren.
-
Die
Expression von UGT-Genen in Hefe ist ein wertvoller komplementärer Ansatz
zur weit verbreiteten Expression in E. coli, insbesondere wenn die
entsprechenden Chemikalien nur in Eukaryonten Ziele haben. Ein Problem
ist, dass Wildtyp-Hefe-Zellen
häufig
für die
Substanzen, an welchen ein Interesse besteht, „undurchlässig" sind. Die Inaktivierung von mehreren
ABC-Transportern im vorliegenden Wirtsstamm war eine Voraussetzung
für den
Ansatz, Resistenz-vermittelnde cDNAs auszuwählen. Im Fall von Trichothecenen
ermöglichte
dies die phänotypische
Detektion der Aktivität
der exprimierten Gene in einem einfachen Platten-Test. Im Prinzip
könnte
dieser Ansatz für
viele andere Substanzen verwendet werden.
-
Gen-Evolution
und Substrat-Spezifität. DOGT1
befindet sich in einem Cluster (1B)
mit 5 anderen Mitgliedern der Familie 73C auf dem Chromosom II (At2g36800),
was eine Gen-Duplizierung durch
ungleiche Rekombinationsereignisse (32) anzeigt. Man könnte mutmaßen, dass
ein solches Gen-Amplifikationsereignis
einen selektiven Vorteil unter Toxin-Stress vorsieht. DOGT1 und andere Mitglieder
im Cluster haben sehr ähnliche
Proteinsequenzen, was eine Redundanz in der enzymatischen Funktion
vermuten lässt.
Beim Testen der Homologen zur Entgiftung von Trichothecenen stellte
sich jedoch heraus, dass Hefe, die das Gen mit der größten Sequenzähnlichkeit,
UGT73C6, exprimiert, gegen alle getesteten Toxine genauso empfindlich
war wie der Wildtyp (sowie auch UGT73C3), während das zweitnächste Homolog
UGT73C4 dieselben Eigenschaften aufwies wie DOGT1. Die enzymatische
Aktivität
gegenüber
verschiedenen Hydroxycoumarinen wurde für alle Mitglieder des 73C-Clusters
gezeigt (45), was darauf hinweist, dass die UGTs, welchen die schützende Aktivität gegen
DON fehlt, nicht einfach Allele mit Funktionsverlust sind. Das Cluster
ist daher ein Beispiel, das die Hypothese stützt, dass duplizierte UGT-Gene
neue Substrat-Spezifitäten und
Funktionen während
der Evolution erwerben können.
-
Pflanzen-UDP-Glucosyltransferasen
sind strukturell in ihrem Carboxy-terminalen Signatur-Motiv den
Säuger-UGTs
sehr ähnlich,
die UDP-Glucuronsäure
anstelle von UDP-Glucose als Donor-Substrat benützen. Die Säuger-Enzyme spielen eine zentrale
Rolle im Metabolismus und der Entgiftung von Chemikalien, wie Karzinogenen
oder hydrophoben Arzneistoffen. Es zeigte sich, dass die UGTs von höheren Pflanzen
an einem parallelen Bereich von Aktivitäten beteiligt sind, wobei auch
xenobiotische Substanzen, wie Herbizide und andere Pestizide, modifiziert
werden (46, 47). [Eine offene Frage ist, ob diese Entgiftungsreaktionen
Nebenwirkungen von UGTs sind, die endogene Pflanzen-Verbindungen konjugieren.
Obwohl jüngste
Veröffentlichungen
die Hypothese unterstützen,
dass für
die Umwandlung endogener Substrate verantwortliche UGTs auch für die Kapazität von Pflanzen,
xenobiotische Substanzen zu entgiften, verantwortlich sein könnten (48), bedarf
diese Frage zu ihrer Lösung
noch weiterer Arbeit.]
-
Die
Feststellung, dass DOGT1 einen Schutz gegen DON, jedoch nicht gegen
NIV, welches eine zusätzliche
Hydroxyl-Gruppe am Rest 4 besitzt (1A),
schützt,
zeigt, dass die Variation des Hydroxylierungsmusters des Trichothecen-Gerüsts ein wichtiger
Mechanismus des Pilzes sein könnte,
um solchen Entgiftungsreaktionen zu entgehen. Es ist unbekannt,
ob Pflanzen auch NIV, das eine größere Toxizität als DON
in Tier-Systemen hat (5), konjugieren kann. Das Fehlen der Aktivität gegen
NIV ist ein starkes Argument gegen die Verwendung eines einzigen
DOGT1-artigen Gens in transgenen Pflanzen, da NIV-produzierende Chemotypen
von F. graminearum einen selektiven Vorteil erhalten könnten.
-
Die
Konstruktion von hybriden Genen durch Umstellen („shuffling") des N- und C-terminalen
Teils von DOGT1 und UGT73C6 und deren Expression in Hefe bewies,
dass die N-terminalen
189 Aminosäuren
von DOGT1 für
deren Fähigkeit,
DON zu entgiften, wesentlich sind, was mit der Hypothese übereinstimmt,
dass eine Substratbindung auf einem konservierten hydrophoben Gebiet
zwischen Aminosäure 130
und 150 stattfinden könnte
(38). Ein Vergleich von zwei Genen mit Schutzwirkung und zwei Genen ohne
Aktivität,
jedoch ähnlichem
Expressions-Level, lieft
vermuten, dass ein Lysin, das an Aminosäure-Position 136 in DOGT1 (und an der entsprechenden
Position in UGT73C4) vorhanden ist, jedoch in den beiden UGTs, die
Trichothecene nicht entgiften können,
ersetzt ist, könnte
für die
Entgiftung von DON wichtig sein. Diese Hypothese wurde unter Verwendung
von Stellen-gerichteter Mutagenese und Expression des erzeugten
Proteins in Hefe als falsch bewiesen.
-
Informationen über spezifische
Domänen oder
Aminosäuren,
die an der Akzeptor-Bindung von DOGT1 beteiligt sind, könnten potentiell
nützlich
sein für
die Suche nach Glucosyltransferasen, die DON in Feldfrüchten, wie
Weizen oder Mais, entgiften können.
Man sollte jedoch bedenken, dass Versuche, UGTs ausschließlich auf
Grund von Aminosäure-Ähnlichkeit
Funktionen zuzuordnen, sehr fehleranfällig sind, wie im Fall des
73C-Clusters gezeigt
wurde. Trotzdem kann die Funktionalität von Anwärter-Genen durch Expression
in Hefe leicht getestet werden. Eine Möglichkeit, die nicht ausgeschlossen werden
kann, ist, dass Glucoside von Trichothecenen in Feldfrüchten durch
strukturell ziemlich unähnliche
UGTs gebildet werden. Z. B. zeigte sich, dass UGT84B1 die höchste In
vitro-Aktivität
gegen das Auxin Indol-3-Essigsäure
(IAA) von allen getesteten A. thaliana-UGTs hatte, dieses Enzym
jedoch nicht die größte Sequenz-Ähnlichkeit
mit dem funktionellen Homolog in Mais, dem Iaglu-Gen (49), aufweist.
-
Regulierung
der Gen-Expression. Es zeigte sich, dass Gene mit großer Sequenz-Ähnlichkeit
zu DOGT1 aus Tabak und Tomate durch Salicylsäure oder Verwundung induziert
werden (34, 36, 37). Die Analyse der Expression von DOGT1 und 73C6
nach SA- und JA-Behandlung
zeigte, dass sie mit erhöhten mRNA-Level
auf SA, JA und den Ethylen-Vorläufer ACC
schwach reagierten. Die Induzierbarkeit der Gen-Expression durch
SA, JA oder Ethylen wird als Anzeichen für eine mögliche Rolle des hinaufregulierten
Gen-Produkts bei Pflanzen-Stress- oder Verteidigungs-Reaktionen (50) angesehen.
-
Unter
Verwendung einer Analyse der mRNA-Level und eines GUS-Reporter-Konstrukts war
es möglich
zu zeigen, dass DOGT1-Transkription
bei Wildtyp-A.thaliana entwicklungsmäßig reguliert ist und als Antwort
auf die Einwirkung von DON rasch und signifikant induziert wird.
Die Induktion der Expression durch das Mykotoxin wurde auch bei
anderen Mitgliedern des 73C-Clusters
beobachtet, unabhängig
von ihrer gegen DON schützenden
Aktitivät.
Es wäre
interessant zu klären,
ob die Induzierbarkeit Verbindungs-spezifisch oder ein allgemeines Phänomen bei
Protein-Biosynthese-Inhibitoren ist. Die „ribotoxische Stress-Antwort" wird derzeit von Forschern
an Humanzellen (51) aktiv untersucht, wo das Mykotoxin die Expression
von Cyclooxigenase-2, einem Schlüssel-Enzym
bei der Synthese von Vermittlern der Entzündungsreaktion, über die MAP-Kinasevermittelte
Signalgebung, induziert. Die DON-induzierbare Expression von DOGT1
ist ein attraktiver Ausgangspunkt für die Untersuchung, ob es ähnliche
Mechanismen in Pflanzen gibt.
-
Mit
der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass die riesige Gen-Familie
der Glucosyltransferasen, insbesondere – wie in den Beispielen gezeigt,
UGTs, eine wichtige Rolle bei der Pflanzen-Pathogen-Interaktion
spielen, indem sie an der Entgiftung von Metaboliten teilnehmen,
die durch Mikroben erzeugt wurden, um ihre Virulenz an Wirten zu
erhöhen. Ähnlich der
großen
Familie der Resistenz-Gene vom Leucin-reichen Repeat-Typ (52), die an
der Pathogen-Erkennung beteiligt sind, könnten die Gen-Amplifikation
und diversifizierende Selektion von UGTs zu einem breiten Schutzspektrum
gegen Pilz-Toxine führen.
Der selektive Druck, solchen Glucosylierungsreaktionen zu entkommen,
könnte
eine treibende Kraft in der Evolution mikrobieller biosynthetischer
Reaktionen sein, was zu einem großen Spektrum an Toxin-Strukturen
führt,
wie für
Trichothe cene beoachtet.
-
Literaturstellen:
-
- 1. McMullen, M. P., Jones, R. und Gallenberg,
D. (1997) Plant Dis. 81, 1340–1348
- 2. Grove, J. F. (1996) Progress in the Chemistry of Organic
Natural Products, S. 1–70,
Springer, Wien
- 3. Cundliffe, E. und Davies, J. E. (1977) Agents Chemother.
11, 491–499
- 4. O'Donnel,
K., Kistler, H. C., Tacke, B. K. und Casper, H. H. (2000) PNAS 97,
7905–7910
- 5. Retina, V. (1989) Mycotoxins-chemical, biological and environmental
aspects. S. 192–241,
Elsevier, Amsterdam
- 6. Canady, R. A., Coker, R. D., Egan, K., Krska, R., Kuiper-Goodman, T., Olsen
M., Pestka, J., Resnik, S., & Schlatter,
J. (2001) WHO Food Additives Series 47, 419–528
- 7. Codex Committee an Food Additives and Contaminants (2002)
Joint FAO/WHO Food Standards Programme, CX/FAC 03/35, www.codexalimentarius.net
- 8. McCormick, S. P. (2003) Fusarium head blight of wheat, pp.
165–183,
American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, USA
- 9. Desjardins, A. E., Procter, R. H., Bai, G., McCormick, S.
P., Shaner, G., Buechley, G. und Hohn, T. (1996) Mol. Plant-Microbe Interact.
9, 775–781
- 10. Bai, G. H, Desjardins, A. E. und Plattner R. D. (2002) Mycopathologia
153, 91–98
- 11. Kang, Z. und Buchenauer, H. (1999) Physiol. Molec. Plant Pathol.
55, 275–288
- 12. Mesterhazy, A. (2003) Fusarium head blight of wheat, S.
363–380,
American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, USA
- 13. Coleman, J. O. D., Blake-Kalff, M. M. A. und Davies, T.
G. E. (1997) Trends Plant Sci. 2, 144–151
- 14. Scott, P. M., Nelson, K., Kanhere, S. R., Karpinski, K.
F., Hayward, S., Neish, G. A. und Teich, A. (1984) Appl. Environ.
Microbiol. 48, 884–886
- 15. Miller, J. D. und Arnison, P. G. (1986) Can J Plant Path
8, 147–150
- 16. Sewald, N., von Gleissenthall, J. L., Schuster, M., Müller, G.
und Aplin, R. T. (1992) Tetrahedron Asymmetry 3, 953–960
- 17. Ross, J., Yi, L., Lim, E. -K. und Bowles, D. (2001) Genome
Biol. 2, 3004.1–3004.6.
- 18. Sikorski, R. S. und Hieter, P. (1989) Genetics 122, 19–27
- 19. Murashige, T. und Skoog, F. (1962) Plant Physiol. 15, 473–497
- 20. Minet, M., Dufour, M. -E. und Lacroute, F. (1992) Plant
J. 2, 417–422
- 21. Ballester, R., Michaeli, T., Ferguson, K., Xu, H. -P., Mc-Cormick F, und Wigler,
M. (1989), Cell 59, 681–686
- 22. Egner, R., Mahe, V., Pandjaitan, R. und Kuchler, K. (1995)
Mol Cell Biol 15, 5879–5887
- 23. Pogulis, R. J., Vallejo, A. N. und Pease, L. R. (1996) Methods
Mol Biol 57, 167–176
- 24. Savard, M. (1991) J. Agr. Food Chem., 39, 570–574
- 25. Hajdukiewicz, P., Svab, Z. und Maliga, P. (1994) Plant Mol
Biol 25, 989–994
- 26. Töpfer,
R., Matzeit, V., Groneborn, B., Schell, J. und Steinbiss H. -H.
(1987) Nucleic Acid Research 14, 5890
- 27. Diener, A. C., Li, H., Zhou, W., Whoriskey, W. J., Nes,
W. D. und Fink, G. R. (2000) Plant Cell 12, 853–870
- 28. Farrand, S. K., O'Morchoe,
S. P. und McCutchan, J. (1989) J Bacteriol 171, 5314–5321
- 29. Koncz, C. und Schell, J. (1986) Mol Gen Genet 204, 383–396
- 30. Clough, S. J. und Bent, A. F. (1998) Plant J. 16, 735–743
- 31. Jefferson, R. A. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387–405
- 32. Wolfger, H., Mamnun, Y. M. und Kuchler, K. (2001) Res Microbiol.
152, 375–89
- 33. Li, Y., Baldauf, S., Lim, E. -K., und Bowles, D. J. (2001)
J. Biol Chem 276, 4338–4343
- 34. Fraissinet-Tachet, L., Baltz, R., Chong, J., Kauffmann,
S., Fritig, B. und Saindrenan, P. (1998) FERS 437, 319–323
- 35. Horvath, D. M. und Chua, N. -H. (1996) Plant Mol Biol 31,
1061–1072
- 36. Truesdale, M. R., Doherty, H. M., Loake, G. J., McPherson,
M. J., Roberts, M. R. und Bowles, D. J. (1996) Plant Physiol 112, 446
- 37. Horvath, D., Huang, D. J. und Chua, N. -H. (1998) Mol. Plant-Microbe
Interact. 11, 895–905
- 38. Vogt, T., Grimm, R. und Strack, D. (1999) Plant J 19, 509–519
- 39. Nganje, W. E., Johnson, D. D., Wilson, W. W., Leistritz,
F. L., Gangsund, D. A. und Tiapo, N. M. (2001) Agribusiness and
Applied Economics Report 464
- 40. Jenczmionka, N. J., Maier, F. J., Losch, A. P. und Schafer,
W. (2003) Curr. Genet. 43, 87–95
- 41. Hou, Z., Xue, C., Peng, Y., Katan, T., Kistler, H. C. und
Xu, J. R. (2002) Mol Plant Microbe Interact. 15, 1119–1127
- 42. Okubara, P. A., Blechl, A. E., McCormick, S. P., Alexander,
N. J., Dill-Macky, R. und Hohn, T. M. (2002) Theor Appl Genet. 106,
74–83
- 43. Jones, P. und Vogt, T. (2001) Planta 213, 164–174
- 44. Engelhardt, G., Ruhland, M. und Wallnöfer, P. R. (1999) Adv. Food
Sci. 21, 71–78
- 45. Lim, E. -K., Baldauf, S., Li, Y., Elias, L., Worrall, D.,
Spencer, S. P., Jackson, R. G., Taguchi, G., Ross, J. und Bowles,
D. (2003) glucobiol. 13, 139–145
- 46. Wetzel, A. und Sandermann, H. (1994) Arch. Biochem. Biophys.
314, 323–328
- 47. Leah, J. M., Worral, T. L. und Cobb, A. H. (1992) Pest.
Science 34, 81–87
- 48. Meßner,
B., Thulke, O. und Schäffner,
A. R. (2003) Planta 217, 138–146
- 49. Jackson, R. G., Lim, E. -K., Li, Y., Kowalczyk, M., Sandberg,
G., Hoggett, J., Ashford, D. A. und Bowles, D. (2001) J. Biol. Chem.
276, 4350–4356
- 50. Reymond, P. und Farmer, E. E. (1998) Curr Opin Plant Biol.
1, 404–411
- 51. Laskin, J. D., Heck, D. E. und Laskin, D. L. (2002) Toxicol
Sci. 69, 289–291
- 52. Meyers, B. C., Kozik, A., Griego, A., Kuang, H. und Michelmore,
R. W. (2003) Plant Cell 15, 809–834
- 53. Sudes F., Comeau, A., Rioux S. und Collin J. (2000) Can.
J. Plant Path. 22, 286–292
- 54. Potrykus, I. und Spangenberg, G. (Eds.): Gene Transfer to
Plants. Springer Verlag Berlin (1995), ISBN 3-54058406-4
-
Abkürzungen:
-
- FHB: Fusarium Head Blight; DON: Desoxynivalenol; 15-ADON:
15-Acetyl-desoxynivalenol;
NIV: Nivalenol; UGT: UDP-Glucosyltransferase;
ABC: ATP-Bindungskassette; DOGT1: DON-Glucosyltransferase; ORF: Offener Leserahmen;
GUS: β-Glucuronidase; SA:
Salicylsäure;
JA: Jasmonsäure;
ACC: 1-Aminocyclopropylcarbonsäure; TDI
(„tolerable
daily intake"):
tolerierbare tägliche
Einnahme; IAA: Indol-3-essigsäure;
DAG („days
after germination"): Tage
nach Keimung.