MXPA06002128A

MXPA06002128A - Metodo para la destoxificacion de micotoxinas

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Publication number: MXPA06002128A
Authority: MX
Inventors: Brigitte Poppenberger; Gerhard Adam; Franz Berthiller; Rudolf Krska; Karl Kuchler; Christian Luschnig; Josef Gloessl; Doris Lucyshyn; Rainer Schuhmacher; Tobias Sieberer
Original assignee: Univ Wien Bodenkultur
Priority date: 2003-09-01
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2006-08-01
Also published as: RU2006110557A; ATE380862T1; DE602004010682D1; EP1660649B1; EP1510585A1; CA2536467A1; NZ546027A; RU2008143112A; US20060183202A1; EP1510573A1; EP1660649A1; WO2005021740A1; DE602004010682T2; RU2347810C2; AU2004269152A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la destoxificación de micotoxinas que se ponen en contacto con una glucosiltransferasa en presencia de una glucosa activa

Description

MÉTODO PARA LA DESTOXIFICACION DE MICOTOXINAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para la destoxificación de micotoxinas así como con un método para producir derivados de micotoxinas . Una especie compleja y relacionada estrechamente del género Fusarium es responsable de las enfermedades destructivas y económicamente muy importantes de las cosechas de cereal (olla de cabeza por Fusarium, FHB, del trigo y la cebada) y maíz (descomposición de oreja por Fusarium) . En años con condiciones climáticas gue favorecen el desarrollo de los hongos, las infecciones por Fusarium pueden alcanzar ' proporciones epidérmicas (1) . Las enfermedades causadas por los fitopatógenos no solo reducen gravemente el rendimiento sino gue también resultan en contaminación de los granos con cantidades inaceptablemente elevadas de micotoxinas, un problema de importancia mundial . Una clase de toxina de preocupación particular para la salud de los humanos y los animales son los tricotecenos, epóxidos sesguiterpenoides los cuales son potentes inhibidores de la síntesis de proteínas en eucariotas. Se han aislado de fuentes naturales más de 180 compuestos de esta clase, predominantemente de la especie Fusarium (2) . En base en la concentración y el patrón de sustitución del tricoteceno, se inhibe de manera preferencial Ref: 170333 el inicio de la traducción, el alargamiento o la terminación (3) . Dos de los agentes causales más importantes de FHB en los cereales son F. graminearum y F. culmorum . Aungue las líneas de F. graminearum en Europa y Norteamérica producen de manera predominante desoxinavelenol (DON) , los derivados acetilados de 3-acetildesoxinivalenol (3-ADON) y 15-acetil-desoxinivalenol (15-ADON) , los productores de nivalenol (NIV) , los cuales contienen un grupo hidroxilo adicional (figura 1A) predominan en Asia (4) . Aungue la toxicidad de estos tricotecenos está bien estudiada en sistemas animales (5) se sabe poco acerca de las diferencias en su fitotoxicidad. La exposición de animales a DON (la cual también se conoce como vomitoxina) se ha demostrado gue provoca efectos perjudiciales para la salud, el sistema neurológico e inmunológico son los objetivos más sensibles (6) . En contraste con las elevadas dosis de DON, las cuales inhiben la producción de anticuerpo, las dosis bajas de DON actúan de manera sinergística con procesos proinflamatorios estimulantes de los lipopolisacáridos bacterianos (6) . Para proteger a los consumidores se han establecido concentraciones de advertencia en los alimentos por la US Food and Drug Administration, y recientemente se han recomendado concentraciones de acción para DON en la comunidad Europea (7) .

El papel de DON en las enfermedades en las plantas aún es tema de discusión (8) pero la mayor parte de las pruebas favorecen la función como un factor de virulencia. Los mutantes de Fusarium con un gen interrumpido involucrado en la biosíntesis de tricoteceno (tricodieno sintasa, Tri5) aún son patogénicos, no obstante presentan una virulencia reducida en trigo (9) debido a su incapacidad para dispersarse desde el sitio de infección (10) . DON se puede mover hacia adelante del hongo en plantas infestadas, lo gue sugiere un papel en el acondicionamiento del tejido hospedador para colonización (11) . Los resultados de varios estudios indican gue la resistencia in vitro de los cultivadores de trigo hacia DON se relaciona con la resistencia a FHB en el campo (12) , lo cual también es el caso para segregación de poblaciones experimentales. La resistencia aumentada contra sustancias tóxicas puede ser causada por varios mecanismos, gue varían desde una captación reducida hasta la derivación, sobreexpresión o mutación de la toxina objetivo. Aún así, un proceso muy promisorio parece ser la transformación metabólica con frecuencia seguida por compartimentación (13) . Una declinación observada en la concentración de DON, la cual se produce en trigo infectado con Fusarium en el campo (14) sugiere gue la toxina puede ser metabolizada. Se ha sugerido la acetilación de tricotecenos (por ejemplo DON) , como una estrategia de resistencia potencial (US 6,346,655 Bl) , no obstante, los tricotecenos acetilados resultantes (por ejemplo acetil-DON = ADON) es eguivalente en su toxicidad total a la forma no acetilada (por ejemplo DON) como lo han demostrado Eudes et al . , en una prueba de alargamiento del coleoptilo (53) . Por lo tanto, la acetilación no resulta en una reducción de la toxicidad de tricoteceno. Dos cultivadores de trigo gue difieren en resistencia a Fusarium mostraron diferencias en su capacidad para formar un metabolito de DON, el cual se sospecha es un glucósido (15). Sewald et al., (16) incubaron un cultivo de suspensión de maíz con DON radiomarcado y demostraron gue es conjugado principalmente a 3-ß-D-glucopiranosil-4-desoxinivalenol . Las enzimas vegetales capaces de modificar los tricotecenos a otras micotoxinas por transferencia de una porción azúcar se han descrito hasta ahora. Los proyectos de secuenciado de genoma revelaron la existencia de una gran cantidad de genes en plantas gue codifican para UDP-glucosiltransferasas putativas (UGT) , gue se predice se conjugan a moléculas pegueñas . Por ejemplo, se ha demostrado gue Arabidopsis thaliana alberga más de 100 miembros de esta familia de genes múltiples (17) cuyas funciones son desconocidas en gran medida. Por lo tanto un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para destoxificación de micotoxinas . Las preparaciones adecuadas de micotoxinas o derivados de las mismas, especialmente derivados de micotoxinas conjugados con azúcar con frecuencia son difíciles de proporcionar. Dado gue la estereoselectividad es crucial para esta clase de productos, la síntesis puramente guímica basada en micotoxinas a granel comunes con frecuencia es difícil, si no imposible, por lo menos a escala industrial. Otro objeto de la presente invención por lo tanto es proporcionar métodos para sintetizar derivados de micotoxinas de azúcar-conjugado . Por lo tanto la presente invención proporciona un método de destoxificación de micotoxinas en donde una micotoxina se pone en contacto con la glucosiltransferasa en presencia de una glucosa activada. Como se menciona en lo anterior, hasta ahora no ha habido informe alguno publicado en la técnica anterior con respecto a enzimas (vegetales) gue sean capaces de modificar micotoxinas por transferencia de una molécula de azúcar y por supuesto no con respecto a tales enzimas gue sean capaces de destoxificar a dichas micotoxinas, es decir, reducir la toxicidad de micotoxinas en un grado considerable, por ejemplo en más de 80%, de manera preferible más de 90%, especialmente más de 95%, determinado por ensayos específicos para micotoxina, tales como la inhibición de síntesis de proteína in vitro. De acuerdo con la presente invención se ha encontrado gue las glucosiltransferasas son herramientas muy específicas para la destoxificación de micotoxinas. La especificidad esta dada, por una parte, por cierta especificidad de las glucosiltransferasas dadas a únicamente una cantidad limitada de micotoxinas y, por otra parte, también a la especificidad con respecto al modo de destoxificación, específicamente por glucosilación específica de sitio de las micotoxinas. Aungue esta especificidad limita el alcance de la solicitud de una glucosiltransferasa única dada, la presente invención proporciona herramientas para determinar con facilidad las especificidades de cualguier glucosiltransferasa con respecto a cualguier micotoxina, especialmente micotoxinas de tricoteceno. Por lo tanto, si una enzima dada es específica para un conjunto dado de micotoxinas, la presente invención permite la identificación directa de especificidades para otras glucosiltransferasas y micotoxinas. Dado gue la uridina difosfato glucosa (UDP-glucosa, por ejemplo glucosa la cual es producida por enzimas, tales como pirofosforilasas) es una forma biológica activada preferida de glucosa, una modalidad preferida del presente método utiliza UDP-glucosiltransferasa como glucosiltransferasa y una UDP-glucosa como glucosa activada (=cosustrato) , no obstante, se puede utilizar cualguier forma de glucosa, la cual puede ser usada por una glucosiltransferasa (por ejemplo ADP-glucosa, CDP-glucosa o cualguier otra forma de glucosa activada biológica y sintéticamente gue sean sustratos adecuados para transferencia a micotoxinas por glucosiltransferasas) , de acuerdo con la presente invención. Una glucosiltransferasa de acuerdo con la presente invención " se define como agüella gue se origina (en la naturaleza) o diseñada sintéticamente (recombinantemente) o producida por enzimas la cual es capaz (como su actividad principal o como una actividad secundaria) de transferir una porción glucosa a una molécula de sustrato utilizando una glucosa activada como cosustrato y de esta manera se produce una molécula de sustrato glucosilada. Las micotoxinas preferidas gue se van a destoxificar por el método de acuerdo con la presente invención son -debido a su importancia económica-tricotecenos, especialmente tricotecenos gue tienen un grupo hidroxi libre en la posición C3 y dos grupos hidrógeno en C4. Especialmente, estos últimos tricotecenos son glucosilados específicamente ya sea en su posición 3 o - si está presente - en su grupo hidroxi libre en la posición 7 o en ambas posiciones. Por lo tanto, las micotoxinas preferidas son desoxinivalenol, 15-acetil-desoxinivalenol, 15-acetoxiescirpendiol o mezclas de los mismos. Una manera preferida de llevar a cabo el método de acuerdo con la presente invención es el modo in vivo. Esto se puede llevar a cabo utilizando tecnología de ADN recombinante y/o compuestos gue mejoren la expresión de glucosiltransferasa. Los ejemplos preferidos comprenden la expresión de una glucosiltransferasa en una célula vegetal transgénica (o un tejido vegetal o una planta completa) gue contiene una glucosiltransferasa recombínate y/o una región reguladora recombinante para una glucosiltransferasa, especialmente un promotor inducible por micotoxina, especialmente una glucosiltransferasa. Los ejemplos preferidos para compuestos gue mejoran la expresión de glucosiltransferasa son sustancias las cuales regulan por activación a las glucosiltransferasa, por ejemplo toxinas (si la expresión de la transferasa es controlada por promotores inducibles por toxina) . En principio, cualguier célula la cual puede ser manipulada genéticamente de manera gue exprese un gen para glucosiltransferasa vegetal recombinante (es decir, un gen el cual ha sido introducido artificialmente en esta célula o su precursor y el cual no está presente de manera natural en el sitio del genoma de la célula) puede ser utilizado para este propósito. Las modalidades preferidas son bacterias transgénicas, levaduras, células de insecto infectadas con baculovirus, etc., gue expresen el gen para la glucosiltransferasa vegetal . En un procedimiento industrial para destoxificación de micotoxinas, la glucosiltransferasa ventajosamente se puede inmovilizar (de acuerdo con técnicas de inmovilización estándar) en una superficie sólida y una solución o suspensión gue contenga micotoxina después se puede poner en contacto con esta glucosiltransferasa inmovilizada. Los ejemplos preferidos de glucosiltransferasas gue se van a utilizar de acuerdo con la presente invención son UDP-glucosiltransferasas gue corresponden a la subfamilia 73c de Arabidopsis thaliana, específicamente las UDP-glucosiltransferasa 73C4 y 73C5. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención establece un método para producir micotoxinas glucosiladas en donde una micotoxina se pone en contacto con una glucosiltransferasa en presencia de una glucosa activada. Con esto, las especificidades de enzima mencionadas antes de pueden utilizar apropiadamente para producir derivados de micotoxina glucosilados específicamente. Si una micotoxina es glucosilada de una manera no enzimática ("guímica") se obtiene una mezcla cruda de productos de glucosilación (cada grupo hidroxi libre en principio es un sitio receptor para residuos glucosilo) . La acetilación como un medio de protección para tales grupos también tiene sus inconvenientes con respecto a la especificidad (además todos los grupos hidroxi son acetilados) . Al utilizar especificidad tanto de sustrato como de sitio, la presente invención proporciona un método para producir derivados glucosilados bien definidos. Si se glucosila más de un grupo hidroxi o si más de una posición es capaz de ser glucosilada por una glucosiltransferasa dada, tal número limitado de productos (por ejemplo 2 a 5) se pueden separar con facilidad por medios de separación adecuados tales como CLAR (por ejemplo, DON, gue está glucosilada en la posición número 3, es separable fácilmente de DON gue está glucosilada en la posición 7) . Las etapas de método preferidas descritas en lo anterior también son aplicables para este aspecto de la invención. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se relaciona con plantas transgénicas o con células (vegetales) transgénicas gue contienen una glucosiltransferasa recombinante y/o un elemento regulador de expresión recombinante, especialmente una región promotora para una glucosiltransferasa. Estas plantas o células (vegetales) se pueden utilizar en un método de acuerdo con la presente invención. La presente invención también se relaciona con una célula u organismo modificado genéticamente, especialmente una planta o célula vegetal gue comprende glucosiltransferasa la cual no se encuentra en la naturaleza (transgénica) en su genoma y gue es resistente a micotoxina, especialmente resistente a tricoteceno, debido a la presencia de dicha glucosiltransferasa como un transgen. De manera alternativa, una glucosiltransferasa endógena en una célula se puede someter a una región o elemento regulador de expresión transgénico diferente tal como un promotor, lo gue lleva a una expresión aumentada de la glucosiltransferasa endógena (es decir, una actividad de expresión aumentada de la glucosiltransferasa homologa debido . a los promotores transgénicos) . Además, tales células muestran una resistencia aumentada contra micotoxinas, como se describe en la presente . Tales células y plantas se pueden producir al aplicar métodos estándar a las enseñanzas de la presente invención (véase, por ejemplo, la figura 6B y los ejemplos así como, por ejemplo (54)).. Las células preferidas de acuerdo con la presente invención también son células de levadura. Dado gue las células de levadura pueden tener una capacidad de captación limitada, las células de levadura preferidas de acuerdo con la presente invención se diseñan o seleccionan para una capacidad aumentada de captación de micotoxina en comparación con la cepa de tipo silvestre o de inicio. Se prefieren específicamente, de acuerdo con la presente invención, las levaduras en las cuales uno o más, preferiblemente tres o más de los transportadores ABC están reducidos o inactivados en su actividad, especialmente pdr5. Tales mutantes de transportador ABC están caracterizados por una captación aumentada de micotoxinas. Preferiblemente, las células de acuerdo con la presente invención tienen una supresión en pdr5, pdrlO, pdrl5, sng2 , yorl, aytl o combinaciones de estas supresiones . Estas células preferiblemente se pueden utilizar para destoxificación de soluciones o suspensiones gue contienen micotoxina, especialmente para la destoxificación de tricotecenos en agricultura y en la producción de cervezas; también en la producción de micotoxinas glucosiladas, especialmente DON glucosilada o 15-ADON. La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos y las figuras, sin gue se limiten a estas .

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A-1D es un espectro de resistencia de tricoteceno de una levadura gue expresa UDP-glucosiltransferasas de Arabidopsis thaliana de la subfamilia UGT73C. A: Estructura y numeración del sistema de anillo de tricotecenos clase B utilizados para prueba de resistencia. Los diferentes residuos en las posiciones variables R1-R4 están indicados en la tabla (OAc: -OCOCH3, OBe : -OCOCH=CHCH3 (Z) ) . El Rl relevante está subrayado (OH en DON, ya blogueado por acetilación en 3-ADON) . La resistencia aumentada conferida por la expresión de DOGTl está indicada por un signo más, la carencia de protección por un signo menos. B: Organización genómica del grupo del gen UGT en el cromosoma II (subfamilia 73C) gue contiene DOGTl (UGT73C5, locus At2g36800) . La DON gue destoxifica a DOGTl y 73C4 están sombreadas en gris. C: Cepas de levadura gue son punteadas (spotted) sobre placas YPD gue contienen la cantidad indicada de toxina (ppm: mg/1) . Las cepas son de tipo silvestre YZGA515 sin plásmido (wt) , esta cepa se transforma con vector vacío (c) , y los transformantes gue expresan los UGT73C etiguetados con myc (C5 = DOGTl, subrayado, punteado por duplicado) . La resistencia se confiere por plásmidos gue lleva a la sobreexpresión de C5 y C4. D: Análisis de transferencia Western de las cepas de levadura utilizadas para pruebas de resistencia. La etigueta de epítopo c-Myc N terminal introducida en los miembros de la familia UGT73C respectivos se detecta (C5 = DOGTl, subrayado) . Se utiliza como control un transformante gue contiene un vector de expresión vacío. La figura 2 es la alineación de aminoácidos de las UDP-glucosiltransferasas vegetales con alta similitud de aminoácidos a DOGTl. Las regiones implicadas (Ref. 38) en la unión de sustrato aceptor (dottet) y el motivo de secuencia de consenso UGT (sombreado) están indicados por rectángulos debajo de las secuencias. El triángulo encima de la secuencia en la región de unión aceptora hipotética marca la lisina 136 en DOGTl la cual ha sido alterada por mutagénesis in vitro. Los números de acceso genban de las proteínas predichas son: ADGT9, glucosiltransferasa-9 de Vigna angularis (AB070752) ; T0GT1, fenilpropanoide : glucosiltransferasa 1 de Nicotiana tabacum (AF346431) ; IS5a de Nicotiana tabacum (U32644) ,-glucosiltransferasa putativa de Oryza sativa (AP002523) ; Twil de Licopersicon esculentum (X85138) ; betanidin-5-0-glucosiltransferasa de Dorothenathus bellidiformis (Y18871) . La figura 3A-3C muestra la expresión de DOGTl la cual es regulada por el desarrollo e inducida por DON y la respuesta de tensión relacionada con los compuestos. A: tinción con GUS de plántulas homocigotas para la fusión transcripcional de promotor DOGTl-GUS. Hilera superior: tres días después de la germinación (3 DAG) , la expresión de la proteína de fusión se limita a la vasculatura de la raíz y los hipocotilos así como la región meristémica de la punta de la raíz. Parte media: posteriormente en el desarrollo (10 DAG) la tinción en la vasculatura de la raíz disminuye excepto por las regiones en donde se forman raíces laterales . Hileras inferior: En partes aéreas de plantas adultas, la expresión de DOGTl se limita a los pétalos de las flores y las zonas de abscisión. B: Tratamiento con DON (5 ppm durante 4 h) de plántulas (14 DAG) gue expresan la expresión gue induce fusión GUS traduccional del indicador GUS . Ambas muestras se tiñen durante 2 horas. C: Análisis por PCR transcriptasa inversa semicuantitativa de la inducción de expresión de DOGTl, UGT73C4 y UGT73C6 después del tratamiento con DON (5 ppm) , SA (100 µM) , JA (50 µM) y ACC (2 µM) . Se utiliza UBQ5 como control interno. La figura 4A-4B es la parte N terminal de DOGTl gue es esencial para su capacidad para destoxificar a DON. La alineación de aminoácidos de DOGTl en su homólogo más cercano UGT73C6, el cual no protege contra DON (negro: identidad de aminoácidos) . El sitio de restricción EcoRI conservado se utiliza para generar los UGT guiméricos gue consisten de la parte N terminal de uno y la parte C terminal del otro gen respectivo. B. Los transformantes de lavadura se puntean por duplicado en medio YPD gue contienen las concentraciones indicadas de DON. Parte superior izguierda: Transformantes gue expresan la enzima guimérica gue consiste de la parte N terminal de UGT73C6 y la parte C terminal de DOGTl (corto: C6-DOG) . Parte superior derecha: cepas gue expresan la proteína guimérica gue consiste de la parte N terminal de DOGTl y la parte C terminal de UGT73C6 (D0G-C6) . Hilera inferior: transformantes gue expresan resistencia conferida por DOGTl (izguierda) e inactivos 73C6 (derecha) . El híbrido gue contiene la parte N terminal de DOGTl es resistente a concentraciones de DON más altas en comparación con la cepa gue expresa el otro híbrido (C6-D0G) o UGT73C6. La figura 5A-5C es un patrón de fragmentación de los DON-glucósidos sintetizados y de un DON-metabolito formado en células de levadura gue expresan DOGTl en espectrometría de masas. A: El D0N-3-0-glucósido sintetizado proporciona un fragmento de 427.2 m/z en la trampa de ion lineal (EM / EM/ EM) . B: este fragmento no se produce por la muestra de DON-15-O-glucósido sintetizada como una separación del grupo -CH20H en C6 evitado por la porción glucosa presente en el grupo hidroxilo . C : El metabolito DON formado en levadura gue expresa DOGTl eluido en CLAR con el mismo tiempo de retención gue DON-3-O-glucósido y gue muestra el patrón de fragmentación gue corresponde a la sustancia de referencia DON-3-O-glucósido. La figura 6A-6D muestra gue la glucosilación de DON reduce la toxicidad in vitro e in vivo. A: Estructura del producto de reacción propuesto: DOGTl cataliza la transferencia de glucosa a partir de UDP-glucosa a la posición 3-OH de DON. B: La comparación de la inhibición de la síntesis de proteína in vitro de ribosomas de trigo por DON y DON-3 -glucósido,' determinada utilizando un extracto de germen de trigo gue se basa en un sistema acoplado de transcripción/traducción. Se mide la luminiscencia y se expresa como % de actividad de luciferasa de las muestras control sin toxina. C: Análisis de transferencia Western de líneas de A . thaliana homocigotas para una construcción (constructo, plásmido recombinante) de sobreexpresión gue codifica para DOGTl etiguetado con c-myc. Se muestra en la parte de abajo un dibujo esguemático del vector de transformación de la planta (GENT: resistencia a gentamicina utilizado como un marcador seleccionable; 2x35S promotor duplicado de transcrito 35S de coliflor (véanse los Procedimientos Experimentales para Detalles) ) . Se utiliza Col-0 como un control negativo. Se muestran dos líneas con niveles altos y dos líneas con niveles bajos de proteína c-myc-DOGl. D: Germinación de semillas en medio EM gue contiene DON. En comparación con el tipo silvestre (Col-0) las líneas transgénicas de Arabidopsis expresan cantidades elevadas de DOGTl (por ejemplo la línea 1319/2) gue muestra resistencia aumentada .

EJEMPLOS Para ilustrar la presente invención, en los ejemplos gue siguen se describe la clonación de una UGT de Arabidopsis por expresión funcional en levadura y su caracterización. Esta enzima es capaz de destoxificar a DON de micotoxina de Fusarium y es acetilada al derivado 15-ADON. Los métodos utilizados en estos ejemplos también son aplicables directamente a otras glucosiltransferasas y micotoxinas sin una carga experimental indebida. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Cepas de Levadura. Las cepas de levadura utilizadas en este trabajo se derivan de YPH499 (Mat a, ade2-lOloc, his3-?200, Ieu2-? 1, lys2-801a, trpl- ? 1 , ura3-52) (18). El genotipo relevante de YZGA452 es pdr5?::TRPl, pdrlO?: :hisG, sng2?::hisG, yorl?::hisG. YZGA515 8pdr5?: : TRPl, pdrlO?: :hisG, pdrl5?: : loxP-KanMX-loxP, aytl?::URA3) gue se construye por interrupción de la acetiltransferasa AYTl en la cepa YHW10515. Material vegetal y condiciones de crecimiento. Se llevan a cabo procedimientos con A . thaliana con el ecotipo de tipo silvestre Columbia-0 (Col-0) . Para propagación las semillas son esterilizadas sembradas en placa en medio de crecimiento EM estándar (19) suplementado con sacarosa 1.0% y fitagar 1.0% (Life Technologyes) y se somete a un tratamiento en la oscuridad durante 2 días a 4°C para sincronizar la germinación. Las plántulas se hacen crecer durante 2 semanas en un ambiente controlado de ciclo de luz-oscuridad de 16 h/8 h (luz blanca de 140 µmol 'z seg"1) a 22°C antes de gue se transfieran al suelo y se hagan crecer a 20°C y 55% de humedad bajo luz blanca continua. Biblioteca de ADNc de Arabidopsis thaliana cribada en levadura. La secuencia (cásete) de unión de ATP (ABC) de un transportador deficiente de Saccharomyces cerevisiae cepa YZGA452, el cual es hipersensible a DON se transforma con una biblioteca de ADNc de A . thaliana gue se expresa de manera constitutiva bajo el control de un promotor de fosfoglucerato cinasa (PGK1) (20) . Se seleccionan un total de 107 transformantes de medio mínimo gue carece de uracilo y se transfieren a medio gue contiene 180 ppm de DON, suficiente para inhibir completamente el crecimiento de levadura transformada con el plásmido de la biblioteca vacía. Las colonias gue muestran resistencia se aislan y de los candidatos gue forman colonias simples sobre medios gue contienen toxina, se determina la dependencia plasmídica del fenotipo por preparación de ADN plasmídico y retransformación de YZGA452. El fragmento Notl gue contiene el inserto de ADNc del candidato el cual se denomina DON glucosiltransferasa 1, DOGTl) se subclona en pBluescript SKII+ (Stratagene) y se secuencia. Expresión constitutiva e inmunodetección de la DON-glucosiltransferasa (DOGTl) y homólogos cercanos en levadura. Los marcos de lectura abiertos (ORF) sin intrón de DOGTl (UGT73C5, Locus At2g36800) y 5 de sus homólogos más cercanos (UGT73C1, At2g36750; UGT73C2, At2g36760; UGT73C3, At2g36780; UGT73C4, At2g36770; UGT73C6, At2g36790) se amplifican por PCR (Triple Master PCR System, Eppendorf) a partir de ADN genómico utilizando cebadores específicos de gen gue contienen los sitios de restricción HindIII y Notl flangueantes en los extremos 5 ' y 3 ' , respectivamente (DOGTl, fw: 5 ' -ACTAAGCTTGGíATCATGGTT"_ 7CCGAAACA-3 ' rv : 5 ' -AAGCGGCCGCATACTCAATTATTGG-3 • ; 73C1, fw: 5' CTAAGCTTGGAATCATGGCATCGGAATTTCG-3 ' , rv: 5' TAGCGGCCGCATTCATTTCTTGGTTGTTC-3 ' ; 73C2, fw: 5' CTAAGCTTGGAATCATGGCTTTCGAGAAAGACC-3 ' , rv: 5' TAGCGGCCGCATTCAACTCTTGGATTCTAC-3 ' ; 73C3, fw: 5' CTAAGCTTGGAATCATGGCTACGGAAAAAA-3 ' ; rv: 5' TAGCGGCCGCATTCATTCTTGAATTGTGC-3 ' ; 73C4, fw: 5' CTAAGCTTGGAATCATGGCTTCCGAAAAATC-3 ' , rv: 5' TAGCGGCCGCATTCAGTTCTTGAATTTCA-3 ' ; 73C6: 5' CTAAGCTTGGAACATGTGTTCTCATGATCCT-3 ' , rv: 5' TAGCGGCCGCATTCAATTATTGGACTGTGC-3 ' ) . Los productos de PCR se clonan en los sitios de clonación HindIII + Notl del vector de expresión de levadura pYAK7 (PADHl-c-Myc-PDR5 LEU2 2 µl) , sustituyendo al gen PDR5. El vector pYAK7 se construye al insertar primero el enlazante de cadena . doble 5 ' - GGATGCCCGAACAAAAGTTAATTTCAGAAGAGGACTTATCAAAGCTTGAGGCCTCGCGA dentro del sitio Smal del vector pAD4? (21) , y de esta manera se genera el epítopo c-Myc N terminal y un sitio HindIII, dentro del cual se inserta, en marco, un fragmento HindIII genómico gue contiene la levadura PDR5. Las construcciones UGT etiguetadas se verifican por secuenciado y se utilizan para transformar la levadura cepa YZGA515. Se utiliza como un control un vector vacío (digerido con HindIII + Notl y religado a pYAK7) . Los transformantes se seleccionan en medio mínimo gue carece de leucina. Los cultivos gue se encuentran en fase de crecimiento exponencial se diluyen hasta una D06oo de 0.05 y se puntean en medio YPD gue contiene concentraciones en aumento de tricotecenos diferentes. Las toxinas utilizadas son: DON, 3-ADON, 15-ADON, NIV, tricocetina (TTC) , toxina T-2, toxina HT-2, diacetoxiescirpenol (DAS) y verucarina A (VA) . Con la excepción de DON, 3-ADON y NIV, los cuales se obtienen de Biopure Referenz-substanzen GmbH (Tulln, Austria) , las micotoxinas de adguieren de Sigma y se almacenan a -20°C disueltas en etanol 70%. Para inmunodetección, la extracción de proteínas de células de levadura se realiza como se describe por Egner et al. (22) . El análisis Western se lleva a cabo con un anticuerpo anti c-Myc primario de ratón (1:5000, clon 9E10, Invitrogen) . Barajado de dominio. Los ORF gue incluyen la etigueta c-Myc N terminal de DOGTl y su homólogo más cercano UGT73C6 se aislan de los vectores de expresión de levadura por digestión con Smal + Notl , se clonan en el vector pBluescript SKII+ (el cual se corta con Xhol y se trata con la enzima Klenow y posteriormente se digiere con Notl) . Los plásmidos resultantes se digieren con HindIII y un sitio EcoRI conservado presente en ambos genes gue separa a DOGTl en la posición nucleotídica 565 (73C6 en 568) . Los híbridos se construyen por ligación de la parte N terminal de un gen con la parte C terminal del otro. Los genes resultantes se mueven de regreso al interior del vector de expresión de levadura pYAK7 utilizando los sitios de restricción HindIII y Notl. Se utiliza la levadura cepa YZGA515 como un hospedador para probar las construcciones para las capacidades de destoxificación alteradas. Mutagénesis dirigida al sitio. Se construyen mutaciones por PCR de extensión con superposición (23) utilizando cebadores mutantes superpuestos DOG-K136E-fw (5 ' -TACAAGCGAAATCGCCAAGAAGTTCA-3') y DOG-K136E-rv (5 ' -CTTCTTGGCGATTTCGCTTGTATAAG-3 ' ) y cebadores flangueantes D0GIpYAK7-fw-a- (5 ' -ACTAAGCTTGGAATCATGGTTTCCGAAACA-3 ' ) y DOG-EcoRI-rv (5'-TCTTGTGAATTCAACTCTATC AGGA-3 * ) para mutagénesis de DOGTl y cebadores mutantes 73C6-E137k-fw (5 ' -TACAAGCAAAATCGCC AAGAAGTTCAA-3 ' ) y 73C6-E137K-rv (5 ' -ACTTCTTGGCGATTTTGCTTGTATT-3 ' ) y los cebadores flangueantes 73C6pYAK7-fw (5 ' -TAAGCTTGGAATCATGTGTTCTCATGATCCT-3) y DOG-EcoRI-rv para mutagénesis de 73C6. Los productos de PCR resultantes se clonan como fragmentos HindIII + EcoRI en los genes correspondientes presentes en el vector pBluscript SKII+. Después del secuenciado, los ORF se mueven como fragmentos HindIII + Notl de regreso en el vector de expresión de levadura pYAK7 (sustituyendo al gen PDR5) y los plásmidos resultantes se transforman en la cepa YZGA515 para analizar las propiedades de destoxificación de los UGT sometidos a ingeniería genética. Síntesis de 3-ß-D-glucopiranosil-4-desoxinivalenol y i5-ß-D-glucopiranosil-4-desoxinivalenol . Para obtener el material de referencia para CLAR y CCD, se sintetizan en reacciones de dos etapas DON-3-glucósido y DON-15-glucósido. En la primera etapa se modifica 15-acetil-DON o 3-acetil-DON con 7-ß-bromo-l-desoxi-2,3, 4, 6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosa (acetobromoglucosa) en tolueno con CdC03 como catalizador para proporcionar los DON-glucósido acetatos (24) . La hidrólisis suave de los acetatos a los glucósidos se realiza en la segunda etapa utilizando un intercambiador aniónico de base fuerte (DOWEXlx2-400, Aldrich, USA) . Después de verificar el avance de la reacción con CCD (fase móvil de tolueno/acetato de etilo 1:1, v/v) , los DON-glucósidos se limpian utilizando cromatografía instantánea sobre gel de sílice con 1-butanol/l-propanol/etanol/agua (2:3:3:1, v/v/v/v) . La purificación adicional de las sustancias se realiza por CLAR, por medio de una columna RP-18 Aguasil (Keystone, Waltham, USA) utilizando acetonitrilo/agua (10:90, v/v) a 22 °C. Los DON-derivados sintetizados se caracterizan en el modo de interconexión de electroaspersión negativa (ESI, por sus siglas en inglés) . El análisis de LC-EM/EM se realiza en un sistema QTrap-LC-EM/EM (Applied Biosystems, Foster City, USA) eguipado con ESI y un sistema de CLAR Serie 1100 (Agilent, Waldbronn, Alemania) . La separación cromatográfica se obtiene en una columna de 150 mm x 4.6 mm de diámetro interno, 3 µm, Aguasil RP-18 (Keystone, Waltham, USA) a 22 °C utilizando metanol/agua (28:72, v/v). El caudal se ajusta a 0.3 ml/min. La interconexión ESI se utiliza en el modo de ion negativo a 400°C con CUR 138 kPa (20 psi) , GS1 207 kPa (30 psi) , GS2 517 kPa (75 psi) , IS -4200 V, DP -46 V, EP -9 V, CE -30 eV, CAD alto, tiempo de llenado LIT 50 ms, barrera de entrada Q3 , 8 V. Aislamiento y análisis de los metabolitos de DON in vivo. Para dilucidar la estructura guímica de los metabolitos de DON gue resultan de la transformación enzimática de la micotoxina por DOGTl, se construye una cepa altamente tolerante y se extrae el DON-metabolito de las células tratadas con toxina para análisis por CLAR subsecuente. La levadura cepa YZGA515 se transforma con DOGTl etiguetado con c-Myc bajo el control del promotor ADHl constitutivo y además con el plásmido pRM561. Este plásmido contiene una versión mutante de la proteína L3 ribosómica (RPL3) de Saccharomyces cerevisiae gue incrementa sustancialmente la resistencia de DON cuando se expresa en levadura. Los transformantes se seleccionan en medio mínimo gue carece de leucina y adenina. La cepa de levadura gue se obtiene se hace crecer hasta una DOSOo de 0.7 en medio selectivo (SC-LEU-ADE) . Las células se transfieren a medio YPD (glucosa 10%) gue se suministran con adenina adicional, se hacen crecer durante 2 h a 30°C, se cosechan por centrifugación y se diluyen hasta un D06oo de 3.0 en YPD. Se agrega DON a 5 mi de cultivo comenzando con 200 ppm de DON. Después de 3 h se incrementa la concentración a 400 ppm, después de 6 h a 600 ppm y después de 9 h a 1000 ppm. Las células se incuban adicionalmente durante 15 h a 30°C antes de gue se cosechen, se laven tres veces con agua enfriada con hielo, se extraen 2.5 mi de metanol/agua (4:1) y se sonican. Después de centrifugación el sobrenadante se filtra a través de un filtro de microfibra de vidrio (Whatman 1822 025) . Se concentran a seguedad 500 µl de los extractos de levadura bajo una corriente constante de nitrógeno y se disuelve en 100 µl de agua grado CLAR. Expresión heteróloga de DOGTl en Escherichia coli . La proteína DOGTl se expresa en Escherichia coli XLl-Blue como una fusión GST. El gen para DOGTl se libera del vector de expresión de levadura por digestión con HindIII y se llena con Klenow, seguido o digerido con Notl. El fragmento resultante se clona en los sitios Smal + Notl del vector de fusión del gen para GST, pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia) . La proteína de fusión recombinante se purifica utilizando Sepharose acoplado a glutation (Amersham Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Para probar el efecto de la etigueta GST N terminal en la actividad, el gen gue codifica para la proteína de fusión se amplifica por PCR utilizando ADN polimerasa con actividad de proof reading (Pfu polimerasa, MBI) y los cebadores específicos para proteína de fusión GSTD0GpYAK7-fw (5'-TCACCCGGGAA?CAGTAATCATGTCC-3') y GSTDGFpYAK7-rv (5 ' -CGAGGCAGATCGTCAGTCAGTC-3 ' ) . El producto de PCR se clona con HindIII+Notl en el vector de expresión de levadura pYAK7. Se prueba la capacidad de destoxificación con DON en YZGA515 y la aplicación a medio gue contiene toxina como se describe en lo anterior. Ensayos de enzima. La mezcla de ensayo de actividad de glucosiltransferasa contiene 1 µg de proteína de fusión GST recombinante, 2-mercaptoetanol 10 mM, Tris-HCl 50 mM, ' pH 7.0, UDP- [14C] glucosa marcada radioactivamente 0.5 mM (4.4*103 cpm, NEN Life Science Products, USA), BSA 0.1% y 1 mM de sustrato aceptor (disuelto en DMSO en soluciones concentradas 20 mM) . Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 20 µl a 30°C durante 1 h, se detienen por la adición de 2 µl de ácido tricloroacético (240 mg/ml) , se congelan y almacenan a -20°C. El análisis de los productos de reacción se realiza por CCD. Una alícuota de cada muestra se gráfica en una placa de gel de sílice (Kieselgel 60; Merck) y se revela con una mezcla de 1-butanol/l-propanol/etanol/agua (2:3:3:1, v/v/v/v) . Se determina la intensidad de cada punto radioactivo utilizando un generador de fosfoimagen (sistema STORM 860, Molecular Dynamics) . Las placas se tiñen adicionalmente con p-anisaldehído (0.5% en metanol/H2S04/ácido acético, 85:5:10, v/v/v) . Inhibición de ribosomas de trigo in vitro. Para analizar si el 3-ß-D-glucopiranosil-4-desoxinivalenol es menos fitotóxico gue su aglucon se utiliza un extracto de germen de trigo acoplado a un sistema de transcripción traducción in vitro (TNT Coupled Wheat Germ Extract, T3 , Promega) . Después de realizar las reacciones de transcripción/traducción durante 25 minutos de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes en presencia ya sea de DON, glucósido DON purificado (1 µM, 2.5 µM, 5 µM, 10 µM y 20 µM) o agua como un control, se determina la actividad del indicador luciferasa de luciérnaga (Luciferasa Assay Systems, Progema) utilizando un luminómetro (Víctor 2, Wallac) . Tratamiento de plantas con diferentes compuestos relacionados con respuesta al estrés para análisis de expresión. Para el análisis de transcripción inversa (RT) -PCR de la expresión de ARNm de DOGTl después de tratamientos con DON, ácido salicílico (SA) , ácido jazmónico (JA) y ácido 1- aminociclopropilcarbónico (ACC) se hacen crecer plántulas durante 2 semanas en placas EM verticales (fitagar 0.8%) antes de gue se transfieran a medio EM líguido. Las plantas se incuban durante 48 h en un agitador orbital (50 rpm) antes de agregar 5 ppm de DON, SA 200 µM, ACC 2 µM o JA 50 µM. Los compuestos se mantienen en soluciones concentradas disueltas ya sea en etanol 70% o en DMSO. Los tratamientos con etanol y con DMSO se realizan como controles. Las plantas se cosechan en diferentes puntos de tiempo, se mueven en nitrógeno líguido y se almacenan a -70 °C hasta gue se realiza la extracción de ARN. Análisis de la expresión de ARNm de DOGTl y homólogos cercanos por transcriptasa inversa-PCR. Se aisla el ARN total de tejido vegetal molido en nitrógeno líguido con Trizol Reagent como lo recomiendan los fabricantes (Gibco BRL Life Technologies) . Se cuantifica fotométricamente el ARN y visualmente en un análisis de gel de ARN desnaturalizante 5 µg de ARN total. Se sintetiza ADNc a partir de 1 µg de ARN total (se digiere con desoxirribonucleasa I) con 500 ng de un oligómero de 18 unidades (dT) y la transcriptasa inversa SuperScript (Gibco BRL Life Technologies) . Se . realiza PCR con aproximadamente 2 µl de ADNc diluido 1:20 utilizando cebadores gue amplifican 200 a 400 pares de bases de fragmentos grandes gue se localizan en la parte C terminal de los genes gue se van a analizar (DOGRT-fw: 5'-ATCCGGGGTTGAACAGCCT-3 ' , DOGRT-rv: 5 ' -TCAATTATTGGGTTCTGCC-3 ' : 73C4RT-fw: 5 ' -GGAGAAAATAGGAGTGTTA-3 ' , 73C4RT-rv: 5*-TCAGTTCTTGGATTTCACT-3 ' ; 73C6RT-fw: 5-GAGAAACTGGTCGTACAA-3 ' , 73C6RT-rv: 5 ' -TCAATTATTGGACTGTGCT-3 ' ; UBQ5-U: 5'-GTCCTTCTTTCTGGTAAACGT-3 ' , UBQ5-D; 5 ' -AACC CTTGAGGTTGAATCATC-3 ' ) . Para comparar las cantidades relativas de los transcritos en las muestras, los fragmentos de ADN de UBQ5 primero se amplifican y los volúmenes de muestra normalizados basados en la cantidad de productos gue corresponden a los transcritos de UBQ5 se utilizan para PCR. Clonación de construcciones de sobreexpresión vegetal y GUS-construcciones de fusión. Para la sobreexpresión constitutiva de proteína DOGTl etiguetada con c-Myc en Arabidopsis, se construye el vector pBP1319. Se deriva de una versión modificada del vector de expresión vegetal pPZP221 (25) . El cásete promotor consiste de dos copias del promotor 35S y la señal de poliadenilación de CaMV cepa Cabb-B-D utilizada para el vector p2RT, una versión modificada de pRTIOO (26) . El fragmento de DOGTl etiguetado con c-Myc se libera por digestión con S a + Notl (rellenado con Klenow) a partir del vector de expresión de levadura y se clona en pBluescript SKII+, el cual se corta con Clal + Smal y se trata con enzima Klenow. En la siguiente etapa, el gen se separa del plásmido resultante como un fragmento Slal + BamI y se inserta en los sitios Xhol + BamHi de p2RT. El cásete gue se obtiene 2x35S c-Myc-DOGT se aisla por digestión PstI y se clonan en el sitio PstI único de pPZP221 después del sitio de clonación múltiple en donde el vector se ha destruido por digerir el plásmido con EcoRI + Slal, llenando los sitios con Klenow y religándolos. En el vector resultante pBP1319, se orienta el cásete 2x35S c-Myc-DOGTl en la dirección opuesta en comparación al marcador de resistencia a gentamicina 2x35S. Para la construcción de una fusión transcripcional DOGT1-GUS, se utiliza el vector GUS pPZP-GUS.l el cual se origina a partir de pPZP200 y gue contiene el gen GUS para pBHOl.l (insertado con HindIII + EcoRI en el MCS) (27) . La región promotora DOGTl se amplifica por PCR y a partir de ADN genómico utilizando ADN polimerasa con actividad proof reading (Pfu polimerasa, MBI) y cebadores específicos (DOGP-GUS-fw: 5 * -GTTAAAAGCTTACATGTGCATTACGGTCTGTGTGAATA, DOGP-GUS-rv: 5 ' -TTTCGGATCCCATG ATTCAACCTTAGTAAGAAACTCTC) . El producto resultante se clona en marco con el gen GUS HindIII + BamHI dentro del vector pPZP-GUS.l. Las construcciones se confirman por secuenciado de ADN. Generación y análisis de A. thaliana transgénica. Para todas las transformaciones en plantas se utiliza Agrobacterium tumefaciens cepa UIA143 deficiente en recA (28) la cual alberga el plásmido auxiliar pMP90 (29) . Se transforma A . thaliana aplicando la técnica de inmersión floral (30) . La progenie de 15 transformantes independientes se selecciona a través de tres generaciones para obtener líneas homocigotas. Para inmunodetección de DOGTl etiguetado con c-Myc, se homogeneiza en nitrógeno líguido aproximadamente 200 mg -500 mg del material vegetal. Se agregan 300 µl de amortiguador de extracción (Tris-HCl 200 mM, pH 8.9; KC1 200 mM; MgCl2 35 mM; EGTA 12.5 mM; DTT 15 mM; sorbitol 0.6 mM) y 15 µl de mezcla de inhibidor de proteasas (Sigma, # 9599) a muestras aún congeladas y la mezcla se incuba bajo agitación vigorosa durante 15 minutos a 4°C. Después de centrifugación (14,000 rpm durante 15 minutos a 4°C), se transfieren 200 µl de los sobrenadantes a tubos nuevos y se almacenan a -20 °C. Se utilizan cantidades eguivalentes de proteína (50 µg) para análisis de transferencia Western el cual se lleva a cabo utilizando el anticuerpo anti C-Myc primario purificado de sobrenadante de hibridoma (clon 9E10) . Para análisis de resistencia DON, se germinan semillas de líneas homocigotas gue muestran una alta expresión de DOGTl y Col-0 como control en medio EM gue contiene concentraciones diferentes de DON (5 - 30 ppm) . Las plántulas se hacen crecer durante 5 semanas antes de gue se documente el fenotipo. Se analiza la actividad de GUS por tinción de las plántulas u órganos de plantas adultas en solución X-Gluc durante 2 a 4 h a 37°C (31) .

RESULTADOS Aislamiento de DON-glucosiltransferasa (DOGTl) por expresión heteróloga en levadura. Se establece un cribado funcional sin desviaciones, gue se basa en la expresión heteróloga de los ADNc en levadura con el objetivo de identificar genes vegetales gue contribuyan a resistencia contra micotoxinas. Saccharomyces cerevisiae de tipo silvestre es altamente resistente con desoxinivalenol (DON) . Con el fin de reducir la cantidad de toxina necesaria para el cribado se genera una cepa deficiente en cuatro transportadores ABC los cuales van a ser responsables en gran medida de la resistencia pleyotrópica al medicamento en levadura (32). La cepa YZGA452 (sng2?::hisG pdr5?::TRPl pdrlO?::hisG yorl?::hisG) es hipersensible a una amplia gama de diferentes sustancias xenobióticas y productos naturales, gue incluyen DON. Se transforma YZGA452 con una biblioteca de expresión de ADNc de A . thaliana (20) , en donde los ADNc se expresan de manera constitutiva bajo el control del promotor de fosfoglucerato cinasa de levadura. Se generaron diez millones de transformantes y se diluyen en acumulados de transformantes gue se siembran en placas sobre medio gue contiene DON. Después de la selección de las colonias de levadura resistentes a DON y la confirmación de la dependencia del plásmido del fenotipo, el inserto se subclona y se secuencia. DOGTl es un miembro de la familia de UDP-glucosiltransferasa de A. thaliana y muestra una alta similitud con ácido salicílico y genes inducibles por heridas de otras especies. El ADNc gue confiere resistencia tiene un tamaño de 1.75 kb y gue contiene un marco de lectura abierto de 1488 longitudes de pares de bases gue codifica o una uridina difosfato (UDP) -glucosiltransferasa putativa. La DON-glucosiltransferasa (DOGTl) identificada corresponde con el gen UGT 73C5 y pertenece a la subfamilia 73C, parte del grupo D de UDP-glucosiltransferasa (las UGT) de A . thaliana (33) . Las UGT de Arabidopsis constituyen una familia de genes muy grandes gue se han dividido en 14 grupos distintos, gue se considera se han originado de ancestros comunes (17) . DOGTl se localiza en un grupo (figura IB) junto con otros cinco miembros de la subfamilia 73C en el cromosoma II (BAC clon F13K3, At2g36800) . La totalidad de los seis genes repetidos en tándem gue no contienen intrones, y gue son altamente similares entre sí (77 - 89% de identidad a nivel de aminoácidos) . La similitud también es muy elevada en regiones promotoras intergénicas . Una investigación de base de datos con la secuencia de aminoácidos de DOGTl mostró alta similitud de glucosiltransferasas a partir de tabaco (T0GT1 ref. 34, Is5a e IslOa, ref. 35) y tomate (Twi-1, ref. 36), cuya expresión se ha demostrado gue es elevada después del tratamiento con ácido salicílico (SA) , inductores micóticos o sanado (34, 36, 37) y con la betanidina 5-0-glucosiltransferasa de Dorotheanthus bellidiformis (38) . En la figura 2 se muestran dos glucosiltransferasas no caracterizadas de Vigna angularis (ADGT-9) y Oryza sativa con homología con DOGTl gue también se incluyen en la alineación de aminoácidos. Las regiones de alta similitud se observaron en los dominios tanto amino como carboxi terminales de las secuencias de aminoácidos deducidas. En la figura 2 se indica la región de unión de sustrato aceptor hipotético (38) y la secuencia de consenso UGT (33) . La expresión de DOGTl se regula por desarrollo y se induce por DON y otros compuestos relacionados con la respuesta del estrés. Para investigar si la expresión de DOGTl es regulada de una manera similar a la descrita para los genes relacionados de otras especies vegetales, se coloca el ORF del gen indicador de ß-glucuronidasa detrás del promotor DOGTl (PDOGTI-GUS) . Esta expresión específica de tejido de la fusión GUS transcripcional se examina histoguímicamente en Arabidopsis transgénica homocigota para el gen de fusión. Los resultados gue se muestran en la figura 3 demuestran gue la expresión de DOGTl es regulada en el desarrollo y en general de manera más bien baja. En plántulas se observa actividad GUS la cual se encuentra en la raíz y específicamente los hipocotilos, con una expresión más fuerte en el sistema vascular, en el tejido merismático y en las puntas de las raíces (en la raíz primaria así como las raíces laterales) y en la vasculatura del hipocotilo derecho después de la germinación. La tinción de la vasculatura disminuye significativamente después en su desarrollo y aparece un patrón de tinción por parches en las células de raíz epidérmica. En plantas adultas, la actividad de GUS se detecta en etapas tardías del desarrollo de las flores en pétalos y en las zonas de abscisión (figura 3A) . La exposición a las plántulas ya sea de DON (5 ppm durante 4 h) o del precursor de etileno ácido aminociclopropilcarbónico (ACC, 2 µM durante 1 h) se encuentra gue induce la expresión de PDOGTI-GUS (figura 3) . No se detecta inducción de la expresión del indicador por tratamiento con SA (200 µM durante 12 h) o el tratamiento con ácido jazmónico (JA, 50 µM durante 1 h) . La PCR de transcriptasa inversa semicuantitativa se aplica para validar los resultados gue se obtienen del análisis del indicador GUS al detectar cambios en las concentraciones de ARNm de DOGTl, 73C4 y 73C6 después del tratamiento con las mismas concentraciones de DON, SA, ACC y JA como las utilizadas en lo anterior.

Como se muestra en la figura 3C, los resultados de PCR de transcriptasa inversa confirman la expresión inducible por DON de DOGTl observado previamente con la construcción indicadora, y además muestran gue también los otros dos UGT probados son inducibles por DON. Se observa un incremento en las cantidades de transcritos de antemano, después de 1 h de incubación con la toxina, alcanzando un pico después de 4 h y declinando nuevamente entre 6 y 12 h. De manera interesante, 73C6 mostró una inducción más fuerte de expresión por DON en comparación con DOGTl o 73C4, aungue los datos mostrados en lo siguiente indican gue no aceptan la toxina como un sustrato.' Después del tratamiento SA, la expresión de DOGTl, 73C4 y 73C6 es evidente a bajas concentraciones a 4 h y ligeramente fuerte a 2 h. Se ha notado gue la concentración aplicada de SA 200 µM induce la expresión de los tres genes en vez de débilmente. El ácido jazmónico así como el tratamiento con ACC también lleva a una inducción débil de la expresión de DOGTl y UGT73C6 aparentemente de antemano después de 1 h del tratamiento, pero declina rápidamente sin acumulación detectable de transcrito después de 2 h de exposición a los compuestos (figura 3C) . La determinación fenotípica del espectro de resistencia a tricoteceno en levadura. La toxicidad de tricoteceno en animales depende del patrón de hidroxilación así como de la posición, número y complejidad de esterificaciones (5) . La estructura básica' de tricoteceno y el sistema de numeración de átomos de carbono se muestra en la figura 1A. Los miembros de la subclase B (por ejemplo DON y NIV) contienen un grupo ceto en el carbono C-8, mientras gue los tricotecenos tipo A (por ejemplo la toxina T-2 altamente tóxica producida por F. sporotrichoides) no. Los tricotecenos macrocíclicos también son extremadamente tóxicos, mientras gue la verucarina A, la cual contiene un anillo macrocíclico con enlaces éster gue unen al carbono 4 y al carbono 15. Los mutantes pdr5 de levadura son hipersensibles a todos los tricotecenos probados hasta ahora, lo gue nos permite investigar la capacidad de DOGTl y otros genes en el grupo para conferir resistencia a diversos miembros de los tricotecenos . La alta similitud de UGT73C1, C2 , C3 , C4, C5 (DOGTl) y C6 y su apariencia agrupada sobre el cromosoma sugiere gue han evolucionado vía duplicaciones de genes a partir de un gen ancestral y por lo tanto posiblemente tengan propiedades enzimáticas relacionadas. Para analizar las posibles similitudes en su función, los seis ORF se amplifican con cebadores específicos y se expresan en levadura como proteínas de fusión con una etigueta de epítopo c-Myc N terminal . La comparación de los transformantes gue expresan DOGTl etiguetado o sin etiguetar muestra gue el epítopo no interfiere con la actividad protectora de DON. El transformante de levadura gue representa el conjunto de gen completo del grupo se puntea en medio gue contiene concentraciones cada vez mayores de diversos tricotecenos . Los transformantes gue contiene el vector de expresión vacío se utilizan como controles. Los resultados gue se muestran en la figura 1 muestran gue UGT73C4, al igual gue DOGTl, confieren resistencia a DON. Aungue C4 tiene únicamente la segunda similitud más alta (79% de identidad con respecto a DOGTl) , tiene la capacidad de desintoxicar DON y 15-ADON (figura 1C) , pero no confiere resistencia a 3-ADON, NIV, TTC, HT-2 -toxina, T2-toxina, DAS y VA. En contraste, UGT73C6, el cual muestra 89% de identidad a nivel de aminoácidos con la similitud más alta no protege contra ninguno de los tricotecenos probados . De igual manera, 73C3 no es capaz de conferir resistencia a las micotoxinas probadas aungue la totalidad de las cuatro proteínas se expresan con un grado similar en levadura. Las construcciones 73C1 y 73C2 tampoco mejoran la resistencia a toxina, no obstante, esto también puede deberse a concentraciones de proteína recombinantes menores presentes en los transformantes de levadura (figura ID) . La especificidad de destoxificación de DON se localiza en la parte N terminal de DOGTl. Las características diferentes de las enzimas relacionadas estrechamente pese a su alta similitud de secuencia abren la posibilidad de dilucidar características de las proteínas las cuales son cruciales para el reconocimiento de DON. Se utiliza un sitio EcoRI presente tanto en DOGTl como en 73C6 (véase la figura 4A) para construir híbridos gue contienen la parte N terminal de uno y la parte C terminal del otro gen respectivo. La expresión en levadura y la exposición a medio gue contiene DON muestra gue la parte N terminal de DOGTl (gue consiste de los primeros 189 aminoácidos) es esencial para determinar la capacidad de desintoxicar DON (figura 4B) . Un residuo lisina en la posición 136 en DOGTl se conserva en el destoxificante 73C4 pero se sustituye por otros aminoácidos en los dos homólogos no destoxificantes C3 y C6. Se utiliza la mutagénesis dirigida a sitio para introducir mutaciones en DOGTl y el UGT73C6 gue lleva a un cambio en el residuo 136 lisina en DOGTl a ácido glutámico, el cual está presente en la posición correspondiente en C6 (aminoácido 137) . La proteína mutante D0GT1K136E protegida con la misma eficacia gue DOGTl, demuestra gue K136 no esencial para la capacidad de destoxificación de DON. Además, la construcci ,ó ^n i,nversa 73C6El _7I_ permanece i'nacti•va. Prueba de análisis in vivo e in vitro de que DOGTl cataliza la transferencia de glucosa a partir de UDP-glucosa específicamente en la posición 3 -OH de DON. La protección contra 15-ADON y la capacidad de conferir resistencia contra 3-ADON sugiere gue DOGTl puede catalizar la formación de DON- 3-O-glucósido. Para comprobar esta hipótesis, en primer lugar se unen derivados de DON sintetizados guímicamente, con la porción glucosa al grupo hidroxilo C3 o C15 de DON. Los dos productos se caracterizan por CL-EM/EM. El D0N-3-0-glucósido y el D0N-15-0-glucósido eluyen a los 12.43 min y 12.68 min, respectivamente. Los espectros de masa de los glucósidos muestran diferencias características en su patrón de fragmentación (figura 5) . Aungue el DON-3-O-glucósido se fragmenta a un ion de 427.2 m/z bajo las condiciones dadas, el mismo ion no se detecta con DON-15-O-glucósido . La pérdida de 30 unidades de masa atómica se puede explicar por la separación del grupo -CH20H en C6, lo cual se evita cuando el grupo hidroxilo está conjugado con glucosa como en DON-15-0-glucósido. Una rotura adicional (EM) de los DON-glucósidos en la trampa de iones lineal muestra un patrón de fragmentación casi idéntico al de el ion [DON-H] - (295.3 m/z, no fragmentado en Q2) , gue confirma la presencia de entidades DON en los productos de reacción. Con estas herramientas a la mano es posible determinar directamente cual glucósido se ha formado en células de levadura. La levadura cepa YZGA515, incapaz de convertir DON en 3-ADON debido a la supresión del gen AYTl de acetiltransferasa de levadura se transforma tanto con el vector de expresión DOGTl como con un plásmido gue contiene un gen gue codifica para la proteína L3 ribosómica mutante insensible a tricoteceno, el objetivo de los tricotecenos, para incrementar la tolerancia a DON de células de levadura. Después de gue la cepa resultante se ha incubado con altas cantidades de DON, al alcanzar una concentración final de 1000 ppm en el medio, el DON-metabolito se extrae de las células y se identifica como se esperaba 3-O-glucopiranosil-4-desoxinivalenol (figura 6A) por CLAR y espectroscopia de masas . La figura 5 muestra el patrón de fragmentación de las sustancias de referencia sintetizadas y el pico de producto de la levadura gue expresa DOGTl. Como se esperaba, el metabolito no está presente en la cepa control, gue carece de actividad de DOGTl. Con el fin de verificar adicionalmente la especificidad de sustrato se construye una fusión GST-DOGTl . El gen de fusión GST-DOGTl también se expresa en levadura, en donde confiere resistencia a DON como DOGTl de tipo silvestre. El producto del gen se expresa en E. coli y se purifica por afinidad. Los productos de reacción generados in vitro durante la incubación ya sea de la proteína de fusión DOGTl o GST con UDP- [14C] glucosa y DON se analiza utilizando CCD. Se observa un punto con el mismo valor Rf gue el DON-glucósido sintetizado en la reacción gue contiene la proteína de fusión GST-DOGTl, pero no en el control. La glucosilación de -desoxinivalenol reduce de manera notable su toxicidad. Para analizar si el 3-ß-D- glucopiranosil-4-desoxinivalenol es menos fitotóxico gue DON, se utiliza extracto de germen de trigo acoplado a un sistema de transcripción/traducción in vitro . Como se muestra en la figura 6B, la presencia de DON 1 µm en la reacción inhibe significativamente la traducción de la proteína, lo gue lleva a 36.8% de actividad de enzima indicadora en comparación con el control (100%) . Una cantidad de 5 µM de la toxina resulta en solo 3.1% de luminiscencia remanente mientras gue 20 µM de DON-3-glucósido sintetizado únicamente inhibe la actividad de luciferasa en 8%. Estos resultados prueban gue la glucosilación de DON es un procedimiento de destoxificación. Sobreexpresión de DOGTl en Arabidopsis thaliana incremente la resistencia a DON. Se genera A. thaliana transgénica gue expresa de manera constitutiva DOGTl bajo el control de un promotor 35S en tándem, y se determina la cantidad de proteína recombinante en los transformantes por transferencia Western utilizando la etigueta de epítopo c-Myc N terminal. Las semillas de la línea homocigota 1319/2, la cual se encuentra gue tiene un alto nivel de expresión de DOGTl (figura 6C) y Col-0 de tipo silvestre como el control se hacen germinar en medio EM gue contiene 5-30 ppm de DON y se hacen crecer durante 5 semanas antes de gue se analice el fenotipo . El efecto fitotóxico principal observado es una germinación lenta de las plantas de tipo silvestre. No se produce formación de raíz alguna, los cotiledones se desarrollan pero comienzan a blanguearse antes de gue se puedan formar hojas verdaderas. Después de 3 semanas de exposición a DON, la mayor parte de las plántulas de tipo silvestre han perdido todo el color verde y han dejado de crecer. Las líneas de sobreexpresión de DOGTl muestran también un retraso evidente en el desarrollo. En comparación con el tipo silvestre, la germinación se produce antes, se forman las raíces, los cotiledones no se blanguean y aparecen las hojas verdaderas. Las diferencias en la sensibilidad de DON observada es más evidente en medio gue contiene 15 ppm de toxina (figura 6D) . Los transformantes de control con vector vacío (gue contienen únicamente el gen resistente a gentamicina) y las líneas gue expresan bajas cantidades de DOGTl son tan sensibles como el tipo silvestre Col-0.

DISCUSIÓN Relevancia Biotecnológica. Las enfermedades de trigo y cebada por Fusarium son de alta importancia económica para países alrededor del mundo. Por ejemplo, los Estados Unidos recientemente ha sido golpeado por epidemias de Fusarium en la última década. Las pérdidas directas debidas al FHB para los productores de trigo de los Estados Unidos se han calculado gue promedian aproximadamente $260 millones anualmente y durante el período de 1998-2000, las pérdidas económicas para seriales de granos pegúenos se calculan en $2.7 miles de millones (39) . La contaminación con desoxinivalenol de grandes porciones de la cosecha ha generado una alta ingestión de micotoxina. Los niños son el grupo de población con mayor riesgo de exceder la concentración de ingestión diaria tolerable (TDl) de DON. En el problemático año de 1998, 80% de niños con 1 año de edad en los países bajos exceden la TDl (7) . La alta importancia de las enfermedades de Fusarium justifica la investigación para buscar la inactivación de la micotoxina, aungue la resistencia contra el patógeno muy probablemente es un rasgo poligénico en plantas de cosecha y la resistencia a la toxina es solo uno de sus componentes. La producción de tricotecenos es el único factor de virulencia del patógeno micótico el cual se confirma experimentalmente hasta ahora, con la excepción de mutaciones peyotrópicas en el MAP cinasas gue afectan no exclusivamente la virulencia sino también la formación de conidias, formación de peritecios, crecimiento vegetativo y producción de micotoxinas (40, 41). El presente hallazgo de gue la sobreexpresión de DOGTl lleva a una resistencia aumentada a desoxinivalenol en Arabidopsis transgénica abre posibilidades nuevas para enfogues biotecnológicos gue tengan como objeto antagonizar el factor de virulencia micótico. El único resultado publicado hasta ahora se basa en una acetiltransferasa de Fusarium (42) gue convierte DON en 3-ADON, el cual es aproximadamente 2 veces menos tóxico en animales de laboratorio y por lo tanto no hay destoxificación dentro del significado de la presente invención. El fenotipo de la levadura transformada y Arabidopsis así como los datos obtenidos utilizando ensayos de translación in vitro demuestran gue DON-glucósido presenta toxicidad reducida. En general, la glucosilación convierte las agluconas reactivas y tóxicas en formas de almacenamiento estables y no reactivas, por lo gue limitan su interacción con otros componentes celulares . La adición de un blogue de azúcar al sitio reactivo de la sustancia y en consecuencia la reducción de la toxicidad para la planta. Tales modificaciones se consideran adicionalmente gue proporcionan acceso a transportadores unidos a membrana gue abren vías de salida desde el citosol para, por ejemplo, la pared celular o la vacuola (43) . La glucosilación de tricotecenos representa un proceso de destoxificación para plantas. Aún así, en el tracto digestivo de los humanos y animales, la micotoxina-glucoconjugados se pueden hidrolizar fácilmente, regenerando la toxina. El grado con el cual se transporta el DON-glucósido a la vacuola o al cloroplasto no se conoce actualmente. Anteriormente los intentos por utilizar sobreexpresión en plantas transgénicas de una DON-glucosiltransferasa, debe investigarse si únicamente el glucósido vacuolar o también la toxina unida al material de pared celular como "residuo insoluble" es una fuente de "micotoxina enmascarada" (44) , la cual escapa a las técnicas analíticas tradicionales y puede ser de una relevancia toxicológica mucho mayor en comparación a lo supuesto actualmente . Las herramientas analíticas y los materiales de referencia desarrollados durante este trabajo son adecuados para resolver estas cuestiones . La inactivación de toxinas por glucosilación parece ser un mecanismo natural prominente para resistencia, lo gue permite gue las plantas traten con enorme diversidad los metabolitos microbianos tóxicos gue pueden encontrar en la naturaleza. DOGTl es uno de los genes 118 UGT en A . thaliana el cual se predice se conjuga a moléculas pegueñas . La expresión de los genes UGT en levadura es un enfogue complementario valioso para la expresión ampliamente utilizada en E. coli , especialmente cuando las sustancias guímicas respectivas tienen objetivos únicamente en eucariotas . Un problema es gue las células de levadura de tipo silvestre con frecuencia son "impermeables" a las sustancias de interés . La inactivación de varios transportadores de ABC en la presente cepa hospedadora es un reguisito para el enfogue de seleccionar los ADNc gue confieran resistencia. En el caso de tricotecenos, esto permite la detección fenotípica de la actividad de los genes expresados en un ensayo en placa simple. En principio, este enfogue se puede adoptar para muchas otras sustancias . Evolución del gen y especificidad de sustrato. DOGTl se localiza en un grupo (figura IB) con otros 5 miembros de la familia 73C en el cromosoma II (At2g36800) indicativo de la duplicación del gen por sucesos de recombinación diferentes (32) . Uno puede especular gue dicho evento de amplificación del gen proporciona una ventaja selectiva bajo la tensión de toxina. DOGTl y otros miembros en el grupo tienen secuencias de proteína muy similares lo gue sugieren redundancia en la función enzimática. No obstante, cuando se prueban los homólogos para destoxificación de tricotecenos, se ha encontrado gue la levadura gue expresa el gen con la mayor similitud de secuencia, UGT73C6 es tan sensible como el tipo silvestre a todas las toxinas probadas (así como UGT73C3) , mientras gue el segundo homólogo más cercano UGT73C4 presenta las mismas propiedades gue DOGTl. La actividad enzimática hacia diferentes hidroxicoumarinas se ha demostrado para la totalidad de los miembros del grupo 73C (45) lo gue indica gue las UGT gue carecen de la actividad protectora de DON no son simplemente pérdida de los alelos de función. Por lo tanto, el grupo es un ejemplo gue soporta la hipótesis de gue los genes UGT duplicados pueden adguirir especificidades de sustrato nuevo y funciones durante la evolución.

Las UDP-glucosiltransferasas vegetales son estructuralmente muy similares en su motivo de firma carboxi terminal a las UGT de mamífero las cuales utilizan UDP-ácido glucurónico en vez de UDP-glucosa como sustrato donador. Las enzimas de mamífero juegan un papel central en el metabolismo y destoxificación de sustancias guímicas como carcinógenos o medicamentos hidrofóbicos . Se ha encontrado gue las UGT de plantas superiores están involucradas en una gama paralela de actividades gue también modifican las sustancias xenobióticas tales como herbicidas y otros plaguicidas (46, 47) . [Una pegunta gue aún esta por resolverse es si las reacciones de destoxificación son actividades secundarias de las UGT gue conjugan a compuestos de plantas endógenas. Aungue las publicaciones recientes favorecen la hipótesis de gue las UGT son responsables de la conversión de los sustratos endógenos también pueden justificar la capacidad de las plantas a destoxificar sustancias xenobióticas (48) esta cuestión necesita investigación adicional para gue se resuelva] . El hecho de gue DOGTl proteja contra DON pero no contra NIV, el cual posee un grupo hidroxilo adicional en el residuo 4 (figura 1A) , indica gue la variación del patrón de hidroxilación de la estructura principal de tricoteceno puede ser un mecanismo importante para gue los hongos escapen a dichas reacciones de desintoxicación. No se sabe si las plantas también conjugan NIV, el cual tiene una toxicidad mayor gue DON en sistemas animales (5) . La carencia de actividad- contra NIV sugiere fuertemente contra el uso de un gen similar a DOGTl único en plantas transgénicas, como los guimiotipos gue producen NIV de F. gramineraum lo cual puede ser una ventaja selectiva. La construcción de genes híbridos para el lanzamiento de la parte N terminal y C terminal de DOGTl y UGT73C6 y su expresión en levadura demuestra gue los 189 aminoácidos de la parte N terminal de DOGTl son esenciales para su capacidad para destoxificar DON, de acuerdo con la hipótesis de gue puede producirse unión de sustrato en un área hidrofóbica conservada entre el aminoácido 130 y 150 (38) . La comparación de los dos genes con efecto protector y dos genes sin actividad, pero con un nivel de expresión similar, sugiere gue una lisina, la cual está presente en la posición de aminoácido 136 en DOGTl (y en la posición correspondiente en UGT73C4) , pero sustituida en las dos UGT incapaz de desintoxicar tricotecenos, puede ser importante para la destoxificación por DON. Esta hipótesis se falsifica utilizando mutagénesis .dirigido al sitio y expresión de las proteínas sometidas a ingeniería en levadura. La información sobre dominios específicos o aminoácidos involucrados en la unión de aceptor de DOGTl puede ser potencialmente útil para la búsgueda dé glucosiltransferasa capaces de destoxificar DON en plantas de cosecha como trigo o maíz. Debe considerarse aungue los intentos por asignar funciones a los UGT en base exclusivamente en la similitud de aminoácidos es altamente susceptible de errores, como se muestra en el caso del grupo 73C. No obstante, se puede probar fácilmente la funcionalidad de genes candidatos por expresión en levadura. Una posibilidad la cual no puede excluirse es gue los glucósidos de tricotecenos se forman en plantas de cosecha por los UGT estructuralmente muy diferentes. Por ejemplo, se ha demostrado gue UGT84B1 presenta la mayor actividad in vitro contra la auxina de ácido indol -3 -acético (IAA, por sus siglas en inglés) de todos los UGT de A. thaliana utilizados, aungue está enzima no muestra la mayor similitud de secuencia con el homólogo funcional en maíz, el gen iaglu (49) . Regulación de expresión de gen. Se ha demostrado gue los genes con altas similitudes de secuencia por DOGTl a partir de tabaco y tomate se ha inducido por ácido salicílico o por heridas (34, 36, 37) . El análisis de expresión de DOGTl y 73 C6 después de tratamiento con SA y JA demostraron gue responden semanalmente con concentraciones elevadas de ARNm hacia SA y JA y el precursor de etileno ACC. Se considera gue la capacidad de inducción de la expresión del gen por SA, JA o etileno es indicativa de un posible papel de un producto de gen regulado por activación en tensiones vegetales o respuestas de defensa (50) . Utilizando el análisis de las concentraciones de ARNm y una construcción de GUS-indicador, es posible demostrar gue la transcripción de DOGTl en A . thaliana de tipo silvestre es regulada por el desarrollo y se induce de manera rápida y significativa en respuesta a una exposición a DON. La inducción de expresión por la micotoxina también sé ha observado para otros miembros del grupo 73C, sin importar su actividad DON-protectora. Sería interesante aclarar si la susceptibilidad a inducción es específica de compuesto o es un fenómeno general para inhibidores de biosíntesis de proteínas. Actualmente se investiga de manera activa la "respuesta de tensión ribotóxica" por investigadores en células humanas (51) , en donde la micotoxina induce la expresión de ciclooxigenasa-2 , una enzima clave en la síntesis de mediadores de la respuesta inflamatoria vía señalización mediada por MAP cinasa. La expresión inducible por DON de DOGTl es un punto de inicio atractivo para investigar si existen en las plantas mecanismos similares. Con la presente invención se ha demostrado gue la gran familia de genes de glucosiltransferasas, especialmente -como se muestra en los ejemplos- las UGT juegan un papel importante en la interacción entre plantas y patógenos al participar en la destoxificación de metabolitos producidos por microbios para incrementar su virulencia en hospedadores . De manera similar a la gran familia de los genes de resistencia del tipo repetido rico en leucina (52) involucrado en el reconocimiento de patógenos, amplificación de genes y selección de diversificación de las UGT puede llevar a una protección de espectro amplio contra toxinas micóticas. La presión selectiva para escapar de dichas reacciones de glucosilación puede ser una fuerza impulsora en la evolución de las reacciones de biosíntesis microbiana gue lleva a un espectro amplio de estructuras de toxina, como se observa para los tricotecenos.

REFERENCIAS 1. McMullen, M.P., Jones, R. and Gallenberg, D. (1997) Plant Dis. 81, 1340-1348 2. Grove, J. F. (1996) Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, pp . 1-70, Springer, Wien 3. Cundliffe, E. and Davies, J.E. (1977) Agents Chemother. 11, 491-499 4. O'Donnel, K., Kistler, H.C., Tacke, B.K. and Casper, H.H. (2000) PNAS 97, 7905-7910 5. Betina, V. (1989) Mycotoxins - chemical, biological and environmental aspects. pp . 192-241, Elsevier, Amsterdam 6. Canady, R.A., Coker, R.D., Egan, K., Krska, R., Kuiper-Goodman, T., Olsen M., Pestka, J. , Resnik, S., & Schlatter, J. (2001) WHO Food Additives Series 47, 419-528 7. Codex Committee on Food Additives and Contaminants (2002) Joint FAO/WHO Food Standards Programme, CX/FAC 03/35, www.codex alimentarius.net 8. McCormick, S.P. (2003) Fusarium head blight of wheat, pp . 165-183, American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, USA 9. Desjardins, A.E., Procter, R.H., Bai, G., McCormick, S.P., Shaner, G., Buechley, G. and Hohn, T. (1996) Mol. Plant -Microbe Interact. 9, 775-781 10. Bai, G.H, Desjardins, A.E. and Plattner R.D. (2002) Mycopathologia 153, 91-98 11. Kang, Z. and Buchenauer, H. (1999) Physiol. Molec. Plant Pathol . 55, 275-288 12. Mesterhazy, A. (2003) Fusarium head blight of wheat, pp. 363-380, American Phytopathological Society, St . Paul, Minnesota, USA 13. Coleman, J.O.D., Blake-Kalff, M.M.A. and Davies, T.G.E. (1997) Trends Plant Sci. 2, 144-151 14. Scott, P.M., Nelson, K. , Kanhere, S.R., Karpinski, K.F., Hayward, S., Neish, G.A. and Teich, A. (1984) Appl. Environ. Microbiol . 48, 884-886 15. Miller, J.D. and Arnison, P.G. (1986) Can J Plant Path 8, 147-150 16. Sewald, N. , von Gleissenthall, J. L., Schuster, M. , Müller, G. and Aplin, R.T. (1992) Tetrahedron Asymmetry 3, 953-960 17. Ross, J., Yi, L., Li , E.-K. and Bowles, D. (2001) Genome Biol. 2, 3004.1-3004.6. 18. Sikorski, R.S. and Hieter, P. (1989) Genetícs 122, 19-27 19. Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Plant Physiol. 15, 473-497 20. Minet, M. , Dufour, M.-E. and Lacroute, F. (1992) Plant J. 2, 417-422 21. Ballester, R. , Michaeli, T., Ferguson, K. , Xu, H.-P., McCormick F, and Wigler, M. (1989), Cell 59, 681-686 22. Egner, R. , Mahe, Y., Pandjaitan, R. and Kuchler, K. (1995) Mol Cell Biol 15, 5879-5887 23. Pogulis, R.J., Vallejo, A.N. and Pease, L.R. (1996) Methods Mol Biol 57, 167-176 24. Savard, M. (1991) J. Agr. Food Chem., 39, 570-574 25. Hajdukiewicz, P., Svab, Z. and Maliga, P. (1994) Plant Mol Biol 25, 989-994 26. Tópfer, R. , Matzeit, V., Groneborn, B., Schell, J. and Steinbiss H.-H. (1987) Nucleic Acid Research 14, 5890 27. Diener, A.C., Li, H. , Zhou, W. , Whoriskey, W.J., Nes, W.D. and Fink, G.R. (2000) Plant Cell 12, 853-870 28. Farrand, S.K., O'Morchoe, S.P. and McCutchan, J. (1989) J Bacteriol 171, 5314-5321 29. Koncz, C. and Schell, J. (1986) Mol Gen Genet 204, 383-396 30. Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) Plant J. 16, 735-743 31. Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405 32. Wolfger, H. , Mamnun, Y.M. and Kuchler, K. (2001) Res Microbiol. 152, 375-89 33. Li, Y. , Baldauf, S., Lim, E.-K. , and Bowles, D.J. (2001) J. Biol Chem 276, 4338-4343 34. Fraissinet-Tachet , L., Baltz, R. , Chong, J., Kauffmann, S. , Fritig, B. and Saindrenan, P. (1998) FEBS 437, 319-323 35. Horvath, D.M. and Chua, N.-H. (1996) Plant Mol Biol 31, 1061-1072 36. Truesdale, M.R., Doherty, H.M., Loake, G.J., McPherson, M.J., Roberts, M.R. and Bowles, D.J. (1996) Plant Physiol 112, 446 37. Horvath, D., Huang, D.J. and Chua, N.-H. (1998) Mol. Plant-Microbe Interact . 11, 895-905 38. Vogt, T., Grimm, R. and Strack, D. (1999) Plant J 19, 509-519 39. Nganje, W.E., Johnson, D.D., Wilson, W.W., Leistritz, F.L., Bangsund, D.A. and Tiapo, N.M. (2001) Agribusiness and Applied Economics Report 464 40. Jenczmionka, N.J., Maier, F.J., Losch, A.P. and Schafer, W. (2003) Curr . Genet. 43, 87-95 41. Hou, Z., Xue, C, Peng, Y., Katan, T., Kistler, H.C. and Xu, J.R. (2002) Mol Plant Microbe Interact. 15, 1119-1127 42. Okubara, P.A., Blechl, A.E., McCormick, S.P., Alexander, N.J., Dill-Macky, R. and Hohn, T.M. (2002) Theor Appl Genet. 106, 74-83 43. Jones, P. and Vogt, T. (2001) Planta 213, 164-174 44. Engelhardt, G., Ruhland, M. and Wallnbfer, P.R. (1999) Ady. Food Sci. 21, 71-78 45. Lim, E.-K., Baldauf, S., Li , Y., Elias, L., Worrall, D., Spencer, S.P., Jackson, R.G., Taguchi, G., Ross, J. and Bowles, D. (2003) glucobiol . 13, 139-145 46. Wetzel, A. and Sandermann, H. (1994) Arch. Biochem. Biophys . 314, 323-328 47. Leah, J.M. , Worral , T.L. and Cobb, A.H. (1992) Pest. Science 34, 81-87 48. MeBner, B. , Thulke, 0. and Scháffner, A.R. (2003) Planta 217, 138-146 49. Jackson, R.G. , Lim, E.-K. , Li , Y. , Kowalczyk, M. , Sandberg, G. , Hoggett, J. , Ashford, D.A. and Bowles, D. (2001) J. Biol. Chem. 276, 4350-4356 50. Reymond, P. and Farmer, E.E. (1998) Curr Opin Plant Biol. 1, 404-411 51. Laskin, J.D. , Heck, D.E. and Laskin, D.L. (2002) Toxicol Sci. 69, 289-291 52. Meyers, B-.C, Kozik, A.., Griego, A., Kuang, H. and Michelmore, R.W. (2003) Plant Cell 15, 809-834 53. Eudes F., Comeau, A., Rioux S. and Collin J. (2000) Can. J. Plant Path. 22, 286-292 54. Potrykus, I. and Spangenberg, G. (Eds . ) : Gene Transfer to Plants. Springer Verlag Berlín (1995) , ISBN 3-54058406-4 Abreviaturas FHB, tizón de cabeza de Fusarium; DON, desoxinivalenol; 15-ADON, 15-acetildesoxinivalenol; NIV, nivalenol, UGT, UDP-glucosiltransferasa; ABC, cásete de unión de ATP; DOGTl, DON-glucosiltransferasa; ORF, marco de lectura abierto; GUS, ß-glucuronidasa; SA, ácido salicílico; JA, ácido jazmónico; ACC, ácido 1-aminociclopropilcarbónico; TDl, ingestión diaria tolerable; IAA, ácido indol-3-acético; DAG; días después de la germinación. Se hace constar gue con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el gue resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para la destoxificación de micotoxinas, caracterizado porgue una micotoxina se pone en contacto con una glucosiltransferasa en presencia de una glucosa activada.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue la glucosiltransferasa es UDP-glucosiltransferasa y la glucosa activada es UDP-glucosa.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porgue la micotoxina se selecciona de tricotecenos, especialmente tricotecenos gue tienen un grupo hidroxi libre en la posición C3 y dos grupos hidrógeno en C4.

4. El método de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porgue la micotoxina es desoxinivalenol, 15-acetildesoxinivalenol, 15-acetoxiescirpendiol o mezclas de los mismos.

5. El método de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porgue se realiza in vivo utilizando tecnologías de ADN recombinante y/o compuestos gue incrementan la expresión de glucosiltransferasa .

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porgue la glucosiltransferasa se expresa en una célula vegetal transgénica gue contiene una glucosiltransferasa recombinante y/o una región reguladora recombinante para una glucosiltransferasa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porgue se utiliza un promotor inducible por micotoxina de una glucosiltransferasa.

8. El método de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porgue la glucosiltransferasa es inmovilizada en una superficie sólida y la solución o suspensión gue contiene micotoxina está en contacto con la glucosiltransferasa inmovilizada.

9. El método de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porgue la glucosiltransferasa es una UDP-glucosiltransferasa gue corresponde a la subfamilia 73C de Arabidopsis thaliana, especialmente las UDP-glucosiltransferasas 73C5 y 73C4.

10. Una célula recombinante gue es resistente a micotoxinas, especialmente a tricotecenos, caracterizada porgue comprende una glucosiltransferasa heteróloga o una actividad de expresión aumentada de una glucosiltransferasa endógena debido a elementos reguladores de expresión transgénica.

11. La célula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porgue es una célula vegetal o una célula de levadura.

12. La célula de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porgue comprende por lo menos uno, y preferiblemente tres o más transportadores ABC los cuales están reducidos o inactivados en su actividad, especialmente por supresiones pdr5.

13. La célula de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porgue tiene una supresión en pdr5, pdrlO, sng2, yorl, pdrl5, aytl o combinaciones de estas supresiones.

14. El uso de una célula de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 10 a 13 en un método como se describe de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde la planta o la célula vegetal es resistente a Fusarium.

16 . El uso de una célula de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 10 a 13, para destoxificación de micotoxinas en soluciones o suspensiones gue contienen micotoxina, especialmente para destoxificación de tricotecenos en la agricultura o la producción de cerveza.

17. El uso de una célula de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 10 a 13, para producir micotoxinas glucosiladas, especialmente DON glucosilada o 15-ADON.

18. Un método para producir micotoxinas glucosiladas, caracterizado porgue la micotoxina se pone en contacto, in vivo o in vitro, con una glucosiltransferasa en presencia de una glucosa activada.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porgue se realiza una etapa de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 2 a 9.