CN103484474B - 参与控制茄科植物种内及种间生殖障碍的一类基因slf及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类在茄科植物中参与控制种内和种间生殖障碍的SLF基因及其编码的蛋白，其中SLF基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1-5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：6-10所示。本发明公开了通过基因工程技术将SLF基因转入矮牵牛和番茄等茄科植物，从而消除种内和种间生殖障碍的方法。本发明还公开了利用上述多核苷酸及其编码的蛋白，在栽培番茄和野生番茄之间进行遗传育种的应用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程和育种技术领域。具体地说，本发明涉及一个控制茄科种内和种间生殖障碍的基因家族SLF(S-locus f-box)，该家族包含5个SLF基因。本发明还涉及所述SLF基因编码的蛋白质及其功能类似物，以及含有所述SLF基因核苷酸序列的载体和含有该基因核苷酸序列或该载体的宿主细胞；另外，本发明还涉及利用所述载体转化植物细胞以打破茄科植物种内及种间生殖障碍的方法以及在茄科遗传育种中的相关应用。
背景技术
生殖障碍制约了作物遗传多样性的提高和杂交优势的利用。例如，栽培番茄在人工驯化和育种的过程中，遗传多样性逐步丧失，导致其遗传背景单一而对生物和非生物逆境抗性下降(Tanksley and McCouch，1997)。具有高度遗传多样性的野生番茄与栽培番茄之间的生殖障碍阻碍了它们之间的基因交流，制约了栽培番茄遗传多样性的提高(Rick，1988)。番茄生殖障碍还降低了杂交育种的效率，增加了育种的时间和难度(Bernacchiand Tanksley，1997)。
茄科植物是与人类关系最密切的植物之一，既包含适合科学研究的模式植物(番茄，矮牵牛等)，还包含许多重要的经济作物(土豆，番茄和烟草等)(Rick，1988)。茄科中的番茄亚属包括17个种，它们在种内和种间表现出不同的生殖障碍(Bedinger et al.，2011)。番茄种间生殖障碍会引起栽培番茄与野生番茄杂交子一代自交不亲和，限制了育种家利用野生番茄资源对栽培番茄进行改良(Bernacchi and Tanksley，1997)。因此，研究并打破种间生殖障碍是番茄育种的重要目标。高密度的种间渐渗系材料，成熟的转基因技术以及高质量的栽培番茄全基因组数据使得番茄成为研究生殖障碍的模式材料。
番茄的生殖障碍主要分为两类：一类是种内生殖障碍，自交不亲和性(self-incompatibility，SI)；另一类是种间生殖障碍，单向不亲和性(unilateral incompatibility，UI)。自交不亲和性是指在一些雌雄同花且正常可育的被子植物中，自花授粉受到抑制的现象。前人的研究结果表明，番茄的自交不亲和性是由单一的复等位基因位点所控制，该位点被称为自交不亲和位点——S位点(the S-locus)。遗传研究发现该位点至少编码两类基因，花柱表达的花柱S基因和花粉表达的花粉S基因，分别控制花柱和花粉的自交不亲和特异性。这两类基因紧密连锁，构成了一种遗传单元，被称为S单体型(S-haplotype)(Zhang et al.，2009)。番茄的花柱S基因编码一类T2家族的核酸酶，被称为S-RNase(Parry et al.，1997)，番茄的自交不亲和现象也因此被命名为S-RNase类自交不亲和性。番茄的花粉S因子目前还不清楚。其它S-RNase类自交不亲和物种，如车前科金鱼草和茄科矮牵牛的花粉S因子已被证明是一类与S-RNase基因紧密连锁的F-box基因，命名为SLF(S-locus F-box)(Lai et al.，2002；Qiao et al.，2004；Sijacic etal.，2004)。最近的研究结果表明多个SLF蛋白协同作用，识别异己S-RNase并使其进入泛素-26S蛋白酶体系统被降解，同时避免降解自己的S-RNase(Kubo et al.，2010；Sun and Kao，2013)。
人们在研究番茄自交不亲和性的过程中，发现当自交亲和的栽培番茄对自交不亲和的野生番茄授粉时，花粉管无法抵达胚珠完成受精；反之，当自交不亲和的野生番茄对自交亲和的栽培番茄授粉时，花粉管可以抵达胚珠完成受精并产生成熟的种子。这种与正反交方向相关的种间生殖障碍被称为单向不亲和性(Martin，1964)。遗传研究表明，含有两个野生潘那利番茄遗传因子的栽培番茄可以打破对野生番茄的单向不亲和性(Chetelat and DeVema，1991)。这两个遗传因子分别被定位在6号染色体(ui6.1)和1号染色体(ui1.1)上(Bernacchi and Tanksley，1997；Li et al.，2010)。Li等人通过遗传学手段证明ui6.1编码一个Cullinl蛋白，在野生番茄中功能正常，而在栽培番茄中失去功能(Li and Chetelat，2010)。ui1.1目前被定位在1号染色体S位点附近约12cM的区域内(Li et al.，2010)，其分子本质和作用机制还不清楚。
本发明从打破番茄种间生殖障碍，进一步利用番茄野生种质资源出发，利用同源克隆的方法在番茄中克隆了一类SLF基因。这类基因在栽培番茄中由于提前终止而丧失功能，而在野生多毛番茄中功能正常，这样的种间基因功能差异与之前发现的ui6.1情况类似。上述SLF基因中的部分成员在杂交矮牵牛中异位表达可以打破杂交矮牵牛S单体型为S3S3L植株的自交不亲和性，提示这类基因作为花粉S因子发挥功能且在属间功能保守。带有功能正常的SLF基因和ui6.1的栽培番茄可以打破对野生番茄的单向不亲和反应，提示这些SLF基因可能作为ui1.1参与番茄的种间生殖障碍。根据上述的结果，育种家可以通过基因工程来恢复栽培番茄SLF基因的功能，使其花粉可以消除对野生番茄的种间生殖障碍，从而利用野生番茄种质资源。
发明内容
本发明分离了参与控制茄科植物种内及种间生殖障碍的多核苷酸家族(将其命名为SLFs，(S-locus F-box))和其编码的蛋白质，以及包含该多核苷酸的载体，核酸构建体，细胞和植物材料等。本发明还涉及一种消除茄科植物种内和种间生殖障碍的方法，及本发明中多核苷酸和其编码蛋白的应用。
基于上述，在第一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成：
a)SEQ ID No：1-5中任一项所示的多核苷酸；
b)多核苷酸，其编码SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列，或编码SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸但保留SEQ ID No：6-10的氨基酸序列的功能而得到的氨基酸序列；
c)多核苷酸，其编码与SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性，优选至少70％的序列同一性，优选至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，优选至少95％的序列同一性和优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；
d)多核苷酸，其在严谨条件下，优选中等严谨条件下和更优选高等严谨条件下可以与a)或b)或c)中任一项杂交(上述严谨条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液里，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次)；
e)多核苷酸，其为a)-d)中任一项的活性片段。
优选地，本发明的多核苷酸由SEQ ID No：1-5所示的核苷酸序列组成或由编码SEQ ID No：6-10所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
更优选地，本发明的多核苷酸编码的蛋白为参与控制茄科植株种内及种间生殖障碍的相关蛋白。
本发明进一步提供重组载体或核酸构建体，其包含本发明的至少一种多核苷酸。
本发明进一步提供植物细胞，其包含本发明的重组载体或核酸构建体。
本发明还提供转基因植物，其包含本发明的植物细胞。优选地，本发明的植物是茄科植物，更优选的选自番茄，土豆或烟草。
本发明进一步提供一种植物材料，包括上述植物的后代，克隆，繁殖材料，种子，果实，植物材料，植物细胞培养物，植物器官和部分，优选为种子。
进一步地，本发明还提供上述植物材料制备的组合物，包括食品和饲料等。
在第二个方面，本发明提供一种参与控制茄科植物种内及种间生殖障碍的蛋白，其由本发明第一方面所述的任一种多核苷酸序列编码，其为具有SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列相同的功能的由SEQ ID No：6-10中任一项衍生的蛋白质。优选地，所述蛋白质优选具有SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列。更优选地，所述蛋白质由SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列组成。
在第三个方面，本发明提供一种培育消除种内及种间生殖障碍的茄科植物的方法，该方法包括将本发明的多核苷酸序列导入所述茄科植物的细胞中的步骤，或者包括使用将本发明的重组载体或核酸构建体导入所述茄科植物的细胞的步骤，和将得到的转基因植物细胞培育成为转基因植株的步骤，从而使所得到的转基因植株消除了种内及种间生殖障碍。其中所述茄科植物包括，但不限于，番茄，土豆，烟草。
在第四个方面，本发明提供了一种消除茄科植物种内及种间生殖障碍的方法，所述方法包括在所述茄科植物中使本发明的多核苷酸过表达的步骤，其中所述茄科植物包括，但不限于，番茄，土豆，烟草。
在第五个方面，本发明提供了本发明的多核苷酸序列及其编码蛋白质、本发明的重组载体或核酸构建体、或本发明的转基因植物细胞在消除茄科植物种内及种间生殖障碍方面的用途，其中所述茄科植物包括，但不限于，番茄，土豆，烟草。
在第六个方面，本发明提供了本发明的多核苷酸序列及其编码蛋白质、本发明的重组载体或核酸构建体、或本发明的转基因植物细胞在调控茄科植物种内或者种间传粉受精方面的应用。
在第七个方面，本发明提供了一种利用上述多核苷酸序列及其编码蛋白质在栽培番茄和野生培番茄之间进行遗传育种的应用。
综上所述，本发明提供下述各项：
1、分离的多核苷酸序列，其包含或由选自下组之一的多核苷酸序列组成：
a)SEQ ID No：1-5中任一项所示的多核苷酸序列；
b)多核苷酸序列，其编码SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列，或编码SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸但保留SEQ ID No：6-10的氨基酸序列的功能而得到的氨基酸序列；
c)多核苷酸序列，其编码与SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性，优选至少70％的序列同一性，优选至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，优选至少95％的序列同一性和优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；
d)多核苷酸序列，其在严谨条件下，优选中等严谨条件下和更优选高等严谨条件下可以与a)或b)或c)中任一项杂交；
e)多核苷酸序列，其为a)-d)中任一项的活性片段。
2、第1项的多核苷酸序列，其由SEQ ID No：1-5中任一项所示的多核苷酸序列组成或由编码SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列的多核酸序列组成。
3、重组载体或核酸构建体，其包含第1-2项任一项的至少一种多核苷酸序列。
4、一种转基因植物细胞，其包含第3项中的重组载体或核酸构建体。
5、一种在茄科植物中参与控制种内和种间生殖障碍的蛋白质，其为具有SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：6-10中任一项所示的氨基酸序列相同的功能的由SEQ ID No：6-10中任一项衍生的蛋白质。
6、第5项所述的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No：6-10中任一项所示。
7、一种培育消除种内及种间生殖障碍的茄科植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将第1-2项所述的任一种多核苷酸序列导入所述茄科植物的细胞中，或者使用第3项的重组载体或核酸构建体转染所述茄科植物的细胞；和
(2)将得到的转基因植物细胞培育成为转基因植株，从而使所得到的转基因植株消除了种内及种间生殖障碍。
8、第7项的方法，其中所述茄科植物选自番茄、土豆或烟草。
9、一种消除茄科植物种内和种间生殖障碍的方法，所述方法包括在所述茄科植物细胞中导入第1-2项中任一项的至少一种多核苷酸序列或第3项的重组载体或核酸构建体进行过表达的步骤。
10、第9项的方法，其中所述茄科植物选自番茄、土豆或烟草。
11、第1-2项所述的多核苷酸序列、第3项所述的重组载体或核酸构建体、第4项所述的转基因植物细胞和第5-6项所述的蛋白质在调控茄科植物种内或者种间传粉受精方面的应用。
12、第1-2项所述的多核苷酸序列、第3项所述的重组载体或核酸构建体、第4项所述的转基因植物细胞或第5-6项所述的蛋白质在消除茄科植物种内或者种间生殖障碍方面的应用。
13、第11-12项所述的应用，其中所述茄科植物选自番茄、土豆或烟草。
为实现上述目的，本发明的一种优选实施方式步骤如下：
一、番茄S位点的确定和SLF基因的克隆
本发明利用茄科植物膨大矮牵牛的花粉S因子PiSLF2(Wang et al.，2004)氨基酸序列在栽培番茄(Solanum lycopersicum，Sl)全基因组数据中进行比对，克隆得到了5个SlSLF基因，均由于提前终止而丧失功能，而在野生的多毛番茄(Solanum habrochaites，Sh)中功能正常。这些基因分布在栽培番茄1号染色体长臂靠近着丝粒约1640kb的区域内(图1)。在该区域还发现了一个S-RNase基因，该结果符合SLF基因与S-RNase基因紧密连锁的规律，且与前人对番茄S位点的遗传定位结果一致(Bernacchiand Tanksley，1997)，提示该区域是番茄的S位点。
二、SLF基因功能的鉴定
上述的5个SLF基因在栽培番茄中均由于提前终止而失去功能，而在野生的多毛番茄中功能正常。前人的研究发现，SLF基因的不同等位与其对应的S核酸酶连锁。为了验证多毛番茄中的这些ShSLF基因位于S位点，本发明选择其中两个SLF基因对亲本和子代群体进行了CAPS(cleavedamplified polymorphic sequence)分析。以多毛番茄ShS1S3和ShS1S5以及它们杂交后得到的31株F1代个体植株的基因组DNA作为模版，对ShSLF2-S5和ShSLF6-S1进行扩增。对于ShSLF2-S5进行CAPS分析，将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶TaqI进行酶切检测；对于ShSLF6-S1进行CAPS分析，将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶AluI进行酶切检测。酶切后的产物分别用浓度为1.5％或2.5％的琼脂糖凝胶分离，用溴化乙啶染色观察酶切后产生的特异条带。亲本和子代均表现出CAPS标记与S核酸酶连锁的对应关系，提示上述两个SLF基因位于S位点(图4)。
由于上述ShSLF基因编码的蛋白质(SEQ ID No：6-10)之间的氨基酸序列一致性大约40-70％，我们推测这些基因可能具有相同的功能。之前的报道提示SLF基因编码产物的羧基端(除去氨基端50个氨基酸剩下的部分)可以在酵母中与杂交矮牵牛PhSv-RNase发生相互作用(Qiao et al.，2004)，我们将上述SEQ ID No：1-5除去起始的150个碱基剩下的序列和PhSv-RNase序列SEQ ID No：12(图15)构建进入酵母载体，在酵母体内进行了双杂交验证。酵母双杂交结果提示，上述5个ShSLF基因产物的羧基端均可以与PhSv-RNase在酵母中发生相互作用(图14)。
本发明利用pBI101质粒构建转化载体(图5)，通过转基因技术，将这些功能正常的ShSLF基因转入自交不亲和物种杂交矮牵牛(S单体型为S3S3L)中(图6)，自交不亲和性被打破，子代群体均带有转基因(图7和图8)。这一结果提示这些ShSLF基因可能作为花粉因子发挥功能，同时在属间(矮牵牛属和茄属)功能保守。
三、验证SLF基因是否作为ui1.1参与番茄种间单向不亲和性
为了验证SLF基因是否作为ui1.1参与番茄种间单向不亲和性，本发明利用上述携带ShSLF基因的pBI101载体(图5)，通过转基因技术，将这些功能正常的ShSLF基因转入自交亲和的栽培番茄(图9)。将转基因栽培番茄与ui6.1的栽培番茄渐渗系进行杂交，获得含有功能正常的ShSLF基因和ui6.1的栽培番茄。将该株系作为父本，对自交不亲和的野生番茄进行授粉。授粉后得到的子代均带有转基因(图10)。对子代进行自花授粉，发现与对照栽培番茄花粉相比，子代花粉可以抵达胚珠(图11)。这些结果提示，上述SLF基因(例如ShSLF6)作为ui1.1参与控制番茄种间单向不亲和性。
四、通过打破单向不亲和性进一步利用野生番茄资源
首先，之前在栽培番茄和野生番茄之间的杂交育种中，栽培番茄只能作为母本。在打破了单向不亲和性后，可以选择野生番茄作为母本进行杂交育种。
其次，之前在栽培番茄和野生番茄之间的杂交育种中，由于杂种一代自交不亲和(类似于单向不亲和性，即栽培番茄对野生番茄授粉的情况)而无法得到性状强烈分离的杂种二代以及后续世代，导致遗传方式复杂的性状(如一些数量性状)无法得到优选(Bernacchi and Tanksley，1997)。在打破单向不亲和性后，杂种一代自交亲和，使得育种家可以在F2代以及后续分离世代中优选遗传方式复杂的性状，从而更有效地利用野生资源改良栽培品种(图12)。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1、栽培番茄SLF基因的定位：
左图显示番茄1号染色体，两条横线之间的基因区段为栽培番茄的S位点，位于番茄1号染色体长臂靠近着丝粒的区域；右图显示该基因区段的放大图：在S位点内，黄色箭头(即，最上方的箭头)表示S-RNase基因，蓝色箭头表示提前终止的SLF基因。
图2、5个ShSLF基因的DNA序列：SEQ ID No：1-5。
图3、5个ShSLF基因编码的氨基酸序列：SEQ ID No：6-10。
图4、ShSLF与ShS-RNase的连锁分析：
为了检测ShSLF2和ShSLF6是否与S-RNase连锁，我们对多毛番茄ShS1S5和ShS1S3以及它们杂交得到的F1代群体(31株)进行了CAPS分析。图a，ShSLF2-S5，ShSLF2-S1和ShSLF2-S3核苷酸序列中TaqI的酶切位点示意图。图b，ShSLF6-S5，ShSLF6-S1和ShSLF6-S3核苷酸序列中AluI的酶切位点示意图。图c，以ShS1S5和ShS1S3基因组DNA为模版，使用引物ShSLF2-F和ShSLF2-R(表1)进行PCR扩增，得到的产物用TaqI进行酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳后用溴化乙啶染色后检测。图d，以ShS1S5和ShS3S5基因组DNA为模版，使用引物ShSLF6-F和ShSLF6-R(表1)进行PCR扩增，得到的产物用AluI进行酶切，酶切产物在2.5％琼脂糖凝胶中电泳后用溴化乙啶染色后检测。图e，ShS1S5和ShS1S3杂交产生的31株个体中，14株基因型为S3S5，17株基因型为S1S3，符合1：1的预期分离比(表2)。然后，我们利用该F1代群体，对ShSLF2进行CAPS分析。结果如图所示，ShSLF2-S5的CAPS分析的特异性条带只出现在14株基因型为S3S5的植株中，而在17株基因型为S1S3中则完全检测不到，表明ShSLF2-S5是S5-单倍型特异性的，与ShS5-RNase紧密连锁。随后，我们利用该F1代群体，对ShSLF6进行CAPS分析。结果如图所示，ShSLF6-S1的CAPS分析的特异性条带只出现在17株基因型为S1S3的植株中，而在14株基因型为S3S5中则完全检测不到，表明ShSLF6-S1是S1-单倍型特异性的，与ShS1-RNase紧密连锁。图中W表示用双蒸水代替底物模版进行PCR的阴性对照。
表1用于同源克隆多毛番茄ShSLF的引物
表2ShS1S5和ShS1S3杂交F1代群体的分离比分析
a，用于分离比分析的F1代群体数目
b，基因型为S3S5的个体数目
c，基因型为S1S3的个体数目
d，分离符合孟德尔遗传定律时，预期的分离比
e，实际分离比相对于预期分离比适合度测验。如果计算值小于χ2 0.05，P>0.05，则实际分离比与预期分离比差异不显著；如果计算值大于χ2 0.01，P<0.01，则实际分离比与预期分离比差异极显著。
图5、ShSLF基因的植物表达载体图谱。
图6、ShSLF5-S5和ShSLF6-S5转化矮牵牛PhS3S3L的T0代植株Southern印迹鉴定：
转基因植株的基因组DNA(30μg)经HindlII完全酶切后进行Southern印迹，印迹杂交的探针是NPTII。以碱基对表示的DNA分子量标记于印迹一侧。用来扩增NPTII探针的引物具体序列如下：
NPTII-F：5’-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3’
NPTII-R：5’-TCGTCAAGAAGGCGATAGAAGG-3’
其中，a图显示ShSLF5-S5转化矮牵牛PhS3S3LT0代Southern印迹分析；b图显示ShSLF6-S5转化矮牵牛PhS3S3LT0代Southern印迹分析。
图7、PhS3S3L／ShSLF5-S5转基因矮牵牛自交结实的T0子代分析：
我们把ShSLF5-S5转化了矮牵牛PhS3S3L，得到PhS3S3L／ShSLF5-S5转基因植物8株，其中7株经Southern印迹确定为独立株系(图6a)。我们选择了其中的4株转基因独立株系(PS5-2，PS5-5，PS5-6和PS5-8)进行自交授粉，结果均能结实，即自交不亲和性被打破。为了确定这ShSLFS-S5的特异性，我们对自交后代进行了基因型分析。对于PhS3S3L／ShSLF5-S5植物，所有子代均遗传了S3L-RNase和转基因，而且S3S3L个体与S3LS3L个体约为1∶1(表3)，这说明PhS3S3L／ShSLF5-S5转基因植物的自交亲和是由于转基因与S3L位点之间的竞争性相互作用导致的。图中W表示用双蒸水代替底物模版进行PCR的阴性对照。
表3转基因植物PhS3S3L／ShSLF5-S5自交子代的基因型分析
a，表示结实数／授粉次数
b，假设转基因可以抑制S3L-RNase，导致自交子代S-单倍型的分离预期为S3S3L∶S3LS3L=1∶1
c，转基因植株自交子代S-单倍型S3S3L∶S3LS3L的数目之比，括号内是供分析的子代总数
d，卡方检验。χ2 0.01=6.63，χ2 0.05=3.84，如果计算值小于3.84，P>0.05，则表示实际分离比与预期分离比差异不显著；如果计算值介于3.84与6.63之间，0.01<P<0.05，则表示实际分离比与预期分离比有显著差异；如果计算值大于6.63，P<0.01，则实际分离比与预期分离比差异极显著。
图8、PhS3S3L／ShSLF6-S5转基因矮牵牛自交结实的T0子代分析：
我们把ShSLF6-S5转化了矮牵牛PhS3S3L，得到PhS3S3L/ShSLF6-S5转基因植物7株，它们经Southern印迹确定为独立株系(图6)。我们选择了其中的4株转基因独立株系(PS6-1，PS6-3，PS6-6和PS6-7)进行自交授粉，结果均能结实，即自交不亲和性被打破。为了确定这ShSLF6-S5的特异性，我们对自交后代进行了基因型分析。对于PhS3S3L／ShSLF6-S5植物，所有子代均遗传了S3-RNase和转基因，而且S3S3L个体与S3S3个体约为1∶1(表4)，这说明PhS3S3L／ShSLF6-S5转基因植物的自交亲和是由于转基因与S3位点之间的竞争性相互作用导致的。图中W表示用双蒸水代替底物模版进行PCR的阴性对照。
表4转基因植物PhS3S3L／ShSLF6-S5自交子代的基因型分析
a，表示结实数／授粉次数
b，假设转基因可以抑制S3-RNase，导致自交子代S-单倍型的分离预期为S3S3L∶S3S3=1∶1
c，转基因植株自交子代S-单倍型S3S3L∶S3S3的数目之比，括号内是供分析的子代总数
d，卡方检验。χ2 0.01=6.63，χ2 0.05=3.84，如果计算值小于3.84，P>0.05，则表示实际分离比与预期分离比差异不显著；如果计算值介于3.84与6.63之间，0.01<P<0.05，则表示实际分离比与预期分离比有显著差异；如果计算值大于6.63，P<0.01，则实际分离比与预期分离比差异极显著
图9、ShSLF6转化栽培番茄Heinz的T0代植株Southern印迹鉴定：
各个植株的基因组DNA经HindlII完全酶切消化，印迹杂交的探针是NPTII。以碱基对表示的DNA分子量标记于印迹一侧。用来扩增NPTII探针的引物具体序列如下：
NPTII-F：5’-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3’
NPTII-R：5’-TCGTCAAGAAGGCGATAGAAGG-3’
图10、带有ShSLF6-S5和功能正常ui6.1的栽培番茄对秘鲁番茄授粉结实的子代分析：
我们将上述Heinz／ShSLF6-S5T0代植株和渐渗有多毛番茄ui6.1(功能正常)的栽培番茄(LA3946)进行杂交，从子代中筛选得到了带有ShSLF6-S5和多毛番茄ui6.1的T1代栽培番茄。以该番茄为父本，对野生的秘鲁番茄(LA0446-5)进行授粉。该授粉打破了单向不亲和性，产生了T2代种子。我们对T2代植株进行了PCR鉴定。鉴定转基因使用的引物名称及序列如下：
PhSLF-S3A-promoter-F：5’-GCTGTAACTACAGAGAGAATCA-3’
NOS-terminator-R：5’-TGCCAAATGTTTGAACGATC-3’
图中W表示用双蒸水代替底物模版进行PCR的阴性对照。
图11、带有ShSLF6-S5和功能正常ui6.1的栽培番茄对秘鲁番茄授粉结实的T2代子代花柱中不同的花粉管的生长情况：
我们以带有ShSLF6-S5和功能正常ui6.1的T1代栽培番茄对秘鲁番茄(L0446-5)授粉后产生的T2代花柱作为花粉受体，用不同的花粉对其进行授粉，36小时后花粉管生长的情况如图所示。ui6.1指带有功能正常多毛番茄ui6.1的栽培番茄(LA3946)的花粉；ShSLF6-S5指Heinz／ShSLF6-S5转基因番茄的花粉；self指带有ShSLF6-S5和功能正常ui6.1的T1代栽培番茄对秘鲁番茄授粉后产生的T2代自花授粉；LA0446-9的S单倍型与LA0446-5不同，对LA0446-5授粉可以结实。图中的标尺代表1mm。
图12、ShSLF基因在番茄远缘杂交育种中的应用：
a、由于番茄种间存在单向不亲和性，当栽培番茄向野生番茄授粉时，无法产生杂种一代种子；
b、由于番茄种间存在单向不亲和性，当野生番茄向栽培番茄授粉时，可以产生杂种一代种子，但杂种一代自交不亲和，无法产生杂种二代及后续世代；
c、带有ShSLF基因和功能正常ui6.1的栽培番茄花粉可以打破栽培番茄对野生番茄的单向不亲和性，产生杂种一代。杂种一代自交亲和，可以产生杂种二代分离群体以及后续世代。
图13、花粉特异启动子PhSLF-S3A-promoter的序列：SEQ ID No：11
图14、5个ShSLF基因编码产物的羧基端与PhSv-RNase的酵母双杂交结果。字母C表示编码产物的羧基端。
图15、PhSv-RNase的DNA序列：SEQ ID No：12
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
实施例1：番茄SLF候选基因的克隆
1.番茄材料
栽培番茄方面，本发明使用自交亲和的番茄测序种Heinz(LA4345)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)作为研究材料和转基因受体。野生番茄方面，本发明使用自交不亲和的多毛番茄(LA1777)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)作为研究材料。Heinz对LA1777授粉不亲和；反之，LA1777对Heinz授粉亲和且可以获得成熟的种子，表现出典型的单向不亲和性。
2.栽培番茄候选SLF基因的克隆
本发明使用膨大矮牵牛花粉S因子PiSLF2氨基酸序列在栽培番茄基因组数据库中(SGN Tomato Combined-WGS，BAC and unigene sequences模式，2.40版本，http：／／solgenomics.net／tools／blast／index.pl)进行比对。在得到的结果中选择定位在番茄1号染色体上S位点附近且氨基酸一致性在30％以上的序列，将它们定为候选SLF基因(共5个SLF候选基因)。
3.野生番茄SLF候选基因的同源克隆及与栽培番茄候选SLF基因的比较
利用栽培番茄(LA4345)中的候选SLF基因序列设计引物(表1)，在多毛番茄(LAl777)基因组DNA中进行SLF候选基因的同源克隆。多毛番茄基因组DNA提取采用番茄微量DNA快速提取方法从叶片中提取：取大约1g番茄叶片，经液氮冷冻，在直径9cm的研钵中磨成粉状，转移到10ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100ul超纯水中。每一个PCR扩增反应用1μl DNA样品。反应体系为：20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP mix1.6μl，5μM的上游引物和下游引物(表4)各1.0μl，TAQ酶(15U／μl)0.2μl。在PE9600或9700或MJ PCR仪上扩增：94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，共计35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，切胶回收测序。将栽培番茄和多毛番茄中的SLF候选基因进行比较，发现栽培番茄中有5个SLF候选基因由于提前终止失去功能，而它们在多毛番茄中的同源基因功能正常。
实施例2：番茄SLF基因的功能研究：
1.5个ShSLF基因编码产物的羧基端与PhSv-RNase的酵母双杂交结果
为了验证ShSLF基因功能的单一性，即它们编码产物的羧基端是否可以与S-RNase发生相互作用，我们把5个ShSLF基因去掉F-box区(起始的150个碱基)的序列构建进入酵母双杂交载体pGBK-T7(购自Clonetech公司)，同时将PhSv-Rnase序列构建进入酵母双杂交载体pGAD-T7(购自Clonetech公司)。将上述载体两两组合共转化酵母AHl09(购自Clonetech公司)，共转化子划线于酵母四缺培养基以检测AD和BD融合蛋白是否有相互作用。在30℃生长72小时的结果如图14所示。
2.ShSLF转基因植株T0代鉴定
为了鉴定ShSLF转基因矮牵牛和转基因栽培番茄独立株系，我们使用NPTII作为探针进行Southern印迹。Southern印迹的方法如下：
(1)制膜：大量提取待分析植物的基因组DNA，取10μg基因组DNA进行限制酶消化。消化产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离(1V／cm)之后，进行EB染色和照相。接着进行胶的处理：0.25N HCl浸洗15min，蒸馏水清洗胶；变性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗40min，蒸馏水清洗胶；中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.2)浸洗两次，每次15min。经处理的胶即可进行印记转膜。DNA的转移采用毛细管法中性转移，具体方法参考《分子克隆》(第三版)。转膜时间为20至24小时，转印到Hybond-N+尼龙膜上的DNA经紫外线交联(240,000μCi／cm2)。
(2)杂交和显影：预杂交3个小时后加入标记好的探针进行杂交，杂交16个小时，然后洗膜。洗膜用高严谨条件进行：一洗，2×SSC，0.1％SDS，65℃，20min；二洗，1×SSC，0.1％SDS，65℃，20min；三洗，0.1×SSC，0.5％SDS，65℃，10min。尼龙膜用保鲜膜包好后，-70℃曝光适当时间后显影。
3.异位表达的ShSLF候选基因在杂交矮牵牛中可以打破自交不亲和性
我们选择了5个SLF基因(SEQ ID No：1-5)作为研究材料，它们在栽培番茄中由于提前终止失去功能，在多毛番茄中功能正常。由于自交不亲和的野生番茄无法转化，所以我们选择茄科中矮牵牛属的自交不亲和物种杂交矮牵牛作为转基因受体进行研究。本发明利用pBI101质粒(购自Clonetech公司)构建转化载体(图5)，通过转基因技术，将这些多毛番茄中功能正常的SLF基因转入杂交矮牵牛(S单体型为S3S3L)(杂交矮牵牛的母本杂交矮牵牛S1S3，来自Thomas L.Robins，北伊利诺伊大学；父本杂交矮牵牛S3LSv来自Tim Robbins，诺丁汉大学；上述矮牵牛材料的详细信息请参考论文(Clark et al.，1990)；杂交矮牵牛S3S3L由上述亲本杂交得到)中，具体步骤如下：
(1)PBI101-PhSLF-S3A promoter-ShSLF重组载体的构建
将从多毛番茄花药cDNA中克隆得到的ShSLF基因编码区连接在本实验室发现的花粉特异启动子PhSLF-S3A-promoter(SEQ ID No：11)后，构建在pBI101载体中。
(2)农杆菌的培养
将构建好的pBI101-PhSLF-S3A promoter-ShSLF重组质粒用1800v电压，2秒电击转化LBA4404农杆菌感受态细胞(菌种购自Invitrogen公司，其感受态细胞由本实验室按常规方法制备，参照《植物基因工程》，王关林、方宏筠，科学出版社，2004年第2版)，在含有50mg／L卡那霉素和25mg／L利福平的YEB平板培养基上28℃培养48小时。挑单克隆于含有卡那霉素和利福平的2ml YEB(50mg／1Kan，25mg／1Rif)液体培养基中，培养过夜(28℃，220rpm)至饱和，1：100接种于100mlYEB培养基中大量培养(28℃，220rpm)，至OD600=0.6-0.8，4000rpm，4℃离心20min收集菌体，弃上清，并重悬于100ml的MS液体培养基中。
(3)植物材料准备
农杆菌大量培养当天，取健康幼嫩矮牵牛叶片。叶片先经自来水清洗，然后进行表面消毒。表面消毒在超净工作台中进行，先用70％酒精浸泡60秒，立即用灭菌水清洗叶片两次，接着用10％次氯酸钠溶液浸泡15-20分钟，叶片再用灭菌水清洗三次至五次。表面消毒过的叶片，用手术刀片切成0.5cm见方的小片待用。
(4)共培养
将上面切好的叶片放入农杆菌菌液，并摇晃，使得叶片悬于菌液中侵染，室温7-10min即可。捞出叶片于灭菌滤纸上，摊开叶片吹干残液。将农杆菌侵染的叶片置于不含抗生素的MS培养基(0.2μg／ml NAA，2μg/ml6-BA)中28℃暗培养三天(该培养基上事先要加一层灭菌滤纸)。
(5)转化叶片的筛选培养
将上面共培养的叶片置于MS培养基(50μg/ml Kan，500μg/ml Car，0.2μg／ml NAA，2μg/ml6-BA)上进行光照培养(25℃，16h光照／8h黑暗)。每两周继代培养一次，两三周即可长出愈伤。
(6)分化芽的生根培养
待分化芽长到合适大小(1-2cm)之后，将芽切下进行生根培养，生根培养基同筛选培养基，但不加激素，两三周即可生根。
转基因杂交矮牵牛自交授粉后自交不亲和性被打破，且子代均带有转基因(图7和图8)。这一结果提示这些SLF基因可能作为花粉因子发挥功能，同时在属间(矮牵牛属和茄属)功能保守。
由于矮牵牛属距离茄属较远，据此推测SLF基因在烟草和辣椒中也发挥相同的功能。
实施例3：番茄SLF基因是否作为ui1.1发挥功能的验证
1.带有功能正常SLF和ui6.1的栽培番茄的构建
(1)农杆菌的培养
将之前提到的pBI101-PhSLF-S3A promoter-ShSLF重组质粒用1800v电压，2秒电击转化LBA4404农杆菌感受态细胞(由本实验室按常规方法制备，参照《植物基因工程》，王关林、方宏筠，科学出版社，2004年第2版)，在含有50mg／L卡那霉素和25mg／L利福平的YEB平板培养基上28℃培养48小时。挑单克隆于含有卡那霉素和利福平的2ml YEB(50mg／1Kan，25mg／1 Rif)液体培养基中，培养过夜(28℃，220rpm)至饱和，1：100接种于100ml YEB培养基中大量培养(28℃，220rpm)，至OD600=0.6-0.8，4000rpm，4℃离心20min收集菌体，弃上清，并重悬于MS液体培养基中并稀释至OD600=0.3-0.4。
(2)植物材料准备
取饱满健康的栽培番茄Heinz种子(购自Tomato Genetic ResourceCentre，TGRC，美国加州)300粒先经自来水清洗，然后进行表面消毒。表面消毒在超净工作台中进行，先用95％酒精浸泡2分钟，立即用灭菌水清洗两次，接着用20％次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用灭菌水清洗五次。表面消毒过的种子，平铺在1／2MS固体培养基上。培养基置于25℃，16h光照／8h黑暗的环境中至种子萌发并伸展出两片子叶。将子叶用剪刀剪成两片置于MS培养基(1mg／L Trans-Zeatin-Riboside)上，16h光照／8h黑暗的环境中预培养48小时(该培养基上事先要加一层灭菌滤纸)。
(3)共培养
将完成预培养的子叶放入农杆菌菌液，并摇晃，使得子叶悬于菌液中侵染，室温10min。捞出叶片于灭菌滤纸上，摊开叶片吹干残液。将农杆菌侵染的叶片置于MS培养基(1mg／L Trans-Zeatin-Riboside)上28℃暗培养48小时(该培养基上事先要加一层灭菌滤纸)。
(4)转化子叶的筛选培养
将上面共培养的叶片置于MS培养基(2mg／L Trans-Zeatin-Riboside，200mg／L Timentin和50mg／L Kan)上进行光照培养(25℃，16h光照／8h黑暗)。每两周继代培养一次，四到六周即可长出愈伤组织。
(5)分化芽的生根培养
待分化芽长到合适大小(1-2cm)之后，将芽切下置入MS培养基(0.5mg／L IBA，200mg／L Timentin和30mg／L Kan)，三到四周即可生根。
将转基因的栽培番茄与渐渗有功能正常ui6.1的栽培番茄渐渗系(LA3946)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)进行杂交，得到了含有功能正常SLF基因和ui6.1的栽培番茄。
2.带有功能正常ShSLF和ui6.1的栽培番茄对野生番茄的授粉结果
将上述含有功能正常SLF基因和ui6.1的栽培番茄作为花粉供体，对自交不亲和的野生番茄进行授粉。花粉受体分别是智利番茄(LA1967)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)，多毛番茄(LA1777)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)，潘那利番茄(LA1277)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)和秘鲁番茄(L40446)(购自Tomato Genetic Resource Centre，TGRC，美国加州)。部分授粉结果亲和，子代植株均带有转基因标记(图10)。对照Heinz花粉生长停滞，子代植株自花授后花粉可以抵达胚珠(图11)。上述结果提示SLF作为ui1.1参与控制番茄种间生殖障碍。
结论：
茄科植物是全世界最重要的经济作物之一，目前面临遗传多样性下降导致抗逆性降低的问题。打破茄科植物种间的生殖障碍，利用丰富的野生种质资源是解决这一间题的有效途径。本发明提供的一类SLF基因不仅在番茄种内控制了花粉的自交不亲和性，同时参与控制了番茄种间的单向不亲和性，对打破番茄植物种间生殖障碍具有重要意义。这些SLF基因在番茄野生资源利用和杂交优势的获得方面有很大的可行性，其功能的保守性提示这类基因的应用可以推广到其它重要的茄科作物中。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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Claims (10)
1.分离的多核苷酸序列，其由选自下组之一的多核苷酸序列组成：
a)SEQ ID No：3-4中任一项所示的多核苷酸序列；或
b)多核苷酸序列，其编码SEQ ID No：8-9中任一项所示的氨基酸序列。
2.核酸构建体，其包含权利要求1的至少一种多核苷酸序列。
3.一种在茄科植物中参与控制种内和种间生殖障碍的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID No：8-9中任一项所示。
4.一种培育消除种内及种间生殖障碍的茄科植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将权利要求1所述的任一种多核苷酸序列导入所述茄科植物的细胞中，或者使用权利要求2的核酸构建体转染所述茄科植物的细胞；和
(2)将得到的转基因植物细胞培育成为转基因植株，从而使所得到的转基因植株消除了种内及种间生殖障碍。
5.权利要求4的方法，其中所述茄科植物选自番茄或矮牵牛。
6.一种消除茄科植物种内和种间生殖障碍的方法，所述方法包括在所述茄科植物细胞中导入权利要求1的至少一种多核苷酸序列或权利要求2的核酸构建体进行过表达的步骤。
7.权利要求6的方法，其中所述茄科植物选自番茄或矮牵牛。
8.权利要求1所述的多核苷酸序列、权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的蛋白质在调控茄科植物种内或者种间传粉受精方面的应用。
9.权利要求1所述的多核苷酸序列、权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的蛋白质在消除茄科植物种内或者种间生殖障碍方面的应用。
10.权利要求8-9任一项所述的应用，其中所述茄科植物选自番茄或矮牵牛。
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