JP2018525995A - 複相胞子生殖遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
a)野生交配による野生アポミクティック植物由来のアポミクシス(アポミクティック)遺伝子の作物種への遺伝子移入は、これまで成功していない。例えば、ガマグラスからトウモロコシ及びキビにアポミクシスを移入する試みが挙げられる[Savidan,Y.(2001).Transfer of apomixis through wide crosses.In Flowering of Apomixis:From Mechanisms to Genetic Engineering,Y.;apomixis from Pennisetum squamulatum into pearl millet.Savidan,J.G.Carman及びT.Dresselhaus編(Mexico:CIMMYT,IRD,European Commission DG VI),pp.153−167;Morgan,R.,Ozias−Akins,P.及びHanna,W.W.(1998).Seed set in an apomictic BC3 pearl millet.Int.J.Plant Sci.159,89−97.;国際公開第97/10704号]
用語「有性植物生殖」とは、本明細書で使用するとき、「大胞子母細胞」と呼ばれる二倍体体細胞が減数分裂を起こして4つの減数した大胞子を生産する発生経路を指す。これらの大胞子の1つは有糸分裂により分裂して、減数した卵細胞(すなわち、母親に比べて染色体数が減数した細胞)及び2つの減数した極性核を含む大配偶体(胚嚢としても知られている)を形成する。花粉粒の1つの精細胞による卵細胞の受精は、二倍体胚を生成し、一方、第2の精細胞による2つの極性核の受精は、三倍体胚乳を生成する(二倍受精と呼ばれるプロセス)。
一実施形態において、キメラ遺伝子は、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その断片及び変異体のいずれかを含み得る。
a)配列番号1及び/又は配列番号2の核酸配列の天然のプロモーター配列;
b)a)のプロモーター配列の機能的断片;又は
c)配列番号1及び/又は配列番号2の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を含む核酸配列;
d)配列番号6の核酸配列の天然のプロモーター配列;
e)d)のプロモーター配列の機能的断片;又は
f)配列番号6の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を含む核酸配列
を含んでもよい。
第3の態様において、本発明は、配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも50%若しくは70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、なおさらにより好ましくは少なくとも96%若しくは97%、最も好ましくは少なくとも98%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに関する。
塩基性(例えば、Arg、His、Lys);
酸性(例えば、Asp、Glu);
非極性(例えば、Ala、Val、Trp、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp);又は
極性(例えば、Gly、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln)。
さらなる態様において、本発明は、アポミクティック種子を生産するための方法に関し、
a)植物、植物部分又は植物細胞を、本明細書において教示されるポリヌクレオチド(例えば、配列番号1若しくは配列番号2)又はその変異体若しくは断片(例えば、配列番号4、5、6若しくは11)、或いは本明細書において教示されるキメラ遺伝子、或いは本明細書において教示される遺伝子構築物及び/或いは本明細書において教示される核酸ベクターのいずれかで形質転換し、一次形質転換体を生産する工程;
b)上記一次形質転換体から顕花植物及び/又は花を生育する工程であって、それにより上記で教示されたポリヌクレオチド、変異体若しくは断片、キメラ遺伝子、構築物及び/又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在及び/又は発現される工程;並びに
c)種子の生産を誘導するために上記一次形質転換体を、好ましくは四倍体植物の花粉又は上記一次形質転換体の自家花粉を用いて受粉する工程
を含む。
(a)配列番号1及び/又は配列番号2の核酸配列の内在性プロモーター配列;
(b)上記天然のプロモーター配列の機能的断片;
(c)配列番号1若しくは配列番号2の核酸配列の内在性プロモーター配列と少なくとも70%の配列同一性を含む核酸配列;又は
(d)(c)の核酸配列の機能的断片;
e)配列番号6の核酸配列の天然のプロモーター配列;
f)d)のプロモーター配列の機能的断片;
g)配列番号6の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を含む核酸配列;又は
h)g)の核酸配列の機能的断片
を含む。
a)有性的に生殖する植物を本明細書において教示される植物の花粉と他家受精させて、F1雑種種子を生産する工程;
b)本明細書において教示されるポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは断片、或いは少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子における、本明細書において教示されるあるポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは断片を含み並びに/或いは発現するF1植物を選択する工程;
c)任意選択で種子の生産を誘導するために、好ましくは四倍体植物の花粉を用いて、上記選択されたF1植物を受粉させる工程;並びに
d)種子を収穫する工程;並びに
e)任意選択で上記種子からハイブリッドクローン植物を生育させる工程
を含む。
a)上記植物、植物部分若しくは植物細胞を、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体若しくは断片のいずれか、本明細書において教示されるキメラ遺伝子、本明細書において教示される遺伝子構築物、及び/又は本明細書において教示される核酸ベクターを用いて形質転換する工程;並びに
b)任意選択で植物を再生する工程、ここで、上記ポリヌクレオチド、変異体若しくは断片、遺伝子、構築物及び/又はベクターが少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在し及び/又は発現される工程
を含む。
a)改変後に植物、植物部分又は植物細胞が本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体又は断片のいずれか1つを含むように、植物、植物部分又は植物細胞において、好ましくは液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子の内在性ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの変異体又は断片を改変する工程;及び
b)任意選択で植物を再生する工程
を含む。
a)上記植物、植物部分又は植物細胞に少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼを導入又は発現させることによって、ここで、好ましくは上記ヌクレアーゼはCas9/RNA CRISPRヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びTALエフェクターヌクレアーゼからなる群から選択されて;及び/又は
b)オリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって、ここで、好ましくはオリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドであり;及び/又は
c)化学的突然変異誘発によって、好ましくはエチルメタンスルホネートを用いて行われる。
さらなる態様において、本発明は、本明細書において教示されるキメラ遺伝子、本明細書において教示される遺伝子構築物、及び/又は本明細書において教示される核酸ベクターを含む植物、植物部分又は植物細胞に関し、それにより遺伝子、構築物及び/又はベクターは、少なくとも雌性子房において、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在し及び/又は発現される。
さらなる態様において、本発明は、植物における複相胞子生殖を誘導するために本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド、その変異体又は断片のいずれかの使用に関する。
(a)複相胞子生殖及び非複相胞子生殖植物材料及び/又はその核酸試料を提供する工程;
(b)ヌクレオチド配列間の多型を同定するために、(a)からの材料中にVps13遺伝子に由来するヌクレオチド配列、例えば、配列番号1及び/又は配列番号2に対応する配列又はその変異体及び/若しくは断片(配列番号4、5、6又は11)を決定する工程;
(c)多型を植物の複相胞子生殖の特徴と相関させ、それにより、多型をDip遺伝子座の複相胞子生殖及び非複相胞子生殖対立遺伝子と相関させる工程
相関させた、同定された多型は、工程(d)において任意選択でさらに使用されてもよい。
を伴ってもよい。
a)植物組織試料、例えば、タンポポ属種の試料、又はその核酸試料を得る工程、
b)Dip対立遺伝子に連結された1つ又は複数のマーカーの存在又は非存在について分子マーカーアッセイを用いて核酸試料を分析する工程であって、ここで、マーカーアッセイは、上記試料中の配列番号1及び/又は配列番号2のいずれか1つ、及び/又は配列番号4、5、6若しくは11、又はそれと少なくとも70%のヌクレオチド同一性を含む配列を検出する工程、及び任意選択で
c)上記マーカーの1つ又は複数を含む植物(例えば、タンポポ属種の植物)を選択する工程
を含む。
複相胞子生殖はアポミクシスのエレメントであり、複相胞子生殖用の遺伝子は、アポミクシスを生じさせ、それを上記で列挙した応用のために使用するために、単為生殖用の遺伝子と組み合わせて使用され得る。これらの遺伝子は、形質転換によって有性作物に導入することができる。また、アポミクシス遺伝子の構造及び機能の知識は、内在性の有性生殖遺伝子を、アポミクシス遺伝子になるような方法で改変するために使用することができる。好ましい使用は、誘導性プロモーターの下でアポミクシスをもたらすことであり、それによりアポミクシスは、有性生殖が新しい遺伝子型を生じさせる場合にスイッチオフにされ得、アポミクシスがエリート遺伝子型を広めるために必要とされる場合にスイッチオンにされ得る。
1.1 アポミクシス組換え集団
複相胞子生殖(Diplosporous)(Dip)遺伝子座の遺伝子マッピングのために、二倍体有性セイヨウタンポポ植物TJX3−20と三倍体アポミクトA68の間で交配を行った。TJX3−20は、メントール花粉の影響の結果として、二倍体×三倍体セイヨウタンポポ交配の場合に通常である、高い割合の自家受粉子孫の生産を防ぐために、雄性不稔(花粉生産なし)の種子親として選択された(Tas en Van Dijk 1999)。TJX3−20×A68交配における平均種子結実は1〜3%の間で低かった。非常に多数の交配は、計190個の子孫をもたらした。生存性の正倍数体子孫のみが生産された:97個の二倍体、92個の三倍体及び1個の四倍体(倍数性レベルは、PARTECフローサイトメーター、Van Dijkら 2003で決定された)。アポミクシス/アポミクシスなしについて分離された三倍体とは対照的に、二倍体のいずれもアポミクシスではなかった。
DIP遺伝子座を遺伝的にマッピングするために、三倍体後代植物を複相胞子生殖対非複相胞子生殖(減数分裂)の表現型にした。交配受粉を伴わない三倍体種子を生産する三倍体後代植物は、アポミクティックであり、したがって複相胞子生殖でもあった。非アポミクティック植物の複相胞子生殖表現型決定について、いわゆる擬似試験交配を行った(Ozias Akins及びVan Dijk 2007)。TJX3−20×A68交配からの三倍体子孫は、二倍体有性花粉ドナーと交配された。種子を収穫し、発芽させ、後代の倍数性レベルをフローサイトメトリー(Partec Ploidy Analyser,van Dijkら 2003)によって決定した。後代が四倍体植物のみで構成されていた場合、二倍体花粉ドナーは単数体花粉粒を生産したため、三倍体母植物は複相胞子生殖であったことを差し引いて結論付けられた。後代が三倍体又はそれ以下の倍数レベルを有する植物からなる場合、母植物の卵細胞の染色体数が減少し、母植物自体は非複相胞子生殖であると結論付けられた。
単一用量の優性マーカー(単体、例えば001)は、Wuら(1992)に記載されている方法に従って、同質倍数体植物においてマッピングすることができる。Dip遺伝子座(Vijverbergら 2004)と密接に関連した7つのAFLP(Vosら 1995)マーカーは、TJX3−20×A68交配から76個の三倍体後代植物にマッピングされた:(AFLPプライマーコードについては、表1参照)E40M60−505(505は塩基対の断片サイズを示す;ショートコード:S4)、E38M48−215(S8)、E42M50−440(S7)、E35M52−235(S10)、E38M48−215(S9)、E45M53−090(A4)及びE37M59−135(A5)。Dip遺伝子座を配置するために、三倍体後代植物を、上記の擬似試験交配法を用いて複相胞子生殖について表現型を決定した。表2は、DIP染色体領域における組換え事象を伴う4つの三倍体後代植物(AS99、AS112、AS193及びAS196)の遺伝子型を示す。
実施例2:DIP遺伝子座の欠失マッピング
2.1 アポミクシス欠失集団
TJX3−20×A68交配における種子結実は遺伝的に精細マッピングに必要な数千の種子を生成するには低すぎたため、代替方法が必要であった。したがって、この染色体領域の精細マッピングのために、欠失マッピング手法を使用した。ガンマ線照射は、組換えホットスポット又はコールドスポットにかかわらず、ゲノム全体にわたって可変サイズのランダムな欠失を引き起こす。ガンマ線照射の欠失は、ヤナギタンポポ属種のアポミクシス遺伝子のマッピングに首尾よく用いられている(Catanach AS,Erasmuson SK,Podivinsky E,Jordan BR,Bicknell RA(2006)Deletion mapping of genetic regions associated with apomixis in Hieracium.Proc Natl Acad Sci USA 103(49):18650−18655)。最初に、クローンA68に対するガンマ線照射の最適用量(50%実生生存率)は、乾燥タンポポ属種子の曝露では60Co源(Isotron B.V.,Ede,The Netherlands)によって生じる100〜800グレイの範囲の一連の試験用量で決定された。最後の実験では、3×2000個の種子に250Gyの1/3、300Gyの1/3、400Gyの1/3の3種類の異なる線量を照射した。種子をペトリ皿中の湿ったろ紙上に置き、室温で発芽させた。計3075個の植物を温室内の鉢で栽培した(350個について200Gy処置、1600個について300Gy処理、及び1125個について400Gy処理)。植物を温めた温室内で2カ月間生育させた(日中21℃、16時間明、夜間18℃)。次に、開花を誘導するために植物を2〜10℃で2カ月間維持した。この春化期間の後、上記に示した条件で植物を温めた温室内で再び生育させた。植物の90%以上が花開し、種子を生産した。植物は、アポミクシスの欠損表現型(LoA)を示すか否かにかかわらず分類された。アポミクティックのA68植物は種子を自発的に生産し、種子(植物学的用語では1つの種子をもつ果実)が花托に付着している濃い茶色の中心を有する大きな白い種子の頭部を形成する(図1A参照)。
照射された植物におけるアポミクシスの欠損は、複相胞子生殖の欠損、単為生殖の欠損、又は他の原因に起因し得る。アポミクシスの欠損植物中の複相胞子生殖の欠損は、擬似試験交配によって検出された(上記参照)。複相胞子生殖の欠損植物はまた、低倍数の三倍体及び低三倍体の子孫を自発的に(したがって、いずれの他家受粉もなし;図1B参照)生産した。これは、これらの非Dip植物が単為生殖表現型を保持したためである。単為生殖は配偶体的に発現されるため、非複相胞子生殖植物の卵細胞に分離する。
3つの相同染色体のうちの1つの一部が欠失した場合、欠失領域に位置する単回投与AFLP/SCARマーカーは失われる。102個のアポミクシスの欠損植物のうちのいずれがDip遺伝子座の一部を失ったのかを決定するために、以下のDip連結した単回投与マーカー:S8、S7、S9、S10、A4及びA5の存在/非存在を調査した。
3.1 欠失集団におけるAFLPマーカーを用いたDIP遺伝子座の精細マッピング
検出された最小のDip欠失(i124)内の新規なAFLPマーカーを見出すために、バルク分離分析(Michelmoreら 1991)と同様に、新規なマーカースクリーニング戦略であるバルク欠失分析(BDA)を開発した。3つのDNA試料である試料A:最小のDip欠失を有する植物由来のDNA(i124)、試料B:Dip領域においてより大きい欠失を有する3つの植物のDNAプール、及び試料C:照射されていないA68クローン由来のDNAをAFLP断片の存在又は非存在について比較した。試料Aと試料Bの両方に欠けているAFLPのみが最小の欠失に位置する。プールされた試料Bを考慮に入れて、Dip遺伝子座以外の欠失の選択を防止した。BDAからの候補AFLPは、個々の複相胞子生殖の欠失植物において確認された。966個の異なるAFLPプライマーの組み合わせのスクリーニングにより、植物i124のDip欠失内に位置する3つの新規なDip欠失マーカー(DD1:E43M40−68、DD2:E49M42−215及びDD3:E60M42−76)がもたらされた。966個のAFLPプライマーの組み合わせを用いてスクリーニングされたAFLPマーカーの数及び3つの欠損したマーカーに基づいて、植物i124におけるDip欠失のサイズは450kb未満であると推定された。DD2マーカーは首尾よくクローニングされ、配列決定された(配列番号12)。
アポミクティッククローンA68のDip−遺伝子座完全物理的BACコンティグを構築するために、BACライブラリーをスクリーニングした。A68のBACライブラリーは、Arizona Genome Instituteによって構築され、AGIのウェブサイト(http://www.genome.arizona.edu/orders/)からTO_Baとして入手することができる。このBACライブラリーは、10ゲノム当量(タンポポ属種ゲノムサイズ:835Mb/1C)をカバーする113kbの平均挿入サイズを有する。それは、pAGIBAC1ベクターのHindIII部位に構築され、73728のクローンを含有する。BACインサートライブラリーを4つのナイロンフィルター上にダブルスポットした。BACライブラリー中のクローン由来のDNAもまたプールした(192個のスーパープール:384個のBACプレートプール;各プレートはまた96個のBAC DNAの4つのプールにプールされた)。プールされたBAC DNAのAFLP分析により、S10、A4、DD1、DD2及びDD3マーカーを含むBACについてBACインサートライブラリーをスクリーニングした。BACライブラリーはまた、DD2配列(配列番号12)(Rossら 1999)を用いて、ナイロンフィルターの過剰なハイブリダイゼーションによってもクリーニングされた。各マーカーについて、GS−FLX配列技術を用いて完全に配列決定された1つのBACインサートを選択した。種菌BACの末端を用いて新たな過剰プローブを開発することにより、BACコンティグ(BACウォーキング)を広げることが可能である。
欠失ブレークポイントをマッピングし、i124における最小タイリングパスが最小のDip欠失をカバーすることを確認にするために、PCRプライマーがBAC配列あたり1遺伝子に対して設計された。遺伝子はPCR増幅され、DNAはABI 3730XLで直接サンガー配列決定された。これにより、多数の二重ピークを有する、A68のABIトレースファイルに複雑な生シーケンシングデータが生成された。しかしながら、i124において、パターンがしばしば簡略化され、A68パターンのサブセットであり、これは、対立遺伝子(最も相違するもの)のうちの1つが欠失される場合に予想される。遺伝子の配列パターンがA68とi124の両方に二重のピークを有する場合、この遺伝子はi124において欠失していないと結論付けた。最小タイリングパスの中央にあるBACが欠失遺伝子を示すことが多いが、一方、末端のBACは欠失の兆候を示さなかった。したがって、最小タイリングパスがi124における欠失に広がっていると結論付けられた。
4.1 EMSアポミクシスノックアウトの生成
本発明者らは、タンポポ属種のアポミクシスが遺伝的に制御されている場合、エチルメタンスルホネート(EMS)などの変異原によってノックアウト突然変異を生成することが可能であると推論した。本発明者らはDip遺伝子座内の遺伝子を予測することができたため、複相胞子生殖の欠失の突然変異体のDip遺伝子座における遺伝子を再度配列決定することによってDip−遺伝子を同定することが可能であるはずである。本発明者らがいくつかの複相胞子生殖の突然変異体を発見した場合、同じ遺伝子(Dip遺伝子)に突然変異を有することが必要であるが、一方、Dip遺伝子座における遺伝子の突然変異であるが、複相胞子生殖表現型に関係しない突然変異は富化されない。したがって、これは機能的Dip遺伝子を同定する。
オーガスタス属種(Augustus)遺伝子予測ソフトウェア(Stanke M.,R Steinkamp,S Waack及びB Morgenstern(2004)”AUGUSTUS:a web server for gene finding in eukaryotes” Nucleic Acids Research,Vol.32,W309−W312)を用いて、Dip及びdipBAC最小タイリングパス(上記参照)における遺伝子は、シロイヌナズナ属種遺伝子モデルを用いて予測された。遺伝子注釈は、閾値として40%のタンパク質同一性を有する、NCBIからの非重複データベースに対して予測されたタンパク質配列をBLAST処理することによって実施された。合計129個のタンポポ属種遺伝子がDipにおいて予測され、dipBAC最小タイリングパスリーフ材料は、タンポポ属種A68、A68 LoD1から6つのEMS突然変異体及びLoD欠失系統(A68 i124)から回収された。CTAB手順(Rogstad 1992)を用いてゲノムDNAを抽出した。標準的な手順を使用して、FLUOstar Omega(BGM LABTHEC)上でQuant−iT(商標)TMPicoGreen(登録商標)dsDNA試薬(Invitrogen)を用いてDNA試料を定量した。DNA試料を20ng/μlの濃度に希釈し、続いてLoD試料をプールして2つのプール(プールA=LoD1+LoD2+LoD3;プールB=LoD4+LoD5+Lod6)を生成した。
(1)Roche GS FLX+ソフトウェアを用いたGS FLX+データ処理。ベースと呼ばれる読み取りは、品質のためにトリミング及びフィルタリングされ、FASTA形式に変換された。
(2)試料処理。配列読み取りの起点は、特定のバーコードに基づいて同定された。バーコード配列をトリミングし、各試料の配列読み取りを別々にデータベースに保存した。
(3)アンプリコン処理。アンプリコンの起点は、標的特異的プライマー配列に基づいて同定された。1アンプリコンあたりの配列読み取りはCAP3(95%相同性、40ヌクレオチドオーバーラップ)を用いてクラスター化された。
(4)多型検出。各々クラスター化されたアンプリコン中の全ての潜在的なSNP及びINDELSの同定。
(5)EMS SNPの検出。EMS処理によって誘導されたSNPの同定。このようなSNPは、EMS突然変異体植物(EMSプールA又はB)においてのみ期待される。6つの独立したEMS突然変異体がプールされ(プールAでは3つ、プールBでは3つ)、EMS誘導性SNPはプールA又はBのいずれかで検出されるが、両方では検出されないことを考慮する。以下のパラメータと一致する場合、SNPは真のEMS−SNPとみなされた:(a)A68及びA68_i124に存在しない;(b)プールA又はプールBのいずれかで検出された。
これは、再度配列決定された全ヌクレオチドの11%に対応する、配列決定された295個のエキソンのうちの34個を表す大きな遺伝子である。原因Dip遺伝子の突然変異の富化は、複相胞子生殖の欠失表現型の選択により期待される。4つ全てのToVps13 EMS突然変異はDipハプロタイプにあり、いずれもdipハプロタイプにはなかった。本発明者らは、配列決定された遺伝子に対するこの突然変異の分布が、以下のように偶然に起因する確率を計算する。予測されるToVps13のサイズは、再度配列決定された全領域の11%である。3つのハプロタイプが存在するため、単一のToVps13ハプロタイプのサイズは、再度配列決定された全領域の3.7%である。最初のEMS突然変異体がDipハプロタイプに位置する確率は0.33である。第2、第3及び第4のEMS突然変異が同じハプロタイプにおいて同じ遺伝子に位置する確率は、0.037×0.037×0.037=5.1×10−5である。最初のEMS突然変異が右ハプロタイプであり、同じDNA領域における同じハプロタイプの第2、第3及び第4である組み合わせ確率は、0.33×5.1*10−5=1.67×10−5である。また、これは他のDNA領域でも起こり得るため、再度配列決定された領域全体にわたる確率は100/11×1.67×10−5=1.54*10−4=である。したがって、この分布が偶然に起因する確率は10,000中1.54である。結果として、Vps13配列は、複相胞子生殖に関与している可能性が非常に高い。
複相胞子生殖表現型における配列番号1の関与のさらなる証拠を提供するために、配列番号4の配列と複相胞子生殖の間の関連性を、アポミクティック(=複相胞子生殖)植物のパネル、及び有性(=減数分裂)植物のパネルにおいて調査した。両方のパネルは、地理的起源及び分類学的グループ(タンポポ属の様々な節及び様々な種)に関して、できるだけ多様な13個の無関係な植物で構成された。倍数性レベルは、Tas及びVan Dijk(1999,Heredity 83:707−714)に記載されている方法に従って、フローサイトメトリーによって決定された。育種システムは、受粉媒介者から隔離した際の種子結実によって決定された:アポミクトは、隔離下で完全な種子結実を生産し、有性体は、隔離下で種子を生産しない。配列番号4の部分は、1〜300nt又は7〜586ntのいずれかに再度配列決定され、第1は、Illumia対末端配列決定によるものであり、第2は、ゲノムシーケンサー(GS)FLX+PLATFORM(Roche Applied Science)によるものである。配列は、標準設定でDecypher(TimeLogic)を用いて配列番号4に対するヌクレオチドBLASTを用いて分析された。表4において、植物あたり最高のヌクレオチド配列同一性及び最小のE値が示されている。この表から、全てのアポミクトは配列番号4の配列決定された領域を有し、一方、有性体はいずれもこのDNA断片を有しないことは明らかである。したがって、この配列と複相胞子生殖の間には、最大の連鎖不均衡が存在する。組換え及び突然変異誘発は、ヌクレオチド領域が複相胞子生殖に機能的に関与していない場合、経時的にヌクレオチド領域と複相胞子生殖の間の連鎖不均衡を侵食する。したがって、大きな地理的及び分類学的規模でのアポミクシスと配列番号4の間の完全な関連性は、この配列が複相胞子生殖に必須であることを確実にする。
実施例6.アポミクトの大胞子母細胞及び準同質遺伝子の複相胞子生殖の欠失の突然変異体におけるDIP遺伝子の発現
DIP候補遺伝子の発現を研究する目的で、RNAseqは、アポミクティック(A68)及び同質遺伝子の欠損系(i124)の単離された大胞子母細胞(MMC)及び雌性配偶体(FG)から実施された。パイロット研究により、芽が植物のロゼットにまだ残っている場合、茎伸長の前に、非常に若い花序(約0.5cm径)の芽に、タンポポ属種に大胞子形成が起こることが明らかになった。後期段階(雌性配偶体;FG)について、芽を茎長1cmで収穫した。
実施例7.シロイヌナズナにおけるToDIP及びTodipの過剰発現
人工ATG開始コドンが先行するToDIP配列断片(配列番号11)及び人工ATG開始コドンが先行するTodip配列断片(配列番号9)を、35Sプロモーターを有するベクターにクローニングした。これらの構成的過剰発現ベクターを用いて、3つの独立したシロイヌナズナ属種フローラルdip形質転換実験を行った。各実験において、各対立遺伝子について15〜30個のT0植物が得られた。
配列番号4の複相胞子生殖機能をさらに確認するために、DIP対立遺伝子が欠失しているタンポポ属i124植物を配列番号4を含むプラスミドで形質転換し、適切なベクター中の様々なプロモーター及び調節エレメントと融合する。以下のプロモーター配列を使用する:
1.配列番号4の天然のタンポポ属種プロモーター(配列番号1の約1500bp、配列番号4の上流)
2.シロイヌナズナ属種Dmc1(At3g22880)のタンポポ属種オルソログのプロモーター(Klimyuk V.I.及びJones J.D.1997.AtDMC1,the Arabidopsis homologue of the yeast DMC1 gene:characterization,transposon−induced allelic variation and meiosis−associated expression.Plant J.:11:1−14)。この遺伝子は、減数分裂特異的プロモーターを有する。
3.35Sプロモーター。このプロモーターは、配列番号4の過剰発現をもたらす。タンポポ属種植物の形質転換のためのプロトコールは、Wahlerら 2009(Plant Phys.151,pp.334−346)によって公開されている。i124はアポミクシスの他の全てのエレメントを持っているため、複相胞子生殖の相補性は、この三倍体植物の高い種子結実によって及びT1後代の遺伝マーカーによって容易に決定することができるアポミクシスを修復する。後代植物は、母系マーカーの分離を伴わない、完全な母系ゲノムを含む。
イネ及びレタスの有性二倍体植物は、それぞれ、Dreni,Lら 2011(Plant Cell 23:2850−2863)及びDias,B.B.A.ら 2006(Plant Pathology 55:187−193)のプロトコールに従って形質転換のために使用される。実施例8に開示されているプロモーター及び配列番号4と同じ構築物を使用する。二倍体花粉ドナーを有するT0複相胞子生殖植物を交配した後、三倍体子孫が生産される。三倍体は、根端染色体数又はフローサイトメトリーによって決定することができる。両者は、標準的な方法である(Tas及びVan Dijk 1999,Heredity 83:707−714)。複相胞子生殖のさらなる証拠は、遺伝子マーカーの後代植物の解析において見出すことができる。父系マーカーに加えて、後代は完全な母系遺伝子型を有する。
CRISPR−CAS9、TALENS及びZFN(亜鉛フィンガーヌクレアーゼ)などの標的化されたゲノム編集技術は、既存の遺伝子に突然変異を生成するために当該技術分野において一般的に用いられている。ノックアウト対立遺伝子を作製することによるだけでなく、いわゆる「修復DNA」によってコードされる突然変異を導入することにもよる(例えば、Doudna J.A.及びGersbach C.A.2015 Genome editing:the end of the beginning Genome Biology(2015)201516:292、及びそこに引用されている参考文献)。
Claims (48)
- 配列番号1の核酸配列、又は配列番号1の核酸配列と少なくとも50%若しくは70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、なおさらにより好ましくは少なくとも96%若しくは97%、最も好ましくは少なくとも98%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号2の核酸配列、又は配列番号2の核酸配列と少なくとも50%若しくは70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、なおさらにより好ましくは少なくとも96%若しくは97%、最も好ましくは少なくとも98%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1又は配列番号2の核酸配列を含む又は有する、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドの発現産物及び/又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドの発現産物及び/又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に導入された場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供する、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 前記発現産物が、RNA分子、好ましくはmRNA分子、siRNA又はmiRNA分子である、請求項4又は5に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片であって、前記断片及び/又は前記断片の発現産物及び/又は前記断片によってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる前記ポリヌクレオチドの断片。
- 前記断片、及び/又は前記断片の発現産物及び/又は前記断片によってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に導入された場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供する、請求項7に記載の断片。
- 前記発現産物がRNA分子、好ましくはmRNA分子、siRNA又はmiRNA分子である、請求項7又は8に記載の断片。
- 前記発現産物が、配列番号5の核酸配列を含む又は有する、請求項9に記載の断片。
- 配列番号4又は6の核酸配列を含む又は有する、請求項7又は8に記載の断片。
- 前記ポリヌクレオチドの少なくとも20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000又は3000個の連続したヌクレオチドの長さを有する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の断片。
- 配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも50%若しくは70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、なおさらにより好ましくは少なくとも96%若しくは97%、最も好ましくは少なくとも98%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含む又は有する、請求項13に記載のポリペプチド。
- 植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる、請求項13又は14に記載のポリペプチド。
- 植物又は植物細胞に導入された場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供する、請求項15に記載のポリペプチド。
- 請求項13又は14に記載のポリペプチドの断片であって、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる前記ポリペプチドの断片。
- 配列番号7又は配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の断片。
- 前記ポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400又は500個の連続したアミノ酸の長さを有する、請求項17又は18に記載の断片。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片を含むキメラ遺伝子。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片、又は請求項20に記載のキメラ遺伝子を含む遺伝子構築物。
- 請求項13〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド又は断片をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチドを5’−3’方向に含む遺伝子構築物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片、請求項20に記載のキメラ遺伝子、又は請求項21若しくは22に記載の遺伝子構築物に作動可能に連結された、植物細胞において活性なプロモーター配列を含む核酸ベクター。
- 前記プロモーター配列が、
e)配列番号2の核酸配列の天然のプロモーター配列;
f)a)のプロモーター配列の機能的断片;又は
g)配列番号2の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を含む核酸配列;
h)配列番号6の核酸配列の天然のプロモーター配列;
i)d)のプロモーター配列の機能的断片;又は
j)配列番号6の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を含む核酸配列
を含む、請求項23に記載の核酸ベクター。 - 前記プロモーターが雌性子房特異的プロモーター、好ましくは大胞子母細胞特異的プロモーター及び/又は雌性配偶子特異的プロモーターである、請求項23に記載の核酸ベクター。
- 請求項20に記載のキメラ遺伝子、請求項21若しくは22に記載の遺伝子構築物、及び/又は請求項23〜25のいずれか一項に記載の核酸ベクターを含む植物、植物部分又は植物細胞であって、ここで、前記遺伝子、構築物及び/又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在する及び/又は発現される前記植物、植物部分又は植物細胞。
- 前記種子が前記植物のアポミクティック種子である、請求項26に記載の植物の種子。
- 前記種子が、それが発生した植物のクローンである、請求項27に記載の種子。
- タンポポ属、アキノノゲシ属、エンゾウ属、トウガラシ属、ナス属、キュウリ属、トウモロコシ属、ワタ属、ダイズ属、コムギ属、オリザ属、ネギ属、アブラナ属、ヒマワリ属、フダンソウ属、キクニガナ属、菊属、ペンニセツム属、ライムギ属、オオオムギ属、ウマゴヤシ属、インゲンマメ属、バラ属、ユリ属、コーヒーノキ属、アマ属、アサ属、キャッサバ属、ニンジン属、カボチャ属、スイカ属、及びモロコシ属からなる群から選択される種由来である、請求項26〜28のいずれか一項に記載の植物、植物部分、植物細胞又は種子。
- アポミクティック種子を生産するための方法であって、
a)請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片、請求項20に記載のキメラ遺伝子、請求項21若しくは22に記載の遺伝子構築物、及び/又は請求項23〜25のいずれか一項に記載の核酸ベクターを用いて植物、植物部分又は植物細胞を形質転換して、一次形質転換体を生産するステップ;
b)前記一次形質転換体由来の顕花植物及び/又は花を生育するステップであって、ここで、前記ポリヌクレオチド、断片、遺伝子、構築物及び/又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在する及び/又は発現されるステップ;並びに
c)好ましくは四倍体植物の花粉又は前記一次形質転換体の自家花粉を用いて、種子の生産を誘導するために前記一次形質転換体を受粉するステップ
を含む、方法。 - 前記植物、植物部分又は植物細胞が単為生殖能を有する、請求項30に記載の方法。
- 雑種植物のクローンを生産するための方法であって、
a)請求項26、29、37又は42のいずれか一項に記載の植物の花粉を用いて有性的に生殖する植物を他家受精させて、F1雑種種子を生産するステップ;
b)請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片、又は請求項13〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含み、及び/又はそれを少なくとも雌性子房において、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子において発現するF1植物を選択するステップ;
c)任意選択で好ましくは四倍体植物の花粉を用いて、種子の生産を誘導するために、前記選択されたF1植物を受粉するステップ;及び
d)種子を収穫するステップ;並びに
e)任意選択で前記種子から雑種クローン植物を生育させるステップ
を含む、方法。 - 前記植物、植物部分又は植物細胞が単為生殖能を有し、前記クローンがアポミクティッククローンである、請求項32に記載の方法。
- 請求項32又は33に記載の方法によって得ることができる又は得られた雑種植物。
- 植物、植物部分又は植物細胞に複相胞子生殖を付与するための方法であって、
a)前記植物、植物部分又は植物細胞を、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片、請求項20に記載のキメラ遺伝子、請求項21若しくは22に記載の遺伝子構築物、及び/又は請求項23〜25のいずれか一項に記載の核酸ベクターを用いて形質転換するステップ;並びに
b)任意選択で前記ポリヌクレオチド、断片、遺伝子、構築物及び/又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在し及び/又は発現される、植物を再生するステップ
を含む、方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片を前記植物、植物部分又は植物細胞のゲノムに組み込む、請求項35に記載の方法。
- 請求項35又は36に記載の方法によって得ることができる又は得られた複相胞子生殖植物、植物部分又は植物細胞。
- 植物、植物部分又は植物細胞に複相胞子生殖を付与するための方法であって、
a)植物、植物部分又は植物細胞において、内在性ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片、好ましくは液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子を改変して、改変後に植物、植物部分又は植物細胞が、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項7〜12のいずれか一項に記載の断片を含むステップ;及び
b)任意選択で植物を再生するステップ
を含む、方法。 - 改変されたポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片が発現され及び/又はポリペプチドをコードする、請求項38に記載の方法。
- 改変されたポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片が、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び/又は雌性配偶子に存在する、請求項38又は39に記載の方法。
- 前記改変が、
a)前記植物、植物部分又は植物細胞に少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼを導入し又は発現させること、好ましくは、前記ヌクレアーゼがCas/RNA CRISPRヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びTALエフェクターヌクレアーゼからなる群から選択される;及び/又は
b)オリゴヌクレオチドを用いるオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである;及び/又は
c)化学的突然変異誘発、好ましくはエチルメタンスルホネートを用いる
による、請求項38に記載の方法。 - 請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる又は得られた複相胞子生殖植物。
- 植物に複相胞子生殖を誘導するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
- 複数の遺伝子、QTL又は導入遺伝子の分離を防止するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
- 遺伝子をスタッキングするための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
- 複相胞子生殖形質用のマーカーの開発及び/又は同定のための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はその断片の使用。
- 植物において倍数体化を誘導するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
- 植物においてアポミクシスを誘導するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
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