CN118006674A - RcWUS1基因在调节月季再生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子育种技术领域，尤其涉及一种RcWUS1基因在调节月季再生中的应用，具体的，本发明提供如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其转录翻译的蛋白具有以下应用：调节月季腋芽萌发中的应用;调节月季体胚再生中的应用；月季基因编辑育种；月季转基因育种，本发明在月季生长状态良好、颗粒型紧密的体细胞胚中过表达RcWUS1基因，研究结果也发现转化率提高了6.35%，过表达RcWUS1的处理体细胞胚生长旺盛，出现增殖现象甚至可观察到诸多芽点，再生效率比对照高出35.47%，总之，RcWUS1对月季的再生具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子育种技术领域，尤其涉及一种RcWUS1基因在调节月季再生中的应用。
技术背景
月季（Rosa hybrida）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）多年生常绿或者半常绿木本观赏植物。月季兼具花型端庄、花色艳丽、花香馥郁等特点，有很高的观赏和经济价值，位于世界四大切花之首，广泛应用于园林绿化、庭院装饰、盆花、香料和化妆品工业等方面。
月季育种目标主要聚焦在花色、花型、花香、抗病虫害等性状的改良上。目前月季的栽培品种约有3-3.5万个，由中国、中东、欧洲的8-20个蔷薇属植物反复杂交、回交而得，使得现代月季遗传背景相对狭隘，花香、抗性等优良性状逐步丧失，加之月季品种间遗传背景复杂，染色体数目和倍性的差异很难实现远缘杂交育种。因而月季育种工作迫在眉睫，但只通过传统的杂交育种技术很难改良其性状。
上世纪60年代兴起的植物基因工程技术可从基因层面快速实现品种的改良，为月季育种提供了一种新的思路和途径。在此背景下，月季再生体系和遗传转化体系的建立极为关键。然而，由于月季本身复杂的遗传背景和基因型的限制，体细胞胚萌发率低，遗传转化困难，现有研究主要针对特定品种且萌发率低，尚未建起各月季品种通用的再生体系。因此，要想通过基因工程技术实现月季品种改良，体细胞胚萌发难题的突破至关重要，寻找萌发相关的基因，采用基因技术实现月季再生体系和遗传转化体系的建立，目前鲜有报道。
发明内容
本发明筛选出再生候选基因RcWUS1，发现该基因在月季分生组织、体胚以及活性芽中高表达，能促进月季腋芽萌发，提高体胚再生。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或其转录翻译的蛋白的如下任一应用：
a）调节月季腋芽萌发中的应用;
b）调节月季体胚再生中的应用；
c）月季基因编辑育种；
d）月季转基因育种。
基因编辑技术是指对基因组中的某些DNA序列进行定点改造的遗传操作技术，其基本原理是通过人工构建能特异性切割DNA序列的核酸酶，对目的基因片段进行精准的靶向剪切，使ＤＮＡ双链断裂， 随后激发细胞内的DNA修复机制，产生基因修改。常用的核酸酶主要有锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术系统以其简单、精确、高效和低成本而得到广泛应用。
转基因育种（Genetically modified breeding, GMB）是指通过现代分子生物学技术将一个或多个基因添加到一个生物基因组，从而生产具有改良特征的生物的育种方法。
基于本发明筛选到的RcWUS1基因的特性，可以通过现有技术手段基因编辑或转基因的方式，调控 RcWUS1的表达，从而获得目的性状。
进一步的，本发明还提供一种含调控如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的产品的如下任一应用：
a）调节月季腋芽萌发中的应用;
b）调节月季体胚再生中的应用；
c）月季基因编辑育种；
d）月季转基因育种。
进一步的，所述产品为试剂盒。
进一步的，本发明提供了一种重组质粒的如下任一应用：
a）调节月季腋芽萌发中的应用;
b）调节月季体胚再生中的应用；
c）月季基因编辑育种；
d）月季转基因育种
所述重组质粒含RcWUS1基因反向互补的编码区序列，所述RcWUS1基因序列如SEQID NO: 1所示，编码区序列如SEQ ID NO: 2所示。
作为一种实施方式，本发明还提供一种促进月季腋芽萌发的方法，所述方法为过表达RcWUS1基因或蛋白，提高月季中RcWUS1基因或蛋白的表达量，所述RcWUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
作为另一种实施方式，本发明提供一种调节月季体胚再生的方法，在体胚中过表达RcWUS1基因或蛋白，提高月季体胚中RcWUS1基因或蛋白的表达量，所述RcWUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明的有益效果：
本发明从月季品种‘月月粉’基因组中鉴定出一个再生候选基因RcWUS1,发现该基因在月季组织部位顶芽和体胚中高表达，表达信号集中于根尖分生组织、茎尖分生组织区域以及体胚的边缘位置，在体胚内部和愈伤组织等已分化细胞中几乎无表达。在月季花枝不同位点芽中RcWUS1的表达情况分析中，发现RcWUS1的表达与腋芽活性呈正相关，在活性芽中表达量高，在休眠芽中表达量低。因此本申请推测RcWUS1可能参与月季的再生。
本发明中根据RcWUS1在月季花枝不同位点芽中的表达结果，瞬时沉默和过表达腋芽中的RcWUS1，发现RcWUS1的异常表达会影响腋芽的萌发和生长，过表达RcWUS1能促进腋芽的生长，反正，沉默则会抑制生长。
本发明在月季生长状态良好、颗粒型紧密的体细胞胚中过表达RcWUS1基因，研究结果也发现转化率提高了6.35%。过表达RcWUS1的处理体细胞胚生长旺盛，出现增殖现象甚至可观察到诸多芽点，再生效率比对照高出35.47%。总之，RcWUS1对月季的再生具有重要意义。
附图说明
图1是本发明提供的月季不同部位RcWUS1的表达分析图；SE-体胚，Ca-愈伤，Ro-根尖，TB-顶芽，Pe-花瓣，IS-嫩茎，TL-嫩叶，OL-老叶，**代表 P≤0.01。
图2是本发明提供的RcWUS1的亚细胞定位图；注：（A）RcWUS1亚细胞定位预测结果；（B）在本氏烟草叶片中的亚细胞定位，将RcWUS1-GFP与NF-YA4-mCherry（核标记）共浸润到烟草叶片中，通过共聚焦显微镜观察荧光信号。
图3是本发明提供的RcWUS1的转录活性分析图；注：（A）转录活性实验所用载体结构图；（B）LUC活性的实时成像；（C）定量分析；数据显示为平均值±SD （n=3）（****表示P ≤0.0001）。
图4是本发明提供的月季花枝不同位点状态及RcWUS1的表达量图；注：（A）不同位点芽的侧视图；（B）不同位点芽的横截面图；（C）RcWUS1在芽中不同位点的相对表达；B-2、B-4、B-6和B-8分别表示花枝从上到下第2、4、6、8位置的腋芽状态，（****表示P≤0.0001，单因素方差分析）。
图5是本发明提供的瞬时沉默RcWUS1后不同时间段腋芽萌发和生长的表型观察结果图；注：0d、2d、4d、6d、8d、10d表示侵染后第0、2、4、6、8、10天TRV和RcWUS1沉默芽的生长情况。
图6是本发明提供的瞬时沉默RcWUS1后不同时间段腋芽生长状态解剖图；注：0d、2d、4d、6d、8d、10d表示侵染后第0、2、4、6、8、10天TRV和RcWUS1沉默芽生长点的体式解剖观察情况。
图7是本发明提供的瞬时沉默RcWUS1后的基因表达量及腋芽长度测量统计图；注：（A）沉默后的RT-qPCR分析RcWUS1相对表达量；（B）沉默后0、2d、4d、6d、8d和10d，对照组TRV和处理组RcWUS1沉默的芽长（*表示P≤0.05，**表示P≤0.01）。
图8是本发明提供的瞬时过表达RcWUS1后不同时间段腋芽萌发和生长的表型观察结果图；注：0d、2d、4d、6d、8d、10d表示侵染后第0、2、4、6、8、10天pSuper1300和RcWUS1:OE超表芽的生长情况。
图9是本发明提供的瞬时过表达RcWUS1后不同时间段腋芽生长状态解剖图；注：0d、2d、4d、6d、8d、10d表示侵染后第0、2、4、6、8、10天后pSuper1300和RcWUS1:OE超表芽生长点的体式解剖观察情况。
图10是本发明提供的瞬时过表达RcWUS1后的基因表达量及腋芽长度测量统计图；注：（A）过表达后的RT-qPCR分析RcWUS1相对表达量；（*表示P≤0.05，t检验）（B）过表达后0、2d、4d、6d、8d和10d，对照组pSuper1300和处理组RcWUS1:OE超表的芽长（**表示P≤0.01）。
图11是本发明提供的体胚过表达RcWUS1后的生长状态和GFP荧光信号图；注：A排为pSuper 1300转化12 d后体胚的生长状态；B排为pSuper 1300转化12 d后体胚的荧光信号；C排为RcWUS1-GFP:OE转化12 d后体胚的生长状态；D排为RcWUS1-GFP:OE转化12 d后体胚的荧光信号；箭头代表绿色荧光（GFP）信号。
图12是本发明提供的体胚过表达RcWUS1后表达量结果图；注：**表示P ≤ 0.01，t检验。
图13是本发明提供的体胚过表达RcWUS1后的转化率和再生率统计图；注;(A)过表达RcWUS1后体胚的转化率；（B）过表达RcWUS1后体胚的再生率；ns表示P > 0.05; ***表示P≤ 0.001，t检验。
具体实施方式
下面结合实施例和附图进行详细说明。本申请基于月季品种‘月月粉’的基因组序列，前期通过WOX家族成员的鉴定和分析，挖掘到到富含分生组织表达顺式作用元件，又在顶芽和体胚中高表达的WOX家族基因RcWUS1,并且发现RcWUS1的表达量与腋芽活性相关，在活性芽的表达高，在休眠芽中表达低。瞬时沉默或过表达RcWUS1后发现腋芽萌发和生长速度受到影响。在月季体细胞胚中过表达会影响转化率和再生率。因此，本申请揭示了RcWUS1在月季腋芽萌发和体细胞胚再生中的生物学功能，从而为月季再生效率的提高提供技术支撑，促进月季功能基因组学研究、基因编辑育种和转基因育种研究；也可为部分体胚难再生，基因难转化的植物遗传改良提供参考。
本实施案例提供了RcWUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
本申请中出现的缩略词及其对应名称如表1所示。
表1 缩略词表
| 缩略词符号 | 英文全称 | 中文名 |
| 2,4-D | 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid | 2,4-二氯苯氧乙酸 |
| 6-BA | 6-Benzylaminopurine | 6-苄氨基腺嘌呤 |
| KT | Kinetin | 激动素 |
| MS | Murashige and Skoog | MS培养基 |
| LB | Luria-Bertani（medium） | LB培养基 |
| MES | 2-morpholinoethanesulfonic acid | 2-吗啉代乙基磺酸 |
| Kan | Kanamycin | 卡那霉素 |
| Rif | Rifampicin | 利福平 |
| Cef | Cefotaxime | 头孢霉素 |
| Hyg | Hygromycin | 潮霉素 |
| AS | Acetosyringone | 乙酰丁香酮 |
| LUC | Luciferase | 荧光素酶 |
| GFP | Green fluorescent protein | 绿色荧光蛋白 |
| OE | over expression | 基因过表达 |
| AM | Axillary meristem | 腋分生组织 |
| VIGS | Virus induced gene silencing | 病毒诱导的基因沉默 |
| TRV | Tobacco rattle virus | 烟草脆裂病毒 |
| RT-qPCR | Real-time Quantitative polymerase chain reaction | 实时荧光定量PCR |
实施例1
1．植物材料
1.1‘月月粉’
‘月月粉’取自云南省农科院花卉所雨树村基地，用于表达验证实验中。取样后立即放入液氮中带回实验室，存放于-80℃冰箱备用。
1.2‘粉红雪山’
‘粉红雪山’为现代切花月季品种，取自云南省农业科学院花卉研究所宝峰基地，以带单芽茎段作为月季腋芽萌发实验的材料。
1.3‘萨曼莎’
‘萨曼莎’种植云南省农业科学院花卉研究所雨树村基地，打芽灭菌后获得无菌苗，实验中涉及的体胚和愈伤组织均由‘萨曼莎’无菌苗诱导所得。
1.4烟草
亚细胞定位和转录激活实验材料为本氏烟草，将种子撒播于湿润的营养基质中，并覆膜，于培养室内培养。
培养条件：温度24±1℃，相对湿度为60-65%，光周期16h/8h。
1.5菌株与载体
大肠杆菌：DH5α以及根癌农杆菌菌株：EHA105，GV3101（pSoup）、pSuper-1300（Kan抗性）均购自北京擎科生物科技有限公司。VIGS载体为购自HonorGene（奥诺基因）的pTRV1、pTRV2。
1.6 案例中涉及的培养基配方
（1）LB培养基和YEB培养基（表2）
表2 LB和YEB培养基配方
（2）实验相关培养基（表3）
表3 相关培养基配方
2.研究方法
2.1 总RNA的提取
使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型），从‘月月粉’的体胚、愈伤、根尖、顶芽、花瓣、嫩茎、嫩叶、老叶中提取总RNA。
2.2 cDNA合成
（1）基因组DNA去除（表4）
表4 基因组DNA去除反应体系
| 组分 | 体积 |
| 模板RNA | 1 pg-1 μg |
| 4 × gDNA wiper Mix | 4 μL |
| RNase-free ddH2O | up to 16 μL |
混匀，42 ℃，2 min。
（2）配制逆转录反应体系（表5）
表5 转录反应体系
| 组分 | 体积 |
| 5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix | 4 μL |
| 第1步反应液 | 16 μL |
吹打混匀，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。产物于-20 ℃保存。
2.3 实时荧光定量PCR
用Primer premier5设计基因的特异性引物（表6）。将cDNA用ddH2O稀释四倍，以反转录得到的cDNA为模板进行Real-Time PCR扩增。以GAPDH为内参，设置3个生物学重复。
表6 RT-qPCR引物序列
反应体系如表7所示：
表7 RT-qPCR反应体系
| 组分 | 体积 |
| Buffer | 10 μL |
| 引物-R | 1 μL |
| 引物-F | 1 μL |
| cDNA | 4 μL |
| ddH2O | 4 μL |
反应程序如表8所示：
2.4 载体构建
2.4.1 PCR扩增目的基因片段
PCR目的基因扩增用高保真酶（PhusionTM Plus PCR Master Mix），反应体系如表9所示：
表9 PCR扩增反应体系
| 组分 | 体积 |
| Master Mix | 25 μL |
| Enhancer | 10 μL |
| Water | 8 μL |
| cDNA | 4 μL |
| 引物-F | 1.5 μL |
| 引物-R | 1.5 μL |
反应程序如表10所示：
扩增结束后进行1%凝胶电泳，选取目的条带进行后续胶回收。
2.4.2 胶回收
用DNA胶回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0）对PCR产物进行回收纯化。
2.4.3 载体双酶切
根据目的片段序列插入的酶切位点，用相应酶对载体进行双酶切。酶切体系如表11所示：
表11 双酶切体系
| 组分 | 体积 |
| 载体质粒 | 1 μg |
| 酶1 | 1.5 μL |
| 酶2 | 1.5 μL |
| Buffer: FD Buffer | 5 μL |
| H2O | up to 50 μL |
在冰上加好体系试剂后，根据具体酶的热变性温度进行载体双酶切。
2.4.4 同源重组
将双酶切后的载体与克隆的目的基因片段进行同源重组，以构建载体。同源重组体系如表12所示：
程序：于PCR仪中50 ℃跑15 min。
2.4.5 大肠杆菌转化
（1）从-80 ℃取出感受态，于冰中融化；
（2）取1.5 mL离心管，加入10 μL重组产物和50 μL DHα感受态，吹打混匀，在冰中静置30 min；
（3）42 ℃水浴锅热激90 s，迅速转至冰上静置2 min；
（4）离心管中加入500 μL LB，37 ℃，200 rpm，1 h；
（5）培养后的菌液，5000 rpm离心5 min；
（6）在超净工作台中弃400 μL上清，吹打混匀后涂布于含抗生素的LB固体培养基上，37 ℃过夜倒置培养。
2.4.6 菌检及测序
（1）摇菌：挑取过夜培养长出的单菌落，于500 μL含有抗生素的LB培养基中振荡培养3-4 h（37 ℃，200 rpm）。
（2）菌液PCR：培养起来的菌液用于PCR扩增，以检测所构建载体目的条带是否符合预期。菌液PCR扩增体系如表13所示：
表13 菌液PCR扩增体系
| 组分 | 体积 |
| Taq Mix | 5 μL |
| 引物-F | 0.5 μL |
| 引物-R | 0.5 μL |
| H2O | 3 μL |
| 菌液 | 1 μL |
菌液PCR扩增程序如表14所示：
扩增产物用于1%凝胶电泳成像，条带大小符合预期的送公司测序。
2.5 质粒提取
送测结果返回后进行序列比对，选择符合预期的样品摇菌，用质粒提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0）提质粒。
2.6 农杆菌转化
（1）从-80 ℃冰箱取出农杆感受态融化至冰水混合物状态时插入冰中；
（2）每100 μL感受态加入0.01-1 μg质粒DNA，拨打混匀后依次于冰上静置5 min，液氮5 min，37 ℃水浴5 min，冰浴5 min；
（3）加入500 μL无抗生素的YEB液体培养基，28 ℃振荡培养2-3 h；
（4）5000 rpm离心2 min，于超净工作台弃400 μL上清，涂布到含抗生素的YEB固体培养基上，28 ℃倒置培养2-3 d。
2.7 亚细胞定位
（1）载体构建
选取SmaI和KpnI为酶切位点,将RcWUS1的完整编码区（SEQ ID NO: 2）序列插入pSuper-1300载体中，利用同源重组的方法设计引物，以构建RcWUS1-GFP载体，得到农杆阳性菌种后进行以下实验。
（2）摇菌
1）菌液划线培养：取出保存的菌液在含相应抗生素的YEB培养基上划线，28 ℃倒置培养2-3天；
2）摇菌：挑取单菌落于1.5 mL离心管中，加入500 μL含抗生素的YEB液体培养基进行过夜小摇（28 ℃，200 rpm），PCR菌检，条带正确的菌液继续进行中摇，大摇。
（3）烟草注射
1）集菌：将培养至OD600=0.4-0.6的菌液进行离心（5000 rpm，8 min），弃上清，收集菌体。用侵染液重悬菌体，将OD600调至1.0，按RcWUS1-GFP/GFP：NF-YA4-mCherry：P19=1:1:0.5比例混合，黑暗静置3 h。
2）注射：静置结束后，用针头在烟草（长至4-6片叶）背面轻轻划个口，用1 mL注射器将按比例混合的菌液注射到烟草叶片中，并做好标记；
3）培养：将注射后的烟草放置在25 ℃培养箱中，先暗培养一天，后转至光下培养2天；期间注意浇水，保持烟草正常生长。
（4）观察拍照
选取烟草注射口附近的叶片，用刀片和镊子轻轻切成方形取下，放置在载玻片上，滴上蒸馏水，盖上盖玻片（注意避免气泡产生）。用云南省农科院生物所国家重点实验室的激光共聚焦显微镜进行观察拍照。
2.8 转录激活
（1）载体构建
以AgeI和StuI为酶切位点，将RcWUS1的完整编码区（SEQ ID NO: 2）序列插入pBD空载中，利用同源重组的方法设计引物，构建pBD-RcWUS1载体。
（2）烟草培养
播种烟草种子，在培养室培养至4-6片叶（一个月），用于后续实验开展。
（3）农杆菌培养
将构好的载体（pBD；pBD-vp16；pBD-RcWUS1；GAL-TATA；P19 ）GV3101（pSoup）农杆菌划线培养2-3天，挑取单菌落小摇，菌检。条带正确的继续中摇（28 ℃，200 rpm，过夜培养），抗性为Kan和Rif。
（4）菌液重悬
将摇好的农杆菌液分装到50 mL离心管中，5000 rpm，8 min，弃上清；用侵染液重悬菌体，pBD；pBD-vp16；pBD-RcWUS1；GAL-TATA OD600调至1.0左右，P19的OD600调至0.5。调好OD后按pBD/pBD-vp16/pBD-RcWUS1：GAL-TATA：P19=1:1:1或2:1:1的比例混合，黑暗静置4-6h用于烟草注射。
（5）注射烟草
挑选生长状态良好的烟草，选烟草顶端外围第二圈的叶片，用去头的1mL注射器从烟草叶片下表皮注射，每片叶片同时分区注射pBD、pBD-vp16和pBD-RcWUS1（通常注射四个孔，基因注射2个孔），并做好标记。将注射完后的烟草放到黑暗条件中培养1天，然后转至光下培养2天，即可观察。
（6）观察
1）荧光底物工作液配制：将母液（100×）用ddH2O稀释至1×，置于雾化效果好的小喷壶中备用。（注意：荧光底物要避光）
2）观察：将烟草叶片剪下，背面朝上用双面胶固定在白纸上，均匀喷上荧光底物，放置在黑暗环境5min后于仪器下观察，通过荧光强度的检测分析转录因子活性。
2.9 稳定遗传转化
（1）菌液培养
载体与亚细胞定位实验的一致，从-80 ℃冰箱取出菌液，在含抗生素（Kan/Rif 50mg/L）的平板上划线，28 ℃倒置培养2-3天。挑取单菌落，小摇，菌检；条带正确的继续中摇，大摇（28 ℃，200 rpm）。
（2）菌液重悬
将菌液（OD600 = 0.4-0.6）转入无菌的50 mL离心管中，2500 rpm离心10 min，弃上清，加入等量重悬液。28 ℃，180 rpm重悬2 h。
（3）体胚侵染
挑选生长状态致密，颗粒性良好的体胚作为侵染的受体，将侵染受体转至菌液中，28 ℃，180 rpm，侵染40 min。侵染后的体胚用滤纸吸除多余菌液，接种到共培养培养基中，暗培养3天。共培养结束后的体胚转至体胚选择增殖培养基中，转至光下2周后观察表型。
（4）数据统计
转化率（%）=有荧光的体胚数/侵染的体胚总数
再生率（%）=有萌芽或新增体胚的体胚数/有荧光的体胚数
2.10 瞬时侵染
（1）载体引物设计与载体构建
以EcoRI和BamHI为酶切位点，将RcWUS1的沉默片段（SEQ ID NO: 3）序列插入TRV2空载中，利用同源重组的方法设计引物，构建TRV-RcWUS1载体。
（2）菌液培养
菌液平板划线（含Kan/Rif 50 mg/L），28 ℃倒置培养2-3天。挑取单菌落于500 μL含抗生素的YEB中小摇，菌检；条带正确的进行中摇，大摇（28 ℃，200 rpm）。
（3）集菌和重悬
用离心机5000 rpm，8 min离心集菌，倒掉上清，用侵染液重悬菌体，用移液枪吹打混匀，调至OD600 = 1.0。进行瞬时沉默实验时，将TRV1和TRV2、TRV2-RcWUS1菌液按体积1:1混合，暗处静置4-6 h，而瞬时过表达时将Super-1300和Super-RcWUS1各自集菌静置即可。
（4）真空抽吸
用真空泵对带单芽的茎段进行抽吸侵染，0.082 MPa，抽吸10 min，持压10 min，放气10 min，尽可能让整个茎段浸没在菌液中，重复处理三次。侵染完后，用无菌水漂洗，于8℃培养室放3 d后扦插，每隔两天进行观察，并取样，拍照记录。
2.11 RcWUS1序列实验中用到的引物
表15 RcWUS1序列及引物列表
表15 RcWUS1序列及引物列表
3试验结果
3.1 RcWOXs在不同组织部位的表达验证
本申请提取了月季的根尖、顶芽、花瓣、嫩茎、嫩叶、老叶、体胚和愈伤组织的总RNA并进行质量检测，选取响应分生组织和植物生长发育相关顺式作用元件最多的基因，进行荧光定量表达分析发现，不同基因在不同组织中的表达存在差异（图1）。其中，RcWUS1在体胚和顶芽两个生长较为旺盛的组织表达较特异且表达量较高，表明RcWUS1可能对月季的生长和发育至关重要。
3.2 RcWUS1的转录激活和亚细胞定位分析
为了探索RcWUS1发挥功能的亚细胞位置，本申请首先用Cell-PLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2）进行了在线预测，显示定位于细胞核（图2A）。为了进一步验证定位的准确性，克隆了RcWUS1的CDS序列，构建RcWUS1-GFP载体。以GFP空载为对照，转入农杆EH105后注射本氏烟草叶片，3 d后于激光共聚焦显微镜下观察，结果显示GFP空载和RcWUS1-GFP均定位于细胞核（图2 B）。
为了进一步探究RcWUS1的转录活性，将RcWUS1的CDS序列通过同源重组的方法插入到pBD载体上，获得的重组载体（pBD-RcWUS1）作为效应子(Effector)，pGAL4-LUC作为报告子（Reporter），pBD作为负对照，pBD-VP16为正对照（图3A）。将上述载体质粒转入农杆GV3101后侵染本氏烟草叶片，同一个叶片同时分区注射正负对照和目的基因，3 d后观察LUC荧光信号，发现正对照pBD-VP16的信号最强，负对照pBD次之，而pBD-RcWUS1的荧光信号最弱（图3B-C），说明pBD-RcWUS1能抑制VP16的转录活性，是转录抑制子，具有转录抑制活性。
3.4 不同活性芽中RcWUS1的表达量分析
本申请去除切花月季‘粉红雪山’花枝（花蕾未露白）不同节点多余的叶片和叶柄，在体式显微镜下对腋芽的状态进行观察，发现越靠近花蕾的芽活性越好，越饱满，靠近根部的芽几乎处于休眠状态（图4A）。对芽体解剖观察的结果同样如此，活性好的芽能清晰的观察到生长点（图4B）。对不同位点芽中RcWUS1的表达水平进行实时荧光定量PCR分析，发现RcWUS1的表达与腋芽的活性呈正相关，其在第二位点芽（B-2）中表达最高，在第八位点芽（B-8）中表达最低（图4C）。因此，本申请推测RcWUS1与腋芽的萌发紧密相关。
3.5 RcWUS1促进月季腋芽萌发
本申请基于RcWUS1在不同位点芽中的表达量分析结果，选取RcWUS1序列的特异区段（SEQ ID NO: 3），用同源重组的方法构建TRV-RcWUS1瞬时沉默载体，将TRV1，TRV2和TRV-RcWUS1转入农杆EHA105后用于带活性芽（B-6）茎段的侵染以沉默RcWUS1，于侵染后0 d、2d、4 d、6 d、8 d、10 d进行表型观察和记录（图5）。从芽的表型来看，与TRV对照相比，TRV-RcWUS1芽的萌发速度明显慢一些，芽的解剖结果同样可以看出RcWUS1沉默后芽的发育减缓（图6）。为了确认沉默效果，提取RcWUS1沉默前后芽的总RNA，对其表达量进行了RT-qPCR分析，发现RcWUS1沉默后表达降低极显著，说明沉默有效（图7A）。此外，也对对照组TRV和实验组TRV-RcWUS1不同时间点的芽长度进行了测量，发现沉默后第10 d差异能达到极显著（图7B）。
为了进一步确认RcWUS1与腋芽萌发的相关性，在休眠芽（B-8）中瞬时过表达了RcWUS1，表型观察显示过表达后的RcWUS1腋芽萌发和生长速度比对照pSuper1300明显加快，RcWUS1表达量显著提高，腋芽长度在第8 d就达到了极显著差异（图8-10）。以上结果说明，RcWUS1的表达会影响月季腋芽的萌发和生长。
3.6 RcWUS1促进月季体胚再生
瞬时侵染已初步验证了RcWUS1在月季腋芽萌发中的作用。然而，在月季遗传转化中，体胚的萌发仍旧是一大技术难点，严重制约了月季品种的改良。为了探索RcWUS1在月季体胚萌发中的作用，本申请构建了RcWUS1-GFP:OE过表达载体。挑选生长致密，颗粒性良好的体胚作为侵染受体，共培养结束后将体胚转至体胚选择增殖培养基，14 d后观察表型（图11），发现侵染后的GFP荧光主要分布于体胚边缘，过表达RcWUS1后的处理组中体胚生长旺盛，可观察到诸多芽点。提取两个处理的体胚总RNA，进行RT-qPCR验证，结果显示超表后与RcWUS1的表达提高三倍之多，与预期相符（图12）。数据统计显示，过表达RcWUS1后转化率提高6.35%，无显著差异。而再生效率显著提高了35.47%（图13）。以上结果表明RcWUS1能一定程度上提高月季体胚的再生效率，在体胚萌发中发挥重要作用。
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或其转录翻译的蛋白的如下任一应用：
a）调节月季腋芽萌发中的应用;
b）调节月季体胚再生中的应用；
c）月季基因编辑育种；
d）月季转基因育种。
2.一种促进月季腋芽萌发的方法，其特征在于，过表达RcWUS1基因或蛋白，提高月季中RcWUS1基因或蛋白的表达量，所述RcWUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.一种调节月季体胚再生的方法，其特征在于，在体胚中过表达RcWUS1基因或蛋白，提高月季体胚中RcWUS1基因或蛋白的表达量，所述RcWUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
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2024
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