CN115067168A - 一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，所述长毛谷应用在强耐盐性地方，所述长毛谷包括显著提高长毛谷芽期耐盐性的耐盐主效基TSC，包括如下验证方法：S1、将长毛谷的干种子浸泡在海水中30天后，海水的全盐量2.19×104mg/L，盐浓度约为2％，仍能正常发芽，根和茎的长度都远远长于国际上公认的耐盐品种Pokkali；S2、对3‑4叶期的水稻幼苗用120mMNaCl溶液胁迫处理15天后，长毛谷黄叶数低于耐盐品种Pokkali。优点：强耐盐性的稻种资源，能够消除或降低稻田盐渍化潜在风险。

Description

一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用

技术领域

本发明涉及农业技术领域，具体是指一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用。

背景技术

水稻种子芽期的耐盐性是直播稻在盐渍土壤中稳定生长的主要决定因素之一(Wang et al.，2011)。但是，当前生产中应用的绝大部分水稻品种都对盐害比较敏感。因此，从丰富的稻种资源中筛选耐盐水稻材料作亲本，培育具有芽期耐盐性的直播稻品种是消除或降低稻田次生盐渍化风险的有效途径。

此外，虽然水稻耐盐碱性研究已经有多年历史，但是由于水稻耐盐性状鉴定影响因素较多，水稻耐盐机理的复杂性，使得水稻耐盐性研究进展一直比较缓慢。目前检测到的大多数水稻耐盐QTL的表型贡献率较小，因此利用正向遗传学方法克隆到的耐盐基因比较少。

发明内容

本发明解决上述的技术问题，提供一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，所述长毛谷应用在强耐盐性地方，所述长毛谷包括显著提高长毛谷芽期耐盐性的耐盐主效基 TSC。

包括如下验证方法：

S1、将长毛谷的干种子浸泡在海水中30天后，海水的全盐量2.19×104mg/L，盐浓度约为2％，仍能正常发芽，根和茎的长度都远远长于国际上公认的耐盐品种Pokkali；

S2、对3-4叶期的水稻幼苗用120mMNaCl溶液胁迫处理15天后，长毛谷黄叶数低于耐盐品种Pokkali。

一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，包括如下验证方法：

A1、设置3个盐NaCl浓度梯度，包括100mM、120mM、140mM，对长毛谷、Pokkali 耐盐对照和浙辐802敏盐对照的干种子进行处理，10天后调查发芽率；

A2、长毛谷在100mM、120mM、140mM盐浓度下的发芽率分别为69％、48.67％、18.7％，而Pokkali耐盐对照的发芽率分别为30.6％、17.33％、0％，浙辐802敏盐对照的发芽率分别为13％、4.67％、0％；长毛谷在发芽期的耐盐性明显强于Pokkali耐盐对照，在120mMNaCl条件下根据发芽率和表型。

本发明具有如下优点：长毛谷在芽期和苗期均表现出强耐盐性的稻种资源，其耐盐性显著优于国际公认的耐盐水稻品种Pokkali，因此，长毛谷一份优异的耐盐水稻种质资源，能够消除或降低稻田盐渍化潜在风险。

附图说明

图1是本发明一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用的基于极端群体的BSA-seq定位作图。

图2是本发明一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用的苗期共同的164个差异表达基因在新陈代谢通路中的富集图。

图3是本发明一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用的编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因序列变异检测及验证示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，所述长毛谷应用在强耐盐性地方，所述长毛谷包括显著提高长毛谷芽期耐盐性的耐盐主效基TSC。

验证方法一

通过对200多份广东沿海地区收集的水稻种质资源进行耐盐性鉴定，获得了强耐盐性材料长毛谷(CMG)。将长毛谷的干种子浸泡在海水(全盐量：2.19×104mg/L，盐浓度约为2％) 中30天后，仍能正常发芽，根和茎的长度都远远长于国际上公认的耐盐材料Pokkali；此外，对3-4叶期的水稻幼苗用120mMNaCl溶液胁迫处理15天后，长毛谷黄叶数低于Pokkali。这就表明，长毛谷在芽期与苗期的耐盐性均显著强于Pokkali，长毛谷是一份非常难得的耐盐水稻资源材料。

验证方法二

为了定位长毛谷的耐盐基因，创建了遗传定位F2群体，构建了极端群体池，并且对长毛谷及其F2群体的耐盐筛选条件进行了优化。

为了进一步鉴定长毛谷的耐盐性，设计了6个盐(NaCl)浓度梯度(包括85mM、100mM、 120mM、140mM、150mM、170mM)对长毛谷、Pokkali(耐盐对照)和浙辐802(敏盐对照)的干种子进行处理，10天后调查发芽率。结果显示，长毛谷在100mM、120mM、140mM盐浓度下的发芽率分别为69％、48.67％、18.7％，而Pokkali的发芽率分别为30.6％、17.33％、 0％，浙辐802的发芽率分别为13％、4.67％、0％。结果显示，长毛谷在发芽期的耐盐性明显强于Pokkali，在120mMNaCl条件下根据发芽率和表型，最容易将长毛谷与浙辐802的耐盐性区分开来。申请人采用120mMNaCl溶液对1000份F_2：3种子进行发芽期耐盐性鉴定，从中分别筛选出30份极耐盐(发芽率>40％)和30份极不耐盐(发芽率＝0％)的株系，等量混合构建极端群体池进行BSA-seq定位分析。

耐盐候选基因TSC的验证方法

通过对遗传群体F₂、双亲(长毛谷和浙辐802)及两个极端群体池的BSA-seq定位分析，同时结合长毛谷转录组分析结果，确定了长毛谷中耐盐候选基因TSC。

通过对测序数据△SNP-/InDel-index指数和ED-SNP/InDel分析的结果，确定了6个重叠区域为耐盐基因候选区间(表1、图1)。这6个候选区间都位于第一染色体上，覆盖2.6Mb 区间，包含了430个基因。进一步对该区间的基因进行筛选，去除编码转座子和逆转座子的相关基因，并与参考基因组日本晴和浙辐802(敏盐亲本)序列相比，结果表明在长毛谷基因组中有23个基因存在非同义突变，8个基因包含移码突变(表2)。

表1.长毛谷耐盐基因的候选区间

表2.候选区间内存在非同义SNP/indel变异的相关基因

为了进一步了解长毛谷在盐胁迫下基因差异表达的情况，我们分别在长毛谷的芽期和幼苗期对其进行盐(120mMNaCl)处理，设清水对照，分不同时间段进行取样，时间点分别为发芽4天(GS)、苗期(4叶期)分别盐处理30分种(SSⅠ)、3小时(SSⅡ)、24小时(SSⅢ)，提取RNA，对其进行转录组测序分析。分别检测到3015、1513、2506和1202个差异表达基因。这些差异表达基因显著地富集在激素信号转导(ko04075，13个基因)和类胡萝卜素生物合成途径中(ko00906，6个基因)(FDR<0.00001)。在这些基因中，两个差异表达基因(Os03g0297600和Os05g0473101)属于PYR1/PYL家族，10个基因(Os01g0656200，Os01g0656250，Os01g0846150，Os01g0846300，Os03g0268600，Os03g0268750，Os05g0457200， Os05g0457300，Os05g0537400和Os09g0325700)属于蛋白磷酸酶2C家族，一个基因 (Os02g0766700)编码bZIP转录因子，充当ABA反应元件结合因子。

结合转录组测序结果，分析以上BSA-seq法初步确定的31个基因(23个基因存在非同义突变，8个基因包含移码突变)的差异表达，同时结合基因组序列变异、基因的差异表达及群体的连锁分析，确定在CDS区存在非同义变异的一个编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的激酶为TSC的候选基因，在该基因的CDS区存在非同义单碱基替换，导致编码的氨基酸由Gly(日本晴和浙辐802中)变异为Ser(长毛谷中)(见图2)。

根据序列变异设计引物扩增双亲，测序比对证实该变异是真实的(见图2)。经RT-PCR 验证了该基因盐胁迫下在长毛谷和浙辐802中存在差异表达，并利用极端群体进行了共分离分析和测序验证，发现该基因与耐盐性状呈现共分离。

利用CRISPR/Cas9技术对长毛谷中TSC基因进行编辑，验证了TSC耐盐功能。

我们利用CRISPR/Cas9技术对长毛谷中的编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因进行敲除，得到7个阳性转化株系，将它们种在转基因试验田中，成熟后收获种子T1。利用120mMNaCl 对T1代株系、长毛谷和浙辐802的干种子进行处理，设3个重复，设清水对照，10天后调查发芽率。发芽标准为，芽长达种子长度的一半，根长达种子长度。结果发现7个T1代种子发芽率比长毛谷均发生了下降(图3b)。结合表型与发芽率发现，其中3个T1代株系(CMG-1、 CMG-2、CMG-3)的耐盐性下降最为显著，在盐处理条件下根基本不生长。这就表明TSC可显著提高长毛谷的芽期耐盐性。

本发明的工作原理：水稻种子萌发期的耐盐性是水稻在盐渍土壤中稳定生长的主要决定因素之一，同时随着播稻技术快速发展，开展水稻芽期耐盐性研究显得尤为重要。

申请人通过对来自广东沿海收集的200多份稻种资源开展了耐盐筛选，鉴定出一份强耐盐地方稻种资源长毛谷，其耐盐性显著优于国际公认耐盐品种Pokkali。申请人采用极端群体法BSA-seq测序技术，结合转录组测序，在长毛谷中确定了一个耐盐主效基因TSC，并且通过基因敲除试验证明TSC基因可显著提供长毛谷的芽期耐盐性，是一个未报道的耐盐主效新基因。

因此，耐盐新基因TSC的克隆，为水稻耐盐机理研究提供了新的理论基础，此外，由于 TSC基因来源于广东沿海地区的地方品种，可直接应用于水稻耐盐分子育种，预期将会产生较大的经济效益。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

以下附上基因序列表：

LOC_Os01g46720 sequence informationGenomic sequence length:6906nucleotides

CDS length:1953 nucleotides

Protein length:650 amino acids

Putative Function:expressed protein---protein kinase

________________________________________

Genomic Sequence

>LOC_Os01g46720

CTCGCGCCCCCCCTTCCTCTTCTTAACCCCCCCGCCTCCTCCCCACTCCACACCTCCTCGCTGCCCAGCCACCGCC GCCCTCCCGTCCCGCGGAGCCGACGACGGTGACCGCCGACGACCCCACCCGCGATGCCTGTCGTCGCGGCCGCCGCCGCC GCCGTCGCCGCCCGACCGACCGGGGCTGGCCCCGCGCGCCCCTTGCGCGGCGGCGTGTCCGCGCGCCCGTGCCGGCGGCG GGGGTTCCGGGCGGAGGCGAGCTCGTCGGCGTCAACGCCCGCGCCGGTGGCGGCGGATGAGGGGGCAGGAGCGGGGCCGT GCCCCGTCGTCAGGTTCGAGATGGGCGACTTCGACGTCGCTGACCGCGTCAGCGTCGGGCTCCACGGGCGGGTGGGTTCT CCGCACCCCCCCACGGATTCGGTTTCCTACTAGTGAATTTTGCTGTGTTGTTGCTCGTGTGTGGTGAATTTCTGCTCCGT GCTGCAGTCGGACGAGATGATCTTCGAGGCCACGGTGCGCGATCCGAGCAGGTTGGTGGCATGGAGCAAATCAGGTAGTG CGAATTCGTTGGATCGATGCTCATTTGTTCTGATTTTGGTGCTCAGTGAGCTGTACGGTTCGACGGTGGTGCTGCGGCAG CTGATGAGCTTTCAGGCGAAGCGCAGGGGCCGGCGCGCGCTGGAGGTGGGTGCTCTTCTCACTAGAATTTTTTGTGAGCT GGAATTAATGCGCGTGTGGTTGAGCTCGAGTGGGTTTCTGTGATCACAGGTGCTGAAGAAGCTGGCTCGCCGACAGATGA TGTACCACTCTTACGCGATGCAGGTCCATGGATATGTTACTCCAGGCAATGACGTGGAGCAGGACGATGGATCCTTCATC CTGGTGCACGGGGTTAGAGTTTCTGTCTTTACTTCCTTCAGCTGATTGGGTTAAGATAAATGTGGCAGTATCATTTTCAA GTCTCACAATTGGGGGGGTCTGGATTAATTATGCAGTCCTTTTCATGTCAGGGATGGGTTTAGTACGATTGTACGAATCT GGATGTAACCACCACATCAGGCTTTCTATTTCTTGCAACTAAAACACCTGAAGTTATTCTTGAGTATTTTCACTTGGCCT TTTAAGGAGGTCTAGGTTTCTAATGGCCAGAAAAAAGTACTTTAAGAGGGGCAAAAGTACTCTTTTCCCTGAAACTAATA TAGGTACTGTGTTTTTATCGGTTTTTATTTTTGAATTAACTTTTCAGTACCATGGGAGTTACTCTTTGCGCCACTGGTTG CAACTCTCTGATTGGCTTCCAACCTTAGAAGCAACATTAGCGTTGGATGAGGAACAAGTTAGGAGGGTAGGTGATGATTC AGTAGGAGGACCTGCTGTAACCCGGCAGCTACGTCTAATCAGGATATTGATGAGAGACCTTCTGATTGGTGTAAGCTTCA AAGTTTTTAAAGTTTTCACGTATCCTCAGTTACTGGTAGATCTGGACTTGAAGATGCTCATTGATGCAGGTGAATTATCT GCATAGCCATGGGCTAGCACATACTGAGCTTAGATTGGAGAATGTTCATGTAAGCCCAATAGACAAACATGTTAAAGTAA GTAACCTTTTCTTATGTTCTTGTTGACATAAGTGATAAGTTTGTTCTCTCTTTGCTATTATGCCTAGTAGTTTATTTATG GCATTAATAAATATTTGCTGTTTTTAATGCAATATAGCTGAACACTTGAAGATACATTCGTCTTTTAGTGTGAAGCATGA TTGTGCACCAGCACGTGGTCACTAGATCTCTGGCATGTCTGAATGATATTTCATAGTTCCAATTTAATATGTTCTCAAAA CACAGATATGCTAAAATAACCAAGACTTTAGTTTCACCATGCGGTTTGATGTATGGTTGTATGAACATATAAACTGTGTC 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TTGCAGGATAGATATGGTTCTTATTGTCAGTCCATTTTCAGAACATATATTTTCTTATTCTTTTCAAGTTCATGTTCTTC TCTTCCAAAACATAATATATTTTAATTTCCTTTTGCTTTTATTCACTCAGAACTGGCTTAACATCCTACCTGGTCACTGG CGTCTCTTATACTGTACTGGAAGGCACATCGGTCTAACACTTCGTCAGCCTTCTCCGAGAATCCTCATCACTGATGTGTT TCTCACATTTGCACAAACTTCAGACTCCATTGATCCTGTGTTCTCTCTGACCTCAGACATTGGTTTCAAAATTATGGCAG AATCTGATTGGCCTCATGACAAATCTGGTAGCGAAGGAACATTATCTGTTACCTCATCTGCGAGGATAGCAACTGGAAGA ATTTATATTCACGAACAGGATGGTGATGATAGTAGGGTTGCATCTTCAAGATCTTCTAGGAGATACCTTCGTGGTAAGTG GAGAAAAGTTTCAAAAATGAAAGAGCTGCCTGCTAGCCTCCCCACAGTAAACATTACCATGGATGAACTCGACGTATCAA TGAGCTGCAGCTCGACTTTAAATGTCAGTTCTGCGCAGAAGGTGCTGCAAGAGATCCGCACTCAGACCCCGCCAGAAATG TTTGATTTATCAAAAATTGTTTGTGGGACATACGTTGATGCAAGGTTGATGATTCTTCGTGGTGTTAACGGGTCCGCGTT ATTTTTCACCAGATCAAATTCTAGAGCTGATTCCTGACGATAATCAGTGAAGCTTGTAACCAATATTCTTTGGGTGTACA TTCTTTGTATTTCTAGCTGTACATTATTCATAACTAGCAAATGTAAATAATAGAGTGTAAGCTAAATCTGTCAGTCATCC TTCCGAATCAGGAGAGAAATATGTTGCCGCTTTATTATTTGATCTTGGAAAATGAGTAAATGACGAATTGACGATGTCTA 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CATGGAGGCAAGCAGCTAATGTCAACCATGACGCACGATGCCAGTTGGCGATCTCTTCTGGGGACTACCTACATTTTGTG GACAAATTTTCTTCAAAAAAATTAATAGATGTAAATATAATACAATCGTGATTATAACTTGTATGTAACCTTCAAAAATC TCTCGGTAACATACTATTTTCATGAAACAG

______________________________________

CDS

>LOC_Os01g46720.1

ATGCCTGTCGTCGCGGCCGCCGCCGCCGCCGTCGCCGCCCGACCGACCGGGGCTGGCCCCGCGCGCCCCTTGCGCG GCGGCGTGTCCGCGCGCCCGTGCCGGCGGCGGGGGTTCCGGGCGGAGGCGAGCTCGTCGGCGTCAACGCCCGCGCCGGTG GCGGCGGATGAGGGGGCAGGAGCGGGGCCGTGCCCCGTCGTCAGGTTCGAGATGGGCGACTTCGACGTCGCTGACCGCGT CAGCGTCGGGCTCCACGGGCGGTCGGACGAGATGATCTTCGAGGCCACGGTGCGCGATCCGAGCAGTGAGCTGTACGGTT CGACGGTGGTGCTGCGGCAGCTGATGAGCTTTCAGGCGAAGCGCAGGGGCCGGCGCGCGCTGGAGGTGCTGAAGAAGCTG GCTCGCCGACAGATGATGTACCACTCTTACGCGATGCAGGTCCATGGATATGTTACTCCAGGCAATGACGTGGAGCAGGA CGATGGATCCTTCATCCTGGTGCACGGGTACCATGGGAGTTACTCTTTGCGCCACTGGTTGCAACTCTCTGATTGGCTTC CAACCTTAGAAGCAACATTAGCGTTGGATGAGGAACAAGTTAGGAGGGTAGGTGATGATTCAGTAGGAGGACCTGCTGTA ACCCGGCAGCTACGTCTAATCAGGATATTGATGAGAGACCTTCTGATTGGTGTGAATTATCTGCATAGCCATGGGCTAGC ACATACTGAGCTTAGATTGGAGAATGTTCATGTAAGCCCAATAGACAAACATGTTAAAGTTGGTATTCTTGGGAATGCTG TTGATTTTCATGACAATGATCCTAGAAATAGCACATTAGCAAGTAATGATGAAAGGAGAAAAATGATGATTGCATTTGAC ATGAGATGTGTTGGCTTTATCATGGCAAAGATGGTTCTGAGAGAGCTAATGGATTCTTCTACTTTCCTAAAATTCAAGTC ATTCTTGACAAAGGGAGATGACCCAGCATGTCTGCGTGAGTTCCTTTTACCTATTCTGTGCCGAAATTCTCCATCCGGGA ATATTGGTCTGCAGATGCTTGATCGACAATGGGGTGCTGGTTGGAATCTTTTGGCGTTATTGCTGGCAACAAAACCTGAC AAAAGGATAAGTTGTGTGGATGCATTGAGGCACCCCTTCCTTTGTGGACCTAAATGGCGCATAAATCCATCAGTTGATGT CATACGGTGGGGCTTGGGTTCTACTGCTGTCCGCATGGCTGAAGATTATATTTATGGACAGCATCAGCGTAGACGATTAG CATATTTTGTTGAATTGATGGAGGTGCTAAACCCTAATCCAAGAACAGAGAACTGGCTTAACATCCTACCTGGTCACTGG CGTCTCTTATACTGTACTGGAAGGCACATCGGTCTAACACTTCGTCAGCCTTCTCCGAGAATCCTCATCACTGATGTGTT TCTCACATTTGCACAAACTTCAGACTCCATTGATCCTGTGTTCTCTCTGACCTCAGACATTGGTTTCAAAATTATGGCAG AATCTGATTGGCCTCATGACAAATCTGGTAGCGAAGGAACATTATCTGTTACCTCATCTGCGAGGATAGCAACTGGAAGA ATTTATATTCACGAACAGGATGGTGATGATAGTAGGGTTGCATCTTCAAGATCTTCTAGGAGATACCTTCGTGGTAAGTG GAGAAAAGTTTCAAAAATGAAAGAGCTGCCTGCTAGCCTCCCCACAGTAAACATTACCATGGATGAACTCGACGTATCAA TGAGCTGCAGCTCGACTTTAAATGTCAGTTCTGCGCAGAAGGTGCTGCAAGAGATCCGCACTCAGACCCCGCCAGAAATG TTTGATTTATCAAAAATTGTTTGTGGGACATACGTTGATGCAAGGTTGATGATTCTTCGTGGTGTTAACGGGTCCGCGTT ATTTTTCACCAGATCAAATTCTAGAGCTGATTCCTGA

______________________________________

Protein

>LOC_Os01g46720.1MVVAAAAAAVAARTGAGARRGGVSARCRRRGRAASSSASTAVAADGAGAGCVVRMGDDV ADRVSVGHGRSDMIATVRDSSYGSTVVRMSAKRRGRRAVKKARRMMYHSYAMVHGYVTGNDVDDGSIVHGYHGSYSRHWS DWTATADVRRVGDDSVGGAVTRRIRIMRDIGVNYHSHGAHTRNVHVSIDKHVKVGIGNAVDHDNDRNSTASNDRRKMMIA DMRCVGIMAKMVRMDSSTKKSTKGDDACRICRNSSGNIGMDRWGAGWNAATKDKRISCVDARHCGKWRINSVDVIRWGGS TAVRMADYIYGHRRRAYVMVNNRTNWNIGHWRYCTGRHIGTRSRIITDVTATSDSIDVSTSDIGKIMASDWHDKSGSGTS VTSSARIATGRIYIHDGDDSRVASSRSSRRYRGKWRKVSKMKASTVNITMDDVSMSCSSTNVSSAKVIRTTMDSKIVCGT YVDARMIRGVNGSATRSNSRADS

Claims (4)

1.一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，其特征在于：所述长毛谷应用在强耐盐性地方，所述长毛谷包括显著提高长毛谷芽期耐盐性的耐盐主效基TSC。

2.根据权利要求1所述的一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，其特征在于：包括如下验证方法：

S1、将长毛谷的干种子浸泡在海水中30天后，仍能正常发芽，根和茎的长度都远远长于国际上公认的耐盐品种Pokkali；

S2、对3-4叶期的水稻幼苗用120mMNaCl溶液胁迫处理15天后，长毛谷黄叶数低于耐盐品种Pokkali。

3.根据权利要求2所述的一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，其特征在于：所述海水的全盐量2.19×104mg/L，盐浓度约为2％。

4.根据权利要求1所述的一个强耐盐性地方稻种长毛谷的应用，其特征在于：包括如下验证方法：

A1、设置3个盐NaCl浓度梯度，包括100mM、120mM、140mM，对长毛谷、Pokkali耐盐对照和浙辐802敏盐对照的干种子进行处理，10天后调查发芽率；

A2、长毛谷在100mM、120mM、140mM盐浓度下的发芽率分别为69％、48.67％、18.7％，而Pokkali耐盐对照的发芽率分别为30.6％、17.33％、0％，浙辐802敏盐对照的发芽率分别为13％、4.67％、0％；长毛谷在发芽期的耐盐性明显强于Pokkali耐盐对照，在120mMNaCl条件下根据发芽率和表型。

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