CN109554381B - 水稻基因OsGE61及其在水稻抗稻瘟病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水稻基因OsGE61及其抗稻瘟病的应用，该基因的开放阅读框长1884bp，编码一种类受体蛋白激酶，由627个氨基酸组成。本发明采用CRISPR/Cas9的方法对水稻基因OsGE61进行敲除，分别对野生型和敲除突变体植株进行稻瘟病菌接种实验，结果显示，敲除OsGE61明显提高了水稻植株对稻瘟病菌的抗性，表明该基因可用于选育或培育相关的抗病品种。

Description

水稻基因OsGE61及其在水稻抗稻瘟病中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻基因OsGE61及其在抗稻瘟病中的应用。
背景技术
水稻（Oryza sativa）是世界一半以上人口的主食。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病导致每年稻米产量损失10％至30％。
植物与病原微生物的相处过程中，不断产生一些复杂的免疫应答系统来抵御病原微生物的侵害，目前发现植物免疫系统至少包括2个层次：第一层为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）激发的免疫性（PAMP-triggeredimmunity，PTI），即植物通过细胞表面模式识别受体（PRRs）对病原菌的PAMPs 进行分子识别，从而启动植物的防卫反应；第二层为病原菌效应子激发的免疫性（Effector-triggeredimmunity，ETI），即有些毒性强的病原菌通过产生效应子（effectors）来抑制PTI，从而突破植物的第一道防线，而植物又进化出新的分子受体（例如R 基因编码的NBS-LRR 蛋白质）以侦察病原菌效应子并启动第二道防卫反应。ETI是特异性抗性，抗谱很窄，同时由于病原菌效应子的快速进化阻断了寄主的有效识别，因此，在农业中依赖于ETI的抗性基因防治措施通常是短暂的。与此相反，同一类病原菌中PAMPs在分子水平上是保守的，因此，PTI使植物拥有广谱抗性，同时抗性也是持久的。
目前已知的植物模式识别受体中，最重要的一类是类受体蛋白激酶（Receptor-Like protein Kinases, RLKs）。RLKs由一个胞外配体结合结构域、一个跨膜结构域和一个胞内激酶结构域组成。RLKs可以通过识别外界的信号，而激活下游的信号通路。植物中类受体激酶家族的成员具有十分明显的扩张，例如拟南芥基因组中拥有超过600个RLK基因家族成员而水稻基因组中含有有超过1100个RLK基因家族成员。植物RLKs参与了许多重要的生物学过程，包括激素应答，细胞分化，生长发育，自身不亲和，逆境的应答和病原物的识别等。
RLKs在植物对病原菌的识别过程中有着重要的作用。例如感应细菌鞭毛蛋白的拟南芥FLS2基因、感应延伸因子-Tu中的拟南芥EFR基因、抗细菌病原菌的水稻Xa21基因和几丁质识别受体中水稻OsCERK1基因等。
目前，并没有关于水稻类受体蛋白激酶OsGE61基因在水稻抗稻瘟病应用的报道。本发明研究发现，采用生物技术手段改变水稻OsGE61的表达水平，可提高水稻抗病能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻基因OsGE61及其在水稻抗稻瘟病中的应用，具体采用CRISPR/Cas9方法对OsGE61基因进行敲除，对作物进行遗传改良，培育出抗稻瘟病的转基因水稻。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种水稻基因OsGE61，其开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述水稻基因OsGE61编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种水稻基因OsGE61在水稻抗稻瘟病中的应用，其具体操作包括：选择合适的靶位点，构建OsGE61敲除载体，然后将重组质粒转化至根癌农杆菌中，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得OsGE61敲除突变体，对其进行稻瘟病菌喷雾接种和打孔接种。
上述靶位点的核苷酸序列为：
GE61-T1 SEQ ID NO.3 5’-AACTGGGACCAAGACTCCG-3’
GE61-T2 SEQ ID NO.4 5’- TGACCATGGTCCAGCTGCA-3’。
水稻基因OsGE61在水稻抗稻瘟病中的应用，敲除OsGE61基因明显提高水稻对稻瘟病的抗性。
本发明具有以下有益效果：
本发明的水稻基因OsGE61敲除之后，与野生型水稻相比显著提高了抗稻瘟的能力，该基因可用于选育或培育抗稻瘟病水稻抗病品种。
附图说明
图1中间载体SK-gRNA中OsU3: gRNA的结构图。
图2双元载体pC1300-Cas9中2×35S:Cas9的结构图。
图3 OsGE61敲除突变体的鉴定。 Reference：为参考基因序列；ge61-3和ge61-7分别为OsGE61基因不同位点纯合突变株系。
图4 喷雾接种6天调查结果。Guy11：稻瘟病菌Guy11 ；Yan8：亲本水稻盐稻8号 ；ge61-3和ge61-7分别为OsGE61基因不同位点纯合突变株系。
图5 打孔接种7天调查结果。Guy11：稻瘟病菌Guy11；Yan8：亲本水稻盐稻8号；ge61-3和ge61-7分别为OsGE61基因不同位点纯合突变株系。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1 OsGE61基因的获得
Harpin是植物细菌病原菌通过三型分泌系统分泌的一类主要定位于植物胞间质的外泌蛋白。Harpin蛋白外施于植物主要有三方面作用：提高抗病性、促进生长、诱导细胞死亡。利用Harpin蛋白喷施处理水稻幼苗，经转录组分析发现OsGE61受Harpin处理诱导转录上调。而水稻在接种毒性稻瘟菌株后不同时间点OsGE61的转录水平与对照处理相比呈现明显降低。据此，我们推测该基因在水稻生长与免疫反应激活之间具有重要调节作用。根据NBCI网站上对水稻品种日本晴基因组中该基因的预测cDNA序列（XM_015770104），我们成功从日本晴叶片总cDNA中克隆到OsGE61的开放阅读框全长1884bp，经测序发现与预测序列一致，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码一种类受体蛋白激酶，由627个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2 OsGE61敲除载体的构建
在OsGE61基因的开放阅读框编码区中选取两个靶位点（序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示），构建gRNA表达盒，然后将两个靶标gRNA表达盒连接到敲除载体pC1300-Cas9中，获得OsGE61敲除载体。详细载体构建方法参照专利“植物多基因敲除载体的构建及应用，ZL201510485573.2”，具体如下：
（1）靶标序列的选择及引物设计
在OsGE61基因的开放阅读框编码区中找含有5’-（N）X-NGG-3’结构的靶标序列，其中N表示A、T、C和G中的任意一个，X为19。根据以上原则设计两条靶标序列，分别为GE61-T1和GE61-T2，序列如：
GE61-T1 SEQ ID NO.3：5’-AACTGGGACCAAGACTCCG-3’
GE61-T2 SEQ ID NO.4：5’- TGACCATGGTCCAGCTGCA-3’
设计用于构建gRNA的引物对：在GE61-T1和GE61-T2正向序列前加GGCA获得引物GE61-T1F和GE61-T2F；在GE61-T1和GE61-T2反向互补序列前加AAAC，获得引物GE61-T1R和GE61-T2R。具体序列如下：
GE61-T1F SEQ ID NO.5：5’-ggcaAACTGGGACCAAGACTCCG-3’，
GE61-T1R SEQ ID NO.6：5’-aaacCGGAGTCTTGGTCCCAGTT-3’；
GE61-T2F SEQ ID NO.7：5’-ggcaTGACCATGGTCCAGCTGCA-3’，
GE61-T2R SEQ ID NO.8：5’-aaacTGCAGCTGGACCATGGTCA-3’。
（2）单个gRNA表达盒的构建：
SK-gRNA（图1）进行Aar I酶切(购自Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体，酶切反应体系如下：
ddH2O 32μL
10×buffer 5μL
50×oligonucleotide 1μL
Aar I 2μL
载体SK-gRNA（0.1μg） 10μL
总体积 50μL
37℃酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒（Biomed，DR0103）按产品说明书进行纯化；得线性载体SK-gRNA/Aar I。
100μM的引物GE61-T1F与GE61-T1R各20μL混合，100℃放置5分钟后置于室温，逐渐冷却，变性退火，形成带有粘性末端的片段。将载体和片段进行T4酶（购自NEB公司）连接，反应如下：
载体SK-gRNA/Aar I(30 ng) 1.5μL
10×T4 ligase buffer 1μL
退火产物 7μL
T4连接酶 0.5μL
总体积 10μL
室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用SK上的引物T7 SEQ ID NO.9：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’，测序确定克隆构建正确，获得gRNA表达盒SK-gRNA-1。同样利用引物对GE61-T2F/T2R的退火产物与线性载体SK-gRNA/Aar I连接获得SK-gRNA-2。
(3) SK-gRNA-1与SK-gRNA-2的聚合
利用BamH I和BglII是同尾酶的属性，进行两个SK-gRNA中间载体的聚合。SK-gRNA-1质粒用BamH I和KpnI双酶切，用Biomed胶回收试剂盒（Biomed，DR0103）按产品说明书进行纯化，得线性载体SK-gRNA-1/BamH I+KpnI。SK-gRNA-2质粒用BglII和KpnI双酶切，切胶回收约550bp大小的SK-gRNA-2/BglII+KpnI片段；将gRNA-2片段连入SK-gRNA-1载体的BamH I和KpnI识别位点间，获得SK-gRNA-1-gRNA-2质粒。
载体和片段进行T4酶（购自NEB公司）连接反应如下：
载体SK-gRNA-1/ BamH I +KpnI (30 ng) 1μL
片段SK-gRNA-2/ Bgl II +KpnI(25 ng) 1μL
10×T4 ligase buffer 1μL
ddH2O 6.5μL
T4连接酶 0.5μL
总体积 10μL
室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用SK上的通用引物T7 SEQ ID NO.9: 5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’和T3 SEQ ID NO.10: 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’ 菌落PCR检测克隆是否成功。当扩增得到约1.1Kb条带时，判定克隆成功；反之，则为克隆不成功。
（4）靶标gRNA表达盒与敲除载体pC1300-Cas9的连接
SK-gRNA-1-gRNA-2质粒用Bgl II和Kpn I双酶切，切胶回收约1.1 Kb大小的条带，将此片段连入pC1300-Cas9（图2）双元载体的Kpn I和BamH I识别位点间，得到最终敲除OsGE61的双元表达载体pC1300-Cas9- SK-gRNA-1-gRNA-2。
连接反应如下：
载体pC1300-Cas9/Kpn I+ BamH I (30 ng) 1μL
片段SK-gRNA-1-gRNA-2/ Bgl II +Kpn I(25 ng) 1μL
10×T4 ligase buffer 1μL
ddH2O 6.5μL
T4连接酶 0.5μL
总体积 10μL
室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。
用引物pC1300-F SEQ ID NO.11：5’-ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3’，GE61-T2R测序确定克隆构建正确。当测序结果与设计序列比对相符合时，判定构建正确；反之，则为构建不正确。
实施例3 OsGE61敲除突变体的获得
将测序正确的双元表达载体pC1300-Cas9-SK-gRNA-1-gRNA-2通过电击的方法转化到根癌农杆菌EHA105中，转化子验证无误后，进行水稻粳稻品种盐稻8号愈伤组织转化，以获得OsGE61基因敲除突变体水稻植株。
实施例4 OsGE61敲除突变体的验证
在OsGE61基因靶位点前后两端附近设计引物，引物序列分别为SEQ ID NO.12：5’-GGGTGTAAACTATGAAGGTT-3’和SEQ ID NO.13：5’-TGGTAGGTCAGCAAGTCAAA-3’，以OsGE61敲除突变体水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经测序比对，结果见图3所示，ge61-3 株系为纯合插入及单碱基替换，ge61-7为纯合缺失。
实施例5 OsGE61敲除突变体喷雾接种鉴定
将水稻盐稻8号和OsGE61的敲除突变体水稻植株置于人工智能培养箱培养3周分别喷雾接种稻瘟病菌Guy11孢子液（浓度约为1×105个/毫升），26℃黑暗保湿培养24小时后，转移到正常光照条件下继续培养，6天后调查发病情况。结果见图4所示，突变体的发病情况与野生型水稻相比明显减弱，表明对OsGE61基因进行敲除突变后，其对稻瘟病的抗性明显增强。
实施例6 OsGE61敲除突变体打孔接种鉴定
将水稻盐稻8号以及OsGE61的敲除突变体种植于人工智能培养箱，培养7周进行打孔接种。在距离叶尖1/3的位置用小型打孔器打孔，在叶片上面留下伤口即可（注意不要把叶片组织打断），以利于稻瘟菌侵染。取10μL稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液（浓度约为5×105个/毫升）滴在伤口处，然后用透明胶带将此处叶片包裹成小腔室。将接种过的水稻置于26℃黑暗保湿培养24小时后，转移到正常光照条件下继续培养，7天后调查发病情况。结果见图5所示，跟野生型水稻盐稻8号比较，OsGE61敲除突变体的叶片病斑明显变小，表明对OsGE61基因进行敲除突变后，其对稻瘟病的抗性明显增强，结果与实施例5相一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 水稻基因OsGE61及其在水稻抗稻瘟病中的应用
<130> 13
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1884
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcaatgg aggtggctct tgcggtttac tcactggtgt tgcttgcctc cttctccttc 60
ccttgcaggc ttgcaagtgc cctcctctct cccaagggtg taaactatga agtgcaagct 120
ctcatgatga tcaagacttc cctcaaggat cctcacggtg tgctcaagaa ctgggaccaa 180
gactccgtgg atccttgcag ctggaccatg gtcacttgct cacctgagaa ccttgtcact 240
ggcctggagg ctccaagcca gaatctttct ggcctgctct ccgcaagcat aggcaacttg 300
accaatcttg agatagttct tctgcagaac aacaacatca atggtccaat tccagaagag 360
attggcaggc taacaaaact caaaacactt gatctctcca gtaaccactt ctctggtgga 420
atcccaaact cagtaggcca cctcgaaagc ctccagtact tgaggctcaa caacaacacc 480
ctgtctggtg catacccttc atcatcagct aatttatcac agcttgtttt cctggacctt 540
tcgtataata atctgagtgg tccagtacct ggttctttgg caagaacgtt caatatagtg 600
gggaatccgt tgatctgtgc tgcgggtacg gaacatgatt gttatggaac tttaccaatg 660
ccgatgtcct acagcctgaa taatacacag ggtactctga tgccagcaaa atctaaaagc 720
cacaaggttg caattgcatt tggttctaca attggctgca tcagcttcct tatccctgtt 780
atgggattgc tgttctggtg gaggcatagg cgaaaccatc aaattctttt tgatgttgat 840
gagcaacaca cagagaatgt caacctagga aatgtgaaga ggtttcagtt cagagagctt 900
caggttgcaa cagagaactt cagcaataag aacatcttag gaaaaggcgg ctttggaaac 960
gtttaccggg gaaagctacc agatggaact gttgtagctg tcaagaggct gaaagatggt 1020
aatgctgcag gcgggcaggc acagtttcag actgaagttg agatgatcag cttggcgctt 1080
caccggaacc tcctcaggct ttatgggttc tgcatgactg ctactgagag gcttctggta 1140
tatccataca tgtcaaatgg gagtgtcgca ttgcgtctga aagggaagcc accattggac 1200
tggatcacca gacagaggat agcactcggt gcagcaagag gcctactgta cctgcacgag 1260
cagtgtgacc ccaagattat tcatagggac gtaaaggcag ccaacatatt gcttgatgac 1320
tactgtgaag ccattgttgg agattttggg cttgccaagc tcctagatca tcgtgactca 1380
catgtcacca cagctgtcag gggtaccgtt gggcacattg ccccggaata cctctccacc 1440
ggccagtcat ctgagaagac cgacgtcttt ggttttggaa ttctgctgct tgaattgatc 1500
actggtcaaa ctgcacttga atttgggaag tcatcaaatc agaagggagc catgctggac 1560
tgggtgaaga agatgcacca ggagaagaag ctcgacgtgc ttgtcgacaa gggcctgaga 1620
agcaactacg accgtgtcga gctggaggag atggtgcagg tggcactgct gtgcacccaa 1680
tatctccctg gtcacaggcc caggatgtca gaggtggtca ggatgctgga gggagatgga 1740
ctggcagagc ggtgggaagc atcccagcgc gctgactcac acaagttcaa agtgcctgag 1800
ttcaccttcg gtcgctgcta ctctgacctg acggatgact cgtcattgct ggtccaggca 1860
gtcgagctct ctgggccgag atga 1884
<210> 2
<211> 627
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Met Glu Val Ala Leu Ala Val Tyr Ser Leu Val Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ser Phe Ser Phe Pro Cys Arg Leu Ala Ser Ala Leu Leu Ser Pro Lys
20 25 30
Gly Val Asn Tyr Glu Val Gln Ala Leu Met Met Ile Lys Thr Ser Leu
35 40 45
Lys Asp Pro His Gly Val Leu Lys Asn Trp Asp Gln Asp Ser Val Asp
50 55 60
Pro Cys Ser Trp Thr Met Val Thr Cys Ser Pro Glu Asn Leu Val Thr
65 70 75 80
Gly Leu Glu Ala Pro Ser Gln Asn Leu Ser Gly Leu Leu Ser Ala Ser
85 90 95
Ile Gly Asn Leu Thr Asn Leu Glu Ile Val Leu Leu Gln Asn Asn Asn
100 105 110
Ile Asn Gly Pro Ile Pro Glu Glu Ile Gly Arg Leu Thr Lys Leu Lys
115 120 125
Thr Leu Asp Leu Ser Ser Asn His Phe Ser Gly Gly Ile Pro Asn Ser
130 135 140
Val Gly His Leu Glu Ser Leu Gln Tyr Leu Arg Leu Asn Asn Asn Thr
145 150 155 160
Leu Ser Gly Ala Tyr Pro Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gln Leu Val
165 170 175
Phe Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Ser Gly Pro Val Pro Gly Ser
180 185 190
Leu Ala Arg Thr Phe Asn Ile Val Gly Asn Pro Leu Ile Cys Ala Ala
195 200 205
Gly Thr Glu His Asp Cys Tyr Gly Thr Leu Pro Met Pro Met Ser Tyr
210 215 220
Ser Leu Asn Asn Thr Gln Gly Thr Leu Met Pro Ala Lys Ser Lys Ser
225 230 235 240
His Lys Val Ala Ile Ala Phe Gly Ser Thr Ile Gly Cys Ile Ser Phe
245 250 255
Leu Ile Pro Val Met Gly Leu Leu Phe Trp Trp Arg His Arg Arg Asn
260 265 270
His Gln Ile Leu Phe Asp Val Asp Glu Gln His Thr Glu Asn Val Asn
275 280 285
Leu Gly Asn Val Lys Arg Phe Gln Phe Arg Glu Leu Gln Val Ala Thr
290 295 300
Glu Asn Phe Ser Asn Lys Asn Ile Leu Gly Lys Gly Gly Phe Gly Asn
305 310 315 320
Val Tyr Arg Gly Lys Leu Pro Asp Gly Thr Val Val Ala Val Lys Arg
325 330 335
Leu Lys Asp Gly Asn Ala Ala Gly Gly Gln Ala Gln Phe Gln Thr Glu
340 345 350
Val Glu Met Ile Ser Leu Ala Leu His Arg Asn Leu Leu Arg Leu Tyr
355 360 365
Gly Phe Cys Met Thr Ala Thr Glu Arg Leu Leu Val Tyr Pro Tyr Met
370 375 380
Ser Asn Gly Ser Val Ala Leu Arg Leu Lys Gly Lys Pro Pro Leu Asp
385 390 395 400
Trp Ile Thr Arg Gln Arg Ile Ala Leu Gly Ala Ala Arg Gly Leu Leu
405 410 415
Tyr Leu His Glu Gln Cys Asp Pro Lys Ile Ile His Arg Asp Val Lys
420 425 430
Ala Ala Asn Ile Leu Leu Asp Asp Tyr Cys Glu Ala Ile Val Gly Asp
435 440 445
Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Asp His Arg Asp Ser His Val Thr Thr
450 455 460
Ala Val Arg Gly Thr Val Gly His Ile Ala Pro Glu Tyr Leu Ser Thr
465 470 475 480
Gly Gln Ser Ser Glu Lys Thr Asp Val Phe Gly Phe Gly Ile Leu Leu
485 490 495
Leu Glu Leu Ile Thr Gly Gln Thr Ala Leu Glu Phe Gly Lys Ser Ser
500 505 510
Asn Gln Lys Gly Ala Met Leu Asp Trp Val Lys Lys Met His Gln Glu
515 520 525
Lys Lys Leu Asp Val Leu Val Asp Lys Gly Leu Arg Ser Asn Tyr Asp
530 535 540
Arg Val Glu Leu Glu Glu Met Val Gln Val Ala Leu Leu Cys Thr Gln
545 550 555 560
Tyr Leu Pro Gly His Arg Pro Arg Met Ser Glu Val Val Arg Met Leu
565 570 575
Glu Gly Asp Gly Leu Ala Glu Arg Trp Glu Ala Ser Gln Arg Ala Asp
580 585 590
Ser His Lys Phe Lys Val Pro Glu Phe Thr Phe Gly Arg Cys Tyr Ser
595 600 605
Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ser Leu Leu Val Gln Ala Val Glu Leu Ser
610 615 620
Gly Pro Arg
625
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> GE61-T1
<400> 3
aactgggacc aagactccg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> GE61-T2
<400> 4
tgaccatggt ccagctgca 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> GE61-T1F
<400> 5
ggcaaactgg gaccaagact ccg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> GE61-T1R
<400> 6
aaaccggagt cttggtccca gtt 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> GE61-T2F
<400> 7
ggcatgacca tggtccagct gca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> GE61-T2R
<400> 8
aaactgcagc tggaccatgg tca 23
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> T7
<400> 9
taatacgact cactatagg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> T3
<400> 10
attaaccctc actaaaggga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> pC1300-F
<400> 11
acactttatg cttccggctc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gggtgtaaac tatgaaggtt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tggtaggtca gcaagtcaaa 20

Claims (2)

1.水稻基因OsGE61在增强水稻对稻瘟病菌的抗性中的应用，其特征在于：所述水稻基因OsGE61其开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的水稻基因OsGE61在增强水稻对稻瘟病菌的抗性中的应用，其特征在于：通过CRISPR/Cas9敲除制备突变体，靶点序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
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Citations (2)

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CN103361324A (zh) * 2012-03-28 2013-10-23 中国科学院微生物研究所 一种与水稻稻瘟病抗性相关的蛋白及其编码基因与应用
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Title
Predicted: Oryza sativa japonica group LRR receptor kinase SERL2-like (LOC4330602),mRNA;Oryza;《Genbank登录号XM_015770104.2》;20180807;参见全文 *
水稻类受体激酶OsBRR1对稻瘟病抗性分析;李亚栋，等;《华北农学报》;20110831;第26卷(第4期);第27-31页 *

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