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本发明涉及一种玉米油份含量相关的SNP位点及其应用，属于植物分子育种领域。玉米参考基因组(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr3.S_166664152的SNP与玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因紧密连锁，并且与玉米油份含量显著相关。本发明的位点可用于高油玉米分子标记辅助育种，克服了常规育种周期长、后期筛选工作量大、对品种或品系进行鉴定的效率低等缺陷和不足。

Description

一种玉米油份含量相关的SNP位点及其应用
技术领域
本发明涉及一种玉米油份含量相关的SNP位点及其应用，属于玉米育种和分子生物学领域。 
背景技术
高油玉米的籽粒油份含量超过6％，高油玉米不仅是人类健康食品与优质动物饲料，而且还是重要的工业原料。玉米油富含较多的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，对人体健康具有重要作用，因此又称为健康油。 
油份在玉米籽粒中以三酰甘油的形式存在，包括软脂酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、月桂酸(C12:1)、豆蔻酸(C14:1)、棕榈油酸(C16:1)、花生酸(C20:1)、三嵛酸(C22:1)、芥子酸(C22:2)、甘四烷酸(C24:1)。其中最具商品价值的脂肪酸组分为软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。玉米油的品质主要由饱和(C16:0、C18:0)与不饱和脂肪酸(C18:1、C18:2、C18:3)的比例决定。 
玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附连三个脂肪酸的形式存在。其基本过程：乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰单酰辅酶A.这是脂肪酸合成的第一关键步骤，也是调控整个脂肪酸合成的限速步骤。然后脂肪酸合成酶(FAS)以丙二酰单酰辅酶A为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加2个碳链的频率合成酰基碳链。而不断增加的酰基碳链又与酰 基载体蛋白(ACP)结合，ACP负责转运脂肪酸合成途径中的中间产物。经过数次聚合反应后，脂肪酸的合成在酰基-ACP硫酯酶或酰基转移酶的作用下终止。终止聚合反应后，不同碳链长度的酰基ACP，在酰基辅酶A合成酶的作用下生成酰基辅酶A，并从质体转运到内质网或胞质中。最后利用储存在胞质中的酰基辅酶A，在内质网中通过3种不同的酰基转移酶(甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT、溶磷脂酸酰基转移酶LPAAT、二酰甘油酰基转移酶DGAT)。在甘油上附连脂肪酸以合成三酰甘油，并储存在不连续分布的亚细胞器油体中。另外，脂肪酸合成后经过不同的修饰方式合成长链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。 
植物的脂肪酸的合成发生在质体中，有乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和脂肪酸合成酶(FAS)催化合成。植物FAS是一个由多个独立蛋白构成的酶体系。其中酮酰-ACP合成酶III(KASIII)催化C4酰基的形成，C4～C16的聚合由酮酰-ACP合成酶I(KASI)催化，C16～C18最后2个碳的聚合由酮酰-ACP合成酶II(KASII)催化。 
植物TAG的合成主要在内质网上，由甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT、溶磷脂酸酰基转移酶LPAAT、二酰甘油酰基转移酶DGAT催化合成。植物脂肪酸的修饰主要指脂肪酸的链延长延伸和脱饱和。脂肪酸每2个碳的延伸由4步催化完成，其中脂肪酸延伸酶(FAE)是脂肪酸眼神的第一关键限速酶。植物中饱和脂肪酸的主要成分是棕榈酸(C16:0)。棕榈酰ACP在脂肪酸代谢途径中是一关键物，其碳链 既能被KASII进一步延长，也可以在乙酰ACP硫酯酶(TE)作用下脱ACP形成棕榈酸并转化为贮存态油。植物不饱和脂肪酸的主要成分是油酸和亚油酸。油酸是硬脂酸脱饱和酶以硬脂酸为底物催化形成，发生在植物质体中，是植物不饱和脂肪酸合成的第一步。植物从油酸——亚油酸——亚麻酸的脱饱和在质体和内质网两个细胞器中完成。在质体中分别由Ψ-6油酸脱饱和酶(FAD6)和Ψ-3油酸脱饱和酶(FAD7/FAD8)催化完成，在内质网中分别由Δ-12油酸脱饱和酶(FAD2)和Δ-15油酸脱饱和酶(FAD3)催化完成。 
目前随着基因组测序技术、生物信息学的高速发展，全基因组关联分析成为挖掘和剖析玉米油份相关基因及其遗传基础是最有效的方法之一。玉米遗传学家在全基因水平上挖掘玉米油分相关基因，开发功能分子标记，加快高油玉米的定向遗传改良。 
发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的： 
AM508群体：由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成(所述的群体材料，均为常见的玉米市售材料，可通过常规商业渠道购买得到)。候选基因重测序材料：155份我国骨干自交系材料。从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73.8±0.7百万碱基，共产生了2445.9Gb的原始数据。 
全基因关联分析：以AM508群体为材料，利用Illumina MaizeSNP50BeadChip对56，110个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73.8±0.7百万碱基，共产生了2445.9Gb的原始序列。 
使用高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N＝1.78×10-6以及5％基因组显著性阈值为：0.05/N＝8.94×10-8)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于0.02的标记。在定位到的单一的显著性信号中。 
利用368份材料关联分析结果发现，其位于玉米基因组chr3.S_166664152的SNP位点，突变为C/G。其中C为主要等位基因，G为最小等位基因，最小等位基因频率为0.08，该位点与玉米油分含量显著相关，解释7.43％的表型变异。 
具体实施方式
AM508群体：由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成，已在参考文献Yang，X.H.et al.Characterization of a global germplasm collection and its potential utilization for analysis of complex quantitative traits in maize.Mol.Breeding 121，417-431公开过。 
候选基因重测序材料：155份我国骨干自交系材料，已在参考文献Yang，X.H.et al.Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection.Theor.Appl.Genet.121，417-431(2010a).公开过。 
转录组测序材料：从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73.8±0.7百万碱基，共产生了2445.9Gb的原始数据。 
表型变异 
AM508群体包含508个自交系(其中包括35个高油品系)油含量相关的变异丰富，软脂肪酸含量差异2.3倍，硬脂肪酸含量差异达8倍。软脂肪酸(16:0，15.7％)、硬脂肪酸(18:0，2.1％)、油酸(18:1，28.0％)、亚麻油酸(18:2，51.2％)和亚麻酸(18:3，1.4％)这五种脂肪酸占98.4％的油含量。4个环境联合检测发现十个油份相关性状的遗传力均在90％以上。 
全基因关联分析 
以AM508群体为材料，利用Illumina MaizeSNP50BeadChip对56，110个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73.8±0.7百万碱基，共产生了2445.9Gb的原始序列。 
研究使用了106万个高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性 混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N＝1.78×10-6以及5％基因组显著性阈值为：0.05/N＝8.94×10-8)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于0.02的标记。在定位到的单一的显著性信号中，有若干个位点位于或者临近于(50Kb)被前人证实报道过的已知基因内，它们在本研究中再次得到了验证。与已知的油脂代谢相关基因较远的关联位点很可能是与油脂代谢相关基因紧密连锁，则距离最近的油脂代谢基因很可能就是本研究的候选基因。 
利用368份材料关联分析结果发现，其位于玉米基因组chr3.S_166664152的SNP位点，突变为C/G。其中C为主要等位基因，G为最小等位基因，最小等位基因频率为0.08，该位点与玉米油分含量显著相关，解释7.43％的表型变异，该位点与玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因紧密连锁。 
a表中给出的基因的名称是所定位的显著位点内的极可能相关的功能候选基因或者与最显著关联SNP(主效SNP)最近的已注释基因。 
b主效SNP的位置根据玉米5a.60版本的参考序列确定(www.maizesequence.org) 
c在检测到的显著的油脂相关性状中最显著相关的性状。 
e主等位基因(第一个)，次等位基因以及次等位基因频率 
f线性混合模型的计算过程使用tassel软件完成 
j所有的候选基因基于Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro)所注释的基因。 

Claims (3)

1.一种玉米油份含量相关的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点与玉米油份含量相关，与玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因紧密连锁，位于玉米参考基因组(www.maizesequence.org，5a.60版)chr3.S_166664152上，该位点突变为C/G。 
2.如权利要求所述的SNP位点的应用，其特征在于包括以下步骤： 
a)由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成AM508群体； 
b)从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序； 
c)利用3个群体进行连锁分析：高油玉米自交系By804与普通玉米自交系B73衍生的重组自交系，利用包含1536个SNP标记的GoldenGate芯片对家系及其亲本进行基因型鉴定，利用Mapmaker3.0软件构建连锁图，采用复合区间作图法进行QTL定位； 
d)结合F2、F2:3两个世代群体油份含量的测定结果，利用软件QTL cartographer V2.5，采用复合区间作图法筛选与油份含量紧密连锁的QTL位点；筛选到在F2和F2:3两个世代均能稳定表达的油份含量主效QTL。 
3.如权利要求1或2所述的玉米油份含量相关的SNP位点在玉米育种的应用。 
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