CN111454987A - GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用。所述应用包括利用基因超表达或基因沉默的方法，通过调节GhNAC091基因的表达量，进而调节植物光合利用效率和植物的强光耐受能力；GhNAC091基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明研究结果表明，GhNAC091基因对棉花和拟南芥的光合利用及抗强光胁迫均有显著调节作用。构建GhNAC091基因的超表达载体或病毒诱导沉默载体，利用转基因技术，农杆菌介导转化植株，可获得光合利用率或强光耐受能力有所变化的植物新品种。

Description

GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用

技术领域

本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用。

背景技术

陆地棉（Gossypium hirsutum）属于被子植物门，原始花被亚纲，锦葵目，锦葵科，木槿族，棉属，是我国农民增产增收的主要经济作物之一。陆地棉与海岛棉是世界范围内广泛种植的两类四倍体棉花，而陆地棉由于其高产和较高的纤维品质占据80%以上的种植范围。

随着人口的增长，城市化进程的加速，我国可用耕地面积正在逐渐减少。另一方面，随着人们生活水平的日益提高，对农产品的质量要求正日益提高。棉花为喜光植物，但是我国大部分地区的棉花主栽品种光能利用率普遍较低，而且在强光（HL，height light）胁迫环境下，棉花作物光合作用受到抑制，产量显著下降。

NAC类蛋白是近年来发现的一类植物特有、种类众多的转录因子家族，其成员广泛分布于陆生植物中。NAC家族成员的N端具有一个保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域，含有A、B、C、D、E五个亚结构域，C端具有一个高度变异的转录激活区。研究表明，NAC类转录因子具有诸多方面的功能，如参与植物次生生长，在细胞分裂和植株衰老中发挥作用，参与激素调控和信号传导，参与矿质元素营养和农作物品质改良等。同时，NACs还参与生物胁迫中植物的防御反应，以及在非生物逆境中发挥作用：如拟南芥的NAC类转录因子ATAFI可受干旱和ABA处理而表达增强；在ATAFI的T-DNA插入系atafI-I和atafI-2后植株干旱相应恢复率较野生型高7倍多（Lu PL, Chen NZ, ect. Novel drought-inducible gene,ATAFI,encode a NAC family protein that negatively regulates the expression ofstress-responsive genes in Arabidopsis.Plant MolBiol, 2007,63(2):289~305）；又如Hu等在水稻中鉴定出SNAC2受干旱、盐、冷、机械损伤和ABA处理的诱导，在日本晴粳稻中花-11中，所有野生型植株在低温（4~8摄氏度下维持5天）条件下死亡，而SNAC2超表达植株存活率达到50%以上；且转基因植株在高盐下具有较高的萌发率和生长率；该研究还表明很多胁迫响应基因表达会受SNAC2基因的调控，如过氧化氢酶、鸟氨酸转移酶、重金属结合蛋白、Na/H泵、熱激蛋白、GDSL-like脂肪酶和苯丙氨酸裂解酶等（Hu H, You J, ect.Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salttolerance in rice. Plant Mol Biol. 2008,67(1/2):159~181）。

GhNAC091基因属于陆地棉中的NAC类转录因子家族。通过发明人对陆地棉幼苗强光胁迫条件进行处理时发现，GhNAC091基因能响应强光胁迫并可能参与强光胁迫下棉花光高效利用过程，这在此前的研究发现中从未报到。因此是否可利用转基因手段，通过获得GhNAC091基因来提高植物光合利用率和强光耐受能力是本发明想要解决的技术问题。

发明内容

本发明的技术目的是提出GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用，从而解决现有技术中部分植物品种光合效率低，受强光胁迫后耐受性较弱的问题。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

GhNAC091基因在调节植物光合利用效率和强光耐受中的应用，所述应用包括利用基因超表达或基因沉默的方法，通过调节GhNAC091基因的表达量，进而调节植物光合利用效率和植物的强光耐受能力；GhNAC091基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述应用包括构建含有GhNAC091基因的超表达载体，通过转基因技术获得GhNAC091基因超表达材料，最终培育获得高光合利用率和强光耐受的转基因植物新品种。

优选的，所用基因超表达的方法包括：将35S::GFP载体与GhNAC091基因通过基因重组制备重组载体；GhNAC091基因扩增所用引物序列为：

F：AAGCTCCTCGACTCTAGGGCCCATGAACACAGTTAAAGGTTTCAG

R：GTTCTTCTCCTTTACTCTCGAGCTGCTGGTAGCTGATACTTCC。

优选的，所用载体为35S::VIP:GFP。

优选的，所用基因沉默的方法包括：利用VIGS技术，根据GhNAC091基因的特异性区域设计引物扩增GhNAC091基因沉默片段，将GhNAC091基因沉默片段与植物VIGS载体通过基因重组制备重组载体；GhNAC091基因沉默片段扩增过程所用引物序列为：

F：GAATTCCCGGCATTGAGAGTTATGCC

R：CTCGAGTCAACATCATCTGGGTTGGTGA。

进一步优选的，所用植物VIGS载体为pTRV2。

优选的，上述植物种类为棉花、拟南芥或烟草。

本发明揭示了GhNAC091基因在植物光高效利用和降低光损伤上具有重要的应用价值，其通过影响叶黄素循环中关键酶玉米黄质环氧化酶（ZE）和紫黄质脱环氧化酶(VDE)的表达进而影响植株过剩光能的耗散，最终影响植物的光合利用效率和强光耐受的能力。本发明研究结果表明，GhNAC091基因对棉花和拟南芥的光合利用及抗强光胁迫均具有显著调节作用，通过构建GhNAC091基因的超表达载体或病毒诱导沉默载体，利用转基因技术，农杆菌介导转化植株，可获得光合利用率或强光耐受能力有所变化的植物新品种。

附图说明

图1为GhNAC091基因在烟草中的瞬时表达定位；

图2为VIGS体系验证和GhNAC091基因沉默检验实验结果；

图3为不同条件下植株的叶绿体荧光表型差异、Fv/Fm随时间变化和不同脉冲梯度下NPQ值对比；其中，A为光强200μmol·m^-2·s^-1（CK）与1800 μmol·m^-2·s^-1强光处理后叶绿体荧光表型差异，B为光照后不同时间的Fv/Fm值对比；C表示不同脉冲梯度下NPQ值变化曲线；

图4为强光照射48h后不同植株叶片的表型对比；

图5为不同植株核黄素循环关键酶基因表达量测定结果；A为玉米黄质环氧化酶（ZE）基因表达量测定结果，B为紫黄质脱环氧化酶(VDE)的基因表达量测定结果；

图6为不同条件下超表达材料与野生型拟南芥Fv/Fm和NPQ对比；其中，A为野生型Col-0和GhNAC091转基因超表达材料在1200 μmol·m^-2·s^-1强光处理后叶绿体荧光的表型差异；B为二者在不同强度的脉冲光下NPQ值的变化对比；上图为正常光照，下图为1200 μmol·m^-2·s^-1强光处理。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

本发明所用试剂及仪器均为普通市售，或本领域技术人员通过公开途径可获得的产品。

发明人通过对陆地棉测序标准系TM-1进行强光处理后发现，在照射强光后部分转录因子表达基因、活性氧相关基因以及E3泛素链接酶相关基因的表达量出现相对显著的变化。通过定量分析实验验证这些显著变化基因表达量的正确性，选取其中表达量显著的基因进行拟南芥遗传转化，获得了转基因超表达材料。然后通过叶绿素荧光仪器分析照射强光后叶绿素荧光参数Fv/Fm、NPQ的变化情况，最终筛选获得几组强光耐受基因；

其中，强光耐受表型最显著的一个基因为GhNAC091，全长1545bp，具体基因序列如SQEID NO.1所示。通过在棉花功能基因组数据库CottonFGD（http://www.cottonfgd.org）中检索，结果显示该基因与NAC类的转录因子Gh_A07G1811序列一致。

实施例1 GhNAC091基因在细胞中的表达及功能性定位

由于现有技术中缺少关于NAC类的转录因子Gh_A07G1811在亚细胞水平定位的相关报，针对前期获得的GhNAC091基因，发明人首先对其进行细胞内表达定位，具体过程如下：

1）基因扩增

将陆地棉测序标准系TM-1在23℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光强约为100 μmol·m^-2·s^-1的培养箱中生长约4周，剪取其真叶，液氮快速冷冻后-80℃保存。提取真叶中总RNA，用转录试剂盒（诺唯赞公司R211-01）反转录获得高纯度cDNA模板；

设计GhNAC091基因的克隆引物，上下引物游5’端酶切位点为KpnⅠ；所用扩增引物为序列如下：

F：GGTACCATGAACACAGTTAAAGGTTTCA

R：GGTACCCTGCTGGTAGCTGATACTTC

以上述cDNA为模板，采用PCR技术扩增GhNAC091基因序列。反应体系为：ddH₂O 18 μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，dNTP 1μl，上游引物2μl，下游引物2μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，模板1μl。PCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 15sec、58℃15sec、延伸72℃ 2min，30个循环，彻底延伸72℃ 5min。反应完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物，结果发现所得样品条带出现在1500bp条带附近，符合GhNAC091基因大小。将上述基因扩增产物利用PCR纯化试剂盒进行纯化。

2）35S::GhNAC091:GFP重组载体构建

利用35S::1300:GFP载体（本实验室保藏，可通过普通市售获得）和GhNAC091基因构建重组载体。

GhNAC091基因的酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×L buffer 3μl，KpnⅠ（Takara公司）2μl，基因15μl；35S::1300:GFP载体的酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×L buffer 5μl，KpnⅠ2μl，载体15μl。酶切程序37℃，3h。将检测正确的酶切后基因片段和载体片段进行酶连，酶连条件为：solutionⅠ（Takara公司）5μl；35S::1300:GFP载体和GhNAC091基因按摩尔比1:3连接，总体积5μl；酶连条件：16℃过夜酶连。

将上述重组载体转入大肠杆菌感受态细胞Trans T-1（全式金）。转化后细胞在50mg/l卡那抗性平板培养12h；挑取菌斑进行菌落PCR，并将PCR进行凝胶电泳鉴定；扩增序列与GhNAC091基因序列一致的菌落即为阳性菌落。挑取阳性单菌落于含50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。提取质粒，并进行核酸测序，序列正确的重组载体进行后续实验。

3）农杆菌介导的细胞定位表达

将上述鉴定正确的重组载体35S::GhNAC091:GFP通过农杆菌热激转化法转入农杆菌GV3101感受态细胞（唯地AC1001）；挑取单菌落通过菌落PCR进行阳性菌落鉴定。挑取鉴定出的阳性单菌落于5ml YEP培养基（包含50mg/l卡那霉素和50mg/l 利福平）28℃，220rpm培养约36h。所得农杆菌菌液按照500μl 菌液和500μl 50%甘油加入1ml EP管中，混匀后液氮速冻，-80℃保存备用。

将35S::GhNAC091:GFP农杆菌与携带细胞核定位指示载体H2B:mCherry的农杆菌（本实验室保藏，也可通过普通市售或常规方法制备）各30μl，分别加入5ml YEP液体培养基（50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平）中，28℃，220rpm过夜小摇。转大摇时，将5ml菌液倒入50ml含相同抗性的YEP培养基，培养基中包含10nM MES （2-(N-吗啉)乙磺酸）和10mMMgCl₂；继续培养至菌液OD值在0.6-0.8。

将两种农杆菌室温下5000rpm集菌15min。用10nM MES，10mM MgCl₂和200μM AS（乙酰丁香酮）配置的重悬液重悬，最终重悬液OD₆₀₀=1.0，室温静止2-3h。将35S::GhNAC091:GFP农杆菌与H2B:mCherry的农杆菌同体积混合，使用不带针头的2.5ml医用注射器将混合菌液注射6周左右的本氏烟草叶片下表皮；21℃左右培养2d后使用激光共聚焦显微镜观察烟草注射区域叶片荧光，结果如图1所示。

从图中可以看出，在激发光488nm条件下可以看到的GFP:GhNAC091定位的绿色荧光，而在激发光543nm下可以看到H2B:mCherry标记的细胞核红色荧光，GFP:GhNAC091荧光和H2B:mCherry荧光位置重合，重合位点显示为黄色荧光，说明GhNAC091基因是在细胞核中表达并行使功能。

实施例2 GhNAC091基因功能验证

为了研究GhNAC091基因在植物光合利用及植物强光耐受方面的功能，发明人利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术构建GhNAC091基因沉默植株，并对照基因沉默植株与野生型植株对强光照射后的培养效果，具体过程如下：

1）载体构建

根据GhNAC091基因在陆地棉TM-1中的特异性区域，设计VIGS片段的扩增引物，具体引物序列如下所示：

F：GAATTCCCGGCATTGAGAGTTATGCC

R：CTCGAGTCAACATCATCTGGGTTGGTGA

以TM-1 cDNA为模板扩增GhNAC091基因VIGS片段，反应体系为：ddH₂O 18 μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，dNTP 1μl，上游引物2μl，下游引物2μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，模板1μl。反应条件为：95℃ 3min，95℃ 15sec、58℃15sec、延伸72℃ 30sec，30个循环，彻底延伸72℃ 5min。扩增后用凝胶电泳检测基因沉默片段大小，并将所得基因进行纯化。

将所得VIGS片段与pTRV2载体用限制性酶（Takara）进行酶切，然后进行酶连获得基因沉默重组载体TRV:GhNAC091，酶连体系为： Solution Ⅰ（Takara）5μl，VIGS酶切片段4μl，pTRV2酶切片段1μl；反应体系于16℃水浴锅中过夜反应。将所得重组载体TRV:GhNAC091转入大肠杆菌感受态细胞，具体过程参照实施例1；通过测序获得表达正确的阳性质粒，然后将其转入GV3101农杆菌感受态细胞，获得携带TRV:GhNAC091农杆菌，具体过程参照实施例1。

2）基因沉默植株的获取

采用与实施例1相同的方法分别制备携带TRV:GhNAC091、TRV:00（空载体）、TRV1:00（诱导载体）和TRV:CLA(叶绿素合成基因沉默载体)的农杆菌重悬液，其中小摇转大摇后，YEP培养基中加入10mM MES和20μM AS；所用重悬液buffer配方为：10mM MES，150μM AS，10mMMgCl₂。将得到的TRV1:00重悬液分别与等体积TRV:CLA、TRV:00和TRV:GhNAC091重悬液进行混合，从而获得TRV:CLA、TRV:00和TRV:GhNAC091农杆菌侵染液。所得侵染液使用前于28℃120rpm培养箱中活化1h。

将TRV1:CLA、TRV:GhNAC091、TRV:00侵染液分别注入生长至两叶一心时期棉花子叶下表面，注射后25℃避光处理24h，然后正常培养2周左右。观察注射含有叶绿素合成基因沉默载体TRV1:CLA的棉花真叶变白（图2A），说明上述侵染液对棉花实现有效侵染，实验体系正常。

分别将TRV:GhNAC091、TRV:00棉花放置于200μmol·m^-2·s^-1正常光强（CK）和1800μmol·m^-2·s^-1强光下培养3h和6h，剪取棉花真叶，提取RNA并获取cDNA序列，基因扩增后使用相对表达量计算公式2^-ΔΔCT计算基因的相对表达量，以GhUBQ7作为内参基因，定量引物序列如下；

F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC；

R：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。

qRT-PCR分析结果如图2B所示；结果显示正常光照处理后，GhNAC091基因在GhNAC091基因沉默植株中的表达量相比对照TRV:00植株下降；当给予3h和6h强光处理后，TRV:00植株中GhNAC091基因被显著诱导表达，而TRV:GhNAC091植株中GhNAC091基因诱导表达量则依旧较低，说明沉默GhNAC091基因实验正常。

3）基因沉默植株对强光处理的反应

将正常生长至3片真叶期的TRV:GhNAC091和TRV:00棉花植株放置在同一光源下，保持最上层叶片所受光强基本一致。设定强白光光强分为1800μmol·m^-2·s^-1，以光强200μmol·m^-2·s^-1为对照（CK），光照时间分别为3h和6h，其它生长条件保持一致。光照处理后，黑暗处理20min，迅速剪取植株真叶，上表皮朝上平铺在1%的琼脂糖凝胶上，用叶绿素荧光仪检测棉花叶片最大潜在光和效率Fv/Fm和非化学荧光淬灭值NPQ，其中测量NPQ所用的不饱和脉冲光梯度为0，100，250，500，750，1000。

实验结果如图3所示为CK与1800 μmol·m^-2·s^-1强光处理后不同植株叶绿体表型荧光差异、Fv/Fm随时间变化和不同脉冲梯度下NPQ值对比。其中，A显示叶绿体表型荧光差异，B为光照后不同时间的Fv/Fm值对比；C表示不同脉冲梯度下NPQ值变化曲线。

叶绿素荧光参数Fv/Fm代表植物最大潜在的光合效率；植物在进行光合作用时如果接收的光能过剩，会引起植物光合效率下降，甚至光抑制，因此对于植物的光合作用而言并非光照强度越高、光照时间越长而对植物更有利，采用Fv/Fm值反应了植物的有效光合效率，Fv/Fm值越大则代表植物的光合效率越高。NPQ代表非光化学淬灭的量；热耗散被认为是植物保护光合系统免受过剩光能损伤的主要机制，NPQ的值越大表示植物光能损耗的越多，植物抵抗强光胁迫的能力越强。

从图3可以看出，在正常光照强度（200μmol·m^-2·s^-1）照射后，TRV:GhNAC091和TRV:00棉花植株的叶绿素荧光参数Fv/Fm值无明显差异。而当光照强度为1800μmol·m^-2·s^-1时，TRV:GhNAC091和TRV:00棉花植株的Fv/Fm值均出现显著下降；TRV:GhNAC091植株的Fv/Fm值下降随时间变化更显著，低于同等条件下的对照植株，说明GhNAC091基因沉默影响了植株的最大潜在光合效率，表现出对强光胁迫的高敏感性。从非化学荧光淬灭值NPQ值来看，TRV:GhNAC091在不同光照和光强条件下其NPQ值均显著低于对照植株，说明GhNAC091基因沉默植株的热耗散能力受到抑制，表现出对强光胁迫较差的抵御能力。

为了更直观的对比TRV:GhNAC091和TRV:00棉花植株对强光胁迫的表征，将4片真叶期的棉花植株放置在叶上表面光强为1800μmol·m^-2·s^-1的光源下，照射48h，照射后叶片表型对比如图4所示。从图中可以看出，强光照射后TRV:00和TRV:GhNAC091植株叶片均表现干枯、发白的现象，而TRV:GhNAC091株系的叶片发白程度明显高于TRV:00。

上述结果表明，与正常棉花植株相比，GhNAC091基因沉默植株的最大潜在光合效率更低，热耗散能力更差，对于强光胁迫表现出更低的抵抗能力，这说明GhNAC091基因在提高植物光合效率，增强植物抵御强光胁迫方面具有关键作用。

4）基因沉默后叶黄素循环关键酶的表达量测定

为了揭示GhNAC091基因影响植株光合效率，进而提高植株光合效率的原因，将上述植株在1200μmol·m^-2·s^-1强光在分别照射为3h和6h；然后测定调控过剩光能热耗散的叶黄素循环中关键酶玉米黄质环氧化酶（ZE）和紫黄质脱环氧化酶(VDE)的基因表达量，测定结果如图5所示；图中A为玉米黄质环氧化酶（ZE）基因表达量测定结果，B为紫黄质脱环氧化酶(VDE)的基因表达量测定结果。

从图中可以看出，强光照射后TRV:00和TRV:GhNAC091植株中GhZE、GhVDE的表达量均升高，且其升高趋势与前面测得NPQ值的升高趋势较为一致；而对比相同光照条件下不同植株的基因表达量可以看出，基因沉默植株TRV:GhNAC091中两种酶的基因表达量均低于对照植株。

植物光保护机制中非化学淬灭（NPQ）是防止植物受到光损伤的第一道防线，其通过热量的耗散来降低光伤害，而叶黄素循环对于调节植物NPQ能力具有关键作用。叶黄素循环中玉米黄质的含量与过剩光能的量相关，从而能够调控过剩光能热耗散。在强光下，紫黄质在紫黄质脱环氧化酶（VDE）的催化作用下经过中间体花药黄质转变为玉米黄质。类囊体内腔的质子和玉米黄质结合到捕光色素复合体上，改变了其结构，导致淬灭和荧光耗散。上述实验结果表明GhNAC091基因是通过影响叶黄素循环中关键酶的表达进而影响棉花中过剩光能的耗散，最终影响植物的光合利用效率和抵御强光胁迫能力。

实施例3 GhNAC091基因超表达载体构建

前期研究表明GhNAC091基因在提高植物光合效率、增强植物抵御强光胁迫方面具有关键作用，为了获得强光耐受能力强的植物材料，并进一步验证GhNAC091基因在其他物种中同样具有提高植物光合利用效率的能力，发明人构建了GhNAC091基因的超表达载体，并将超表达载体转入模式生物拟南芥进行验证，具体过程如下：

1）超表达载体的构建

根据35S::VIP:GFP载体（本实验室保藏，可通过普通市售获得）序列和酶切位点设计扩增引物，所述引物的具体序列如下：

F：AAGCTCCTCGACTCTAGGGCCCATGAACACAGTTAAAGGTTTCAG

R：GTTCTTCTCCTTTACTCTCGAGCTGCTGGTAGCTGATACTTCC。

利用快速克隆试剂盒（诺唯赞C112-01）进行GhNAC091基因扩增，纯化所得基因片段。用ApaⅠ和XhoⅠ酶切35S::VIP:GFP载体，将酶切后线性载体与扩增的基因片段进行酶连，酶连体系为：ddH₂O 4.9μl，5×CE Buffer 2μl，线性化载体1.8μl，GhNAC091基因0.3μl，Exnase 1μl；反应程序为37℃ 30min。

将上述重组载体转入大肠杆菌感受态细胞（Trans T-1），转化后细胞在100mg/l壮观霉素性平板过夜培养。挑取菌斑进行菌落PCR，并将PCR进行凝胶电泳鉴定；扩增序列与GhNAC091基因序列一致的菌落即为阳性菌落。挑取阳性单菌落于含100mg/l壮观霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。提取质粒，并进行核酸测序鉴定。

利用电转法将鉴定正确的重组载体35S::GhNAC091:GFP重组质粒转入农杆菌EHA105感受态细胞（唯地AE1010）。挑选单菌落进行阳性菌斑PCR鉴定，最终获得阳性菌斑。菌落扩大培养后-80℃保存备用。

2）模式生物转染

将上述获得的GhNAC091农杆菌5ml加入200ml YEP培养基，培养基中含100mg/l壮观霉素和50mg/l 利福平，28℃，220rpm培养至OD₆₀₀=1.0~1.2（11h左右）。将菌液收集于集菌管中，5500 rpm离心15 min，弃上清，收集菌体。使用1/2 MS和5%蔗糖液体培养基重悬菌体，OD600为0.8左右，加入Silwet L-77（20-30 μl/100ml），摇匀。

将拟南芥野生型Col-0（本实验室保藏，普通市售可得）的花序浸入重悬液中30~60sec，避光处理24h后正常培养；拟南芥培养条件为：16光照/8h黑暗，培养温度为22℃。为了提高转化效率，从拟南芥开花到盛花期间可重复3次浸染操作。待种子成熟，收获T₀代种子，将种子于50mg/l卡那霉素固体MS培养基上进行筛选，其中根生长正常、子叶未白化的植株为阳性株系；将T₁再次种植单株收获T₂代，卡那霉素固体培养基筛选出阳性和阴性比大致符合为3:1的比率的植株，将其中的阳性株系继续种植筛选，得到后代全为阳性株系的T₃转基因材料，此为纯种的GhNAC091转基因材料。

3）超表达材料对强光的抗性研究

将莲座叶时期的拟南芥野生型Col-0和所得35S::GhNAC091:GFP转基因植株在1200 μmol·m^-2·s^-1的强光下垂直照射3h，暗处理10~15min，测量叶绿素荧光参数Fv/Fm和NPQ，其中不饱和脉冲光设定梯度为0，100，250，500，750，1000，实验结果如图6所示；图中A为野生型Col-0和GhNAC091转基因超表达材料在1200 μmol·m^-2·s^-1强光处理后叶绿体荧光的表型差异；B为二者在不同强度的脉冲光下NPQ值的变化对比；上图为正常光照，下图为1200 μmol·m^-2·s^-1强光处理.

从图6A可以看出，照射强光后，野生型Col-0和GhNAC091转基因超表达材料的直观表型无明显差异，但是结合Fv/Fm和NPQ显示，GhNAC091转基因超表达植株叶绿素荧光的量明显更高。这说明GhNAC091转基因超表达材料和野生型Col-0的光合效率会随着光强增加而逐步增强，但是同样光照条件下GhNAC091超表达材料的最大潜在光合效率Fv/Fm值更大，说明其光合效率更高。

从图6B中NPQ值的变化来看，随着不饱和脉冲光光强的增加，GhNAC091超表达材料和Col-0的最大潜在光合效率Fv/Fm和非化学荧光淬灭NPQ的值均升高；有所不同的是，最大潜在光合效率Fv/Fm的值表现出先迅速升高，后缓慢升高的趋势；而NPQ的值表现出先升高后逐渐稳定的趋势。GhNAC091超表达材料和野生型Col-0的热耗散能力均会受到光强的限制，当不饱和脉冲强度达到100时，材料基本达到最大热耗散能力，但是相比野生型Col-0，GhNAC091超表达材料的热耗散值更高，表现出对强光损伤更强的抵御能力。

综上，本发明研究结果表明GhNAC091基因在植物光高效利用和降低光损伤上具有重要的应用价值，通过转基因手段获得该基因的超表达株系，能够获得高光效利用和强光耐受的转基因作物品种。

本发明通过VIGS实验验证了GhNAC091基因具有光高效利用和降低光损伤的功能，以模式生物拟南芥的GhNAC091基因超表达材料证实了GhNAC091基因异源表达同样具有相同的能力；理论上本发明中超表达载体构建模式对其他相近植物同样有效。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用

<130> None

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 天然基因片段

<400> 1

atgaacacag ttaaaggttt cagatttcac ccaaccgacg aagaactcat cgagtatctg 60

ctcctcgtaa ccttctgcgt cgaccgtgat tctctcgtcc aagttattga tcaagtaccg 120

gacatctgcc agtgggagcc ttggcaacta gctggtaatc ttttatatat gtatggtgaa 180

cttgttggga ctttttttta tatccatttt ggtgaaatat atgtatgtat gttttggtgt 240

ttcagagagt tccaaattgc aaactgggga tcgattatgg tacttcatat atacaccgac 300

atataagtac cggaatagta aacgaattaa ccggaccacc cgggaaggtt attggaaacc 360

tacgggcaat gctcggaaaa ttatagaccc taaaacaggg aaggtgattg gcaccaagaa 420

gaccttggtt tactataaag gccaatgtaa tgataaagac aaaatcaaga cttgctgggt 480

tatgcatgag tatgaactcg tggctgcccc taactccact gacactgatc gggtaagtca 540

ctatttcatt tgaattaata tattttagct tttattatgt tcgatttttt gtttatttgc 600

tttgatttgt tgtagaaaac attcaacctt tgtaaattga agaaaagggt tgatatttcc 660

tgcactgatg ctgggcaatc aagtcagcat aaggactgtg atgatgttgt tcataatcaa 720

tccggcattg agagttatgc cggagaaata agtagtcaac ataatatagc caatgatgat 780

gtagtctcta atttatcgtc tcatgatctg gatgatgcga tttcgaaggt aagatgctta 840

atgcagaatt tcttaatcat ttatctgttt agatgatgac taaatgctca tttctttgat 900

tcagggaaat ttacacgaga ggtcaaaaga atgcaatgaa cccgaaggca acagtggggt 960

tcaaaaactg aatagcatca ttgaaaagga tgataagtcc tgtagttcgg ttcttactaa 1020

tggtgatgaa accatcaccg tcgaaagaag cgatcaaaat aatgtagttg ttgcaattga 1080

gggattagga ataccttcta gtttcgagta tcttggcgat gaggttttaa ttccggcggt 1140

aaaaatctgt ttctcttagt tatttattcc tgcagattat gatgaagata aaaagtaaag 1200

ctgtttttgc atacgtttca ggaatttttc tacaatgagg ggttatcgtt tgatgagtta 1260

ttagaagtac cacaggcaac taataactct aattggattc aagatcaatc tatcaccaac 1320

ccagatgatg ttgagttctt gaattcaagt tttgttgaca atgatgaagc ctacctccta 1380

gaagaaaaca gaccgtatcc atctgctgct gataatgaag tcttaggtgc agtgggatca 1440

tctgattcga tggagaaacc tagtaaaagg ccgcgtcttt cacatgacga tcatgtagag 1500

accacagagg ctcgagctgg aggaagtatc agctaccagc agtag 1545

Claims (7)

1.GhNAC091基因在调节植物光合利用效率和强光耐受中的应用，其特征在于：利用基因超表达或基因沉默的方法，通过调节GhNAC091基因的表达量，进而调节植物光合利用效率和植物的强光耐受能力；GhNAC091基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用包括构建含有GhNAC091基因的超表达载体，通过转基因技术获得GhNAC091基因超表达材料，最终培育获得高光合利用率和强光耐受的转基因植物新品种。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所用基因超表达的方法包括：将35S::GFP载体与GhNAC091基因通过基因重组制备重组载体；GhNAC091基因扩增所用引物序列为：

F：AAGCTCCTCGACTCTAGGGCCCATGAACACAGTTAAAGGTTTCAG

R：GTTCTTCTCCTTTACTCTCGAGCTGCTGGTAGCTGATACTTCC。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所用载体为35S::VIP:GFP。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所用基因沉默的方法包括：利用VIGS技术，根据GhNAC091基因的特异性区域设计引物扩增GhNAC091基因沉默片段，将GhNAC091基因沉默片段与植物VIGS载体通过基因重组制备重组载体；GhNAC091基因沉默片段扩增过程所用引物序列为：

F：GAATTCCCGGCATTGAGAGTTATGCC

R：CTCGAGTCAACATCATCTGGGTTGGTGA。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所用植物VIGS载体为pTRV2。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：植物种类为棉花、拟南芥或烟草。

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