WO2010106676A1 - 植物の色素量を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、植物に導入する工程を含むことを特徴とする植物の色素量を増加させる方法。

Description

植物の色素量を増加させる方法

　本発明は、トランスジェニック植物の花、果実等の色素量を増加させる方法に関する。

　植物が生育するためには、窒素、リン、カリウム等の多量必須元素と、鉄、マンガン、ホウ素等の微量必須元素とが必要である。しかしながら、例えば、鉄は地殻中の元素の約５％を占め、元素として４番目に多いとされているにもかかわらず、地球上の耕地土壌の約３０％は、潜在的な鉄欠乏地帯と言われている。このような土壌では、土壌のｐＨが上昇しアルカリ性を示すため土壌中の鉄が不溶態の形で存在し、鉄の溶解度が極めて低くなる。このため、このような土壌に生育した植物は、可溶性の鉄が少ないことにより、鉄欠乏クロロシスとなり、生育が阻害されるか又は枯死する。

　高等植物は、このような溶けにくい鉄を獲得するために、２つの戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｙ）をとっている（非特許文献１）。図１に、植物の鉄取り込み機構を模式的に示す（図１は、後述する非特許文献６から引用した）。ＳｔｒａｔｅｇｙＩ（図１ａ）は、イネ科を除く高等植物の鉄獲得機構である。これは、土壌中の３価の不溶体鉄を根の細胞表面に存在する３価鉄還元酵素により還元し、２価鉄のトランスポーターで吸収する機構である。例えば、シロイヌナズナの根に特異的に発現する２価鉄のトランスポーターＩＲＴ１（Ｉｒｏｎ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１）（非特許文献２）は、３価鉄還元酵素の遺伝子ＦＲＯ２（Ｆｅｒｒｉｃ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ　２）(非特許文献３)によって還元された２価鉄を吸収する。また、ＳｔｒａｔｅｇｙＩにおいては、プロトンＡＴＰａｓｅにより放出されたプロトンが根圏のｐＨを低下させ、さらにフェノール性酸の分泌により、鉄の可溶化を促進し、ＦＲＯの効率を高める。

　一方、ＳｔｒａｔｅｇｙＩＩ（図１ｂ）は単子葉植物のイネ科植物にのみ見られる鉄獲得機構である。イネ科植物は鉄欠乏状態で、ファイトシデロフォア（ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ；鉄キレーター）であるムギネ酸類を土壌に分泌する。イネ科植物は、このムギネ酸類により土壌中の３価鉄をキレートして「Ｆｅ（ＩＩＩ）－ムギネ酸類」錯体を形成し、該錯体のまま鉄を根から吸収する（非特許文献４）。ムギネ酸は、鉄欠乏オオムギの根から分泌される、最初に構造決定された鉄キレート物質である（非特許文献５）。その後、ムギネ酸の生合成やオオムギでのＦｅ（ＩＩＩ）－ムギネ酸類錯体の取り込みなど、ムギネ酸の特徴が研究されてきた（非特許文献６）。他のイネ科植物から数種の関連化合物が単離及び同定されたが、これらの化合物は、ムギネ酸類と総称されている。このムギネ酸類の分泌と「Ｆｅ（ＩＩＩ）－ムギネ酸類」錯体トランスポーターの機能とによって、イネ科植物がアルカリ耐性であると考えられる。ムギネ酸類の分泌量はオオムギ、コムギ＞ライムギ、エンバク＞トウモロコシ＞イネの順で多く、これは鉄欠乏耐性の強さの順序と一致する。鉄欠乏状態で葉にＹｅｌｌｏｗ　ｓｔｒｉｐｅを示すトウモロコシ(Ｚｅａ　ｍａｙｓ)の変異体からムギネ酸類鉄錯体のトランスポーター遺伝子(ＺｍＹＳ１)が単離されたが（非特許文献７)、その遺伝子からコードされるタンパク質は、鉄以外に、銅、亜鉛、コバルト及びニッケルの錯体も取り込み、また、植物細胞内の鉄輸送に関与している、ムギネ酸の前駆体、ニコチアナミン鉄錯体も輸送することが報告されている（非特許文献８及び９）。この遺伝子のホモログ検索が行われ、該遺伝子は植物及び微生物界に存在するオリゴペプチドトランスポーターファミリーであることが分かり、イネから３６～７６％のホモロジーを有する遺伝子（ＯｓＹＳＬ）が１８個、シロイヌナズナから８個見つかっている(非特許文献１０)。このうち、イネのＯｓＹＳＬ２（非特許文献１１）、及びシロイヌナズナのＡｔＹＳＬ２（特許文献１、非特許文献１２）が、ムギネ酸鉄錯体は輸送せず、ニコチアナミン錯体のみを輸送することが報告されている。

　本発明者らは、イネやトウモロコシよりムギネ酸類の分泌量が多いオオムギ(Hordeum vulgare)の鉄欠乏状態の根から、ムギネ酸鉄錯体トランスポーターの遺伝子(HvYS1)を同定し、そのタンパク質の機能解析を行った（非特許文献１３及び特許文献２）。この遺伝子は鉄欠乏状態の根で表皮細胞に特異的に強く発現していた。また、この遺伝子産物は、ムギネ酸鉄錯体を特異的に取り込むトランスポーターであることが分かった。最近、イネのOsYSL15がHvYS1同様にムギネ酸類鉄錯体特異的トランスポーターであることが報告された（非特許文献１４）。

　イネ科植物のトランスポーターの機能を明らかにするために種々の研究がなされ、ファイトシデロフォアに関与する遺伝子を分離し、該遺伝子を導入したトランスジェニック植物が種々提案されている。例えばイネにデオキシムギネ酸からムギネ酸を生合成する酵素の遺伝子ＩＤＳ３を導入して、ムギネ酸分泌を可能にし、同じくムギネ酸生合成経路中の酵素であるニコチアナミン・アミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）をコードする遺伝子を導入して鉄欠乏耐性を改善したイネが（非特許文献１５及び特許文献３参照）、また、シスエレメント転写因子ＩＤＥＦ１を導入することによりアルカリ培地での鉄欠乏耐性が改善されたイネが製造されている（非特許文献１６及び特許文献４参照）。
　しかしながら、イネ科以外の植物にムギネ酸類鉄トランスポーターを発現させて、その機能を調べた例はこれまで報告されていない。

先行技術文献
特表２００５－５０１５０２号公報 国際公開ＷＯ２００６／１２６２９４ 特開２００１－１７０１２号公報 特開２００５－００６５９９号公報

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　本発明は、植物に外来性遺伝子を導入することにより植物の色素量を増加させる方法、及び植物の花等の色を改変する方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ね、イネ科以外の植物としてペチュニアに、鉄欠乏状態で育てたオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）から単離したトランスポーター遺伝子（配列番号１）を導入してペチュニア形質転換体を作製し、該ペチュニア形質転換体をデオキシムギネ酸鉄錯体含有水耕栽培で栽培して生育させ、その根から取り込まれたデオキシムギネ酸鉄錯体を検出し、さらに、該ペチュニア形質転換体の生育、鉄含量、植物体の色、及びアルカリ耐性能について検証した。その結果、植物体全体を観察したところ、トランスポーター遺伝子（配列番号１）を導入したペチュニア形質転換体は、コントロールのペチュニア非形質転換体と比較して花の色が顕著に濃いことを見出し、さらに、このペチュニア形質転換体における濃い花色の発現は、該ペチュニアの花の色素量が増加したためであることを見出し、ムギネ酸金属錯体のトランスポーター遺伝子を植物に導入することにより、植物の色素量を増加させることができることに想到した。さらに、土壌からムギネ酸鉄錯体を植物体内に取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を導入すれば、植物にアルカリ耐性も付与することができるため、従来生育不能であったアルカリ土壌でも生育できるトランスジェニック植物を得ることができることを見出した。本発明者らは、この知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明は、以下の（１）～（１１）に関する。
（１）ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を、植物に導入する工程を含むことを特徴とする植物の色素量を増加させる方法。
（２）トランスポータータンパク質が、ムギネ酸金属錯体を選択的に取り込むタンパク質である前記（１）に記載の方法。
（３）トランスポータータンパク質が、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むタンパク質である前記（１）に記載の方法。
（４）トランスポータータンパク質が、イネ科植物由来のトランスポータータンパク質である前記（１）に記載の方法。
（５）トランスポータータンパク質が、オオムギ由来のトランスポータータンパク質である前記（１）に記載の方法。
（６）トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである前記（１）に記載の方法。
（７）植物の色素が、フラボノイドである前記（１）に記載の方法。
（８）植物の色素が、アントシアニンである前記（１）に記載の方法。
（９）植物の花、花托、種子、果実、茎、根及び葉からなる群より選択される少なくとも一種において色素量を増加させる前記（１）に記載の方法。
（１０）ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子の、植物の色素量を増加させるための使用。
（１１）ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を、植物に導入する工程を含むことを特徴とする植物の色を改変する方法。

　本発明はまた、ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子の、植物の色を改変するための使用、に関する。

　本発明によれば、植物の色素量を増加させることができるため、植物の花、果実等の色を深く及び／又は濃くすることができる。このため、新しい色の花、果実等を有する植物を創製することができる。さらに本発明によれば、植物にアルカリ耐性等を付与することができるため、植物の生産能を高めることも可能となる。

図１は、植物の鉄取り込み機構の模式図である。 図２は、プラスミドＭａｃ－ＨｖＹＳ１－ｍａｓ－ｐＢｉｎＰｌｕｓの模式図である。 図３は、ムギネ酸鉄錯体トランスポーター遺伝子ＨｖＹＳ１を含むベクターを導入したペチュニア形質転換体の根のパラフィン切片を抗体染色することにより、ＨｖＹＳ１にコードされるタンパク質の発現を調べた結果を示す図である。 図４はＦＴ－ＩＣＲ　ＭＳ（ネガティブＥＳＩ）により、図２に示すプラスミドを導入したペチュニア形質転換体の根の抽出物中のデオキシムギネ酸鉄錯体の分子イオンピークを検出した結果を示す図である。 図５は、図２に示すプラスミドを導入したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の花の写真である。 図６は、図２に示すプラスミドを導入したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の花の色を比較した写真である。 図７は、図２に示すプラスミドを導入したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の花色の濃さを色差計により測定した結果を示す図である。 図８は、図２に示すプラスミドを導入したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の花のマルビジン量を測定した結果を示す図である。 図９は、ｐＨ５．８のＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地（ａ）若しくはＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地（ｂ）、又はｐＨ８．０のＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地（ｃ）若しくはＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地（ｄ）をそれぞれ水耕培地として用いて、２週間栽培した、図２に示すプラスミドを導入したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の写真である。図９（ｅ）は、水耕培地上のポリプロピレン製フロート上における各植物体の位置を示す。 図１０は、図９ｄに示すｐＨ８．０のＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地で生育したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の全長の写真である。 図１１ａ～ｄは、図９ｄに示すｐＨ８．０のＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地で生育したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の生育を比較した結果を示す図であり、図１１ｅは、図９ｃに示すｐＨ８．０のＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地又は図９ｄに示すｐＨ８．０のＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地で生育したペチュニア形質転換体及びコントロールであるペチュニア非形質転換体の鉄濃度（鉄含有量／乾燥質量（ｍｇ／ｇ））を比較した結果を示す図である。

　本発明の植物の色素量を増加させる方法は、ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を、植物に導入する工程を含む。
　本発明においては、ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を植物に導入して該植物を形質転換することにより、該植物の色素量を増加させることができる。

　ムギネ酸金属錯体とは、ムギネ酸類が、金属イオンと配位結合して形成するキレート化合物をいう。金属イオンとしては、２価又は３価の鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、モリブデンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、カドミウムイオン等が挙げられる。本発明におけるムギネ酸金属錯体としては、ムギネ酸鉄錯体が好ましい。ムギネ酸鉄錯体とは、ムギネ酸類が鉄イオン、好ましくは３価の鉄イオンと配位結合して形成するキレート化合物をいう。

　ムギネ酸類としては、例えばムギネ酸、２’－デオキシムギネ酸、３－ヒドロキシムギネ酸、３－エピヒドロキシムギネ酸、アベニン酸、ディスティコン酸、エピヒドロキシデオキシムギネ酸又はアベニン酸等が挙げられる。好ましくは、２’－デオキシムギネ酸である。

　トランスポータータンパク質とは、物質の細胞膜を介した輸送を担う細胞膜上に存在するタンパク質をいうが、本明細書においては、ムギネ酸金属錯体の細胞膜輸送を担うタンパク質を意味する。ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質は、ムギネ酸金属錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質が好ましく、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質（以下、ムギネ酸鉄トランスポータータンパク質とも言う。）がより好ましい。例えば、「ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む」とは、他の化合物、例えば鉄以外の金属とムギネ酸類から形成される錯体化合物や、ムギネ酸アナログの例えばニコチアナミンが２価鉄イオンと配位して形成するキレート錯体化合物等よりも、ムギネ酸鉄錯体を優先して細胞外から細胞内に移送又は輸送することをいう。

　ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質としては、イネ科植物由来、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム又はイネ由来のトランスポータータンパク質が好ましく、中でも、オオムギ由来のトランスポータータンパク質が好ましい。すなわち本発明におけるトランスポータータンパク質をコードする遺伝子（本明細書において、トランスポーター遺伝子と略記することもある。）としては、イネ科植物由来のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子が好ましく、オオムギ由来のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子がより好ましい。

　本発明におけるトランスポーター遺伝子としては、トランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ又はＲＮＡを用いることができる。好ましくは、トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを用いる。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの配列でもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよい。トランスポーター遺伝子は、例えば、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成したＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を使用することが出来る。また、該遺伝子のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明におけるトランスポーター遺伝子を得ることができる。ＤＮＡ配列が不明の場合であっても、トランスポータータンパク質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のトランスポーター遺伝子配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＰＣＲによって断片を取得することが可能である。

　本発明におけるトランスポーター遺伝子は、例えば、国際公開ＷＯ２００６／１２６２９４に記載されている方法に従って得ることができ、通常、まずトランスポータータンパク質をコードするｍＲＮＡの供給源からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、次いで、例えば３’－ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）、５’－ＲＡＣＥ及び／又は５’／３’－ＲＡＣＥを行なうことにより、目的のトランスポーター遺伝子を得ることができる。

　トランスポータータンパク質をコードするｍＲＮＡの供給源としては、例えば水耕栽培したイネ科の植物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム又はイネ、好ましくはオオムギの根を用いることができる。さらに、トランスポーター遺伝子は、通常は鉄欠乏環境下に発現する遺伝子であるため、鉄イオンフリー又はアルカリ性条件下で鉄イオンを３価の水不溶性とした環境下に曝露させたイネ科植物（好ましくはオオムギ）の根を好適に用いることができる。また、イネ科植物（好ましくはオオムギ）の種子を水耕栽培して、生育させたイネ科植物（好ましくはオオムギ）の根を用いてもよい。またカルス又は無菌条件下で育てたイネ科植物（好ましくはオオムギ）の培養細胞等でもよく、目的とする遺伝子のｍＲＮＡを含んでいる細胞であればその種類は問わない。

　本発明においては、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。配列番号１で示される塩基配列は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）由来のムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。オオムギ由来のムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列については、オオムギ由来のＨｖＹＳ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ　Ｖｕｌｇａｒｅ　Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｔｒｉｐｅｌ）遺伝子（配列番号２）が、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ２１４１８３で登録されており、配列番号１で示される塩基配列は、このオオムギ由来のＨｖＹＳ１遺伝子（配列番号２）のコード領域（第１６９～２２０２番目）のポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号１で示される塩基配列にコードされる、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）のトランスポータータンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。

　本発明においては、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１のポリヌクレオチド）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本発明におけるトランスポータータンパク質をコードする遺伝子として好適に用いることができる。

　本発明においては配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２のポリヌクレオチド）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本発明におけるトランスポータータンパク質をコードする遺伝子として好適に用いることができる。

　「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの部分配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、特に11.45節”Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間及び塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。好ましい「ストリンジェントな条件」は、高ストリンジェントな条件である。また、本発明における「ストリンジェントな条件」とは、より好ましくは、（１）通常約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、又は、（２）約０．１～２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズする条件をいう。

　２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセント（％）は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つのポリヌクレオチドの配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるＢＬＡＳＴＮプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン２．２．７が挙げられる。

　本発明におけるトランスポーター遺伝子としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。なお、前記数個とは好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下、例えば、通常１～１０個、好ましくは１～９個、中でも好ましくは１～８個、より好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～６個、さらにより好ましくは１～５個、特に好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、中でも特に好ましくは１～２個、又は最も好ましくは１個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が好ましい。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により生じうる、又は天然に生じうる程度の数が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。

　さらに、上記配列番号３のアミノ酸配列と、通常約６０％以上の同一性を有するタンパク質、好ましくは約７０％以上の同一性を有するタンパク質、より好ましくは約８０％以上の同一性を有するタンパク質、さらに好ましくは約９０％以上の同一性を有するタンパク質、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有するタンパク質であって、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明における本発明おけるトランスポーター遺伝子として好ましい。上記アミノ酸配列について「同一性」とは、タンパク質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。

　２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等が挙げられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス）、ＤＩＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ）等のプログラムを用いて決定することもできる。

　本発明におけるトランスポーター遺伝子は、コードされるタンパク質においてムギネ酸金属錯体（好ましくは、ムギネ酸鉄錯体）を選択的に取り込む活性が保持されている限り、トランスポーター遺伝子の塩基配列の一部が他の塩基と置換されていてもよく、削除されていてもよく、また新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記の一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下、例えば、１乃至数個（通常１～１０個、好ましくは１～９個、中でも好ましくは１～８個、より好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～６個、さらにより好ましくは１～５個、特に好ましくは１～４個、中でも特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１～２個）であってよい。

　上記トランスポーター遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の方法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（タカラバイオ社製）やＭｕｔａｎｔ－Ｇ（タカラバイオ社製）等）を用いて、あるいは、タカラバイオ社製のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット等を用いて行うことができる。

　上記トランスポーター遺伝子によりコードされるタンパク質がムギネ酸金属錯体を選択的に取り込む活性を有することは、酵母、大腸菌等にトランスポーター遺伝子を導入して形質転換し、形質転換された酵母等を、ムギネ酸金属錯体を添加した培地で培養することにより確かめることができる。
　例えばムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有することは、例えば出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）二重変異体ｆｅｔ３ｆｅｔ４（ＤＤＹ４株）に、トランスポーター遺伝子を導入して形質転換し、形質転換された酵母を、ムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体を添加した培地で培養することにより確かめることができる。ＤＤＹ４株は、２価鉄の取込み系に欠損を持ち、鉄制限培地では生育することができず（Ｅｉｄｅ，Ｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６年，第９３巻，ｐ．５６２４－５６２８）、かつ、ムギネ酸（ＩＩＩ）鉄錯体を利用して生育することができない（Ｌｏｕｌｅｒｇｕｅ，Ｃ．Ｇｅｎｅ，１９９８年，第２２５巻，ｐ．４７－５７）酵母であるので、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性能を有する酵母はムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体を添加した培地で生育し、該活性能を有さない酵母は生育できない。

　また、トランスポーター遺伝子によりコードされるタンパク質が、例えばムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有することは、アフリカツメガエル卵母細胞等で細胞膜電位変化等の観察を行うことによっても、確かめることができる。細胞膜電位変化の測定は、ムギネ酸鉄錯体を含有する溶液をトランスポーター遺伝子を導入した卵母細胞に添加し、該卵母細胞膜に発現したトランスポータータンパク質を介して取り込まれるムギネ酸鉄錯体に伴っておこる卵母細胞の細胞膜電位変化を膜電位固定法等により、細胞膜内外の電位を電極で直接測定等することにより行うことが可能である。

　トランスポーター遺伝子を植物に導入する際には、通常、まずＰＣＲにより増幅させたトランスポーター遺伝子を、ベクターに導入する。通常、この得られたトランスポーター遺伝子を含むベクターを宿主である植物に導入して、植物中でトランスポーター遺伝子を増幅させる。

　トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットとして、例えば、オオムギ由来のムギネ酸鉄トランスポータータンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）については、国際公開ＷＯ２００６／１２６２９４の実施例で使用されたプライマーセット（配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー及び５で示される塩基配列からなるプライマー）などが挙げられる。

　ＰＣＲ法は、公知のＰＣＲ装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。ＰＣＲのサイクルは、公知の技術にしたがって行なわれてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を１サイクルとし、通常１０～１００サイクル、好ましくは、約２０～５０サイクルである。ＰＣＲの鋳型としては、上述のトランスポーター遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、ＰＣＲ法により該遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲ法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、pGEM-T easy vector system（Promega社製）、TOPO TA-cloning system（Invitrogen社製）、Mighty Cloning Kit（Takara社製）などの商業的に入手可能なＰＣＲクローニングシステムなどを使用することもできる。

　「ベクター」とは、遺伝子を細胞内へ導入する働きを持つ物質であればよく、例えば、プラスミド、ウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明におけるトランスポーター遺伝子を植物に導入するためのベクターは、該トランスポーター遺伝子を含み、植物に導入された際に、該トランスポーター遺伝子を発現するものであればよく、トランスポーター遺伝子以外の構造は特に限定されない。本発明におけるトランスポーター遺伝子を植物に導入するためのベクターは、例えば、該遺伝子を植物中で発現させるために、さらに、トランスポーター遺伝子の発現に必要なプロモーター等の調節配列を含むことが好ましい。さらにベクターは、例えば他のタンパク質のための認識配列等を形成する非発現ＤＮＡセグメントを含むこともできる。

　本発明において用いられるベクターは、基礎となるベクター（以下の説明では、便宜上、基礎ベクターと称する）のマルチクローニングサイトに、上記トランスポーター遺伝子、プロモーター及びターミネーター等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記基礎ベクターとしては、宿主である植物中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等のｐＵＣ系プラスミド；ｐＢＩ２２１等の植物細胞宿主用プラスミド、又は、ｐＷＴＴ２３１３２（ＤＮＡＰ社製）、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のバイナリーベクター等が挙げられる。

　プロモーターとしては、宿主である植物中で発現できるものであればいずれを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター又はｒｂｃＳプロモーター等の植物由来のプロモーター、或いはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ－１プロモーター等のような構成的プロモーター等が好ましい。さらに、ｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。また、植物の遺伝子由来の種々のプロモーターを利用することも出来る。例えば、植物体の根で発現する遺伝子、例えば、ムギネ酸金属錯体トランスポーター遺伝子等のプロモーター配列も利用できる。本発明においては、導入したトランスポーター遺伝子が植物において恒常的に発現することが好ましいことから、構成的プロモーターを用いることが好ましく、中でもｍａｃ－１プロモーターが好ましい。ｍａｃ－１プロモーターを用い構築されたベクターが植物ゲノム中に挿入された場合、該プロモーターの下流に連結された遺伝子（ＨｖＹＳ１）が植物体のほとんど全ての器官で、いずれの成長段階においても高レベルで発現し得る。

　ターミネーターとしては、宿主である植物中で発現できるものであればいずれを用いてもよく、例えば、３５Ｓターミネーター、ｒｐｓ１６ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター等が挙げられる。

　また、本発明おいて用いられるベクターは、遺伝子が導入された形質転換体（トランスジェニック植物）を選択するための遺伝子（選択マーカー配列）を有することが好ましい。トランスジェニック植物を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。該遺伝子としては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子又は植物の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子又は除草剤クロルスルフロン耐性遺伝子等が挙げられる。また、該遺伝子の上流及び下流には、該遺伝子を認識するためのプロモーター及びターミネーターを有することが好ましい。

　本発明において用いるベクターには、トランスポーター遺伝子に加え、さらに他の遺伝子、例えばムギネ酸類の生合成酵素をコードする遺伝子等を共に導入し得る。上記トランスポーター遺伝子に加えムギネ酸類の生合成酵素をコードする遺伝子がベクターに導入されると、該ベクターで形質転換される植物は、ムギネ酸鉄錯体等のムギネ酸金属錯体を選択的に取り込む機能に加え、ムギネ酸類を植物体自身で生合成し土壌に分泌し得るので、例えば、ムギネ酸類を含まないアルカリ土壌においてもムギネ酸鉄錯体を取り込むことができ得る。ムギネ酸類の生合成酵素をコードする遺伝子としては、例えば特開２００１－１７１８１号公報に記載の３６ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子や、特開２００１－１７０１２号公報に記載のニコチアナミン・アミノ基転移酵素をコードする遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、前記他の遺伝子には、前記他の遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつムギネ酸類を生合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含される。ストリンジェントな条件は上記と同様である。

　本発明に係るベクターの作製方法については、特に限定されるものではなく、上記基礎ベクターに、上述した各ＤＮＡセグメント（プロモーター、ターミネーター、トランスポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等）を所定の順序となるように導入すればよい。

　本発明の方法においては、上記トランスポーター遺伝子を含むベクターを目的の植物に導入すればよく、ベクターの導入方法や条件等は制限されない。植物への遺伝子（ベクター）の導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスやアグロバクテリウム・リゾゲネスを利用した間接導入法（Ｈｅｉｅｉ，Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１－２８２，１９９４、Ｔａｋａｉｗａ，Ｆ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１１１，３９－４９，１９９５）；エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，Ｙ．ら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，８０，４７５，１９９０）、ポリエチレングリコール法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０，６１９－６２９，１９９２）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．２，２７５－２８１，１９９２、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，８３３－８３９，１９９０）などに代表される直接導入法を用いることも可能である。中でも、例えばペチュニア等については、国際公開ＷＯ２００６／０８５６９９でも用いているアグロバクテリウムを用いて植物に遺伝子を導入する方法が好ましい。

　アグロバクテリウムを用いて植物に遺伝子を導入する方法は、Plant　J.，5，81，1994に記載された方法に従って行うことができ、通常、まず上記ベクターを、Ｖｉｒ領域を有するプラスミドを持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。そして、目的の植物体に該アグロバクテリウムを感染させ、培地で培養を行う。この際、前述のようにベクターが選択マーカー配列を有していれば、例えば、該アグロバクテリウムを感染させた植物を、薬剤等を含有する培地で培養することによって、ベクターが導入されたトランスジェニック植物を容易に選択できる。

　アグロバクテリウム法により植物にベクターを導入する形質転換法は、国際公開ＷＯ２００６／０８５６９９、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ６，ｐ２３９－２４６等に記載されており、これらに記載の方法に従って行うことができる。

　上記ベクターにより遺伝子が導入された植物を増殖又は生育させる方法、栽培する方法等については特に限定されるものではなく、トランスポーター遺伝子の種類、植物の種類等に応じた条件を適宜用いることができる。

　本発明において、形質転換の対象となる植物は、トランスポーター遺伝子により形質転換され、該遺伝子がコードするトランスポータータンパク質が発現し、結果として色素量が増加する植物であれば特に限定されない。本発明における植物は、好ましくは、色素を含む及び／又は色素合成する能力がある植物である。植物の色素としては、植物に含まれる色素性を有する化合物であればよく、例えば、フラボノイド、カロテノイド等が挙げられる。本発明における植物の色素は、好ましくはフラボノイドであり、本発明の方法の好ましい態様の１つは、植物のフラボノイド量を増加させることである。フラボノイドを含む及び／又はフラボノイドを合成する能力がある植物は、本発明における形質転換の対象として好適である。フラボノイドとしては、アントシアニン、オーロン、カルコン等が挙げられる。中でも、アントシアニンが好ましく、本発明のより好ましい態様の１つは、植物のアントシアニン量を増加させることである。例えば、ムギネ酸鉄トランスポーター遺伝子を導入した場合には、植物のアントシアニン量を効果的に増加させることができる。

　本発明の方法は、植物のアントシアニン量を増加させるのに好適である。
　アントシアニンには、そのアグリコンであるアントシアニジンのヒドロキシ基の位置により、デルフィニジン、シアニジン、ペラルゴジニン、オーランチニジン等がある。またヒドロキシ基がメトキシ化されているものも存在する。デルフィニジンのメトキシ体としては、マルビジン、ペチュニジン等が挙げられる。シアニジンのメトキシ体としては、ペオニジンが挙げられる。
　本発明における植物の色素としては、デルフィニジン、シアニジン及びペラルゴジニンからなる群より選択される少なくとも１種が好適であり、本発明の方法は、このような色素を増加させるために好適である。中でも、デルフィニジン及び／又はマルビジンがさらに好ましく、マルビジンが特に好ましい。このような色素を含む及び／又は合成する能力がある植物は、本発明における形質転換の対象として特に好適である。

　本発明において、トランスポーター遺伝子を使って形質転換される植物としては、単子葉植物又は双子葉植物が好ましい。より具体的には、例えば、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、スグリ（カシス）、ラズベリー等）、ナデシコ科（カーネーション、カスミソウ等）、キク科（キク、ガーベラ等）、ラン科（ラン等）、サクラソウ科（シクラメン等）、リンドウ科（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科（キンギョソウ、トレニア等）、ベンケイソウ科（カランコエ）、ユリ科（ユリ、チューリップ等）、フウロソウ科（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ）、ツバキ科植物（例えば、ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、牧草類）、クワ科植物（例えば、クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（例えば、コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（例えば、ナラ、ブナ、カシワ等）、ヒルガオ科植物（サツマイモ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ等）又はアブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロイヌナズナ等）などが挙げられるが、これらに限定されない。

　また、アントシアニンを含む植物又はその一部（組織）の例として、例えば、クワ、クランベリー、スグリ（カシス）、ハスカップ、ブルーベリー、ブラックベリー、プルーン、ビルベリー、アサイー、ブドウ、ラズベリー、ナス、黒米、黒大豆（黒豆）、黒ゴマ、イチゴ等の果実又は種子；赤キャベツ、ハボタン、赤ブドウ等の葉；サツマイモ（特にムラサキイモ）、ダイショ（ベニイモ）等の魂茎；バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ及びミヤコグサ等の花弁等が挙げられる。

　遺伝子を導入することにより得られたトランスジェニック植物において目的遺伝子が発現したことの確認は、例えば、ムギネ酸鉄トランスポーター遺伝子を導入した場合には、得られたトランスジェニック植物の根からＲＮＡを調製し、その遺伝子特異的なプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲによって、その産物をアガロースゲル電気泳動し該当するバンドを検出することによって行うことができる。
　また、トランスジェニック植物の根から全可溶性タンパク質を抽出し、それを電気泳動で分離してメンブレンにブロッティングした後、該当するバンドを検出することによっても、トランスポータータンパク質の発現を確認することができる。

　本発明において得られるトランスジェニック植物は、導入されたトランスポーター遺伝子の発現によりトランスポータータンパク質を生産するものであるが、このトランスポーター遺伝子は特に根の表皮細胞に発現することが好ましい。根の表面に導入したトランスポーター遺伝子が発現することにより、土壌中のムギネ酸金属錯体（好ましくは、ムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体）の取り込みが容易となる。トランスジェニック植物の根における該遺伝子の発現は、組織学的染色により確認できる。組織学的染色は、公知の方法により行なうことができる。

　なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Molecular　Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold　Spring　Harbor　Laboratory）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Molecular　Cloning，　2nd　ed．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold　Spring　Harbor　Laboratory）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。

　このようにして得られたトランスジェニック植物においては、導入されたトランスポーター遺伝子の発現によって鉄等の金属の取り込み量が増えることにより、植物において色素量が増加する。このため、該色素が含まれる及び／又は該色素を合成する植物の色を濃く及び／又は色を深くすることができ、植物の色を改変することができる。本発明において植物とは、例えば、植物体全体でも、植物体の一部でもよく、また、プロトプラスト、カルス等の植物細胞であってもよい。植物体の一部としては、花（花を構成する花弁、がく、雄蕊（花粉を含む）及び雌蕊等のうち１又は２以上）、花托、種子、果実、茎、根（根茎又は塊茎）、葉等の植物体の組織又は植物体の一部が挙げられる。本発明の好ましい態様の１つは、植物の花、花托、種子、果実、茎、根及び葉からなる群より選択される少なくとも一種において色素量を増加させることである。例えば、花弁等の花の色、果実の色等を深く及び／又は濃くすることにより、これまでにない色の花、果実等を有する植物を創製することができる。また、例えば、フラボノイド等の色素には抗酸化作用、紫外線防止作用等があることから、植物の色素量を増加させることにより、植物の抗酸化作用、紫外線防止作用、ストレス防御作用等を高めることもできる。

　本発明の方法によれば、トランスポーター遺伝子を導入していないコントロールの植物（植物体全体又はその一部分）と比較して、例えば、該遺伝子を導入した植物のアントシアニン量を、通常約１．０５倍以上増加させることができる。好ましくは、約１．１倍以上、より好ましくは、約１．２倍以上、さらに好ましくは、約１．５倍以上増加させる。

　植物の色素量の測定は、公知の方法に従って行うことができ、例えばアントシアニン量は、Yukihisa Katsumoto et al. Plant Cell Physiol. 2007, 48, 1589-1600、又は国際公開ＷＯ２００５／０１７１４７の実施例２に記載の方法に従って測定することができる。

　さらに、本発明により得られるトランスジェニック植物は、例えば、最も鉄欠乏耐性に強い、つまりアルカリ土壌下でも３価の鉄イオンを体内に摂取できるオオムギ由来のトランスポーター遺伝子が導入された場合には、ムギネ酸類鉄錯体摂取メカニズムを利用することにより、従来生育不能であったアルカリ土壌でも生育できる。このようなトランスジェニック植物は、例えばアルカリ土壌のような、２価鉄不含であるが３価鉄やムギネ酸鉄錯体を含有する土壌において栽培でき、アルカリ耐性を有するものである。すなわち本発明の方法によれば、さらに、植物にアルカリ耐性を付与することができる。また、本発明により得られるトランスジェニック植物は、例えば、ムギネ酸鉄トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が導入された場合には、光合成に必要な鉄が効率よく吸収されるため、生長が速いという特徴を持ち、植物の生産性を向上できる。

　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子の、植物の色素量を増加させるための使用も、本発明の１つである。ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子の、植物の耐アルカリ性を向上させるための使用も、本発明の１つである。トランスポーター遺伝子及びその好ましい態様、並びに植物への導入方法等は、上述と同様である。

　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を、植物に導入する工程を含む植物の色を改変する方法も、本発明の１つである。本発明の方法によれば、植物の色素量を増加させることができ、これにより植物の色を濃く及び／又は色を深くすることができる。このため、植物又はその部分の色を改変することができる。本発明の好ましい態様は、上述した植物の色素量を増加させる方法と同様である。

　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子の、植物の色を改変するための使用も、本発明の１つである。トランスポーター遺伝子及びその好ましい態様、並びに植物への導入方法等は、上述と同様である。

実施例
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
　本実施例において、分子生物学的手法は特に断らない限り、国際公開ＷＯ９６／２５５００又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載されている方法に従った。

（ＨｖＹＳ１遺伝子を導入したペチュニア形質転換体の作製）

（Ｉ）ＨｖＹＳ１ｃＤＮＡのクローニング
　ＨｖＹＳ１ｃＤＮＡのクローニングは、国際公開ＷＯ２００６／１２６２９４の実施例１に記載した方法に従って行ない、オオムギ（品種Ｍｏｒｅｘ）の根から配列番号２で示されるポリヌクレオチドからなる塩基配列を得た。配列番号２で示されるポリヌクレオチドからなる塩基配列は、ＨｖＹＳ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ　Ｖｕｌｇａｒｅ　Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｔｒｉｐｅｌ）と命名されている（ＤＤＢＪ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ２１４１８３）。なお、配列番号２で示される塩基配列において、第１６９～２２０２番目の塩基配列が、オオムギトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号１）である。

　ＨｖＹＳ１発現ベクターの構築、及びペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ、品種サフィニアパープルミニ、サントリー社製）の形質転換は、以下に示すように国際公開ＷＯ２００６／１２６２９４の実施例１に記載した方法に従って行った。

（ＩＩ）　ＨｖＹＳ１発現ベクターの構築
　（ｉ）ｐＣＧＰ１３９４（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，３６：１０２３－１０３１に記載）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と、（ｉｉ）ｐＣＧＰ１３９４をＰｓｔＩで消化後ブランティングキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化し、さらにＳａｃＩＩで消化して得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片と、（ｉｉｉ）ｐＢｉｎＰＬＵＳ（ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，２８８－２９０）をＳａｃＩで消化後同様に平滑末端化しさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化した約１２ｋｂのＤＮＡ断片の、（ｉ）～（ｉｉｉ）３種のＤＮＡ断片をライゲーションして得られるプラスミドをｐＳＰＢ１８５とした。

　ＨｖＹＳ１はＴＯＰＯ－ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ＰＥＲＩＩ－ＴＯＰＯのベクターに以下のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をサブクローニングした。
フォワードプライマー：　5’-GCTCTAGAAT GGACATCGTC GCC-3’（配列番号４）
リバースプライマー：　5’-CCCAAGCTTT TAGGCAGCAG GTAG-3’（配列番号５）

　上記フォワードプライマーは、ＨｖＹＳ１翻訳領域５’末端に制限酵素サイトとしてＸｂａＩ配列（ＧＣＴＣＴＡＧＡ）を付加したものであり、リバースプライマーは、ＨｖＹＳ１翻訳領域３’末端に制限酵素サイトとしてＨｉｎｄＩＩＩ配列（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ）を付加したものである。

　このＨｖＹＳ１を含有するプラスミド（サブクローニングされたＰＥＲＩＩ－ＴＯＰＯベクター）を、まずＨｉｎｄＩＩＩで消化し、突出する末端をブランティングキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化し、さらにＸｂａＩで消化して約２ｋｂのＨｖＹＳ１を含有するＤＮＡ断片を取り出した。別途、増幅したｐＳＰＢ１８５をＫｐｎＩで消化し、末端を同様に平滑末端化し、さらにＸｂａＩで消化して約１４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次いで、前記ＨｖＹＳ１を含有するＤＮＡ断片と約１４ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションして連結し、図２に示すプラスミドＭａｃ－ＨｖＹＳ１－ｍａｓ－ｐＢｉｎＰｌｕｓを作製した。このプラスミドは、植物において、ＨｖＹＳ１をＭａｃプロモーター（Comai et al．，１９９０，Plant Mol Biol，１５，３７３－３８１）により構成的に発現させることを目的としている。

（ＩＩＩ）　ペチュニアの形質転換
　引き続いて、公知の方法（Plant J.，5，81，1994）に基づいて、Ｍａｃ－ＨｖＹＳ１－ｍａｓ－ｐＢｉｎＰｌｕｓを用いてアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ａｇ１０）を形質転換した。次いで、該形質転換されたアグロバクテリウムをペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ、品種サフィニアパープルミニ（サントリー社製）)に感染させ、ＨｖＹＳ１の翻訳領域遺伝子をペチュニアに導入し、ペチュニア形質転換体（形質転換体Ｔ－１株～Ｔ－２２株）を得た。
　すべての植物を１６時間照射（６０μＥ．冷白色蛍光灯）のもとで２３±２℃に保持した。根が２～３ｃｍの長さに達したとき、ペチュニア形質転換体を、１５ｃｍの培養ポット中のオートクレーブ殺菌されたＤｅｂｃｏ　５１４１０／２ポットミックスに移植した。４週間後、植物を同じポットミックスを用いる１５ｃｍのポットに再移植し、そして１４時間照射（３００μＥ．ハロゲン化水銀灯）のもとで２３℃にて保持した。

（ペチュニア形質転換体のＨｖＹＳ１遺伝子の発現とＨｖＹＳ１タンパク質の局在）
　導入されたＨｖＹＳ１のＲＴ－ＰＣＲ法による検出は、国際公開ＷＯ２００６/１２６２９４「ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子」の実施例６に記載した方法で行った。その結果、ＨｖＹＳ１を導入した形質転換体では、ＨｖＹＳ１由来のＰＣＲ産物として予想される７５５ｂｐにバンドが検出され、ＨｖＹＳ１遺伝子がペチュニアに導入されていることを確認した。ＨｖＹＳ１遺伝子を導入していない通常のペチュニアにおいてはＧＡＰＤＨのＰＣＲ産物（約１０００ｂｐ）は検出されたが、ＨｖＹＳ１由来のＰＣＲ産物は検出されなかった。

　ＨｖＹＳ１タンパク質の局在は、抗体染色法により、明らかにした。ＨｖＹＳ１抗体として、非特許文献１３（Murata, Y. et al. Plant J. 2006, 46, 563-572）に記載の方法でポリクローナル抗体を作製した。ペチュニア形質転換体の根及びコントロールのペチュニアの根の横断面方向の、厚さ５μＭのパラフィン切片を作製した。これらのパラフィン切片を脱パラフィン後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）に室温１時間反応させ、その後ＨｖＹＳ１抗体をブロッキング液で１００倍希釈したものを各切片に５０μＬかけて、チャンバーボックスに並べて、４℃の暗所で１５時間反応させた。これをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０分×４回洗浄後、二次抗体、Alexa Fluor 488(goat anti-rabbit、Invitrogen社製)をブロッキング液で１０００倍希釈したものと、室温で１時間反応させた。これをＰＢＳＴで１０分×４回洗浄後、水溶性の封入剤、ＣＲＹＳＴＡＬ／ＭＯＵＮＴ（Ｂｉｏｍｅｄａ　Ｃｏｒｐ．）で封入した。これをＮＩＫＯＮ　ＥＣＬＩＰＳＥ顕微鏡で観察し、ＡＱＵＡ－Ｌｉｔｅ（浜松フォトニクス）で画像処理を行った。ＨｖＹＳ１抗体によって染色されたＨｖＹＳ１タンパク質は、該抗体に結合した蛍光色素（緑色の蛍光を発する）によって検出される。図３ａ～ｄはそれぞれ、ペチュニア形質転換体及びペチュニア非形質転換体（コントロール）の根の横断面方向の切片を免疫染色したものの顕微鏡写真である（白いスケールバー：１００μｍ）。図３ａは、ペチュニア形質転換体の根の横断方向の切片をＨｖＹＳ１抗体で染色したもの、図３ｂは、ペチュニア形質転換体の根の横断方向の切片をＨｖＹＳ１抗体を使用せずに染色したブランク、図３ｃは、ペチュニア非形質転換体の根の横断方向の切片をＨｖＹＳ１抗体で染色したもの、図３ｄは、ペチュニア非形質転換体の根の横断方向の切片を、ＨｖＹＳ１抗体を使用せずに染色したブランクである。図３ａ～ｄにおいて、灰色に見える部分が緑色の蛍光部分であり、抗体が結合したＨｖＹＳ１タンパク質である。非形質転換体（図３ｃ）ではＨｖＹＳ１の発現が見られなかったが、形質転換体（図３ａ）の根のすべての細胞膜にＨｖＹＳ１トランスポーターが発現していた。

（デオキシムギネ酸鉄錯体含有培地でのペチュニア形質転換体の水耕栽培）
　ペチュニアは、鉄獲得機構Ｉをもつ（図１ａ）。しかし、ナス科であるペチュニアは本来、鉄獲得機構ＩＩ（図１ｂ）を持たないものである。そこで、ムギネ酸鉄錯体トランスポーターＨｖＹＳ１を導入して作製したペチュニア形質転換体を、デオキシムギネ酸（ＤＭＡ）鉄錯体を添加した培地で栽培することにより、該ペチュニア形質転換体がイネ科植物のもつ鉄獲得機構ＩＩ（図１ｂ）を利用することができるかを検証した（図１は、非特許文献６から引用した）。アッセイに用いたデオキシムギネ酸は、イネやトウモロコシが分泌しているファイトシデロフォアであり、本発明者らは、既に簡便でかつ高収率の合成方法を確立している（日本国特許第４１１７００９号、又はKosuke Namba et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 7060-7063.）。

　実施例１で作製した形質転換体Ｔ－１２株、Ｔ－１４株及びＴ－１５株及び非形質転換体コントロールを、根が３ｃｍに伸びた段階で水耕栽培へ移した。水耕栽培の培地には、ｐＨ５．８のＭＳ培地を用い、これに、含有鉄としてエチレンジアミン４酢酸鉄錯体（ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ））５０μＭ又はデオキシムギネ酸鉄錯体（ＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ））５０μＭを添加した。栽培においては、該培地に通気しながら各ペチュニアを２週間～４週間生育させた。培地は１週間に２度交換した（つまり、３又は４日に１度交換した）。
　この４週間水耕栽培したペチュニア非形質転換体及びペチュニア形質転換体の花の色を、以下の実施例５において分析した。

（ペチュニア形質転換体の根からデオキシムギネ酸鉄錯体の検出）
　植物内でのムギネ酸類鉄錯体の検出方法として、ナノエレクトロスプレーイオン化、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（Ｎａｎｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　Ｉｏｎ　Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：以下、単に「Ｎａｎｏ－ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ　ＭＳ」と記載する）の高分解能質量分析法を用いた。ＦＴ－ＩＣＲ　ＭＳによる、合成ムギネ酸鉄錯体やカドミウム錯体の検出はすでに報告されている（Gunther Weber et al. Rapid Commun. Mass Spectom. 2006, 20, 973-980及びAnderson R. Meda et al. Plant Physiol. 2007, 143, 1761-1773）が、多くの成分が含まれている植物抽出物からムギネ酸鉄錯体のＦＴ－ＩＣＲＭＳによる分子イオンピークを検出したのは、本願が初めてである。

　実施例３で得られた、デオキシムギネ酸鉄錯体（ＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ））（５０μＭ）含有ＭＳ培地、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）（５０μＭ）含有ＭＳ培地で２週間水耕栽培したペチュニア形質転換体及び非形質転換体それぞれの根をＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）含有水で２回洗浄後、－８０℃で保存した。そのうち約３ｇを液体窒素中乳鉢で粉砕して１ｇあたり２ｍＬの滅菌水を加えた。２ｍＬエッペンチューブにサンプルを移し、まず、遠心機（トミー精機、ＭＸ－１５０）を用いて、１３、０００ｇで１０分、４℃で遠心後、上清をとり、さらにＢｅｃｋｍａｎ卓上超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＣＯＵＬＴＥＲ、ｏｐｔｉｍａＴＬＸ）で１００，０００ｇ、６０分、４℃遠心後、上清を採った。この上清をゲルろ過カラムクロマト（ガラスカラム：３ｍｍ×３００ｍｍ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．）、充填剤：Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－１０（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）、パッキング：湿式、ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ　ｍｏｄｅｌ　１１００　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、流速：０．０３ｍＬ／ｍｉｎ、移動相：Ｗａｔｅｒ（ＨＰＬＣグレード、Ｍｅｒｃｋ）、ＵＶ：３３０ｎｍ、サンプル量：５μＬ）にアプライし、３１～３４分の溶出フラクションを得た。このフラクションを用いて、Ｎａｎｏ－ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ　ＭＳの高分解能質量分析を行った。

　Ｎａｎｏ－ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ　ＭＳの分析条件は、ＭＳ機器：Ａｐｅｘ－Ｑ９４ｅ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）、イオン源：Ａｐｏｌｌｏ２　ｄｕａｌ　ｓｏｕｒｃｅ、極性：ネガティブ、タイムドメイン：２Ｍ、キャリブラント：ＮａＩ（０．１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％　ｉ－ＰｒＯＨ）、積算：５０～５００回で行った。

　図４ａ～ｄに、Ｎａｎｏ－ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ　ＭＳのスペクトルを示す。図４ａは、ペチュニア形質転換体の根の抽出物、図４ｂは、ペチュニア非形質転換体の根の抽出物について測定したスペクトルである。デオキシムギネ酸鉄錯体の分子イオンピークは、３５６＝[ＤＭＡ（分子量；３０４）－４Ｈ＋Fe(III)]^-1である。図４ａ及びｂのペチュニアはいずれも、ＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加ＭＳ培地で水耕栽培したものである。図４ｃは、ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加ＭＳ培地で栽培したペチュニア形質転換体の根の抽出物のＮａｎｏ－ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ　ＭＳスペクトルである。図４ｄは、ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加ＭＳ培地で栽培したペチュニア非形質転換体の根の抽出物のＮａｎｏ－ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ　ＭＳスペクトルである。

　デオキシムギネ酸鉄錯体（ＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ））添加培地にて水耕栽培したペチュニア形質転換体の根においてのみ、デオキシムギネ酸鉄錯体を検出し（図４ａ～ｄ）、遺伝子導入したトランスポーターが機能して、デオキシムギネ酸鉄錯体を選択的に培地から植物体内にとりこむ機能を有していることが示された。

（水耕栽培したペチュニア形質転換体の花色解析）
　実施例３で得られた、４週間（２８日）水耕栽培したペチュニア非形質転換体及びペチュニア形質転換体の花の色を、以下のようにして分析した。
（Ｉ）目視による花色の観察
　ペチュニア非形質転換体（コントロール）及びペチュニア形質転換体（形質転換体Ｔ－１４株及びＴ－１５株）の花（花弁）の色を目視で観察した。図５ａは、温室水耕栽培２８日目のコントロールのペチュニアの写真である。図５ｂは、温室水耕栽培２８日目のコントロールのペチュニアの花の写真である。図５ｃ及びｄはそれぞれ、温室水耕栽培２８日目の形質転換体Ｔ－１４株（図５ｃ）及びＴ－１５株（図５ｄ）の花の写真である。図６は、コントロール及びペチュニア形質転換体の花（花弁）の色を比較した写真であり、ａがコントロール、ｂがペチュニア形質転換体の花である。このように、図５ａ～ｄ及び図６より、形質転換体の方がコントロールより明らかに花の色（赤紫色）が濃いことが観察された。一方、葉の色（緑色）及び茎の色（黄緑色）は、ペチュニア形質転換体及びペチュニア非形質転換体（コントロール）で差が観察されなかった（図５ａ～ｄ）。

（ＩＩ）花のｐＨの測定方法
　－８０度で１時間以上凍結したペチュニアの花弁約２ｇを、ホモジナイザーを用いて絞り、搾汁液を得た。これを、ｐＨメーター（Ｆ－２２、堀場製作所社製）に微小電極６０６９－１０Ｃ（堀場製作所社製）を接続してｐＨを測定した。コントロール及びペチュニア形質転換体の花のｐＨには、表１に示すように差がなかった。

（ＩＩＩ）色差計による花色の測定
　花色測定は分光測定計ＣＭ２０２２（ミノルタ社製、日本）を用いて、Y Katsumoto et al. Plant Cell Physiol. 2007, 48, 1589-1600、又は国際公開ＷＯ２００５／０１７１４７の実施例１に記載した方法に従って行った。具体的には、分光測定計ＣＭ２０２２（ミノルタ社製、日本）を用いて、１０度視野、Ｄ６５光源で測定し、色彩管理ソフトSpectraMagic（ミノルタ社製、日本）により解析を行なった。ペチュニア形質転換体及び非形質転換体の花の色差を図７に示す。ペチュニア形質転換体は、コントロールである非形質転換体に比べて、色差計で色の濃さを表すｈｕｅ値が約半分であり、これは、花の色が濃いことを示している。

（ＩＶ）　アントシアニンの分析
　花弁色素アントシアニン（マルビジン）の分析は高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）を用いて、Y Katsumoto et al. Plant Cell Physiol. 2007, 48, 1589-1600、又は国際公開ＷＯ２００５／０１７１４７の実施例２に記載した方法に従って行った。具体的な手順は、以下の通りである。

　凍結乾燥した花弁０．５ｇをスパーテルで潰し、これを４ｍＬの０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル中で２０分間、超音波下で抽出し、３６００ｒｐｍ×１０分、５℃にて遠心分離した。上澄みを採取し、０．４５μｍのフィルターでろ過した（Cosmonice Filter W、１３ｍｍ／０．４５μｍ）。この抽出液のアントシアニン量を、以下の分析条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
ＨＰＬＣ装置：島津ＬＣ１０Ａ（島津製作所社製）
紫外可視分光光度検出器：ＳＰＤ－Ｍ１０Ａ（島津製作所社製）
カラム：Shodex DE-413L（４．６ｍｍΦ×２５ｃｍ、昭和電工社製）
流速：０．６ｍＬ／分
圧力：９０ｋｇ／ｃｍ^２
カラム温度：４０℃
移動層：Ａ液　０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液
　　　　Ｂ液　０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液
グラジエント：Ｂ液２０％から１００％のグラジエント１５分の後、Ｂ液１００％でイソクラティック溶出を行なった。
注入量：１５μＬ
検出：島津フォトダイオードアレイ検出器ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所社製）により、２５０－６００ｎｍの波長領域を検出し、５２０ｎｍの吸光度の面積により、各アントシアニンを定量した。

　定量については、標品と保持時間（Ｒ．Ｔ．）とλmaxの一致したピークを５２０ｎｍの面積で定量した。約１００本の分析に１回、８０％アセトニトリルで４０分洗浄した。標品として、MALVIDIN CHLORIDE（ChromaDex社製）を使用した。

　上記方法により測定した、ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地又はＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地で水耕栽培したペチュニア形質転換体及び非形質転換体のマルビジン量（乾燥質量あたりのマルビジン量：マルビジン（ｍｇ）／乾燥質量（ｇ））を図８に示す。この結果から、ペチュニアのアントシアニン色素であるマルビジン量が約２倍増えていることが明らかになった。
　以上の結果から、花の写真（図６）に示されるように、ペチュニア形質転換体が非形質転換体より色が濃く見えるのは、花弁における単位質量あたりの色素量が増えたためであることが示された。

（ペチュニア形質転換体のアルカリ耐性能の検証１）
　ペチュニア形質転換体（形質転換体　Ｔ－１２株、Ｔ－１４株及びＴ－１５株）のアルカリ耐性を調べるために、ｐＨ５．８又はｐＨ８．０のアルカリ水耕培地でペチュニア非形質転換体（コントロール）及び形質転換体を生育させた。水耕栽培は、図９に示すように、ポリプロピレン製フロート（ポリプロピレン板）を水耕培地上に浮かべて行った。図９ｅに、水耕培地上のポリプロピレン製フロートにおける各植物体の栽培位置を示す。図９ｅに示すように、ポリプロピレン板に８個穴を開け、上からコントロール、Ｔ－１２株、Ｔ－１４株及びＴ－１５株について、各々２つずつエッペンチューブ底に穴をあけて植物を差込み、各々の根が水耕培地に触れるようにした。培地は、ＭＧＲＬ培地（Ｆｕｊｉｗａｒａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２、　ｖｏｌ．９９，　２６３－２６８，　１９９２）に、含有鉄としてエチレンジアミン４酢酸鉄錯体（ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ））２０μＭ又はデオキシムギネ酸鉄錯体（ＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ））２０μＭを添加し、栽培中、培地に通気しながら、該培地で２週間生育させた。培地のｐＨは、１Ｎ　ＫＯＨで調節した。図９ａは、ｐＨ５．８のＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地、図９ｂは、ｐＨ５．８のＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地、図９ｃは、ｐＨ８．０のＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地、図９ｄは、ｐＨ８．０のＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地でそれぞれ生育させたコントロール（上１列目）と形質転換体　Ｔ－１２株（上から２列目）、Ｔ－１４株（上から３列）、及びＴ－１５株（上から４列目）とをトレーで栽培した写真である。ＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）を添加したアルカリ培地（図９ｃ）では、コントロール及び形質転換体ともにクロロシスを起こし、生育が悪かった。しかし、ＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地（図９ｄ）では、形質転換体である上から２、３及び４列（上から順に、形質転換体Ｔ－１２株、Ｔ－１４株及びＴ－１５株）は一番上のコントロールに比べてアルカリ耐性を示した。

（ペチュニア形質転換体のアルカリ耐性能の検証２）
　ペチュニア形質転換体（Ｔ－１４株及びＴ－１５株の２株）及びコントロール（ペチュニア非形質転換体）各々を、ｐＨ８．０のデオキシムギネ酸鉄錯体２０μＭ含有ＭＧＲＬ培地（Ｆｕｊｉｗａｒａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２、ｖｏｌ９９，２６３－２６８，１９９２）で２週間水耕栽培した後、目視により生育を観察し（図１０ａ～ｃ）、さらに、生育（地上部及び根各々の質量及び長さ）及び根の鉄濃度を測定した（図１１ａ～ｅ）。鉄濃度は、Ｖｅｒｔ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２００２，　ｖｏｌ．　１４，　１２２３－１２３３に記載の方法に従って、根を洗浄後、６０℃の乾燥機で２日乾燥し、その質量を乾燥質量とした。鉄濃度の測定では、この根の乾燥物に２Ｎの硝酸を加えて、湿式灰化法により、溶解し、島津原子吸光光度計ＡＡ－６８００で鉄濃度を測定した。

　図１０ａは、非形質転換体（コントロール）の写真であり、図１０ｂは、形質転換体Ｔ－１４株の写真であり、図１０ｃは、形質転換体Ｔ－１５株の写真である。
　図１１ａは非形質転換体、形質転換体　Ｔ－１４株及びＴ－１５株の地上部の長さ（ｃｍ）の測定結果を、図１１ｂは、非形質転換体、形質転換体　Ｔ－１４株及びＴ－１５株の地上部の質量（ｇ）の測定結果を、図１１ｃは、非形質転換体、形質転換体　Ｔ－１４株及びＴ－１５株の根の長さ（ｃｍ）の測定結果を、図１１ｄは、非形質転換体、形質転換体　Ｔ－１４株及びＴ－１５株の根の質量（ｇ）の測定結果を、それぞれ示す。図１１ｅは、ｐＨ８．０のＥＤＴＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地又はｐＨ８．０のＤＭＡ－Ｆｅ（ＩＩＩ）添加培地で生育させた非形質転換体、形質転換体　Ｔ－１４株及びＴ－１５株それぞれの根の鉄濃度（根の鉄濃度：根の鉄含有量／乾燥質量（ｍｇ／ｇ））を測定した結果を示す図である。

　図１１ａ～ｅ中、＊は、有意差検定　ｐ＜０．０１を示し、＊＊は、有意差検定　ｐ＜０．０５を示す。図１０ａ～ｃ及び図１１ａ～ｄより、ペチュニア形質転換体において、地上部及び根の質量、並びに地上部及び根の長さ共にコントロールの約１．５～２倍に生育しており、図１１ｅより、植物体内の鉄濃度もペチュニア形質転換体の方がコントロールより若干増えており、ペチュニア形質転換体がアルカリ耐性を示すことが分かった。

　本発明によれば、植物の色素量を増加させることができるため、花等の色を濃く及び／又は色を深くすることができる。さらに本発明によれば、植物にアルカリ耐性を付与することができる。従って本発明は、農業、園芸等の分野等において有用である。

Claims (11)

1. 　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を、植物に導入する工程を含むことを特徴とする植物の色素量を増加させる方法。
2. 　トランスポータータンパク質が、ムギネ酸金属錯体を選択的に取り込むタンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 　トランスポータータンパク質が、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むタンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法。
4. 　トランスポータータンパク質が、イネ科植物由来のトランスポータータンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法。
5. 　トランスポータータンパク質が、オオムギ由来のトランスポータータンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法。
6. 　トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求の範囲第１項に記載の方法。
7. 　植物の色素が、フラボノイドである請求の範囲第１項に記載の方法。
8. 　植物の色素が、アントシアニンである請求の範囲第１項に記載の方法。
9. 　植物の花、花托、種子、果実、茎、根及び葉からなる群より選択される少なくとも一種において色素量を増加させる請求の範囲第１項に記載の方法。
10. 　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子の、植物の色素量を増加させるための使用。
11. 　ムギネ酸金属錯体を取り込むトランスポータータンパク質をコードする遺伝子を、植物に導入する工程を含むことを特徴とする植物の色を改変する方法。

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