ES2298733T3

ES2298733T3 - Aumento en la acumulacion de carotenoides en plantas.

Info

Publication number: ES2298733T3
Application number: ES04722310T
Authority: ES
Inventors: Caroline Rachel Syngenta Limited DRAKE; Jacqueline Ann Mary Syngenta Limited PAINE; Catherine Ann Syngenta Limited SHIPTON
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2024-03-22
Also published as: DE602004011035T2; WO2004085656A2; DE602004011035D1; AU2004223634A1; JP2006521107A; ATE382702T1; AU2004223634B2; EP1608759A2; EP1608759B1; US20080109919A1; CA2520021A1; WO2004085656A3; US20150322444A1; US20120042417A1

Abstract

Un polinucleótido que comprende: (a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción.

Description

Aumento en la acumulación de carotenoides en plantas.

La presente invención se refiere, inter alia, a tecnología de ADN recombinante. Más específicamente, la invención se refiere a la provisión de polinucleótidos mejorados que proporcionan una acumulación incrementada de carotenoides en plantas y, en particular, en las semillas de dichas plantas. La invención también proporciona material vegetal, plantas y semillas que comprenden los polinucleótidos, en particular, materia vegetal de arroz, plantas de arroz y semillas de arroz.

Los carotenoides son isoprenoides de 40 carbonos (C_{40}) formados por la condensación de ocho unidades de isopreno procedente del precursor biosintético difosfato de isopentenilo. Atendiendo a la nomenclatura, los carotenoides se dividen básicamente en dos clases, a saber, carotenos y xantofilas. Su función esencial en las plantas es la de proteger el aparato fotosintético de los plástidos frente al daño foto-oxidativo. Además de esto, los carotenoides participan en la recogida de la luz durante la fotosíntesis y representan componentes integrales de los centros de reacción fotosintéticos. Los carotenoides son los precursores directos de la fitohormona ácido abscísico. Una parte de la vía de biosíntesis de los carotenoides se muestra en la Figura 1.

Los carotenoides con actividad de provitamina A son componentes esenciales de la dieta humana. Además, existe una evidencia convincente que sugiere que una dieta rica en carotenoides puede prevenir el desarrollo de varias condiciones médicas graves, incluyendo determinados cánceres (especialmente pulmón y próstata), degeneración macular, cataratas y enfermedad cardiovascular. También se ha indicado que los carotenoides tienen efectos inmunomoduladores, tales como la reducción de la inmunosupresión inducida por UV. Los carotenoides son capaces de actuar como pantallas eficaces frente a especies de oxígeno reactivas perjudiciales tales como oxígeno singlete y, de esta manera, tienen propiedades antioxidantes.

Debido a que la población mundial está aumentando, existe una necesidad de producir alimentos con un contenido nutricional alto, saludables, sabrosos y visualmente atractivos.

La inserción general de genes implicados en la vía de biosíntesis de los carotenoides en plantas se describe en WO00/53768. La patente de EEUU 6.429.356 describe métodos para la producción de plantas y semillas que tienen composiciones alteradas de ácidos grasos, tocoferol y carotenoides mediante la inserción de un gen crtB. La presente invención proporciona, inter alia, polinucleótidos mejorados que cuando se insertan en material vegetal proporcionan una acumulación sorprendentemente alta de carotenoides en al menos las semillas de las plantas procedentes de dicho material. Más específicamente, la presente invención proporciona combinaciones particulares de secuencias de nucleótidos que, cuando se expresan en material vegetal, proporcionan una acumulación sorprendentemente alta de carotenoides en al menos las semillas de las plantas procedentes de dicho material.

Según la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende: (a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción.

Además, se describe un polinucleótido que comprende: (a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de tomate (Lycopersicon sp.) o pimiento (Capsicum sp.) o una bacteria; y (iii) una región terminadora de la transcripción.

En una realización adicional, dicha caroteno desaturasa puede proceder de Streptomyces; Staphylococcus; Synechocystis; Rhodobacter; Paracoccus; Erwinia; y Xanthophyllomyces. En una realización adicional, dicha caroteno desaturasa es una fitoeno desaturasa. En una realización adicional de la invención, dicha fitoeno sintetasa se puede obtener de Zea mays u Orzya sativa.

En una realización adicional, dicha fitoeno sintetasa se obtiene de Zea mays u Orzya sativa. En una realización adicional más, dicha fitoeno sintetasa comprende, está comprendida por o consiste en la secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 10; 11; 12; y 13. En una realización adicional, dicha fitoeno sintetasa comprende, está comprendida por o consiste en una secuencia que codifica la proteína mostrada como SEQ ID NO 14. Las secuencias alternativas que codifican la fitoeno sintetasa también pueden estar disponibles a partir de bases de datos conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, las secuencias mostradas en la Base de Datos EMBL con los Números de Registro-AY024351, AK073290, AK108154 y AY078162.

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Además, se describe una fitoeno sintetasa procedente de, que se puede obtener de o que se obtiene de Lycopersicon esculentum o Capsicum anuum. Aún más, se describe una fitoeno sintetasa, en la que la fitoeno sintetasa comprende, está comprendida por o consiste en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

Además, se describe una fitoeno sintetasa procedente de, que se puede obtener de o que se obtiene de los genes CrtB de bacterias. En particular, dicho crtB comprende, está comprendido por o consiste en la secuencia crtB mostrada en Shewmaker et al. (1999) Plant J. 20:401-12. En una realización adicional de la invención, la secuencia que codifica una caroteno desaturasa de una bacteria procede de Erwinia sp., más específicamente, Erwinia uredovora. En una realización adicional más, la caroteno desaturasa procede del gen CrtI de Erwinia uredovora. En una realización adicional más, la caroteno desaturasa es el gen CrtI de Erwinia uredovora. En una realización adicional más, la caroteno desaturasa comprende, está comprendida por o consiste en la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que dicho promotor se selecciona del promotor de la Glutelina 1 y el promotor de la Prolamina y dicha región terminadora de la transcripción se selecciona de las regiones terminadoras de la transcripción Nos; CaMV 35S y PotP1-II. Dichos promotores de la Gutelina 1 y Prolamina pueden aislarse a partir de arroz. En una realización particular, dicho promotor comprende la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 20 ó 21. Los promotores adicionales incluyen el promotor procedente del gen de nabo de Brassica napus y otros promotores que proceden de genes que se expresan normalmente en el endospermo de la semilla. Las regiones terminadoras de la transcripción adicionales incluyen la región terminadora de un gen de alfa-tubulina (EP-A 652.286). También es posible utilizar, en asociación con la secuencia de regulación del promotor, otras secuencias de regulación que están situadas entre el promotor y la secuencia que codifica la proteína, tales como amplificadores de la transcripción o traducción, por ejemplo, el activador de la traducción del virus del grabado del tabaco (TEV), descrito en la solicitud de Patente Internacional, número de publicación PCT WO 87/07644.

La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que la secuencia que codifica la caroteno desaturasa y la secuencia que codifica la fitoeno sintetasa comprenden además una secuencia de direccionamiento a plástidos. En una realización particular, la secuencia de direccionamiento a plástidos procede de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa (RUBISCO Ssu) de Pisum sativum. En una realización adicional, dicha secuencia de direccionamiento a plástidos RUBISCO Ssu está localizada en 5' respecto al punto de inicio de la traducción de dicho gen de caroteno desaturasa procedente de CrtI. En una realización adicional más, dicha secuencia de direccionamiento a plástidos RUBISCO Ssu está localizada en 5' respecto al punto de inicio de la traducción de dicho gen de fitoeno sintetasa procedente de CrtB. En una realización adicional más, dicha secuencia de direccionamiento a plástidos es heteróloga respecto a dicha fitoeno sintetasa y/o dicha caroteno desaturasa. En una realización adicional más, dicha secuencia de direccionamiento a plástidos es autóloga respecto a dicha fitoeno sintetasa y/o dicha caroteno desaturasa. Por "heteróloga" se quiere decir procedente de una fuente diferente y, de manera correspondiente, "autóloga" significa procedente de la misma fuente - pero a nivel génico más que a nivel de organismo o tejido. En una realización adicional más, la secuencia de direccionamiento a plástidos asociada con la caroteno desaturasa es heteróloga respecto a ésta y la secuencia de direccionamiento a plástidos asociada con la fitoeno sintetasa es autóloga respecto a ésta. En una realización adicional más, la secuencia de direccionamiento a plástidos proporciona la acumulación de carotenoides en el amiloplasto de la semilla.

La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que la secuencia que codifica dicha caroteno desaturasa y/o la secuencia que codifica dicha fitoeno sintetasa comprende además un intrón. En una realización particular, dicha región del intrón está localizada entre la región promotora y la región que codifica la caroteno desaturasa/fitoeno sintetasa. En una realización adicional, dicha región del intrón está localizada entre la región promotora y la secuencia de direccionamiento a plástidos. En una realización adicional más, dicha región del intrón está localizada antes del extremo 5' de dicha(s) secuencia(s) que codifican la caroteno desaturasa y/o la fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicho intrón procede del intrón del primer gen del gen de la catalasa de la planta de ricino. En una realización adicional más, dicho intrón es del primer intrón del gen de la catalasa de la planta de ricino. En una realización adicional más, dicho intrón comprende la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 22. En una realización adicional más, el intrón es el intrón del gen de la poliubiquitina de maíz.

La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que dicha secuencia que codifica la caroteno desaturasa está localizada en 5' respecto a dicha secuencia que codifica la fitoeno sintetasa.

La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que dicha secuencia que codifica la fitoeno sintetasa está localizada en 5' respecto a dicha secuencia que codifica la caroteno desaturasa.

La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente que comprende la secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización particular de la invención, el polinucleótido consiste en una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización adicional de la invención, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional más de la invención, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2. En una realización adicional más de la invención, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 3. En una realización adicional más de la invención, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4. En una realización adicional más de la invención, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 6. La presente invención proporciona además un polinucleótido como se ha descrito anteriormente que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8; y 9.

La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que es el complemento de una que hibrida con un polinucleótido como se ha descrito en el párrafo anterior a una temperatura de aproximadamente 65ºC en una disolución que contiene 6 x SSC, 0,01% SDS y 0,25% de leche desnatada en polvo, seguido de lavado a la misma temperatura en una disolución que contiene 0,2 x SSC y 0,1% SDS en el que dicha secuencia de polinucleótido comprende todavía una región que codifica una caroteno desaturasa y una región más que codifica una fitoeno sintetasa y cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce una cantidad incrementada de carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. El experto en la técnica puede seleccionar alternativamente las condiciones de hibridación siguientes, por ejemplo, hibridación a una temperatura entre 60ºC y 65ºC en disolución salina tamponada con citrato con una fuerza 0,3 que contiene 0,1% SDS seguido de lavado a la misma temperatura con disolución salina tamponada con citrato con una fuerza 0,3 que contiene 0,1% SDS seguido de la confirmación de que cuando la secuencia de polinucleótido así identificada se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce una cantidad incrementada de carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. El experto en la técnica también puede seleccionar condiciones de hibridación que también se entiende que son condiciones de "alta astringencia". En una realización particular de la presente invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos sesenta veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos cien veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos ciento cincuenta veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos doscientas veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos doscientas cincuenta veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos trescientas veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos trescientas cincuenta veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos cuatrocientas veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar. En una realización adicional más de la invención, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un incremento de al menos quinientas veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar.

El término semilla control similar se refiere a semillas que son sustancialmente similares a aquellas según la invención pero las semillas control similares no contienen los polinucleótidos o las secuencias de polinucleótidos según la invención. Típicamente, una semilla control similar comprenderá una semilla de la misma o de una especie similar de planta pero la semilla control similar no ha sido transformada. El contenido incrementado de carotenoides de las semillas que comprenden los polinucleótidos o las secuencias de polinucleótidos según la invención también se puede demostrar mediante una comparación de dichas semillas con semillas que comprenden el TADN mostrado en el Plásmido A de la Figura 4 de WO 00/53768, en el que la fitoeno sintetasa (psy) es de narciso (Narcissus pseudonarcissus). Típicamente, dicha comparación se realizará cuando las semillas que se quieren comparar son de la misma especie de planta o de especies de plantas sustancialmente similares. En una realización particular, la semilla que comprende los polinucleótidos o las secuencias de polinucleótidos según la invención contiene al menos tres veces la cantidad de carotenoides cuando se compara con una semilla que comprende el TADN mostrado en el Plásmido A de la Figura 4 de WO 00/53768, en el que la fitoeno sintetasa (psy) es de narciso (Narcissus pseudonarcissus). En una realización adicional más, la semilla que comprende los polinucleótidos o las secuencias de polinucleótidos según la invención contiene al menos cuatro veces, o al menos cinco veces, o al menos seis veces, o al menos siete veces, o al menos ocho veces o al menos nueve veces o al menos diez veces o al menos quince veces o al menos veinte veces o al menos treinta veces o al menos cuarenta veces o al menos cincuenta veces la cantidad de carotenoides cuando se compara con una semilla que comprende el TADN mostrado en el Plásmido A de la Figura 4 de WO 00/53768, en el que la fitoeno sintetasa (psy) es de narciso (Narcissus pseudonarcissus).

La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente en la que cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 3 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 4 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 5 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 6 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 7 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 8 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 9 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 10 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 11 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 12 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 13 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 14 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 15 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 20 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 25 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 30 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 35 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 40 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 45 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 50 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 55 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 60 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 65 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, la cantidad de carotenoides se calcula como \mug/g de peso seco del endospermo de dicha semilla.

La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que es el complemento de una que hibrida con un polinucleótido que consiste en una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6 a una temperatura de aproximadamente 65ºC en una disolución que contiene 6 x SSC, 0,01% SDS y 0,25% de leche desnatada en polvo, seguido de un lavado a la misma temperatura en una disolución que contiene 0,2 x SSC y 0,1% SDS en el que dicha secuencia de polinucleótido comprende todavía una región que codifica una caroteno desaturasa y una región adicional que codifica una fitoeno sintetasa y cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 80% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización adicional, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 85% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 90% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 95% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización adicional más, cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 100% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 1. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 2. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 3. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 4. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 6.

Se prefiere que cuando el contenido de carotenoides de la semilla que comprende dicha secuencia de polinucleótido se compara con la semilla que comprende el polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6, las semillas sean de plantas sustancialmente de la misma especie. Se prefiere además que cuando el contenido de carotenoides de la semilla que comprende dicha secuencia de polinucleótido se compara con la semilla que comprende el polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6, las semillas sean de plantas que son sustancialmente idénticas genéticamente salvo por la presencia de dicho polinucleótido o dicha secuencia de polinucleótido. Se prefiere además que cuando el contenido de carotenoides de la semilla que comprende dicha secuencia de polinucleótido se compara con la semilla que comprende el polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5; y 6, las semillas sean de plantas que se crecen sometidas a las mismas condiciones medioambientales de crecimiento.

La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que es el complemento de una que hibrida con un polinucleótido que consiste en una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8; y 9 a una temperatura de aproximadamente 65ºC en una disolución que contiene 6 x SSC, 0,01% SDS y 0,25% de leche desnatada en polvo, seguido de un lavado a la misma temperatura en una disolución que contiene 2 x SSC y 0,1% SDS en el que dicha secuencia de polinucleótido comprende todavía una región que codifica una caroteno desaturasa y una región adicional que codifica una fitoeno sintetasa y cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 80% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8; y 9. Se prefiere que cuando el contenido de carotenoides de la semilla que comprende dicha secuencia de polinucleótido se compara con la semilla que comprende el polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8; y 9, las semillas sean de plantas sustancialmente de la misma especie. Se prefiere además que cuando el contenido de carotenoides de la semilla que comprende dicha secuencia de polinucleótido se compara con la semilla que comprende el polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8; y 9, las semillas sean de plantas que son sustancialmente idénticas genéticamente salvo por la presencia de dicho polinucleótido o dicha secuencia de polinucleótido.

En una realización particular, las secuencias de polinucleótido según la invención que se identifican tomando como base su hibridación (en las condiciones proporcionadas) con las secuencias descritas en el Listado de Secuencias, codifican las mismas proteínas que las proporcionadas por las secuencias del Listado de Secuencias. En una realización adicional, dichas secuencias de polinucleótido pueden codificar proteínas que tienen la misma función o una función similar a las proteínas codificadas por las secuencias del Listado de Secuencias. En una realización adicional más, las proteínas codificadas por la secuencia de polinucleótido según la invención comprenden sustituciones y/o deleciones de aminoácidos cuando se comparan con las proteínas codificadas por las secuencias del Listado de Secuencias. En una realización adicional más, dichas sustituciones de aminoácidos son sustituciones "conservativas". Se entiende que una "sustitución" conservativa significa que el aminoácido se reemplaza por un aminoácido con propiedades químicas similares en general. En particular, las sustituciones "conservativas" pueden hacerse entre aminoácidos de los grupos siguientes: (i) Alanina y Glicina; (ii) Treonina y Serina; (ii) Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; (iii) Arginina y Lisina; (iv) Asparagina y Glutamina; (v) Isoleucina y Leucina; (vi) Valina y Metionina; y (vii) Fenilalanina y Triptófano.

La presente invención proporciona además un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente que cuando se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides en unos niveles que son mayores que los presentes en semillas nativas similares. La presente invención proporciona además un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente que cuando se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides en unos niveles que son mayores que los presentes en semillas no transformadas similares.

En una realización particular, los carotenoides que están incrementados se seleccionan del grupo que consiste en: licopeno; alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeaxantina; beta-criptoxantina; anteraxantina; violaxantina; y neoxantina o una combinación de éstos. En una realización adicional, los carotenoides que están incrementados se seleccionan del grupo que consiste en: licopeno; alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeaxantina; beta-criptoxantina; o una combinación de éstos. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados se seleccionan del grupo que consiste en: alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeaxantina; beta-criptoxantina; o una combinación de éstos. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados incluyen al menos fitoeno y beta-caroteno. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados incluyen al menos beta-caroteno. En una realización adicional más, el carotenoide que está incrementado es beta-caroteno. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados son carotenoides con color.

La presente invención proporciona además un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que dicha semilla es una semilla de arroz. En una realización particular de la invención, antes de analizar el contenido de carotenoides de las semillas, las semillas se preparan antes del análisis. Dicha preparación puede incluir, por ejemplo, respecto a la semilla de arroz, "descascarar" y "pulir". Además, dicha preparación puede implicar la eliminación de las partes de la planta asociadas con la semilla no teniendo normalmente dichas partes de la planta aplicación en el consumo humano.

La cantidad de carotenoides en las semillas puede determinarse utilizando técnicas que son muy conocidas y que están disponibles para el experto en la técnica. Dichas técnicas incluyen, pero no están necesariamente limitadas a, análisis por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) y espectrofotometría.

La presente invención proporciona además un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente que comprende además una región que codifica un marcador seleccionable. En una realización particular, dicho marcador seleccionable comprende un gen de manosa-6-fosfato isomerasa. En una realización particular adicional, el marcador seleccionable utilizado es el gen de la manosa-6-fosfato isomerasa según el sistema de selección Positech^{TM}. En una realización específica, dicho marcador seleccionable es el descrito en la publicación de la Solicitud/Patente Europea Número EP 0 896 063 y EP 0 601 092. Alternativamente, el marcador seleccionable utilizado puede, en particular, conferir resistencia a kanamicina, higromicina o gentamicina. Los marcadores seleccionables adecuados adicionales incluyen genes que confieren resistencia a herbicidas tales como herbicidas basados en glifosato (por ejemplo, genes EPSPS tales como en USP 5510471 o WO 00/66748) o resistencia a toxinas tales como eutipina. También están disponibles otras formas de selección tales como sistemas de selección basados en hormonas tal como el sistema de Multi Auto Transformación (MAT) de Hiroyrasu Ebinuma et al. 1997. PNAS Vol. 94 p2117-2121; sistemas de selección visual que utilizan proteínas fluorescentes, \beta glucoronidasa y cualquier otro sistema de selección tal como xilosa isomerasa y 2-desoxiglucosa (2-DOG).

La presente invención proporciona además un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según la invención que está optimizada a nivel de codones para la expresión en una especie de planta particular. En una realización particular, el polinucleótido o secuencia de polinucleótido está optimizada a nivel de codones para la expresión en arroz (Orzya sp.) o maíz (Zea sp.). Dicha optimización a nivel de codones es muy conocida por el experto en la técnica y la tabla siguiente proporciona un ejemplo de los codones preferentes en plantas para arroz y maíz.

1

2

La presente invención proporciona además un vector que comprende un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente. En una realización particular de la invención, dicho vector comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; 5; y 6. En una realización particular de la invención, dicho vector comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8; y 9. En una realización particular, dicho vector permite la replicación de dicho polinucleótido o secuencia de polinucleótido en una bacteria.

La presente invención proporciona además un vector como se ha descrito anteriormente que es un vector de expresión de plantas.

En una realización particular de la invención, la secuencia alrededor de la o las posiciones de inicio de la traducción de las secuencias que codifican la fitoeno sintetasa y/o dicha caroteno desaturasa como se ha descrito anteriormente pueden modificarse de manera que se prefiere "Kozak". Lo que esto significa es muy conocido para el experto en la técnica. Los ejemplos de secuencias de consenso Kozak que son muy conocidos para el experto en la técnica incluyen cagcc(atg) o agcc(atg). Las secuencias que codifican la fitoeno sintetasa y/o dicha caroteno desaturasa como se ha descrito anteriormente también pueden comprender adicionalmente una secuencia que proporciona la retención en un orgánulo intracelular particular.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el contenido de carotenoides de las semillas que comprende insertar en el material vegetal un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido o un vector como se ha descrito anteriormente; y regenerar una planta que contiene las semillas a partir de dicho material e identificar las semillas que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de una semilla control similar.

La presente invención proporciona además un método para incrementar el contenido de carotenoides de las semillas que comprende insertar en el material vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; 5; y 6 y regenerar una planta que contiene las semillas a partir de dicho material e identificar las semillas que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de semillas control similares. En una realización particular de la invención, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos sesenta veces de los carotenoides cuando se comparan con una semilla control similar. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos cien veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos ciento cincuenta veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos doscientas veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos doscientas cincuenta veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos trescientas veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos trescientas cincuenta veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos cuatrocientas veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares. En una realización adicional, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos quinientas veces de los carotenoides cuando se comparan con semillas control similares.

La presente invención proporciona además un método como se ha descrito anteriormente en el que dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 3 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 4 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 5 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 6 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 7 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 8 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 9 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 10 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 15 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 20 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 25 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 30 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 35 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 40 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 45 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 50 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 55 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 60 \mug/g de endospermo de dicha semilla. En una realización particular, dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 65 \mug/g de endospermo de dicha semilla.

La presente invención proporciona además un método para incrementar el contenido de carotenoides de las semillas que comprende insertar en el material vegetal una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente y regenerar una planta que contiene las semillas a partir de dicho material e identificar la semilla que contiene carotenoides cuya cantidad representa al menos el 80% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6. En una realización adicional, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 85% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6. En una realización adicional más, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 90% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6. En una realización adicional más, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 95% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6. En una realización adicional más, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce carotenoides cuya cantidad representa al menos el 100% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 1. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 2. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 3. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 4. En una realización particular, la secuencia de polinucleótido proporciona un porcentaje del contenido de carotenoides de la semilla como se ha descrito anteriormente en el que la semilla con la que se realiza la comparación comprende el polinucleótido mostrado como SEQ ID NO: 6.

La presente invención proporciona además un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende insertar en el material vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8 y 9 y regenerar una planta que contiene la semilla a partir de dicho material e identificar las semillas que contienen niveles mayores de carotenoides que los de las semillas control similares. En una realización particular de la invención, las semillas obtenidas con dicho método contienen un incremento de al menos cincuenta veces de los carotenoides cuando se compara con una semilla control similar.

La presente invención proporciona además un método como se ha descrito anteriormente en el que dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 3 \mug/g de endospermo de dicha semilla.

La presente invención proporciona además un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende insertar en el material vegetal una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente y regenerar una planta que contiene las semillas a partir de dicho material e identificar la semilla que contiene carotenoides cuya cantidad representa al menos el 80% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8 y 9.

La presente invención proporciona además un método como se ha descrito anteriormente en el que los carotenoides que están incrementados se seleccionan del grupo que consiste en: licopeno; alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeaxantina; beta-criptoxantina; anteraxantina; violaxantina; y neoxantina o una combinación de éstos. En una realización adicional, los carotenoides que están incrementados se seleccionan del grupo que consiste en: licopeno; alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeaxantina; beta-criptoxantina; o una combinación de éstos. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados se seleccionan del grupo que consiste en: alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeaxantina; beta-criptoxantina; o una combinación de éstos. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados incluyen al menos fitoeno y beta-caroteno. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados incluyen al menos beta-caroteno. En una realización adicional más, el carotenoide que está incrementado es beta-caroteno. En una realización adicional más, los carotenoides que están incrementados son carotenoides con color.

El polinucleótido o secuencia de polinucleótido o vector como se ha descrito anteriormente puede insertarse en el material vegetal mediante técnicas de transformación de plantas que son muy conocidas para el experto en la técnica. Dichas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, transformación biolística mediada por partículas, transformación mediada por Agrobacterium, transformación de protoplastos (opcionalmente en presencia de polietilen glicoles); sonicación de tejidos vegetales, células o protoplastos en un medio que comprende el polinucleótido o vector; microinserción del polinucleótido o vector en material vegetal totipotencial (opcionalmente utilizando la técnica conocida "whiskers" de carburo de silicio), electroporación y semejantes. En una realización particular de la invención, se transforma material vegetal de arroz según los métodos descritos en los Ejemplos que se muestran en la presente memoria. En una realización particular, el Agrobacterium que se utiliza es una cepa que ha sido modificada para reducir la posibilidad de recombinación entre las secuencias que tienen una alto grado de similitud en la región TADN del Agrobacterium. Además, pueden utilizarse como parte del proceso de transformación técnicas y elementos tales como los referidos en WO 99/01563, EEUU 6.265.638, EEUU 5.731.179 y EEUU 5.591.616.

La presente invención proporciona además semillas que se obtienen o se pueden obtener por un método como se ha descrito anteriormente. En una realización específica, dichas semillas son semillas de arroz. En una realización adicional, dichas semillas son semillas de maíz.

A lo largo de esta especificación los términos "semilla" y "semillas" pueden utilizarse indistintamente con los términos "grano" o "granos". En particular, los términos "semilla" y "semillas" se refieren a semillas o partes de las semillas comestibles, en particular, al endospermo de la semilla.

La presente invención comprende además una planta que comprende una semilla según el párrafo anterior.

La presente invención proporciona además una planta o material vegetal que comprende un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido o un vector como se ha descrito anteriormente. En una realización particular, dicha planta o material vegetal es una planta de arroz o material vegetal de arroz o una planta de maíz o material vegetal de maíz. En una realización adicional más, la planta o material vegetal de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en plantas de sandía, melón, mango, soja, algodón, tabaco, remolacha, colza, canola, lino, girasol, patata, tomate, alfalfa, lechuga, maíz, trigo, sorgo, centeno, plátanos, cebada, avena, césped, forraje, caña de azúcar, pimiento, guisante, judías, arroz, pino, álamo, manzana, melocotón, uva, fresa, zanahoria, repollo, cebolla, limón, cereal o nuez o cualquier otro cultivo hortícola. En una realización específica, dicha planta es una planta de arroz.

La presente invención proporciona además una planta o semilla según la invención que comprende además un gen que codifica una enzima que es capaz de convertir caroteno en un retinoide. Un ejemplo de dicho gen es el gen que codifica la \beta-caroteno dioxigenasa como se describe en WO 01/48162 y/o WO 01/48163.

La presente invención proporciona además una planta según la invención que comprende además un polinucleótido que proporciona un rasgo seleccionado del grupo que consiste en: resistencia y/o tolerancia a insectos; resistencia y/o tolerancia a nematodos; resistencia y/o tolerancia a herbicidas; resistencia y/o tolerancia mejoradas al estrés; una sustancia que tiene una actividad farmacéutica y/o cualquier otro rasgo agronómico deseado.

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La presente invención proporciona además una planta según la invención que comprende además un polinucleótido que proporciona un incremento adicional de la biosíntesis de isoprenoides y/o de la acumulación de carotenoides en la planta. En una realización particular, dicho polinucleótido proporciona un factor de transcripción que proporciona un incremento adicional de la biosíntesis de isoprenoides y/o de la acumulación de carotenoides en la planta.

La presente invención proporciona además una planta según la invención que comprende además un polinucleótido que proporciona un incremento en los plástidos en la planta. En una realización particular, dicho polinucleótido comprende el gen PhyA de avena o arabidopsis, siendo estos genes muy conocidos para el experto en la técnica. En una realización adicional, dicho polinucleótido comprende el gen Hp1 o Hp2 del tomate que también son muy conocidos para el experto en la técnica.

La presente invención proporciona además un marcador molecular, siendo este marcador capaz de identificar el material vegetal que comprende una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1 a 9 en el que dicho marcador molecular comprende al menos aproximadamente 25 nucleótidos contiguos con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1 a 9.

La presente invención proporciona además un método para identificar material vegetal según la invención mediante la utilización, por ejemplo, de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores adecuados pueden diseñarse utilizando parámetros muy conocidos para los expertos en la técnica basándose en las secuencias listadas en el Listado de Secuencias. El experto en la técnica tiene experiencia en las técnicas de extracción de ácidos nucleicos y una vez que se ha aislado una muestra problema puede analizarse para detectar la presencia de la secuencia según la invención utilizando técnicas que son muy conocidas en la técnica. Éstas incluyen, pero no están limitadas a, PCR, RAPIDS, RFLP y AFLP.

La presente invención proporciona además un kit, comprendiendo este kit un medio para obtener una muestra problema y un medio para detectar la presencia de las secuencias de la invención en dicha muestra problema. También pueden generarse kits adecuados para ensayar el contenido de carotenoides de una muestra problema y esto puede combinarse opcionalmente con las características de un kit como se ha descrito en la frase anterior.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la utilización de un polinucleótido, secuencia de polinucleótido o un vector como se ha descrito anteriormente en un método para la producción de semillas que contienen un contenido incrementado de carotenoides. En una realización particular, la presente invención proporciona la utilización de un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6 para la producción de semillas que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de una semilla control similar.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la utilización de un polinucleótido, secuencia de polinucleótido o un vector como se ha descrito anteriormente en un método para la producción de semillas que contienen un contenido incrementado de carotenoides. En una realización particular, la presente invención proporciona la utilización de un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8 y 9 para la producción de semillas que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de una semilla control similar.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona la utilización de un polinucleótido, secuencia de polinucleótido o un vector como se ha descrito anteriormente en un método para producir una planta que comprende dicho polinucleótido, dicha secuencia de polinucleótido o dicho vector.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona la utilización de un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 1; 2; 3; 4; 5 y 6 en un método para la producción de una planta que comprende dicho polinucleótido.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona la utilización de un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 7; 8 y 9 en un método para la producción de una planta que comprende dicho polinucleótido.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende insertar en el material vegetal (a) un primer polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) un segundo polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (c) regenerar una planta que contiene la semilla a partir de dicho material e identificar las semillas que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de las semillas control similares.

Además, se describe un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende insertar en el material vegetal (a) un primer polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) un segundo polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de tomate (Lycopersicon sp.) o pimiento (Capsicum sp.); o una bacteria; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (c) regenerar una planta que contiene la semilla a partir de dicho material e identificar las semillas que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de las semillas control similares.

En una realización particular, la etapa (a) del párrafo anterior se realiza antes que la etapa (b). En una realización adicional, la etapa (b) del párrafo anterior se realiza antes que la etapa (a). En una realización adicional más, el promotor, la secuencia que codifica dicha caroteno desaturasa, la secuencia que codifica la fitoeno sintetasa y la región terminadora proceden de las secuencias mostradas en el Listado de Secuencias. En una realización adicional más, dicha caroteno desaturasa es el gen CrtI de Erwinia sp. En una realización adicional más, la caroteno desaturasa comprende o consiste en la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 18 ó 19. En una realización adicional, dicha fitoeno sintetasa procede de maíz o arroz. En una realización adicional más, dicha fitoeno sintetasa es de maíz o arroz En una realización adicional más, dicha fitoeno sintetasa comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 10; 11; 12; y 13.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende cruzar (a) una primera planta que comprende un polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una planta adicional que comprende un polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (c) cosechar las semillas de las hembras parentales de las plantas así cruzadas; y (d) crecer dicha semilla para producir plantas que comprenden más semillas e identificar di-
chas semillas adicionales que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de las semillas control similares.

Además, se describe un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende cruzar (a) una primera planta que comprende un polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una planta adicional que comprende un polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de tomate (Lycopersicon sp.) o pimiento (Capsicum sp.); o una bacteria; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (c) cosechar las semillas de las hembras parentales de las plantas así cruzadas; y (d) crecer dicha semilla para producir plantas que comprenden más semillas e identificar dichas semillas adicionales que contienen unos niveles mayores de carotenoides que los de las semillas control similares.

En una realización adicional más, el promotor, la secuencia que codifica dicha caroteno desaturasa, la secuencia que codifica la fitoeno sintetasa y la región terminadora se pueden obtener a partir de las secuencias mostradas en el Listado de Secuencias. En una realización adicional más, dicha caroteno desaturasa es el gen CrtI de Erwinia sp. En una realización adicional más, la caroteno desaturasa comprende o consiste en la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 18 ó 19. En una realización adicional más, dicha fitoeno sintetasa procede de maíz o arroz. En una realización adicional más, dicha fitoeno sintetasa es de maíz o arroz. En una realización adicional más, dicha fitoeno sintetasa comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NOS: 10; 11; 12 y 13.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un polinucleótido que comprende (a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa o una secuencia de nucleótido que codifica una caroteno desaturasa procedente de una planta seleccionada del grupo que consiste en: tomate (Lycopersicon sp.); pimiento (Capsicum sp.); maíz (Zea sp.); arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de una bacteria o de una planta seleccionada del grupo que consiste en: maíz (Zea sp.) y arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (c) una región adicional más que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una zeta-caroteno desaturasa (ZDS) procedente de una bacteria o de una planta seleccionada del grupo que consiste en: tomate (Lycopersicon sp.); pimiento (Capsicum sp.); maíz (Zea sp.); arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción. En una realización particular, la caroteno desaturasa y la fitoeno sintetasa proceden de maíz (Zea sp.) y la zeta-caroteno desaturasa (ZDS) procede de pimiento (Capsicum sp.). En una realización adicional, la caroteno desaturasa y la fitoeno sintetasa son de maíz (Zea sp.) y la zeta-caroteno desaturasa (ZDS) es de pimiento (Capsicum sp.).

Los polinucleótidos como se han descrito anteriormente pueden utilizarse para identificar secuencias de polinucleótido que proporcionan una función similar, tomando como base las condiciones de hibridación descritas anteriormente. Estos polinucleótidos y secuencias de polinucleótido que comprenden la zeta-caroteno desaturasa también pueden utilizarse en métodos para incrementar el contenido de carotenoides de semillas de una manera análoga a los métodos descritos anteriormente.

En una aspecto adicional de la invención, se proporciona un polinucleótido que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa o una secuencia de nucleótido que codifica una caroteno desaturasa procedente de una planta seleccionada del grupo que consiste en: tomate (Lycopersicon sp.); pimiento (Capsicum sp.); maíz (Zea sp.); arroz (Orzya sp.); y (iii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de una planta seleccionada del grupo que consiste en: maíz (Zea sp.) y arroz (Orzya sp.); y (iv) una secuencia de nucleótido que codifica una zeta-caroteno desaturasa (ZDS) procedente de una bacteria o de una planta seleccionada del grupo que consiste en: tomate (Lycopersicon sp.); pimiento (Capsicum sp.); maíz (Zea sp.); arroz (Orzya sp.); y (v) una región terminadora de la transcripción.

Cualquiera de las regiones descritas en esta especificación puede separarse por una región que proporciona un polipéptido de auto-procesamiento que es capaz de separar las proteínas tal como el polipéptido de auto-procesamiento descrito en EEUU 5.846.767 o cualquier elemento que funcione de manera similar. Alternativamente, las regiones pueden separarse por una secuencia que actúa como un sitio diana para un elemento externo que es capaz de separar las secuencias de proteína. Alternativamente, el polinucleótido puede proporcionar una poliproteína que comprende muchas funciones proteicas. En una realización adicional de la presente invención, las proteínas de la poliproteína pueden estar dispuestas en tándem. El experto en la técnica apreciará que cuando se genera un polinucleótido que codifica dicha poliproteína, la expresión de dicha poliproteína puede conseguirse mediante la utilización de un único promotor que se describe en la presente memoria.

Todos los polinucleótidos y secuencias de polinucleótido descritos a lo largo de esta especificación pueden aislarse y construirse utilizando técnicas que son muy conocidas para el experto en la técnica. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden sintetizarse utilizando sintetizadores estándar de polinucleótidos. Dichos polinucleótidos sintéticos pueden sintetizarse y ligarse para formar los polinucleótidos más largos según la invención. Los polinucleótidos y secuencias de polinucleótido también pueden aislarse a partir de otras construcciones/vectores que contienen dichas secuencias e insertarse en construcciones/vectores adicionales para producir los de la invención. Las secuencias también pueden aislarse a partir de bibliotecas, por ejemplo de ADNc y ADNg, utilizando la información de las secuencias proporcionada en el Listado de Secuencias para la creación de sondas/cebadores adecuados para el propósito de identificar dichas secuencias a partir de dichas bibliotecas. Una vez aisladas, las secuencias pueden unirse para crear los polinucleótidos y secuencias de polinucleótido según la invención. Las secuencias según la invención también pueden utilizarse para identificar secuencias similares según las condiciones de hibridación descritas anteriormente. Al identificar dichas secuencias similares, el experto en la técnica puede desear identificar secuencias similares a una o más de las partes componentes de las secuencias mostradas en el Listado de Secuencias y posteriormente unir las secuencias similares de una manera semejante a la organización de las secuencias mostradas en el Listado de Secuencias. Por ejemplo, puede ser deseable modificar sólo la región que codifica la fitoeno sintetasa. Una vez que se ha identificado la secuencia modificada que codifica la fitoeno sintetasa, podría utilizarse para reemplazar la secuencia que codifica la fitoeno sintetasa en una de las secuencias mostradas en el Listado de Secuencias. Alternativamente, la fitoeno sintetasa modificada puede utilizarse en la creación de una nueva secuencia en la que todas las partes componentes son las mismas que una secuencia del Listado de Secuencias salvo por la fitoeno sintetasa. En un ejemplo más, pueden modificarse todos los componentes y cada uno de los componentes modificados se organiza de la misma manera que las secuencias del Listado de Secuencias, por ejemplo, promotor-intrón-secuencia diana-caroteno desaturasa-terminador-promotor-intrón-(secuencia diana)-fitoeno sintetasa-terminador. El grado de modificación afectará a la capacidad de la secuencia modificada para hibridar con una secuencia del Listado de Secuencias bajo las condiciones descritas anteriormente.

La presente invención proporciona además una planta que comprende un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente. En una realización particular, dicha planta es una planta de arroz o de maíz.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente en el que el o los promotores actúan de forma preferente en un tejido y/o órgano. En una realización particular, el o los promotores proporcionan una expresión preferente en el fruto. En una realización adicional, dicho promotor o promotores proporcionan una expresión alta en el fruto. En una realización adicional más, dicho fruto es un fruto de plátano. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende: (a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en el fruto; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en el fruto; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción.

En una realización adicional más, se proporciona un método para incrementar el contenido de carotenoides del fruto que comprende insertar en material vegetal un polinucleótido que comprende: (a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en el fruto; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y (b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en el fruto; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción y regenerar una planta que contiene el fruto a partir de dicho material e identificar el fruto que contiene unos niveles mayores de carotenoides que los de un fruto control similar. La presente invención proporciona además polinucleótidos que comprenden las secuencias que codifican la fitoeno sintetasa y las secuencias que codifican la caroteno desaturasa mencionadas anteriormente estando unidas estas secuencias de manera operativa a promotores que proporcionan una expresión preferente en el fruto o un tejido o un órgano. Dichos promotores adecuados pueden identificarse por el experto en la técnica.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la utilización de un polinucleótido o secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente en un método para la producción de plantas que son resistentes y/o tolerantes a un herbicida.

En un aspecto adicional más de la presente invención, se proporciona un método para la producción de una planta que es resistente y/o tolerante a un herbicida que comprende insertar en material vegetal un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido como se ha descrito anteriormente y regenerar una planta morfológicamente normal a partir de dicho material. La resistencia y/o tolerancia al herbicida de la planta que contiene el polinucleótido o la secuencia de polinucleótido de la invención puede compararse con una planta control similar. El término planta control similar se refiere a plantas que son sustancialmente similares a las plantas según la invención pero estas plantas control similares no contienen los polinucleótidos o secuencias de polinucleótido según la invención. Típicamente, una planta control similar comprenderá una planta de la misma especie o de una especie similar de planta en la que la planta control similar es una planta nativa o que no ha sido transformada.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13. En una realización particular, se proporciona un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13. La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica la proteína mostrada como SEQ ID NO: 14. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 87% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 91% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 92% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 93% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 94% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 96% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 97% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 98% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa. La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 99% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 13 en el que dicha secuencia todavía codifica una fitoeno sintetasa.

La presente invención proporciona además una proteína que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 14 o una variante que tiene al menos un 82% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional, dicha variante tiene al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 91% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 92% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 93% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 94% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 96% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 97% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, dicha variante tiene al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 14 en el que dicha variante todavía proporciona actividad fitoeno sintetasa. En una realización adicional más, se proporciona un polinucleótido que codifica dicha variante. Por actividad fitoeno sintetasa se quiere decir que la proteína variante tiene una función igual o similar que la proteína mostrada como SEQ ID NO: 14. El porcentaje de identidad de secuencia de las proteínas se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) comparado con la secuencia de referencia inicial (que no comprende ni adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece el resto de aminoácido idéntico en ambas secuencias para rendir el número de posiciones de correspondencia, dividiendo el número de posiciones de correspondencia por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para rendir el porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación también puede llevarse a cabo mediante implementaciones informáticas de algoritmos conocidos tales como Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Shaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. También existen algoritmos disponibles para el experto en la técnica que permiten un cálculo del porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de polinucleótidos. La variante puede diferir de la proteína mostrada como SEQ ID NO: 14 en particular en sustituciones conservativas. Dichas sustituciones conservativas se han descrito anteriormente.

La presente invención se describirá ahora mediante los ejemplos siguientes no limitativos con referencia a las Figuras y Listado de Secuencias siguientes de las cuales:

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SEQ ID NO: 1 = 12423 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Maíz-gb)-nos

SEQ ID NO: 2 = 12421 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Maíz-E1B)-nos

SEQ ID NO: 3 = 12422 = Glu- SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Maíz-E1B)-nos

SEQ ID NO: 4 = 12424 = Glu- SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Maíz-gb)-nos

SEQ ID NO: 5 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Maíz)-nos

SEQ ID NO: 6 = 11586 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Arroz)-nos

SEQ ID NO: 7 = 7651 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Pimiento)-nos

SEQ ID NO: 8 = 7650 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Tomate)-nos

SEQ ID NO: 9 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (crtB)-nos

SEQ ID NO: 10 = Fitoeno sintetasa gb (Maíz)

SEQ ID NO: 11 = Fitoeno sintetasa (Maíz) de la SEQ ID NO 5 anterior

SEQ ID NO: 12 = Fitoeno sintetasa E1B (Maíz)

SEQ ID NO: 13 = Fitoeno sintetasa (Arroz)

SEQ ID NO: 14 = Fitoeno sintetasa (Arroz) PROTEÍNA

SEQ ID NO: 15 = Fitoeno sintetasa (Pimiento)

SEQ ID NO: 16 = Fitoeno sintetasa (Tomate)

SEQ ID NO: 17 = Fitoeno sintetasa (Erwinia crtB)

SEQ ID NO: 18 = Caroteno desaturasa (Erwinia crtI) utilizada en SEQ ID NOS: 1-4

SEQ ID NO: 19 = Caroteno desaturasa (Erwinia crtI)

SEQ ID NO: 20 = Promotor de la glutelina preferente para semillas

SEQ ID NO: 21 = Promotor de la prolamina preferente para semillas

SEQ ID NO: 22 = Intrón del gen de la catalasa

SEQ ID NO: 23 = Péptido de tránsito (Subunidad pequeña de Rubisco)

SEQ ID NO: 24 = Región terminadora de la transcripción del gen de la nopalina sintetasa

SEQ ID NO: 25 = Región terminadora de la transcripción de 35S CaMV

SEQ ID NO: 26 = Región terminadora de la transcripción del inhibidor de proteinasa de patata

SEQ ID NO: 27 = Caroteno desaturasa (Tomate)

SEQ ID NO: 28 = Caroteno desaturasa (Pimiento)

SEQ ID NO: 29 = Caroteno desaturasa (Maíz)

SEQ ID NO: 30 = Caroteno desaturasa (Arroz)

SEQ ID NO: 31 = Zeta-caroteno desaturasa (Tomate)

SEQ ID NO: 32 = Zeta-caroteno desaturasa (Pimiento)

SEQ ID NO: 33 = Zeta-caroteno desaturasa (Maíz)

SEQ ID NO: 34 = Zeta-caroteno desaturasa (Arroz)

SEQ ID NOS: 35 a 38 = Cebadores

Glu = Promotor de la glutelina preferente para semillas

Pro = Promotor de la prolamina preferente para semillas

Cat = Intrón del gen de la catalasa

SSU = Péptido de tránsito (Subunidad pequeña Rubisco)

CrtI = Caroteno desaturasa de Erwinia

Pds = Caroteno desaturasa (fuente indicada en paréntesis)

Psy = Fitoeno sintetasa (fuente indicada en paréntesis)

Zds = Zeta-caroteno desaturasa

Pds = Fitoeno desaturasa

Nos = Región terminadora de la transcripción del gen de la nopalina sintetasa

35S term = Región terminadora de la transcripción de 35S CaMV

PotP1-II term = Región terminadora de la transcripción del inhibidor de proteinasa de patata

Figura 1 = Parte de la vía de biosíntesis de carotenoides empezando desde GGPP (Geranilgeranil difosfato).

Figura 2 = Construcción pPRP0117.

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Ejemplos

Los métodos generales de biología molecular se llevan a cabo según Sambrook et al (1989) "Molecular cloning: A laboratory Manual", 2a Edición, Cold Spring Harbour Lab. Press.

1.0 Construcción de vectores binarios de plantas

Las referencias de las secuencias génicas siguientes se proporcionan como aparecen listadas en la base de datos EMBL. Esta base de datos está mantenida y distribuida por el European Bioinformatics Institute (Patricia Rodriguez-Tomé, Peter J. Stoehr, Graham N. Cameron y Tomas P. Flores, "The Europen Bioinformatics Institute (EBI) databases", Nucleic Acids Res. 24:(6-13), 1996, www.ebi.ac.uk).

Se utilizó un vector pPRP0117 basado en pUC (Figura 2) para clonar todos los vectores de transformación de plantas. Éste contiene los nucleótidos -806 a +33 del gen de la glutelina de arroz como promotor (Y00687), el primer intrón del gen de la catalasa-1 del ricino alterado para eliminar las secuencias ATG, una región codificadora gus y un terminador nos. La secuencia codificadora gus se eliminó por digestión de pPRP0117 con NcoI y SfiI y se reemplazó por las secuencias codificadoras de los genes de la fitoeno sintetasa o los genes de la fitoeno desaturasa de carotenoides o se eliminó como un casete gus::nos por digestión de pPRP0117 con NocI y PacI y se reemplazó por una fusión de una región codificadora de carotenoides/terminador nos como se describe a continuación.

1.1 Construcción del vector pPRP0117 +crtI

Se clonó un casete del péptido señal de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa de guisante (SSU) (X00806) fusionado con la fitoeno desaturasa bacteriana CrtI (D90087) y un terminador nos en los sitios NcoI y PacI de pPRP0117. La secuencia crtI de las construcciones 7651, 7650 y 11586 tenía 9 nucleótidos adicionales (3 alaninas) insertados después del primer ATG con el fin de incorporar un sitio de restricción NotI para fines de clonación.

1.2 Construcción del vector binario pJH0104HygCrtI

El casete SgfI Gt::intrón::SSUcrtI::nos se clonó en el sitio PacI del vector binario pJH0104+Hyg (que contiene un gen de resistencia a higromicina para selección con antibióticos) para proporcionar la construcción pJH0104Hyg
SSUCrtI.

1.3 Construcción 7651 psy de pimiento + crtI

El intrón de la catalasa y psy de pimiento (X68017) se amplificaron independientemente mediante PCR utilizando cebadores que se superponían a ambas secuencias y se fusionaron mediante PCR recombinante y se clonaron en los sitios EcoRI y SfiI de pPRP0117. El casete Gt::intrón::psy de pimiento::nos se recuperó mediante digestión con SgfI y se clonó en el sitio PacI de pJH0104HygCrtI para proporcionar la construcción 7651.

1.4 Construcción 7650 psy de tomate + crtI

El intrón de la catalasa y psy de tomate (Y00521) se amplificaron independientemente mediante PCR utilizando cebadores que se superponían a ambas secuencias y se fusionaron mediante PCR recombinante y se clonaron en los sitios EcoRI y SfiI de pPRP0117. El casete Gt::intrón::psy de tomate::nos se recuperó mediante digestión con SgfI y se clonó en el sitio PacI de pJH0104HygCrtI para proporcionar la construcción 7650.

1.5 Construcción 11586 psy de arroz + crtI

Se extrajo ARNm poliA de hojas de arroz (Asanohikari). La primera hebra de síntesis de ADNc de psy de arroz se sintetizó utilizando el cebador antisentido 5' cgtcggcctgcatggccctacttctggctatttctcagtg 3' (SEQ ID NO: 35) y el ADNc se obtuvo mediante amplificación por PCR con este cebador antisentido y el cebador con sentido 5' ctgtccatggcggccat
cacgctcct 3' (SEQ ID NO: 36). Éste se digirió con NcoI y SfiI y se clonó en pPRP0117. El fragmento Gt::intrón::psy de arroz::nos se transfirió al vector binario pJH0104Hyg. Un casete HindIII/PacI Gt::intrón::SSUcrtI::nos se hizo romo en sus extremos y se clonó en el sitio PmeI del vector pJH0104HygpsyArroz para proporcionar la construcción 11586.

1.6 Construcción 12421 psy de maíz (E1B) + crtI

Se extrajo ARNm poliA de hojas de maíz. La primera hebra de síntesis de ADNc de psy de maíz (secuencia denominada "E1B") se sintetizó utilizando el cebador antisentido 5' cgatggcctgcatggccctaggtctggccatttctcaatg 3' (SEQ ID NO: 37) y el ADNc se obtuvo mediante amplificación por PCR con este cebador antisentido y el cebador con sentido 5' taggataagatagcaaatccatggccatcata 3' (SEQ ID NO: 38). Éste se digirió con NcoI y SfiI y se clonó en los sitios NcoI y SfiI de un vector basado en pPRP0117. El casete Gt::intrón::psy de maíz::nos se recuperó mediante digestión con HindIII/PacI y se clonó en un vector binario que contenía un casete Gt:intrón::SSUcrtI::nos para proporcionar la construcción 12421.

1.7 Construcción 12422 psy de maíz (E1B) + crtI

El vector con el casete Gt::intrón::psy de maíz::nos en el núcleo de pPRP0117 (de la construcción de 12421 anterior) se digirió con las enzimas de restricción que flanquean el intrón seguido de religación del vector con el fin de eliminar el intrón de la catalasa. El casete Gt::psy de maíz::nos se recuperó mediante digestión con HindIII/PacI y se clonó en un vector binario que contenía un casete Gt::SSUcrtI::nos para proporcionar la construcción 12422.

1.8 Construcción 12423 psy de maíz + crtI

La secuencia Y1 psy de maíz (U32636) cds se sintetizó con sitios de restricción NcoI y SfiI añadidos en los extremos 5' y 3' respectivamente. Éste se clonó en los sitios NcoI y SfiI de un vector basado en pPRP0117. El casete Gt::intrón::psy de maíz::nos se recuperó mediante digestión con HindIII/PacI y se clonó en un vector binario que contenía un casete Gt::intrón::SSUcrtI::nos para proporcionar la construcción 12423.

1.9 Construcción 12424 psy de maíz + crtI

El vector con el casete Gt::intrón::psy de maíz::nos en el núcleo de pPRP0117 (de la construcción de 12423 anterior) se digirió con las enzimas de restricción que flanquean el intrón seguido de religación del vector con el fin de eliminar el intrón de la catalasa. El casete Gt::psy de maíz::nos se recuperó mediante digestión con HindIII/PacI y se clonó en un vector binario que contenía un casete Gt::SSUcrtI::nos para proporcionar la construcción 12424.

2.0 Construcción de vectores para la transformación de plantas

Cuando se proporcionan vectores para transformar plantas que utilizan Agrobacterium, es preferible que las secuencias según la invención se inserten entre las regiones que limitan una región única TADN. Agrobacterium puede transformarse según métodos que son muy conocidos para el experto en la técnica y/o mediante los métodos descritos en la presente memoria.

3.0 Transformación de Arroz

Basada en el protocolo publicado por Hiei et al (1994 The Plant Journal, 6(2), 271-282). La modificación clave implica la utilización de una cepa supervirulenta en combinación con un vector binario estándar.

El procedimiento básico es el siguiente:

Semillas maduras de arroz (Asanohikari) se descascaran y se esteriliza su superficie con etanol al 70% durante un minuto seguido de Hipoclorito sódico al 4% + Tween durante 30 minutos. Las semillas se siembran en un medio de inducción de callos (CIM) (sales N6, vitaminas N6, 30 g/l de sacarosa, 1 g/l de hidrolizado de caseína, 2 mg/l de 2,4-D, pH 5,8, 4 g/l de Gelrite) y se ponen en oscuridad a 30ºC. Después de 3 semanas se aíslan los callos embriogénicos y se plaquean en CIM y se ponen en las mismas condiciones. Al mismo tiempo, se establecen cultivos de Agrobacterium (cepa AGL1 más binario) mediante la dispersión de inóculos en placas LB más Kanamicina (50 mg/l). Después de tres días, Agrobacterium se raspa de la placa y se resuspende en AA1 + AS (sales AA, vitaminas B5, Aminoácidos AA, 68,5 g/l de sacarosa, 36 g/l de glucosa, 0,5 g/l de hidrolizado de caseína, 100 \muM de Acetosiringona, pH 5,2) hasta una densidad óptica de 0,1 a 600 nm. El callo embriogénico se inocula con la disolución de Agrobacterium durante 10 minutos después de lo cual los callos se dispersan en placas de R2COMAS (Micro sales R2, Macro sales ½ R2, Vitaminas B5, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 1 g/l de hidrolizado de caseína, 2 mg/l de 2,4-D, 100 \muM de Acetosiringona, pH 5,2) y se ponen en oscuridad a 26ºC. Después de tres días, los callos se transfieren a medio de selección (sales N6, vitaminas N6, 30 g/l de sacarosa, 1 g/l de hidrolizado de caseína, 2 mg/l de 2,4-D, 300 mg/l de Timentina, 50 mg/l de Higromicina, 4 g/l de Gelrite, pH 5,8) y se ponen en la luz a 30ºC. Todas las etapas siguientes se producen bajo las mismas condiciones de crecimiento (Luz, 30ºC). Después de tres semanas, los callos potencialmente transgénicos se transfieren a un medio de pre-regeneración (sales y vitaminas N6, 30 g/l de sacarosa, 1 g/l de hidrolizado de caseína, 1 mg/l de 2,4-D, 300 mg/l de Timentina, 50 mg/l de Higromicina, 6 g/l de Gelrite, pH 5,8). Después de dos semanas, los callos embriogénicos de alta calidad se transfieren a medio de regeneración (Micro N6, Macro N6 ½, vitaminas N6, aminoácidos AA, 20 g/l de sacarosa, 1 g/l de hidrolizado de caseína, 0,2 mg/l de NAA, 1 mg/l de Kinetina, 50 mg/l de Higromicina, pH 5,8, Gelrite 6 g/l). Después de tres semanas, las plántulas que se regeneran se subcultivan en medio de enraizamiento (sales MS ½, Vitaminas B5 ½, 10 g/l de sacarosa, Higromicina 25 mg/l, pH 5,8, 8 g/l de microagar). Después de dos semanas, las plántulas que tienen sistemas de raíz robustos se transfieren a tierra (50% John Innes #3, 50% turba, 26ºC, fotoperiodo de 16 horas) y se cubren con un agrotextil térmico hasta que las plantas se establecen.

4.0 Análisis de carotenoides en transformantes de arroz

Los carotenoides se extraen de semillas cosechadas en la madurez. La semilla se descascara utilizando un Descascarador de Arroz con Electromoción TR-200 y después se pulen durante 1 min. con un pulidor Pearlest (Kett). Se eliminan todas las semillas blancas o decoloreadas y 0,5 g de la muestra se muelen durante 2 minutos utilizando un Mezclador/Molino Glen Creston 8000. Puede obtenerse un total de 1 g de material/planta molido con este método. Esto puede mezclarse concienzudamente antes de extraer 2 x 0,5 g partes del polvo. Puede añadirse un compuesto estándar a las muestras para cuantificar las recuperaciones. Astaxantina y equinenona son ejemplos de estándares que pueden utilizarse. Las muestras se hidratan con 1 ml de agua y se mezclan utilizando un vórtex durante unos pocos segundos. Se añaden 6 ml de acetona y las muestras se sonican durante 2 minutos. Las muestras se centrifugan durante 5 min. a 3.500 rpm. Los sobrenadantes se decantan y las muestras se vuelven a extraer dos veces más con 3 ml de acetona, repitiendo las etapas de sonicación/centrifugación entre las extracciones. Se lleva a cabo una extracción con 2 ml de terc-metilbutiléter incluyendo las etapas de sonicación/centrifugación y todos los sobrenadantes de una muestra se juntan. El volumen total de cada extracto se ajusta a 14 ml con acetona y se repite la etapa de centrifugación. Se evapora a sequedad una alicuota de 2 ml de cada muestra bajo una corriente de nitrógeno gas. Estas alicuotas se vuelven a disolver en 75 \mul de acetato de etilo, se agitan durante 5-10 s y se transfieren a viales de inyección ámbar de HPLC. Los viales se sellan inmediatamente y se centrifugan de nuevo a 3.500 rpm antes del análisis por HPLC.

La cuantificación por HPLC se basa en el factor de respuesta determinado para cada estándar de referencia. La concentración global de los estándares de referencia preparados y disueltos se mide espectrofotométricamente tomando como base los coeficientes de extinción molar publicados y/o la absorbancia medida para la disolución con una concentración del 1% utilizando una longitud de paso de 1 cm (A1%1cm) (Ref: Britton G., Liaanen-Jensen S. y Pfander H.P. (1995) Carotenoids: Spectroscopy Vol 1B p57-62, Birkhauser Verlag, Basel, ISBN 3-7643-2909-2). Para cada disolución madre de los estándares, se determina la pureza del componente principal por HPLC. Para los componentes en los que no está disponible un estándar de referencia, por ejemplo, varios isómeros cis, los resultados cuantitativos se expresan utilizando el factor de respuesta para el del \beta-caroteno.

4.1 Equipo y Condiciones para HPLC

3

4

Condiciones del gradiente (6%/min)

5

5.0 Resultados de la cuantificación de carotenoides por HPLC

Resultados para plantas de arroz transformadas con la construcción 11586 (construcción descrita en 1.5 anterior).

6

7

8

6.0 Transformación de arroz - método utilizado para la transformación de arroz con Agrobacterium que comprende las construcciones 12421, 12422, 12423 y 12424 (construcciones descritas en los ejemplos 1.6, 1.7, 1.8 y 1.9 respectivamente)

Para este ejemplo, se utiliza arroz (Oryza sativa) para generar plantas transgénicas. Pueden utilizarse varios cultivos de arroz (Hiei et al., 1994, Plant Journal 6:271-282; Dong et al., 1996, Molecular Breeding 2:267-276; Hiei et al., 1997, Plant Molecular Biology, 35:205-218). Además, los diferentes constituyentes de los medios descritos a continuación pueden variarse en concentración o sustituirse. Las respuestas embriogénicas se inician y/o los cultivos se establecen a partir de embriones maduros cultivando en medio MS-CIM (sales basales MS, 4,3 g/litro; vitaminas B5 (200 x), 5 ml/litro; Sacarosa, 30 g/litro; prolina, 500 mg/litro; glutamina, 500 mg/litro; hidrolizado de caseína, 300 mg/litro; 2,4-D (1 mg/ml), 2 ml/litro; ajustar pH a 5,8 con 1 N KOH; Fitagel, 3 g/litro). Bien embriones maduros en las etapas iniciales de la respuesta del cultivo o líneas de cultivo establecidas se inoculan y co-cultivan con la cepa de Agrobacterium LBA4404 que contiene la construcción de vector deseada. Agrobacterium se cultiva a partir de cultivos madre en glicerol en medio YPC sólido (100 mg/L de espectinomicina y cualquier otro antibiótico apropiado) durante \sim2 días a 28ºC. Agrobacterium se resuspende en medio MS-CIM líquido. El cultivo de Agrobacterium se diluye hasta una DO600 de 0,2-0,3 y se añade acetosiringona hasta una concentración final de 200 \muM. Agrobacterium se induce con acetosiringona antes de mezclar la disolución con los cultivos de arroz. Para la inoculación, los cultivos se sumergen en la suspensión bacteriana. La suspensión bacteriana líquida se elimina y los cultivos inoculados se ponen en medio de co-cultivo y se incuban a 22ºC durante dos días. Los cultivos se transfieren a medio MS-CIM con Ticarcilina (400 mg/litro) para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Para las construcciones que utilizan el gen marcador seleccionable PMI (Reed et al., In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 37:127-132), los cultivos se transfieren a medio de selección que contiene Manosa como fuente de carbohidrato (MS con 2% de Manosa, 300 mg/litro de Ticarcilina) después de 7 días y se cultivan durante 3-4 semanas en oscuridad. Las colonias resistentes se transfieren a medio de inducción de la regeneración (MS sin 2,4-D, 0,5 mg/litro de IAA, 1 mg/litro de zeatina, 200 mg/litro de timentina, 2% de Manosa y 3% de Sorbitol) y se crecen en oscuridad durante 14 días. Las colonias que proliferan se transfieren a otro ciclo de medio de inducción de la regeneración y se trasladan a la habitación de crecimiento con luz. Los brotes regenerados se transfieren a medio GA7-1 (MS sin hormonas y 2% de Sorbitol) durante 2 semanas y se trasladan al invernadero cuando son lo suficientemente grandes y tienen raíces adecuadas. Las plantas se transplantan a tierra en el invernadero y se crecen hasta la madurez.

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7.0 Método de extracción/cuantificación de carotenoides - para plantas transformadas según el Ejemplo 6.0

(a) La muestra se tritura en una Geno/Grinder a 1.600 rpm durante 40 segundos.

(b) Se pesan cantidades representativas de la muestra homogeneizada (0,1 g) en un recipiente de extracción adecuado (por ejemplo, tubo de microcentrífuga de 2 ml). Se registra el peso de la muestra.

(c) Las muestras se hidratan con agua (200 \mul) y se agitan con vórtex durante aproximadamente 2-3 segundos y se dejan durante aproximadamente 10 minutos.

(d) Se añade acetona (1,2 ml) a la muestra.

(e) Ultrasonicar la muestra durante 5 minutos.

(f) Centrifugar la muestra durante 3 min a 6.000 rpm y transferir el sobrenadante a otro tubo de tamaño apropiado.

(g) Las etapas (d) a (f) se repiten y se combinan con el extracto anterior.

(h) Las etapas (d) a (f) se repiten con terc-butilmetiléter (400 \mul) y se combinan con los extractos de acetona.

(i) Todos los extractos combinados se transfieren a un tubo de tamaño apropiado y se evaporan a sequedad bajo una corriente de nitrógeno gas.

(j) Las muestras se vuelven a disolver en 2 ml de acetato de etilo + 0,5% BHT, se agitan con vórtex o se ultrasonican durante 5-10 segundos y se centrifugan a 3.500 rpm durante 5 minutos antes del análisis por HPLC.

(k) Se determina la absorción a la longitud de onda de 450 nm en un espectrofotómetro para todas las muestras y se calcula la concentración total de carotenoides tomando como base un valor \varepsilon de 124865.

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8.0 Resultados del método del Ejemplo 7.0

9

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10

11

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12

13

Aunque la invención se ha descrito mediante los ejemplos referidos anteriormente y el Listado de Secuencias y Figuras como se proporcionan en la presente memoria, será evidente que pueden practicarse modificaciones y cambios que permanecen en el ámbito de la presente invención.

Referencias

14

15

16

<110> SYNGENTA LIMITED

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<120> AUMENTO EN LA ACUMULACIÓN DE CAROTENOIDES EN PLANTAS

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<130> 70237/WO

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US60/457,053

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-03-24

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 38

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 5630

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO - 12423

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<400> 1

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17

18

19

20

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<210> 2

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<211> 5630

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO - 12421

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<400> 2

21

22

23

24

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<210>

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<211> 5180

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO - 12422

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<400> 3

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25

26

27

28

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<210> 4

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<211> 5180

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO - 12424

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<400> 4

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29

30

31

32

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<210> 5

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<211> 5653

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> sintético

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<400> 5

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33

34

35

36

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<210> 6

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<211> 5714

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<212> adn

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> SINTÉTICO - 11586

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<400> 6

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37

38

39

40

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<210> 7

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<211> 5974

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> SINTÉTICO - 7651

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<400> 7

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41

42

43

44

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<210> 8

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<211> 5782

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO - 7650

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<400> 8

45

46

47

48

49

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<210> 9

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<211> 5551

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO

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<400> 9

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50

51

52

53

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<210> 10

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<211> 1233

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 10

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54

55

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<210> 11

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<211> 1233

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 11

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56

57

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<210> 12

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<211> 1233

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 12

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58

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<210> 13

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<211> 1263

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<212> ADN

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<213> Oryza sp.

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<400> 13

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59

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<210> 14

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<211> 420

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<212> PRT

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<213> Oryza sp.

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<400> 14

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60

61

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<210> 15

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<211> 1260

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<212> ADN

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<213> Capsicum annuum

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<400> 15

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62

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<210> 16

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<211> 1239

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<212> ADN

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<213> Lycopersicon esculentum

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<400> 16

63

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<210> 17

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<211> 891

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<212> ADN

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<213> Erwinia sp.

\newpage

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<400> 17

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64

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<210> 18

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<211> 1479

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<212> ADN

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<213> Erwinia sp.

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<400> 18

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65

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<210> 19

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<211> 1488

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<212> ADN

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<213> Erwinia sp.

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<400> 19

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66

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<210> 20

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<211> 839

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<212> ADN

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<213> Oryza sp.

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<400> 20

67

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<210> 21

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<211> 642

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<212> ADN

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<213> Oryza sp.

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<400> 21

68

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<210> 22

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<211> 190

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> SINTÉTICO - INTRÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

69

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<210> 23

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<211> 171

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> PÉPTIDO DE TRANSPORTE

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TERMINADOR DE NOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> REGIÓN TERMINADORA DE CAMV 35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> REGIÓN TERMINADORA DEL GEN DEL INHIBIDOR DE LA PROTEINASA DE PATATA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

74

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1749

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Capsicum annuum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2027

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

81

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1931

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1982

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Capsicum annuum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2265

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1632

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcggcctg catggcccta cttctggcta tttctcagtg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtccatgg cggccatcac gctcct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatggcctg catggcccta ggtctggcca tttctcaatg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggataaga tagcaaatcc atggccatca ta

\hfill

Claims

1. Un polinucleótido que comprende:

(a) una región que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido procedente de una bacteria codificando la secuencia una caroteno desaturasa; y (iii) una región terminadora de la transcripción; y

(b) una región adicional que comprende como componentes unidos de manera operativa (i) un promotor que proporciona una expresión preferente en la semilla; y (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una fitoeno sintetasa procediendo la secuencia de maíz (Zea sp.) o arroz (Orzya sp.); y (iii) una región terminadora de la transcripción.

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2. Un polinucleótido según la reivindicación 1 en el que la secuencia que codifica la caroteno desaturasa procede de Erwinia sp.

3. Un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que dicho promotor se selecciona del promotor de la Glutelina 1 y el promotor de la Prolamina y dicha región terminadora de la transcripción se selecciona de las regiones terminadoras de la transcripción Nos; CAMV 35S y PotP1-II.

4. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la secuencia que codifica la caroteno desaturasa y la secuencia que codifica la fitoeno sintetasa comprenden además una secuencia que codifica una secuencia de direccionamiento a plástidos.

5. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; y 6.

6. Una secuencia de polinucleótido que es el complemento de una que hibrida con un polinucleótido según la reivindicación 5 a una temperatura de aproximadamente 65ºC en una disolución que contiene 6 x SSC, 0,01% SDS y 0,25% de leche desnatada en polvo, seguido de lavado a la misma temperatura en una disolución que contiene 0,2 x SSC y 0,1% SDS en el que dicha secuencia de polinucleótido comprende además una región que codifica una caroteno desaturasa y una región más que codifica una fitoeno sintetasa y en el que cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce un nivel de carotenoides de al menos 10 \mug/g de endospermo de dicha semilla.

7. Una secuencia de polinucleótido que es el complemento de una que hibrida con un polinucleótido según la reivindicación 5 a una temperatura de aproximadamente 65ºC en una disolución que contiene 6 x SSC, 0,01% SDS y 0,25% de leche desnatada en polvo, seguido de lavado a la misma temperatura en una disolución que contiene 0,2 x SSC y 0,1% SDS en el que dicha secuencia de polinucleótido comprende además una región que codifica una caroteno desaturasa y una región más que codifica una fitoeno sintetasa y cuando dicha secuencia de polinucleótido se inserta en material vegetal, la semilla de una planta regenerada a partir de dicho material produce una cantidad de carotenoides de al menos el 80% del contenido de carotenoides de una semilla que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; 5 y 6.

8. Una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 en la que dicha semilla es una semilla de arroz.

9. Un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además una región que codifica un marcador seleccionable.

10. Un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según la reivindicación 9 en la que dicho marcador seleccionable comprende un gen de manosa-6-fosfato isomerasa.

11. Un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que está optimizada a nivel de codones para la expresión en una especie de planta particular.

12. Un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según la reivindicación 11 en la que dicha especie de planta es arroz (Orzya sp.).

13. Un vector que comprende un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un método para incrementar el contenido de carotenoides de semillas que comprende insertar en el material vegetal un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o un vector según la reivindicación 13; y regenerar una planta que contiene la semilla a partir de dicho material e identificar las semillas que contienen niveles de carotenoides mayores que los de semillas control similares.

15. Un método para incrementar el contenido de carotenoides de una semilla que comprende insertar en el material vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; 5 y 6 y regenerar una planta que contiene la semilla a partir de dicho material e identificar la semilla que contiene niveles de carotenoides mayores que los de una semilla control similar.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 en el que dicha semilla contiene un incremento de carotenoides de al menos sesenta veces cuando se compara con una semilla control similar.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 en el que dicha semilla contiene un nivel de carotenoides de al menos 10 \mug/g de endospermo de dicha semilla.

18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en el que dichos carotenoides se seleccionan del grupo que consiste en: licopeno; alfa-caroteno; luteína; beta-caroteno; zeantina; anteraxantina; violaxantina; y neoxantina o una combinación de éstos.

19. Una planta o material vegetal que comprende un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o un vector según la reivindicación 13.

20. Una planta o material vegetal según la reivindicación 19 que es una planta de arroz o es material vegetal de arroz.

21. Una planta o material vegetal según la reivindicación 19 que es una planta de maíz o es material vegetal de maíz.

22. Utilización de un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de un vector según la reivindicación 13 en un método para la producción de semillas que contienen cantidades incrementadas de carotenoides.

23. Utilización de un polinucleótido seleccionado del grupo mostrado como SEQ ID NO: 1; 2; 3; 4; 5 y 6 para la producción de una semilla que contiene niveles de carotenoides mayores que los de una semilla control similar.