CN109055409B - 一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种编码裙带菜ζ‑胡萝卜素脱氢酶的cDNA序列及其氨基酸序列与应用。裙带菜ζ‑胡萝卜素脱氢酶基因的全长cDNA序列通过快速扩增cDNA末端途径从裙带菜中分离得到并命名为UPZDS，全长cDNA序列为2804bp，含有1821bp的开放阅读框ORF，编码606个氨基酸，其分子量为65.82717kDa。该裙带菜ζ‑胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的克隆为研究岩藻黄素在褐藻中的生物合成途径奠定了基础，对于褐藻中类胡萝卜素的医药保健以及工业化生产具有重要意义。

Description

一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因与应用

技术领域：

本发明涉及一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的克隆和功能验证，尤其是涉及一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

类胡萝卜素分为两类：一类是不含氧的烃类，即胡萝卜素；另一类是胡萝卜素的含氧衍生物，即叶黄素类。岩藻黄素又称为褐藻黄素，属于类胡萝卜素中叶黄素类，是一类脂溶性色素，广泛分布于褐藻门、硅藻纲。在红藻和绿藻中类胡萝卜素的生物合成途径已经有完整的说明，相反，在褐藻中，类胡萝卜素的生物合成途径尚不完全清楚。因此，研究裙带菜中类胡萝卜素生物合成途径中涉及到的关键酶的基因，并对其进行克隆及其功能的研究，有助于了解褐藻属植物类胡萝卜素生物合成及其分子水平的调控，对于褐藻中类胡萝卜素的医药保健以及工业化生产具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因与应用。

为了实现上述发明目的，本发明的一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的cDNA序列及其氨基酸序列按照以下方法操作：

一、裙带菜ζ-carotene desaturase基因cDNA部分序列克隆

cDNA合成采用反转录试剂盒(PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA SynthesisKit，TaKaRa)，并按照反转录试剂盒说明书进行，以适量总RNA为模板，以Oligo(dT)为引物，在PrimeScript II RTase逆转录酶的作用下，42℃温育1h，合成cDNA第一链，-20℃保存；

根据已知的裙带菜近缘藻类的ZDS序列资料及裙带菜转录组测序数据，设计一对引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；

正向引物ZDS-P1：5’-TGACTTTGTCGCCCCCTCCATGG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向引物ZDS-P2：5’-AAGGACGGGAACCACATCGAGATGG-3’(SEQ ID NO:4)。

以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR程序：94℃预变性3min，94℃30s，56℃30s，72℃1min10s，30个循环，72℃延伸10min；得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并将其连接到pMD-18T Vector上，构建pMD-18T-ZDS，将连接PCR产物的载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并测序；

二、裙带菜ζ-carotene desaturase基因3’端cDNA序列克隆

3’端cDNA序列克隆采用3’-RACE方法，试剂盒为

RACE 5’/3’Kit UserManual(TaKaRa公司产品)，并按照3’-RACE试剂盒说明书进行。根据裙带菜ZDS大片段cDNA序列设计克隆3’端cDNA序列所需的下列引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；

正向引物3’GSP1：5’-GGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCC-3’(SEQ ID NO:5)；

正向引物3’GSP2：5’-CGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTAC-3’(SEQ ID NO:6)。

克隆得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并将其连接到pMD-18T Vector上，构建pMD-18T-ZDS；将连接PCR产物的载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并测序；测序结果表明，到polaA尾巴该序列大小为1033bp，该3’端序列中含有终止密码子TGA和一段279bp的编码序列(+2294～+2572)；

三、裙带菜ζ-carotene desaturase基因5’端cDNA序列克隆

5’端cDNA序列克隆采用5’-RACE方法，试剂盒为

RACE 5’/3’Kit(TaKaRa公司产品)，并按照5’-RACE试剂盒说明书进行；根据裙带菜ZDS大片段cDNA序列设计克隆5’端cDNA序列所需的下列引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

反向引物5’GSP1：5’-GACGTCCTCCATCGCAGCGTCGAAGTTG-3’(SEQ ID NO:7)；

反向引物5’GSP2：5’-CATGCGGAAATCCAAAGCCCCCAGCTCG-3’(SEQ ID NO:8)。

克隆得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并将其连接到pMD-18T Vector上，构建pMD-18T-ZDS；将连接PCR产物的载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并测序；序列分析表明，该序列大小为835bp，其中包括完整的5’端序列603bp。该5’端序列中含有起始密码子ATG，以及起始密码子ATG前面的一段187bp的前导序列(+1～+187)。

四、裙带菜ζ-carotene desaturase基因全长cDNA序列克隆

按照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的说明书提取裙带菜总RNA，并按照反转录试剂盒要求，取7μL总RNA为模板，合成cDNA第一链，冻存于-80℃备用。

对3个序列的测序结果进行拼接，推断裙带菜ZDS基因全长cDNA序列。利用ORFFinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对拼接的全长cDNA序列进行开放阅读框的查找，设计引物ZDScF和ZDScR。并且参考表达载体pET28a的多克隆位点，分别在引物的5’端引入BamH I,Xho I的酶切位点,以总cDNA为模板进行PCR扩增。

ZDScF：ACTGGATCCATGAAGGCTTCAGCAGCATTGGT(SEQ ID NO:9)

ZDScR：ACTCTCGAGTCACGCAGACGCGGAAACG(SEQ ID NO:10)

PCR反应条件为：95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸120s，共进行30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的DNA，并将连接到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-ZDS，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选转化子，经过菌落PCR和酶切检测，筛选出阳性克隆，命名为pMD-18T-ZDS。测序结果表明，该序列大小为1821bp。

序列1：裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)的cDNAACATGGGGACTGAGACAGACCAATACGGGGTTCTGTGTCGTCGCTGCCAGGCCAAGGAGGGAACAAGTGGAAGGAAGGAAGGAGTGGCTTTGCCAATACGTCCGTATTTCGCCGGCGCAGCTTACCTGTTTCGCTGCAGGCTAGAGCGTAGCGGACTCCAACCTCCTCTCCACCTCTGGCGGTGGCGATGAAGGCTTCAGCAGCATTGGTGCTGGGCACGGCGTTGGCGGGGTCGACGTTAAGAGATGCGTCTGCATTCGTCGGTACGCCGCTGGCCCGGCTGTCTTCGGTAGCGCCGGCGGCTCCTTCTTCCTCGGTAGCAATGCGGCCCAGGACGGGCGTGAGCATGGTGGCCGGCGTGGCCGGCACGGTGGGGGGATCGGGGATTGAGCGCATCAAGGGCACCGACAAGGAGGGGCTACTGGATGTCAACCGCATTGACAGGGCGCGCAAGGGGCCGGAGATCAAGCTGCCCCAGGACCAAAAAATGAAAATTGGCATTATCGGGGGCGGGTTGGCGGGGATGATCACGGCGATGGACCTTTCGGAGGCAGGTCACCAGGTGGAGATATTCGAGGCGCGGCCTTTCATGGGGGGTAAGGTGGGGAGCTGGAAGGACAAGGACGGGAACCACATCGAGATGGGACTGCACGTGTTTTTCGGATGCTACTACAATTTCTTTGGGATTTTCCGGCGTCTCGGGATTTTCGACTCGGCGCTGAGGCTCAAGGTTCACACGCATCAGTTCGTGAACAAGGGCGGCGAGCTGGGGGCTTTGGATTTCCGCATGGGCGGCATTGGGGCACCCTTCAACGGGCTCAAAGCTTTCGCGACTACGGATCAGCTGGGGATCTACGATAAGCTGGCGAACGCACTGGCGTTGGGCACGTCGCCCATCGTAAAAGCTCTGTTCAACTTCGACGCTGCGATGGAGGACGTCCGTGCGCTGGACAAGATGACCTTCAGCGAGTGGTTCGAGGGGAAAGGGGGATCGCGGGGCTCCATCTCTCGCATGTGGGACCCTGTCGCGTACGCGCTCGGCTTCATCGACTGCGACCACATCTCGGCCAGGTGCATGCTCACCATCTTCCAGCTGTTCGCCATTCGCTCGGAGGCATCGGTTCTCCGAATGCTGGAGGGATCGCCCGACGACTTCATTCACCAGCCCATTCTCAAGTATTTGGCTGAGCGCGGCGTGACCCACCAGACCTCTCGCCGGATCACGGAGATCAGACACGAGGTGGACGCTGACGGCAAGCCGACCCACGTTAACGGCCTCGTCATTGCGGGAGGCGGGACGGAGGAGGAGTACCGAGAGTACGACGTCGTCATTGCCGCCACCGACGTGCCGGGGATCAAGAAGCTCCTCCCCGAGAATTTCCGCAAGTACGACATGTTCGACAACATCTACAAGCTGGACGGTGTCCCGGTAGCCACGGTGCAGCTGCGGTTCGATGGCTGGGTTACCGAGCTCAACGATGCGGAAAAGATGAAGGACGTTGCCGGCGACTACGGCCAGGGTCGGGCGCCGGGCATGGACAACTTGTTGTACACCGCTGACGCCGAGTTCTCGTGCTTCGCGGACCTTGCTTTGACCAGCCCTAGCTCGGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCCCTGCTGCAGTGCGTTATGACGCCAGGAGACAAATGGATGCCGAAGACGACGGACGAGATCGCCGCCGTGTGCCTTGAGCAGGTGTTGGAACTGTTCCCGTCGGCACGTGACCTGAACTGCACGTGGACCAACGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTACCGCGAGGGACCGGGCCTGGACCAGTATCGGCCCGACCAGAGGACGCCCATCCCTAACTTCTTCATGGCCGGCTCGTACACGTACCAGGACTACATTGACTCCATGGAGGGGGCGACAAAGTCAGCCCTCTTGTGCGCCGACCGTGTTTTAGAGGACACGCCGGCACTAGCGAAGTTGACCAAGGATCGAGCGGCCGTTTCCGCGTCTGCGTGAAAAAATGAACTTTAACCGCTGTAGAGCTGCCCCTCGTCTTTTTTTACAAACCGCTTGAAATTTGTGTGGCATATTTTTTGCTGCGGTACGAGGGGTACAAACGCCTCCTCCTCCCGCATTTTTGAAACCCCCGCCAAGTGTCAAGAGTGTGTGCGGTTGCGCTTTTGCATTTCGCATTTTGCTTTTGCATTTTCGATTCGAGTTTTTTGTTTGCGATTTCGTTTTGCGGAGGGAGCGGTTCGCGTTTTCGAAAGGCGTTTGAAAGACCCGGTGTTTTTTTTTACGATGACATGGCGTTACGTAAGCCACCTTGGGCGGTCGGAGGAAGACTGGAGATTCGAAAGATGGTCCGGCAAGGACCCGATGTACCTTAGTAGACCTTTTTTGGAAACGCTTGGGGGGTGTACTCAACGAAACGCTCGGGGGGGGGGGGGTTGCAGAGGCTTGTGGGGTTATAGAGCGCCAAATCCTCCTCTTTTTCTCATCTTTGTGCTGAGCTGGCCTCTTTCTCACCTTTCACGCTGGGCTAGATGGTTGCTATGCCCGTTTTTTTGCTACTATTGATAAGTACCTGGTAGTTTTTCCGGGACTGCGTGGTGGCTACGCGCAAGATGGGCGGCAATAGCGTGGTGTGGGGCGTGGAGTTGGAACTGCCCGCAGGTACGAAGCTCGTTGCTGGTGGTGTCTCGTCAAATTGTGTTGAGCGGGGCTGTCTACACCGCGAGTTTCGAGAATGCTATCAATAATGCTAATAACGCAACCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGT(SEQ ID NO:1)

序列2：裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)cDNA编码的氨基酸

HGD*DRPIRGSVSSLPGQGGNKWKEGRSGFANTSVFRRRSLPVSLQARA*RTPTSSPPLAVAMKASAALVLGTALAGSTLRDASAFVGTPLARLSSVAPAAPSSSVAMRPRTGVSMVAGVAGTVGGSGIERIKGTDKEGLLDVNRIDRARKGPEIKLPQDQKMKIGIIGGGLAGMITAMDLSEAGHQVEIFEARPFMGGKVGSWKDKDGNHIEMGLHVFFGCYYNFFGIFRRLGIFDSALRLKVHTHQFVNKGGELGALDFRMGGIGAPFNGLKAFATTDQLGIYDKLANALALGTSPIVKALFNFDAAMEDVRALDKMTFSEWFEGKGGSRGSISRMWDPVAYALGFIDCDHISARCMLTIFQLFAIRSEASVLRMLEGSPDDFIHQPILKYLAERGVTHQTSRRITEIRHEVDADGKPTHVNGLVIAGGGTEEEYREYDVVIAATDVPGIKKLLPENFRKYDMFDNIYKLDGVPVATVQLRFDGWVTELNDAEKMKDVAGDYGQGRAPGMDNLLYTADAEFSCFADLALTSPSSDYYKPGEGSLLQCVMTPGDKWMPKTTDEIAAVCLEQVLELFPSARDLNCTWTNVVKVGQSLYREGPGLDQYRPDQRTPIPNFFMAGSYTYQDYIDSMEGATKSALLCADRVLEDTPALAKLTKDRAAVSASA*KNEL*PL*SCPSSFFTNRLKFVWHIFCCGTRGTNASSSRIFETPAKCQECVRLRFCISHFAFAFSIRVFCLRFRFAEGAVRVFERRLKDPVFFFTMTWRYVSHLGRSEEDWRFERWSGKDPMYLSRPFLETLGGCTQRNARGGGGCRGLWGYRAPNPPLFLIFVLSWPLSHLSRWARWLLCPFFCYY**VPGSFSGTAWWLRARWAAIAWCGAWSWNCPQVRSSLLVVSRQIVLSGAVYTASFENAINNANNATRKKKKKKKKKK(SEQ ID NO:2)

本发明涉及的裙带菜ZDS基因的全长cDNA序列是一个完整的cDNA序列，通过快速扩增cDNA末端途径(RACE)从裙带菜中分离得到并命名为UPZDS。全长cDNA序列为2804bp，含有1821bp的开放阅读框(ORF)，编码606个氨基酸，其分子量为65.82717kDa。与已知藻类相比，推测的蛋白质序列具有高度的同源性。系统发育分析表明，UPZDS与褐藻ZDS的亲缘关系较其他物种更为密切。

裙带菜与其他几种近缘藻类ZDS基因的同源性比较结果发现，蛋白质序列的同源性程度高于核苷酸序列同源性，说明ZDS在氨基酸水平上具有相当的保守性，这可能与其自身的功能密切相关。ζ-胡萝卜素脱氢酶是类胡萝卜素合成途径的关键酶，它参与催化了ζ-胡萝卜素转化为番茄红素。并且为进一步深入探索该酶在类胡萝卜素合成途径中的功能奠定了基础，为研究岩藻黄素在褐藻中的合成途径提供了有力的依据。

本发明通过研究裙带菜中类胡萝卜素生物合成途径中涉及到的关键酶的基因，能够用于褐藻中类胡萝卜素的医药保健以及工业化生产。

说明书附图：

图1是从裙带菜中提取全长ZDS基因示意图；

图2是ZDS氨基酸序列系统发育树；

图3是UPZDS三维模型图；

图4是UPZDS重组蛋白的SDS-PAGE图；

图5是UPZDS基因功能验证发酵产物HPLC放大图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步阐述。

实施例1、

从裙带菜中提取全长ZDS基因示意图如图1所示。图1中，A是UpZDS基因cDNA部分序列克隆电泳图；B是5’-RACE扩增产物电泳图(M:5K DNA Marker；1:ZDS 5’端第一轮扩增的产物；2:ZDS 5’端第二轮扩增的产物)；C是3′-RACE扩增产物电泳图(M:5K DNA Marker；1:ZDS3’端第一轮扩增的产物；2:ZDS 3’端第二轮扩增的产物)；D是UPZDS基因的cDNA全长扩增产物电泳图；E是从裙带菜中克隆全长ZDS基因示意图，并标明PCR扩增片段的长度和使用的PCR引物。

操作步骤如下：

一、裙带菜ζ-carotene desaturase基因cDNA部分序列克隆

cDNA合成采用反转录试剂盒(PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA SynthesisKit，TaKaRa)，并按照反转录试剂盒说明书进行，以适量总RNA为模板，以Oligo(dT)为引物，在PrimeScript II RTase逆转录酶的作用下，42℃温育1h，合成cDNA第一链，-20℃保存；

根据已知的裙带菜近缘藻类的ZDS序列资料及裙带菜转录组测序数据，设计一对引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；

正向引物ZDS-P1：5’-TGACTTTGTCGCCCCCTCCATGG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向引物ZDS-P2：5’-AAGGACGGGAACCACATCGAGATGG-3’(SEQ ID NO:4)。

以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR程序：94℃预变性3min，94℃30s，56℃30s，72℃1min10s，30个循环，72℃延伸10min；得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并将其连接到pMD-18T Vector上，构建pMD-18T-ZDS，将连接PCR产物的载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并测序；

克隆的部分cDNA序列：

AAGGACGGGAACCACATCGAGATGGGACTGCACGTGTTTTTCGGATGCTACTACAATTTCTTTGGGATTTTCCGGCGTCTCGGGATTTTCGACTCGGCGCTGAGGCTCAAGGTTCACACGCATCAGTTCGTGAACAAGGGCGGCGAGCTGGGGGCTTTGGATTTCCGCATGGGCGGCATTGGGGCACCCTTCAACGGGCTCAAAGCTTTCGCGACTACGGATCAGCTGGGGATCTACGATAAGCTGGCGAACGCACTGGCGTTGGGCACGTCGCCCATCGTAAAAGCTCTGTTCAACTTCGACGCTGCGATGGAGGACGTCCGTGCGCTGGACAAGATGACCTTCAGCGAGTGGTTCGAGGGGAAAGGGGGATCGCGGGGCTCCATCTCTCGCATGTGGGACCCTGTCGCGTACGCGCTCGGCTTCATCGACTGCGACCACATCTCGGCCAGGTGCATGCTCACCATCTTCCAGCTGTTCGCCATTCGCTCGGAGGCATCGGTTCTCCGAATGCTGGAGGGATCGCCCGACGACTTCATTCACCAGCCCATTCTCAAGTATTTGGCTGAGCGCGGCGTGACCCACCAGACCTCTCGCCGGATCACGGAGATCAGACACGAGGTGGACGCTGACGGCAAGCCGACCCACGTTAACGGCCTCGTCATTGCGGGAGGCGGGACGGAGGAGGAGTACCGAGAGTACGACGTCGTCATTGCCGCCACCGACGTGCCGGGGATCAAGAAGCTCCTCCCCGAGAATTTCCGCAAGTACGACATGTTCGACAACATCTACAAGCTGGACGGTGTCCCGGTAGCCACGGTGCAGCTGCGGTTCGATGGCTGGGTTACCGAGCTCAACGATGCGGAAAAGATGAAGGACGTTGCCGGCGACTACGGCCAGGGTCGGGCGCCGGGCATGGACAACTTGTTGTACACCGCTGACGCCGAGTTCTCGTGCTTCGCGGACCTTGCTTTGACCAGCCCTAGCTCGGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCCCTGCTGCAGTGCGTTATGACGCCAGGAGACAAATGGATGCCGAAGACGACGGACGAGATCGCCGCCGTGTGCCTTGAGCAGGTGTTGGAACTGTTCCCGTCGGCACGTGACCTGAACTGCACGTGGACCAACGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTACCGCGAGGGACCGGGCCTGGACCAGTATCGGCCCGACCAGAGGACGCCCATCCCTAACTTCTTCATGGCCGGCTCGTACACGTACCAGGACTACATTGACTCCATGGAGGGGGCGACAAAGTCA(SEQ ID NO:11)

二、裙带菜ζ-carotene desaturase基因3’端cDNA序列克隆

3’端cDNA序列克隆采用3’-RACE方法，试剂盒为

RACE 5’/3’Kit UserManual(TaKaRa公司产品)，并按照3’-RACE试剂盒说明书进行。根据裙带菜ZDS大片段cDNA序列设计克隆3’端cDNA序列所需的下列引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；

正向引物3’GSP1：5’-GGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCC-3’(SEQ ID NO:5)；

正向引物3’GSP2：5’-CGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTAC-3’(SEQ ID NO:6)。

克隆得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并将其连接到pMD-18T Vector上，构建pMD-18T-ZDS；将连接PCR产物的载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并测序；测序结果表明，到polaA尾巴该序列大小为1033bp，该3’端序列中含有终止密码子TGA和一段279bp的编码序列(+2294～+2572)；

3’RACE得到的序列：

GGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCCCTGCTGCAGTGCGTTATGACGCCAGGAGACAAATGGATGCCGAAGACGACGGACGAGATCGCCGCCGTGTGCCTTGAGCAGGTGTTGGAACTGTTCCCGTCGGCACGTGACCTGAACTGCACGTGGACCAACGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTACCGCGAGGGACCGGGCCTGGACCAGTATCGGCCCGACCAGAGGACGCCCATCCCTAACTTCTTCATGGCCGGCTCGTACACGTACCAGGACTACATTGACTCCATGGAGGGGGCGACAAAGTCAGCCCTCTTGTGCGCCGACCGTGTTTTAGAGGACACGCCGGCACTAGCGAAGTTGACCAAGGATCGAGCGGCCGTTTCCGCGTCTGCGTGAAAAAATGAACTTTAACCGCTGTAGAGCTGCCCCTCGTCTTTTTTTACAAACCGCTTGAAATTTGTGTGGCATATTTTTTGCTGCGGTACGAGGGGTACAAACGCCTCCTCCTCCCGCATTTTTGAAACCCCCGCCAAGTGTCAAGAGTGTGTGCGGTTGCGCTTTTGCATTTCGCATTTTGCTTTTGCATTTTCGATTCGAGTTTTTTGTTTGCGATTTCGTTTTGCGGAGGGAGCGGTTCGCGTTTTCGAAAGGCGTTTGAAAGACCCGGTGTTTTTTTTTACGATGACATGGCGTTACGTAAGCCACCTTGGGCGGTCGGAGGAAGACTGGAGATTCGAAAGATGGTCCGGCAAGGACCCGATGTACCTTAGTAGACCTTTTTTGGAAACGCTTGGGGGGTGTACTCAACGAAACGCTCGGGGGGGGGGGGGTTGCAGAGGCTTGTGGGGTTATAGAGCGCCAAATCCTCCTCTTTTTCTCATCTTTGTGCTGAGCTGGCCTCTTTCTCACCTTTCACGCTGGGCTAGATGGTTGCTATGCCCGTTTTTTTGCTACTATTGATAAGTACCTGGTAGTTTTTCCGGGACTGCGTGGTGGCTACGCGCAAGATGGGCGGCAATAGCGTGGTGTGGGGCGTGGAGTTGGAACTGCCCGCAGGTACGAAGCTCGTTGCTGGTGGTGTCTCGTCAAATTGTGTTGAGCGGGGCTGTCTACACCGCGAGTTTCGAGAATGCTATCAATAATGCTAATAACGCAACCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGT(SEQ ID NO:12)

三、裙带菜ζ-carotene desaturase基因5’端cDNA序列克隆

5’端cDNA序列克隆采用5’-RACE方法，试剂盒为

RACE 5’/3’Kit(TaKaRa公司产品)，并按照5’-RACE试剂盒说明书进行；根据裙带菜ZDS大片段cDNA序列设计克隆5’端cDNA序列所需的下列引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

反向引物5’GSP1：5’-GACGTCCTCCATCGCAGCGTCGAAGTTG-3’(SEQ ID NO:7)；

反向引物5’GSP2：5’-CATGCGGAAATCCAAAGCCCCCAGCTCG-3’(SEQ ID NO:8)。

克隆得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并将其连接到pMD-18T Vector上，构建pMD-18T-ZDS；将连接PCR产物的载体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆并测序；序列分析表明，该序列大小为835bp，其中包括完整的5’端序列603bp。该5’端序列中含有起始密码子ATG，以及起始密码子ATG前面的一段187bp的前导序列(+1～+187)。

5’RACE得到的序列：

ACATGGGGACTGAGACAGACCAATACGGGGTTCTGTGTCGTCGCTGCCAGGCCAAGGAGGGAACAAGTGGAAGGAAGGAAGGAGTGGCTTTGCCAATACGTCCGTATTTCGCCGGCGCAGCTTACCTGTTTCGCTGCAGGCTAGAGCGTAGCGGACTCCAACCTCCTCTCCACCTCTGGCGGTGGCGATGAAGGCTTCAGCAGCATTGGTGCTGGGCACGGCGTTGGCGGGGTCGACGTTAAGAGATGCGTCTGCATTCGTCGGTACGCCGCTGGCCCGGCTGTCTTCGGTAGCGCCGGCGGCTCCTTCTTCCTCGGTAGCAATGCGGCCCAGGACGGGCGTGAGCATGGTGGCCGGCGTGGCCGGCACGGTGGGGGGATCGGGGATTGAGCGCATCAAGGGCACCGACAAGGAGGGGCTACTGGATGTCAACCGCATTGACAGGGCGCGCAAGGGGCCGGAGATCAAGCTGCCCCAGGACCAAAAAATGAAAATTGGCATTATCGGGGGCGGGTTGGCGGGGATGATCACGGCGATGGACCTTTCGGAGGCAGGTCACCAGGTGGAGATATTCGAGGCGCGGCCTTTCATGGGGGGTAAGGTGGGGAGCTGGAAGGACAAGGACGGGAACCACATCGAGATGGGACTGCACGTGTTTTTCGGATGCTACTACAATTTCTTTGGGATTTTCCGGCGTCTCGGGATTTTCGACTCGGCGCTGAGGCTCAAGGTTCACACGCATCAGTTCGTGAACAAGGGCGGCGAGCTGGGGGCTTTGGATTTCCGCATGGGCGGCATTGGGGCACCCTTCAACGGGCTCAAAGCTTTCGCGACTACGGATCAGCTGGGGATCTACGATAAGCTGGCGAACGCACTGGCGTTGGGCACGTCGCCCATCGTAAAAGCTCTGTTCAACTTCGACGCTGCGATGGAGGACGTC(SEQ ID NO:13)

四、裙带菜ζ-carotene desaturase基因全长cDNA序列克隆

按照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的说明书提取裙带菜总RNA，并按照反转录试剂盒要求，取7μL总RNA为模板，合成cDNA第一链，冻存于-80℃备用。

对3个序列的测序结果进行拼接，推断裙带菜ZDS基因全长cDNA序列。利用ORFFinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对拼接的全长cDNA序列进行开放阅读框的查找，设计引物ZDScF和ZDScR。并且参考表达载体pET28a的多克隆位点，分别在引物的5’端引入BamH I,Xho I的酶切位点,以总cDNA为模板进行PCR扩增。

ZDScF：ACTGGATCCATGAAGGCTTCAGCAGCATTGGT(SEQ ID NO:9)

ZDScR：ACTCTCGAGTCACGCAGACGCGGAAACG(SEQ ID NO:10)

PCR反应条件为：95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸120s，共进行30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的DNA，并将连接到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-ZDS，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选转化子，经过菌落PCR和酶切检测，筛选出阳性克隆，命名为pMD-18T-ZDS。测序结果表明，该序列大小为1821bp。

序列1：裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)cDNA序列

ACATGGGGACTGAGACAGACCAATACGGGGTTCTGTGTCGTCGCTGCCAGGCCAAGGAGGGAACAAGTGGAAGGAAGGAAGGAGTGGCTTTGCCAATACGTCCGTATTTCGCCGGCGCAGCTTACCTGTTTCGCTGCAGGCTAGAGCGTAGCGGACTCCAACCTCCTCTCCACCTCTGGCGGTGGCGATGAAGGCTTCAGCAGCATTGGTGCTGGGCACGGCGTTGGCGGGGTCGACGTTAAGAGATGCGTCTGCATTCGTCGGTACGCCGCTGGCCCGGCTGTCTTCGGTAGCGCCGGCGGCTCCTTCTTCCTCGGTAGCAATGCGGCCCAGGACGGGCGTGAGCATGGTGGCCGGCGTGGCCGGCACGGTGGGGGGATCGGGGATTGAGCGCATCAAGGGCACCGACAAGGAGGGGCTACTGGATGTCAACCGCATTGACAGGGCGCGCAAGGGGCCGGAGATCAAGCTGCCCCAGGACCAAAAAATGAAAATTGGCATTATCGGGGGCGGGTTGGCGGGGATGATCACGGCGATGGACCTTTCGGAGGCAGGTCACCAGGTGGAGATATTCGAGGCGCGGCCTTTCATGGGGGGTAAGGTGGGGAGCTGGAAGGACAAGGACGGGAACCACATCGAGATGGGACTGCACGTGTTTTTCGGATGCTACTACAATTTCTTTGGGATTTTCCGGCGTCTCGGGATTTTCGACTCGGCGCTGAGGCTCAAGGTTCACACGCATCAGTTCGTGAACAAGGGCGGCGAGCTGGGGGCTTTGGATTTCCGCATGGGCGGCATTGGGGCACCCTTCAACGGGCTCAAAGCTTTCGCGACTACGGATCAGCTGGGGATCTACGATAAGCTGGCGAACGCACTGGCGTTGGGCACGTCGCCCATCGTAAAAGCTCTGTTCAACTTCGACGCTGCGATGGAGGACGTCCGTGCGCTGGACAAGATGACCTTCAGCGAGTGGTTCGAGGGGAAAGGGGGATCGCGGGGCTCCATCTCTCGCATGTGGGACCCTGTCGCGTACGCGCTCGGCTTCATCGACTGCGACCACATCTCGGCCAGGTGCATGCTCACCATCTTCCAGCTGTTCGCCATTCGCTCGGAGGCATCGGTTCTCCGAATGCTGGAGGGATCGCCCGACGACTTCATTCACCAGCCCATTCTCAAGTATTTGGCTGAGCGCGGCGTGACCCACCAGACCTCTCGCCGGATCACGGAGATCAGACACGAGGTGGACGCTGACGGCAAGCCGACCCACGTTAACGGCCTCGTCATTGCGGGAGGCGGGACGGAGGAGGAGTACCGAGAGTACGACGTCGTCATTGCCGCCACCGACGTGCCGGGGATCAAGAAGCTCCTCCCCGAGAATTTCCGCAAGTACGACATGTTCGACAACATCTACAAGCTGGACGGTGTCCCGGTAGCCACGGTGCAGCTGCGGTTCGATGGCTGGGTTACCGAGCTCAACGATGCGGAAAAGATGAAGGACGTTGCCGGCGACTACGGCCAGGGTCGGGCGCCGGGCATGGACAACTTGTTGTACACCGCTGACGCCGAGTTCTCGTGCTTCGCGGACCTTGCTTTGACCAGCCCTAGCTCGGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCCCTGCTGCAGTGCGTTATGACGCCAGGAGACAAATGGATGCCGAAGACGACGGACGAGATCGCCGCCGTGTGCCTTGAGCAGGTGTTGGAACTGTTCCCGTCGGCACGTGACCTGAACTGCACGTGGACCAACGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTACCGCGAGGGACCGGGCCTGGACCAGTATCGGCCCGACCAGAGGACGCCCATCCCTAACTTCTTCATGGCCGGCTCGTACACGTACCAGGACTACATTGACTCCATGGAGGGGGCGACAAAGTCAGCCCTCTTGTGCGCCGACCGTGTTTTAGAGGACACGCCGGCACTAGCGAAGTTGACCAAGGATCGAGCGGCCGTTTCCGCGTCTGCGTGAAAAAATGAACTTTAACCGCTGTAGAGCTGCCCCTCGTCTTTTTTTACAAACCGCTTGAAATTTGTGTGGCATATTTTTTGCTGCGGTACGAGGGGTACAAACGCCTCCTCCTCCCGCATTTTTGAAACCCCCGCCAAGTGTCAAGAGTGTGTGCGGTTGCGCTTTTGCATTTCGCATTTTGCTTTTGCATTTTCGATTCGAGTTTTTTGTTTGCGATTTCGTTTTGCGGAGGGAGCGGTTCGCGTTTTCGAAAGGCGTTTGAAAGACCCGGTGTTTTTTTTTACGATGACATGGCGTTACGTAAGCCACCTTGGGCGGTCGGAGGAAGACTGGAGATTCGAAAGATGGTCCGGCAAGGACCCGATGTACCTTAGTAGACCTTTTTTGGAAACGCTTGGGGGGTGTACTCAACGAAACGCTCGGGGGGGGGGGGGTTGCAGAGGCTTGTGGGGTTATAGAGCGCCAAATCCTCCTCTTTTTCTCATCTTTGTGCTGAGCTGGCCTCTTTCTCACCTTTCACGCTGGGCTAGATGGTTGCTATGCCCGTTTTTTTGCTACTATTGATAAGTACCTGGTAGTTTTTCCGGGACTGCGTGGTGGCTACGCGCAAGATGGGCGGCAATAGCGTGGTGTGGGGCGTGGAGTTGGAACTGCCCGCAGGTACGAAGCTCGTTGCTGGTGGTGTCTCGTCAAATTGTGTTGAGCGGGGCTGTCTACACCGCGAGTTTCGAGAATGCTATCAATAATGCTAATAACGCAACCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGT(SEQ ID NO:1)

序列2：裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)cDNA编码的氨基酸

HGD*DRPIRGSVSSLPGQGGNKWKEGRSGFANTSVFRRRSLPVSLQARA*RTPTSSPPLAVAMKASAALVLGTALAGSTLRDASAFVGTPLARLSSVAPAAPSSSVAMRPRTGVSMVAGVAGTVGGSGIERIKGTDKEGLLDVNRIDRARKGPEIKLPQDQKMKIGIIGGGLAGMITAMDLSEAGHQVEIFEARPFMGGKVGSWKDKDGNHIEMGLHVFFGCYYNFFGIFRRLGIFDSALRLKVHTHQFVNKGGELGALDFRMGGIGAPFNGLKAFATTDQLGIYDKLANALALGTSPIVKALFNFDAAMEDVRALDKMTFSEWFEGKGGSRGSISRMWDPVAYALGFIDCDHISARCMLTIFQLFAIRSEASVLRMLEGSPDDFIHQPILKYLAERGVTHQTSRRITEIRHEVDADGKPTHVNGLVIAGGGTEEEYREYDVVIAATDVPGIKKLLPENFRKYDMFDNIYKLDGVPVATVQLRFDGWVTELNDAEKMKDVAGDYGQGRAPGMDNLLYTADAEFSCFADLALTSPSSDYYKPGEGSLLQCVMTPGDKWMPKTTDEIAAVCLEQVLELFPSARDLNCTWTNVVKVGQSLYREGPGLDQYRPDQRTPIPNFFMAGSYTYQDYIDSMEGATKSALLCADRVLEDTPALAKLTKDRAAVSASA*KNEL*PL*SCPSSFFTNRLKFVWHIFCCGTRGTNASSSRIFETPAKCQECVRLRFCISHFAFAFSIRVFCLRFRFAEGAVRVFERRLKDPVFFFTMTWRYVSHLGRSEEDWRFERWSGKDPMYLSRPFLETLGGCTQRNARGGGGCRGLWGYRAPNPPLFLIFVLSWPLSHLSRWARWLLCPFFCYY**VPGSFSGTAWWLRARWAAIAWCGAWSWNCPQVRSSLLVVSRQIVLSGAVYTASFENAINNANNATRKKKKKKKKKK(SEQ ID NO:2)

实施例2、裙带菜ζ-carotene desaturase基因序列生物信息分析与蛋白质结构预测

对3个序列的测序结果进行拼接，推断裙带菜ZDS基因全长cDNA序列。然后，采用生物信息学软件DNAMAN(LynnonBiosoft，美国)，将全长cDNA序列翻译成蛋白质序列。在此基础上，将推断的裙带菜Undaria pinnatifida Suringar ZDS氨基酸序列与长囊水云Ectocarpus siliculosus ZDS(CBN76924.1)、海洋富油微拟球藻Nannochloropsisgaditana ZDS(EWM29966.1)、金色藻Chrysochromulina sp.ZDS(KOO28349.1)、三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum ZDS(XP_002176685.1)、羊栖菜Fistulifera solaris ZDS(GAX15703.1)进行多序列比对，以此来比较在氨基酸水平上裙带菜ZDS的重要功能位点与其他近缘藻类之间的差异。

此外，利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对转录组测序获得的CDS序列进行开放阅读框的查找，并对氨基酸序列组成和蛋白质的理化性质预测；利用DNAMAN进行多重序列比对；利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)预测蛋白二级结构；通过Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)预测三维结构。根据推断的裙带菜ZDS氨基酸序列，使用MEGA4构建系统发育树。

UPZDS基因编码的蛋白分子式为：C2925H4592N794O876S29。由软件ORF Finder分析表明，该目标cDNA是一个完整的开放阅读框，确定翻译起始密码子ATG(加粗双下划线表示)及终止密码子TGA(加粗波浪下划线表示)的位置，该开放阅读框编码606个氨基酸残基组成的多肽。该基因的cDNA全长为2804bp，共编码910个氨基酸，包含1821bp的开放阅读框，编码606个氨基酸。通过Expasy预测蛋白的分子量为65.82717kDa，等电点为5.54。总的亲水性平均系数(Grand average of hydropathicity(GRAVY))为-0.117，预测该蛋白为疏水性蛋白。该基因预测不稳定系数为33.69，属于稳定蛋白。

氨基酸组成分析表明，LcZDS蛋白富含丙氨酸和甘氨酸，摩尔百分比均为10.2。606个氨基酸由75个碱性氨基酸，76个酸性氨基酸，274个疏水性氨基酸和285个极性氨基酸组成。

PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)预测蛋白二级结构表明，该蛋白有60.56％的无规则卷曲，25.08％的α-螺旋和14.36％的β-折叠。

与NCBI数据库中已知的其它物种ZDS蛋白序列进行BLASTP分析，结果表明，裙带菜ZDS蛋白的氨基酸序列与长囊水云Ectocarpus siliculosus ZDS的氨基酸同源性最高，可达89％；其次为海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana ZDS氨基酸，序列同源性为68％；与金线藻Chrysochromulina sp.ZDS的氨基酸序列同源性为64％；与三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum ZDS的氨基酸序列同源性为62％；与索拉脆杆藻Fistuliferasolaris ZDS氨基酸序列同源性为61％。

利用21个不同物种ZDS蛋白构建的系统发育树如图2所示，该树由四个大簇组成，分别为：植物、褐藻门、蓝藻门和绿藻门。UPZDS位于褐藻门簇，与蓝藻门ZDS和绿藻门有较近的进化关系。裙带菜ZDS蛋白与长囊水云ZDS有较近接的进化关系，它们都属于褐藻，可能起源于共同的祖先。图3为Phyre2预测的LcZDS三维结构，可清晰区分α-螺旋，β-折叠和无规则卷曲。

实施例3、表达载体pET-15b-ZDS的构建与鉴定

将PCR扩增的UpZD基因序列用BaMHⅠ和XHOⅠ限制性内切酶进行双酶切用引物ZDSCF和ZDSCR引物克隆，纯化并连接到PET-28a(+)载体上，形成重组质粒pET-28a-UPZDS，在N端携带6×His标签。

实施例4、LcZDS在大肠杆菌中的表达及功能验证

大肠杆菌BL21质粒pET-28a-UPZDS在含100mg/L卡那霉素的液体LB培养基中培养，在37℃下(165rpm/min)。约6小时后(指数生长期)，用0.5mM IPTG诱导细胞，并培养24h以诱导产生目标蛋白。将未诱导和诱导的细菌放入无菌EP管中，100000转/分离心30s，保留沉淀。将20μL无菌水加入EP管中，悬浮沉淀，煮沸5min，冷却后，剧烈涡旋震荡使DNA断裂，1000rpm离心10min，然后在蛋白质缓冲液中加入10μL制备的样品，进行12％的SDS-PAGE电泳分析。用考马斯亮蓝染色。

如图4所示M为蛋白marker；1泳道为未诱导的转化子总蛋白，可见一较模糊的条带；2泳道为IPTG诱导的细菌总蛋白，预测分子量大小处，有很明显的条带；3泳道为未经pET-28a-LcZDS质粒转化的空菌总蛋白，没有可见的目的条带。

实施例5、UPZDS在大肠杆菌中的功能验证

遗传互补是指野生型基因补偿突变体的基因突变引起的功能性缺失。为了验证该基因的功能，我们构建了相应的ZDS基因互补基因表达载体。遗传互补缺陷菌株不能正常合成目标色素。只有裙带菜的相应基因才能组成完整的途径并合成目标产物。如果在互补品系的发酵产物中成功地检测到目标色素，则可以验证该基因的功能。为了构建互补的遗传表达菌株，本研究使用坎宁安等人提供的质粒(2007)。质粒中的基因来源于细菌，已通过功能确认。

通过选择PAC-ZETAiPi构建遗传互补菌株。质粒PAC-ZETAiPi编码Erwiniauredovora crtE(GGPP合成酶)、CRTB(植烯合酶)加聚球藻CRTP(植烯脱氢酶)，介导了ζ-胡萝卜素的形成。在ZDS的作用下，发酵得到遗传互补菌株获得番茄红素(前番茄红素，7，9，7’，9’-四顺式番茄红素)，ZDS的中间产物，可能含有链孢霉素和顺式环孢菌素(桑德曼，1994)，是催化还原反应的中间产物。

将质粒PAC-ZETAiPi与PET-28α-UPZDS共转化进大肠杆菌BL21中。在氯霉素(34mg/L)、卡那霉素(100mg/L)和0.5mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的作用下，将共转化后的细菌在液体培养基中培养。提取类胡萝卜素后，用HPLC法进行分析。

取得上步所得甘油种2ul,加入含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素或34ug/ml氯霉素的600ul液体lb培养基中过夜震荡培养，以活化菌株。然后，按1％的接种量将已活化的菌株转入含相应抗生素的10ml液体LB培养基中37℃培养3小时。冰上冷却菌液后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，并在28℃，200rpm的条件下避光培养24h。发酵完成后，6000Xg离心收集菌体。

将发酵所得E.coli菌体收集，在阴暗处按如下步骤萃取色素样品：

1)收集发酵菌体至EP管中，吸干多余培养液；

2)加入400ul丙酮，涡旋震荡30s；

3)28℃、200rpm遮光震荡孵育30min；

4)13400×g离心2min，收集上清至2ml离心管中；

5)向步骤1)的EP管中加入400ul乙酸乙酯，涡旋震荡30s；

6)13400×g离心2min，收集上清至步骤d的2ml离心管中,轻柔混匀；

7)向上步离心管中加入600ul超纯水，混匀；

8)13400×g离心5min，小心吸取上层有机相于-80℃保存备用。

所有的程序都是在黑暗中进行，以保护类胡萝卜素对光降解和异构化。取制备的色素样品13400×g离心5分钟，之后取300μL至新的EP管中，并用0.22μm滤膜过滤色素样品。以90％乙腈为洗脱剂，乙酸乙酯为洗脱剂，流速为1mL/min，在洗脱液中分离出20μL高效液相色谱(HPLC)柱，梯度洗脱，检测波长454nm。通过比较典型的保留时间和吸收光谱与标准样品鉴定类胡萝卜素。

HPLC结果显示只转化有pET-28a-ZDS的菌株的发酵产物中未检测到任何色素合成。只转化有pAC-ZETAiPi的菌株的发酵产物只有在34.71min有峰(如图5所示)。根据Bonora et al.(2000)的报道，该特征吸收峰代表的物质即质粒pAC-ZETAiPi的催化产物ζ-胡萝卜素，表明用于将遗传互补实验的菌株只能合成ZDS的催化底物ζ-胡萝卜素。共转化有pET-28a-ZDS和pAC-ZETAiPi质粒的菌株的发酵产物经过HPLC，分离得到三个峰，根据Bonora et al.(2000)的报道，其中保留时间为34.266min的物质为ZDS催化ζ-胡萝卜素生成的终产物番茄红素。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因与应用

<130> 2020021

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2804

<212> DNA

<213> 裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)

<400> 1

acatggggac tgagacagac caatacgggg ttctgtgtcg tcgctgccag gccaaggagg 60

gaacaagtgg aaggaaggaa ggagtggctt tgccaatacg tccgtatttc gccggcgcag 120

cttacctgtt tcgctgcagg ctagagcgta gcggactcca acctcctctc cacctctggc 180

ggtggcgatg aaggcttcag cagcattggt gctgggcacg gcgttggcgg ggtcgacgtt 240

aagagatgcg tctgcattcg tcggtacgcc gctggcccgg ctgtcttcgg tagcgccggc 300

ggctccttct tcctcggtag caatgcggcc caggacgggc gtgagcatgg tggccggcgt 360

ggccggcacg gtggggggat cggggattga gcgcatcaag ggcaccgaca aggaggggct 420

actggatgtc aaccgcattg acagggcgcg caaggggccg gagatcaagc tgccccagga 480

ccaaaaaatg aaaattggca ttatcggggg cgggttggcg gggatgatca cggcgatgga 540

cctttcggag gcaggtcacc aggtggagat attcgaggcg cggcctttca tggggggtaa 600

ggtggggagc tggaaggaca aggacgggaa ccacatcgag atgggactgc acgtgttttt 660

cggatgctac tacaatttct ttgggatttt ccggcgtctc gggattttcg actcggcgct 720

gaggctcaag gttcacacgc atcagttcgt gaacaagggc ggcgagctgg gggctttgga 780

tttccgcatg ggcggcattg gggcaccctt caacgggctc aaagctttcg cgactacgga 840

tcagctgggg atctacgata agctggcgaa cgcactggcg ttgggcacgt cgcccatcgt 900

aaaagctctg ttcaacttcg acgctgcgat ggaggacgtc cgtgcgctgg acaagatgac 960

cttcagcgag tggttcgagg ggaaaggggg atcgcggggc tccatctctc gcatgtggga 1020

ccctgtcgcg tacgcgctcg gcttcatcga ctgcgaccac atctcggcca ggtgcatgct 1080

caccatcttc cagctgttcg ccattcgctc ggaggcatcg gttctccgaa tgctggaggg 1140

atcgcccgac gacttcattc accagcccat tctcaagtat ttggctgagc gcggcgtgac 1200

ccaccagacc tctcgccgga tcacggagat cagacacgag gtggacgctg acggcaagcc 1260

gacccacgtt aacggcctcg tcattgcggg aggcgggacg gaggaggagt accgagagta 1320

cgacgtcgtc attgccgcca ccgacgtgcc ggggatcaag aagctcctcc ccgagaattt 1380

ccgcaagtac gacatgttcg acaacatcta caagctggac ggtgtcccgg tagccacggt 1440

gcagctgcgg ttcgatggct gggttaccga gctcaacgat gcggaaaaga tgaaggacgt 1500

tgccggcgac tacggccagg gtcgggcgcc gggcatggac aacttgttgt acaccgctga 1560

cgccgagttc tcgtgcttcg cggaccttgc tttgaccagc cctagctcgg actactacaa 1620

acccggggag ggctccctgc tgcagtgcgt tatgacgcca ggagacaaat ggatgccgaa 1680

gacgacggac gagatcgccg ccgtgtgcct tgagcaggtg ttggaactgt tcccgtcggc 1740

acgtgacctg aactgcacgt ggaccaacgt ggtgaaggtc ggtcagtcgc tctaccgcga 1800

gggaccgggc ctggaccagt atcggcccga ccagaggacg cccatcccta acttcttcat 1860

ggccggctcg tacacgtacc aggactacat tgactccatg gagggggcga caaagtcagc 1920

cctcttgtgc gccgaccgtg ttttagagga cacgccggca ctagcgaagt tgaccaagga 1980

tcgagcggcc gtttccgcgt ctgcgtgaaa aaatgaactt taaccgctgt agagctgccc 2040

ctcgtctttt tttacaaacc gcttgaaatt tgtgtggcat attttttgct gcggtacgag 2100

gggtacaaac gcctcctcct cccgcatttt tgaaaccccc gccaagtgtc aagagtgtgt 2160

gcggttgcgc ttttgcattt cgcattttgc ttttgcattt tcgattcgag ttttttgttt 2220

gcgatttcgt tttgcggagg gagcggttcg cgttttcgaa aggcgtttga aagacccggt 2280

gttttttttt acgatgacat ggcgttacgt aagccacctt gggcggtcgg aggaagactg 2340

gagattcgaa agatggtccg gcaaggaccc gatgtacctt agtagacctt ttttggaaac 2400

gcttgggggg tgtactcaac gaaacgctcg gggggggggg ggttgcagag gcttgtgggg 2460

ttatagagcg ccaaatcctc ctctttttct catctttgtg ctgagctggc ctctttctca 2520

cctttcacgc tgggctagat ggttgctatg cccgtttttt tgctactatt gataagtacc 2580

tggtagtttt tccgggactg cgtggtggct acgcgcaaga tgggcggcaa tagcgtggtg 2640

tggggcgtgg agttggaact gcccgcaggt acgaagctcg ttgctggtgg tgtctcgtca 2700

aattgtgttg agcggggctg tctacaccgc gagtttcgag aatgctatca ataatgctaa 2760

taacgcaacc agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagt 2804

<210> 2

<211> 927

<212> PRT

<213> 裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)

<400> 2

His Gly Asp Asp Arg Pro Ile Arg Gly Ser Val Ser Ser Leu Pro Gly

1 5 10 15

Gln Gly Gly Asn Lys Trp Lys Glu Gly Arg Ser Gly Phe Ala Asn Thr

20 25 30

Ser Val Phe Arg Arg Arg Ser Leu Pro Val Ser Leu Gln Ala Arg Ala

35 40 45

Arg Thr Pro Thr Ser Ser Pro Pro Leu Ala Val Ala Met Lys Ala Ser

50 55 60

Ala Ala Leu Val Leu Gly Thr Ala Leu Ala Gly Ser Thr Leu Arg Asp

65 70 75 80

Ala Ser Ala Phe Val Gly Thr Pro Leu Ala Arg Leu Ser Ser Val Ala

85 90 95

Pro Ala Ala Pro Ser Ser Ser Val Ala Met Arg Pro Arg Thr Gly Val

100 105 110

Ser Met Val Ala Gly Val Ala Gly Thr Val Gly Gly Ser Gly Ile Glu

115 120 125

Arg Ile Lys Gly Thr Asp Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Asn Arg Ile

130 135 140

Asp Arg Ala Arg Lys Gly Pro Glu Ile Lys Leu Pro Gln Asp Gln Lys

145 150 155 160

Met Lys Ile Gly Ile Ile Gly Gly Gly Leu Ala Gly Met Ile Thr Ala

165 170 175

Met Asp Leu Ser Glu Ala Gly His Gln Val Glu Ile Phe Glu Ala Arg

180 185 190

Pro Phe Met Gly Gly Lys Val Gly Ser Trp Lys Asp Lys Asp Gly Asn

195 200 205

His Ile Glu Met Gly Leu His Val Phe Phe Gly Cys Tyr Tyr Asn Phe

210 215 220

Phe Gly Ile Phe Arg Arg Leu Gly Ile Phe Asp Ser Ala Leu Arg Leu

225 230 235 240

Lys Val His Thr His Gln Phe Val Asn Lys Gly Gly Glu Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Asp Phe Arg Met Gly Gly Ile Gly Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys

260 265 270

Ala Phe Ala Thr Thr Asp Gln Leu Gly Ile Tyr Asp Lys Leu Ala Asn

275 280 285

Ala Leu Ala Leu Gly Thr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Phe Asn Phe

290 295 300

Asp Ala Ala Met Glu Asp Val Arg Ala Leu Asp Lys Met Thr Phe Ser

305 310 315 320

Glu Trp Phe Glu Gly Lys Gly Gly Ser Arg Gly Ser Ile Ser Arg Met

325 330 335

Trp Asp Pro Val Ala Tyr Ala Leu Gly Phe Ile Asp Cys Asp His Ile

340 345 350

Ser Ala Arg Cys Met Leu Thr Ile Phe Gln Leu Phe Ala Ile Arg Ser

355 360 365

Glu Ala Ser Val Leu Arg Met Leu Glu Gly Ser Pro Asp Asp Phe Ile

370 375 380

His Gln Pro Ile Leu Lys Tyr Leu Ala Glu Arg Gly Val Thr His Gln

385 390 395 400

Thr Ser Arg Arg Ile Thr Glu Ile Arg His Glu Val Asp Ala Asp Gly

405 410 415

Lys Pro Thr His Val Asn Gly Leu Val Ile Ala Gly Gly Gly Thr Glu

420 425 430

Glu Glu Tyr Arg Glu Tyr Asp Val Val Ile Ala Ala Thr Asp Val Pro

435 440 445

Gly Ile Lys Lys Leu Leu Pro Glu Asn Phe Arg Lys Tyr Asp Met Phe

450 455 460

Asp Asn Ile Tyr Lys Leu Asp Gly Val Pro Val Ala Thr Val Gln Leu

465 470 475 480

Arg Phe Asp Gly Trp Val Thr Glu Leu Asn Asp Ala Glu Lys Met Lys

485 490 495

Asp Val Ala Gly Asp Tyr Gly Gln Gly Arg Ala Pro Gly Met Asp Asn

500 505 510

Leu Leu Tyr Thr Ala Asp Ala Glu Phe Ser Cys Phe Ala Asp Leu Ala

515 520 525

Leu Thr Ser Pro Ser Ser Asp Tyr Tyr Lys Pro Gly Glu Gly Ser Leu

530 535 540

Leu Gln Cys Val Met Thr Pro Gly Asp Lys Trp Met Pro Lys Thr Thr

545 550 555 560

Asp Glu Ile Ala Ala Val Cys Leu Glu Gln Val Leu Glu Leu Phe Pro

565 570 575

Ser Ala Arg Asp Leu Asn Cys Thr Trp Thr Asn Val Val Lys Val Gly

580 585 590

Gln Ser Leu Tyr Arg Glu Gly Pro Gly Leu Asp Gln Tyr Arg Pro Asp

595 600 605

Gln Arg Thr Pro Ile Pro Asn Phe Phe Met Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr

610 615 620

Gln Asp Tyr Ile Asp Ser Met Glu Gly Ala Thr Lys Ser Ala Leu Leu

625 630 635 640

Cys Ala Asp Arg Val Leu Glu Asp Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Thr

645 650 655

Lys Asp Arg Ala Ala Val Ser Ala Ser Ala Lys Asn Glu Leu Pro Leu

660 665 670

Ser Cys Pro Ser Ser Phe Phe Thr Asn Arg Leu Lys Phe Val Trp His

675 680 685

Ile Phe Cys Cys Gly Thr Arg Gly Thr Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ile

690 695 700

Phe Glu Thr Pro Ala Lys Cys Gln Glu Cys Val Arg Leu Arg Phe Cys

705 710 715 720

Ile Ser His Phe Ala Phe Ala Phe Ser Ile Arg Val Phe Cys Leu Arg

725 730 735

Phe Arg Phe Ala Glu Gly Ala Val Arg Val Phe Glu Arg Arg Leu Lys

740 745 750

Asp Pro Val Phe Phe Phe Thr Met Thr Trp Arg Tyr Val Ser His Leu

755 760 765

Gly Arg Ser Glu Glu Asp Trp Arg Phe Glu Arg Trp Ser Gly Lys Asp

770 775 780

Pro Met Tyr Leu Ser Arg Pro Phe Leu Glu Thr Leu Gly Gly Cys Thr

785 790 795 800

Gln Arg Asn Ala Arg Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Leu Trp Gly Tyr

805 810 815

Arg Ala Pro Asn Pro Pro Leu Phe Leu Ile Phe Val Leu Ser Trp Pro

820 825 830

Leu Ser His Leu Ser Arg Trp Ala Arg Trp Leu Leu Cys Pro Phe Phe

835 840 845

Cys Tyr Tyr Val Pro Gly Ser Phe Ser Gly Thr Ala Trp Trp Leu Arg

850 855 860

Ala Arg Trp Ala Ala Ile Ala Trp Cys Gly Ala Trp Ser Trp Asn Cys

865 870 875 880

Pro Gln Val Arg Ser Ser Leu Leu Val Val Ser Arg Gln Ile Val Leu

885 890 895

Ser Gly Ala Val Tyr Thr Ala Ser Phe Glu Asn Ala Ile Asn Asn Ala

900 905 910

Asn Asn Ala Thr Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

915 920 925

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgactttgtc gccccctcca tgg 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggacggga accacatcga gatgg 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggactactac aaacccgggg agggctcc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtggtgaag gtcggtcagt cgctctac 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacgtcctcc atcgcagcgt cgaagttg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catgcggaaa tccaaagccc ccagctcg 28

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actggatcca tgaaggcttc agcagcattg gt 32

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actctcgagt cacgcagacg cggaaacg 28

<210> 11

<211> 1299

<212> DNA

<213> 裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)

<400> 11

aaggacggga accacatcga gatgggactg cacgtgtttt tcggatgcta ctacaatttc 60

tttgggattt tccggcgtct cgggattttc gactcggcgc tgaggctcaa ggttcacacg 120

catcagttcg tgaacaaggg cggcgagctg ggggctttgg atttccgcat gggcggcatt 180

ggggcaccct tcaacgggct caaagctttc gcgactacgg atcagctggg gatctacgat 240

aagctggcga acgcactggc gttgggcacg tcgcccatcg taaaagctct gttcaacttc 300

gacgctgcga tggaggacgt ccgtgcgctg gacaagatga ccttcagcga gtggttcgag 360

gggaaagggg gatcgcgggg ctccatctct cgcatgtggg accctgtcgc gtacgcgctc 420

ggcttcatcg actgcgacca catctcggcc aggtgcatgc tcaccatctt ccagctgttc 480

gccattcgct cggaggcatc ggttctccga atgctggagg gatcgcccga cgacttcatt 540

caccagccca ttctcaagta tttggctgag cgcggcgtga cccaccagac ctctcgccgg 600

atcacggaga tcagacacga ggtggacgct gacggcaagc cgacccacgt taacggcctc 660

gtcattgcgg gaggcgggac ggaggaggag taccgagagt acgacgtcgt cattgccgcc 720

accgacgtgc cggggatcaa gaagctcctc cccgagaatt tccgcaagta cgacatgttc 780

gacaacatct acaagctgga cggtgtcccg gtagccacgg tgcagctgcg gttcgatggc 840

tgggttaccg agctcaacga tgcggaaaag atgaaggacg ttgccggcga ctacggccag 900

ggtcgggcgc cgggcatgga caacttgttg tacaccgctg acgccgagtt ctcgtgcttc 960

gcggaccttg ctttgaccag ccctagctcg gactactaca aacccgggga gggctccctg 1020

ctgcagtgcg ttatgacgcc aggagacaaa tggatgccga agacgacgga cgagatcgcc 1080

gccgtgtgcc ttgagcaggt gttggaactg ttcccgtcgg cacgtgacct gaactgcacg 1140

tggaccaacg tggtgaaggt cggtcagtcg ctctaccgcg agggaccggg cctggaccag 1200

tatcggcccg accagaggac gcccatccct aacttcttca tggccggctc gtacacgtac 1260

caggactaca ttgactccat ggagggggcg acaaagtca 1299

<210> 12

<211> 1196

<212> DNA

<213> 裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)

<400> 12

ggactactac aaacccgggg agggctccct gctgcagtgc gttatgacgc caggagacaa 60

atggatgccg aagacgacgg acgagatcgc cgccgtgtgc cttgagcagg tgttggaact 120

gttcccgtcg gcacgtgacc tgaactgcac gtggaccaac gtggtgaagg tcggtcagtc 180

gctctaccgc gagggaccgg gcctggacca gtatcggccc gaccagagga cgcccatccc 240

taacttcttc atggccggct cgtacacgta ccaggactac attgactcca tggagggggc 300

gacaaagtca gccctcttgt gcgccgaccg tgttttagag gacacgccgg cactagcgaa 360

gttgaccaag gatcgagcgg ccgtttccgc gtctgcgtga aaaaatgaac tttaaccgct 420

gtagagctgc ccctcgtctt tttttacaaa ccgcttgaaa tttgtgtggc atattttttg 480

ctgcggtacg aggggtacaa acgcctcctc ctcccgcatt tttgaaaccc ccgccaagtg 540

tcaagagtgt gtgcggttgc gcttttgcat ttcgcatttt gcttttgcat tttcgattcg 600

agttttttgt ttgcgatttc gttttgcgga gggagcggtt cgcgttttcg aaaggcgttt 660

gaaagacccg gtgttttttt ttacgatgac atggcgttac gtaagccacc ttgggcggtc 720

ggaggaagac tggagattcg aaagatggtc cggcaaggac ccgatgtacc ttagtagacc 780

ttttttggaa acgcttgggg ggtgtactca acgaaacgct cggggggggg ggggttgcag 840

aggcttgtgg ggttatagag cgccaaatcc tcctcttttt ctcatctttg tgctgagctg 900

gcctctttct cacctttcac gctgggctag atggttgcta tgcccgtttt tttgctacta 960

ttgataagta cctggtagtt tttccgggac tgcgtggtgg ctacgcgcaa gatgggcggc 1020

aatagcgtgg tgtggggcgt ggagttggaa ctgcccgcag gtacgaagct cgttgctggt 1080

ggtgtctcgt caaattgtgt tgagcggggc tgtctacacc gcgagtttcg agaatgctat 1140

caataatgct aataacgcaa ccagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagt 1196

<210> 13

<211> 940

<212> DNA

<213> 裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)

<400> 13

acatggggac tgagacagac caatacgggg ttctgtgtcg tcgctgccag gccaaggagg 60

gaacaagtgg aaggaaggaa ggagtggctt tgccaatacg tccgtatttc gccggcgcag 120

cttacctgtt tcgctgcagg ctagagcgta gcggactcca acctcctctc cacctctggc 180

ggtggcgatg aaggcttcag cagcattggt gctgggcacg gcgttggcgg ggtcgacgtt 240

aagagatgcg tctgcattcg tcggtacgcc gctggcccgg ctgtcttcgg tagcgccggc 300

ggctccttct tcctcggtag caatgcggcc caggacgggc gtgagcatgg tggccggcgt 360

ggccggcacg gtggggggat cggggattga gcgcatcaag ggcaccgaca aggaggggct 420

actggatgtc aaccgcattg acagggcgcg caaggggccg gagatcaagc tgccccagga 480

ccaaaaaatg aaaattggca ttatcggggg cgggttggcg gggatgatca cggcgatgga 540

cctttcggag gcaggtcacc aggtggagat attcgaggcg cggcctttca tggggggtaa 600

ggtggggagc tggaaggaca aggacgggaa ccacatcgag atgggactgc acgtgttttt 660

cggatgctac tacaatttct ttgggatttt ccggcgtctc gggattttcg actcggcgct 720

gaggctcaag gttcacacgc atcagttcgt gaacaagggc ggcgagctgg gggctttgga 780

tttccgcatg ggcggcattg gggcaccctt caacgggctc aaagctttcg cgactacgga 840

tcagctgggg atctacgata agctggcgaa cgcactggcg ttgggcacgt cgcccatcgt 900

aaaagctctg ttcaacttcg acgctgcgat ggaggacgtc 940

Claims (3)

1.一种编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.一种裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶，其特征在于，其氨基酸 序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

3.一种如权利要求1所述的编码裙带菜ζ-胡萝卜素脱氢酶的基因的应用，其特征在于，用于褐藻中类胡萝卜素的工业化生产。

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