CN102399276A - 提高棉花耐盐与干旱能力的GbWD1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能够在干旱、盐碱条件下促进棉花液泡形成GbWD1基因及其编码的GbWD1蛋白质多肽，本发明经实验证实了所述多肽与液泡形成蛋白AtVC1互作的功能，以及在棉花植株中超量表达GbWD1基因具有显著提高棉花耐盐与干旱能力的功能。

Description

提高棉花耐盐与干旱能力的GbWD1基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种能够提高棉花耐盐与干旱能力的GbWD1基因及其编码的多肽。

背景技术

土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题，越来越引起人们的重视。联合国粮农组织的调查结果显示，全球6％的陆地面积遭受着土壤盐渍化的侵蚀，20％的灌溉农业受到不同程度的盐害威胁。当前，全球盐碱地面积已达9.5×108hm²。中国盐渍土总面积约1亿hm²，其中已经盐渍化土壤约0.37亿hm²，残余盐渍化土壤约0.45亿hm²，潜在盐渍化土壤约0.17亿hm²。土壤盐渍化吞噬着有限的土地资源，成为严重制约农业生产的一个全球性问题。大量研究证明，运用分子生物学手段从耐盐的种质(例如海岛棉)中分离耐盐基因，通过转基因分子育种手段获得耐盐作物新品种可以有效解决上述问题。

土壤盐渍化对植物的伤害主要包括3个方面：(1)对植物的萌发和生长产生抑制作用。(2)影响植物对营养物质的吸收与利用。(3)影响植物的细胞结构的稳定性。为了应对土壤盐渍化对植物的伤害，植物发展一系列的耐盐与避盐机制：(1)平衡金属离子的吸收以减少毒性离子(Na⁺)的伤害；(2)形成大量的调节渗透物质如小分子的氨基酸(脯氨酸)、甘露醇、山梨醇等来调节细胞的渗透压力。近年来，通过分子生物学方法克隆了大量有关编码植物信号传导蛋白(例如碱性磷酸酶互作蛋白激酶CIPK等)、渗透物质合成酶(甜菜碱合成酶)以及离子转运蛋白(例如钠离子转运蛋白等)的基因，并通过转基因的手段将这些基因转化到不同的植物中，获得了具有一定耐盐水平的转基因植物。但遗憾地是，到目前为止还没有上述转基因作物的商业化报道。因此，分离新的耐盐/抗旱基因对于植物的耐盐和抗旱转基因育种仍然具有重要的意义。

WD重复蛋白(WD repeats protein)是一类含有色氨酸-天门冬氨酸(WD)重复序列的蛋白。已有的研究证明：WD重复蛋白参与植物液泡形成和运输，从而实现在细胞信号转导、蛋白质运输、细胞骨架的动态组装以及染色质的修饰及转录等不同的生物化学过程中的功能。尽管WD重复蛋白在植物发育方面的研究比较详细，但是有关WD重复蛋白如何参与植物抗逆性(耐盐与抗旱)的研究、以及WD重复蛋白是否具有耐盐和抗旱的功能没有报道。

本申请利用分子生物学的方法从海岛棉中克隆了一个WD重复蛋白基因GbWD1。在此基础上，进一步通过表达谱分析、蛋白质互作分析以及转基因植株的耐盐与抗旱能力分析证实WD重复蛋白基因GbWD1具有抗旱和耐盐功能，从而构成此发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的能够提高棉花耐盐与干旱能力的基因，并得到所述基因表达的蛋白产物。

本发明首次采用分子克隆方法，从构建的海岛棉根部cDNA文库中分离获得了新的GbWD1基因，并且通过转基因实验证实了它具有提高棉花耐盐与干旱能力的功能，从而达到了发明目的。本发明利用渗透压诱导表达启动子在棉花中特异表达GbWD1基因提高在干旱、高盐土壤条件下棉花合成新的液泡数目，从而提高棉花对有毒Na⁺离子的分配能力以及调节细胞渗透压力的能力。本发明包括以下内容：

1、提供了一种新的分离出的GbWD1蛋白质多肽，包含：

具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐盐与干旱能力功能的GbWD1蛋白质活性的由(a)衍生的多肽。

2、提供了编码上述多肽的多核苷酸，选自：

(a)编码上述GbWD1蛋白质多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中160-1404位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1591位的序列。

3、提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

4、提供了制备上述GbWD1蛋白质多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。

5、提供了上述多核苷酸和GbWD1蛋白质多肽的用途，即，在培育提高棉花耐盐与干旱能力的棉花品种方面的应用。

6、提供了一种提高棉花耐盐与干旱能力的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸，所述的GbWD1选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐盐与干旱能力的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使GbWD1基因编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入GbWD1基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

在本发明中，术语“GbWD1蛋白质”、“GbWD1多肽”或者“提高棉花耐盐与干旱能力蛋白”可互换使用，都指具有提高棉花抗旱、耐盐能力的GbWD1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的GbWD1蛋白质。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的GbWD1蛋白或多肽”是指GbWD1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GbWD1蛋白质。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GbWD1蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GbWD1蛋白质相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“GbWD1多肽”指具有能够与液泡形成蛋白质相互作用、能够提高棉花耐盐与干旱能力的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与GbWD1蛋白质相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GbWD1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与GbWD1杂交的DNA、cDNA所编码的蛋白、以及利用抗GbWD1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GbWD1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GbWD1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GbWD1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供GbWD1蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然GbWD1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GbWD1蛋白质的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的GbWD1核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO：1的序列进行全序列合成。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的GbWD1核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GbWD1基因编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GbWD11多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码GbWD1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，GbWD1蛋白质多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GbWD1基因编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗旱、耐盐能力提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用GbWD1蛋白质特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GbWD1蛋白质的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用原位杂交技术从构建的海岛棉cDNA文库库中分离的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1591个碱基，其开放读框位于160-1404位，编码全长为415个氨基酸的GbWD1蛋白质(SEQ ID NO：2)。

本发明的GbWD1蛋白质具有如下特性：A)提高棉花抗旱、耐盐能力功能明确，该基因在棉花等植物上没有报道；B)结构新，在核酸水平上与已见报道的GbWD1蛋白质编码基因无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。

GbWD1蛋白质为提高植物耐盐、抗旱能力提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。通过将GbWD1基因导入棉花，提高现有棉花品种的耐盐、抗旱水平。

附图说明：

图1是GbWD1基因在干旱以及盐处理条件下根部的表达分析。图中UBQ代表内参是棉花泛素化基因。0，1h，3h，7h，12h分别代表干旱以及盐处理0，1，3，7，12小时(见实施例2)。

图2是GbWD1基因编码的蛋白质与液泡形成蛋白质AtVC1互作图。图中的上图为GbWD1与AtVC1在SD-T-L(缺乏色氨酸和亮氨酸的SD培养基)培养基的平板的生长情况。图中的下图GbWD1与AtVC1在SD-T-A-L-H(缺乏色氨酸、腺嘌呤、亮氨酸和组氨酸的SD培养基)培养基的平板上生长的情况(见实施例3)。

图3是GbWD1基因遗传转化载体的构建示意图。图中，LB、RB分别为T-DNA的左右边界序列；CaMV35S为烟草花叶病毒35S启动子；Kan为卡那霉素抗性基因；BnVPS是油菜根特异表达启动子；NOS为终止子(见实施例5)。

图4是转GbWD1基因棉花幼苗(T0)叶片PCR检测图。图中，M为DL2000分子量标记，标记的分子量分别为2000、1000、750、500、250和100bp；P为阳性对照(GbWD1质粒)；1～5为经过转化GbWD1基因的转基因棉花幼苗的编号(见实施例6)。

图5是转GbWD1基因的棉花植株的Southern杂交分析情况。图中，1～5为转基因植株的编号(见实施例7)。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1提高棉花抗旱、耐盐能力GbWD1基因的CDNA片段克隆

(1)海岛棉根部cDNA文库的构建

文库的构建方法采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒的方法实施，具体步骤如下：

海岛棉品种Pima-90用于抽提棉花的总RNA。称取0.5g海岛棉幼根，用液氮研磨成细粉，分装于两个1.5ml的试管中。每管加入1ml TRIZOL用力摇动使混合均匀，室温下放置5min。然后在4℃，12,000g的条件下离心10min，将上清液吸入干净的1.5ml的eppendorf管中。每管加0.2ml氯仿，用力振荡15s，室温放置2～3min。然后在4℃、12,000g的条件下离心15min。将上清液转移到干净的1.5ml的eppendorf管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。在4℃，12,000g的条件下离心10min。弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤，在4℃，7,500g离心5min。弃上清，室温干燥15-20min后溶于适量无RNA酶的水中(55-60℃水浴10min使RNA充分溶解)。所获得的RNA用于cDNA合成反应。

按照QIAGEN公司的mRNA纯化试剂盒的方法(QIAGEN，CA，USA)将总RNA纯化为mRNA，然后立刻按照ClonTECH^TM试剂盒中所提供的方法进行单链cDNA合成和双链cDNA合成。

将BM25.8和XL1-Blue分别涂布于带有卡那霉素(50mg/L)、四环素(50mg/L)LB固体平板上，37℃培养箱过夜培养。挑单菌落接种到相应的LB+MgSO₄培养基上37℃过夜培养。此平板即可用于以后的实验菌源。按照下列的梯度将cDNA连接到载体λTriplEx2上。连接反应在16℃水浴过夜连接。

将每一管连接产物分别做λ噬菌体包装反应，获得克隆数在1～2×10⁶个左右的cDNA文库。

(2)采用原位杂交的方法分离GbWD1基因

将获得的λ噬菌体按照每个培养皿(直径为20cm)大约10000个克隆的数目进行铺平板，总共平板数目为20个。取直径为20厘米的圆形尼龙膜进行方位标记，标记后的尼龙膜影印上述的平板，将平板上的噬菌体克隆影印到尼龙膜上。

尼龙膜经过酸变性(0.25mol/LHCl溶液处理5分钟)、碱变性(0.4mol/LNaOH溶液处理10分钟)以及中和反应(0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5)，1.5mol/LNaCl溶液中和10min，蒸馏水冲洗3次)后即可用于Southern杂交。按照每200cm²尼龙膜加入100ng探针(探针序列：5-AATAT GATTT TATTT TGACTG ATAGTG ACCTG TTCGT TGCAA CAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCCCTAGAATCCTCCATAACTGTTTTCTAGATCCATCCAATGGCCACCCTCTCAGCTTATCCTAACACTAATCCTAACACCAATTTCCTCTCCCCCACCGATCA-3)的用量。按照以下的反应体系进行探针标记。探针标记前将探针在100℃沸水中水浴10min，再将其放入冰上10min，使探针充分变性。探针标记体系为：充分变性DNA5-15μL，dNTPs(dATP，dTTP，dGTP)6μL，Klenow fragment 2units，标记缓冲液5μL，随机引物4μL，加入无菌水补足50μL体系，迅速混匀后离心。按每管2μL加入³²P同位素，静置5hr使DNA充分标记。将充分标记后的探针变性后备用。

按照《分子克隆第2版》的方法进行southern杂交。杂交结束以后，用保鲜膜包裹杂交膜，测定膜上放射性强度。在暗匣中依次放置增感前屏、杂交膜、X-光片和增感后屏，在-70℃冰箱中自显影7-10天后洗X-光片。取出杂交膜后用吸水纸吸干增感屏上的水分，风干30min。

(3)GbWD1基因的cDNA片段的测序验证

挑取与尼龙膜杂交结果相对应的阳性克隆噬菌体。按照Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒的所示方法将携带有阳性克隆的插入片断质粒转染到大肠杆菌DH5α中。大肠杆菌经过质粒抽提后即可进行序列测定。

(4)GbWD1基因与蛋白质的比对分析

将SEQ1的核苷酸序列与NCBI(http://www.ncbi.nih.nlm.gov)进行核酸序列比对没有发现同源序列。利用SEQ2的蛋白质序列与NCBI(http://www.ncbi.nih.nlm.gov)进行蛋白质比对分析，GbWD1蛋白质与拟南芥AtATG18a蛋白(序列号：NP_567132.4)部分同源高度同源，同源性为76％，同源部分主要集中在WD的保守结构区域。这个结果说明GbWD1蛋白质具有WD结构域的功能，但是与现有的拟南芥序列不具有核酸同源性，为新的GbWD1基因。

实施例2在干旱、高盐情况下的GbWD1基因表达分析

为了分析GbWD1基因的功能，我们分析GbWD1基因在干旱、高盐情况下的表达情况。具体操作如下：

为了分析棉花在干旱、盐碱条件下的生长状况，我们在生长海岛棉幼苗的土盆中分别加入150mM的NaCL以及300mM甘露醇。然后在0，1，3，7，12，24分别收集经过150mM的NaCL以及300mM甘露醇处理以后棉花的幼根，抽提总RNA。

RNA的抽提方法参照实施例1-(1)的方法进行。

RNA反转录成cDNA。取不同样品的2μg RNA分别用于反转录实验。反转录使用的试剂盒为PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit。操作步骤如下：在0.2-mL的PCR管中加入Oligo dT Primer(50μM)、1μL dNTP Mixture(10mM each)、1μL Total RNA。混合液在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应，简单离心后继续放冰上。配置反转录缓冲液：5×PrimeScript Buffer 4μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl、

RTase(200U/μl)1μl、RNase Free dH₂O 4.5μl。将10μL反转录缓冲液加入到管子中，42℃1h，然后70℃处理15min失活反转录酶。

RT-PCR分析GbWD1基因在干旱、高盐情况下的表达情况：每次PCR时以2μL总RNA为模板进行RT-PCR扩增反应。GbWD1的RT-PCR使用的引物为GbWD1-1和GbWD1-2。内参基因为UBQ，其扩增所使用的引物为GbUBQ-1和GbUBQ-2。PCR扩增体系为：2μL总RNA、1μL dNTP Mixture(10mM each)、2μL10×buffer、1unit Taq酶，加水至20μL。PCR条件为：94℃1min，50℃30sec，72℃30sec，28个循环。PCR扩增完成后加入2μL上样缓冲液混匀并简短离心后，点样，跑胶后拍照。每个RT-PCR至少三个重复。

经过扩增和点样分析以后，GbWD1基因在干旱、高盐情况下的表达情况如图1所示。从图中可以看出，GbWD1基因在干旱、高盐情况下能够增强表达，24小时后的表达量是未经过处理的表达量的3倍以上。这个结果说明GbWD1基因参与了棉花的抗旱、耐盐的生理反应过程。

实施例3GbWD1蛋白质与液泡形成蛋白AtVC1互作

为了进一步分析GbWD1蛋白质是如何参与抗旱、耐盐的生理过程，我们分别构建了pGBD-GbWD1以及pGADT7-AtVC1(AT2G38020)的表达载体，通过酵母的双杂交实验分析这2个蛋白质是否具有相互作用。具体过程如下：

酵母感受态制备：-80℃取出AH109菌株在YPDA培养基上划线，28℃培养三天，挑取生长较快的克隆于10mL的YPDA上过夜培养(28℃，220rpm)，第二天测OD₆₀₀后将菌液稀释至浓度为0.4，继续摇菌2-4h。室温2500rpm离心10min，去上清后用40mL1×TE悬浮。再室温2500rpm离心10min，小心去上清后用2mL 1×LiAC/0.5×TE悬浮，室温放置10min，即为酵母感受态。

酵母转化：将1.5μL质粒(两个质粒则为1.5μg)加入无菌的1.5-mL离心管中，再加入10μL 10mg/mL的鲑鱼精DNA(鲑鱼精DNA经过100℃煮沸5min，再放在冰上冷却备用)。取100μL酵母感受态细胞，加入700μL 1×LiAc/40％PEG3350/1×TE溶液，震荡混匀后放在30℃金属水浴锅30min，期间颠倒3次。在混合液中继续加入88μL DMSO。42℃热击7min。转化后的酵母菌在13200rpm室温条件下离心15s，吸掉上清后加入1mL1×TE重新悬浮酵母菌。然后再离心，弃上清后加入100μL的1×TE，悬浮菌后分别涂布在含有SD-Ade-His、SD-Ade-His-Leu-Trp培养基的平板上。

培养平板密封后放入30℃的培养中生长，在生长5天后观察酵母生长情况，分析蛋白质之间的相互作用。pGBD-GbWD1以及pGADT7-AtVC1的相互作用如图2所示。从图中可以看出，含有pGBD-GbWD1与pGADT7、pGBD-GbWD1以及pGADT7-AtVC1酵母菌体均能够在SD-Ade-His培养基的平板上生长。但是，只有含有pGBD-GbWD1以及pGADT7-AtVC1酵母菌体能够在SD-Ade-His-Leu-Trp培养基的平板上生长。这个结果证实：GbWD1蛋白质能够与液泡形成蛋白AtVC1互作。由于AtVC1参与了细胞中液泡的形成，从而证实GbWD1蛋白质与液泡形成有关。

实施例4GbWD1基因的人工合成

根据已完成的含1245bp编码区的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度约150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T₄DNA连接酶催化组装成一个完整的GbWD1基因。该合成的DNA片段含有SEQ ID NO：1中160-1404位的核苷酸序列，并且合成基因的两端含XbaI和SacI位点。

将上述人工合成的5’和3’端酶切位点为XbaI和SacI位点GbWD1基因，用于下面GbWD1蛋白质基因植物表达载体的构建。

实施例5提高棉花抗旱、耐盐能力的GbWD1蛋白质基因植物表达载体的构建

提高棉花抗旱、耐盐能力的GbWD1蛋白质基因植物表达载体构建的具体方法如下：

A.pBI121和pCAMBIA2301用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有p35S-GUS-Nos-ter的片段连入pCAMBIA2301，形成中间载体p35S-2301-GUS；

B.用XbaI和SacI双切p35S-2301-GUS和上述人工合成的GbWD1基因，用GbWD1置换p35S-2301-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得GbWD1基因植物表达载体(见图3)。再将GbWD 1基因植物表达载体质粒转入农杆菌系LBA4404中，用于转化棉花。实施例6利用农杆菌介导转化构建获得抗旱、耐盐能力的转基因棉花

把含有目的基因的农杆菌在合适的LB培养基上划线，28℃下培养2天，挑取单菌落接种于50ml(浓度为50mg/L卡那霉素)的LB液体培养基中。培养基在200rpm，28度条件下摇床上培养42-48小时。当OD600达到0.3-0.8之间时，3000g离心收集菌体。利用1/2MS液体培养基将收集的菌体稀释至OD600＝0.2-0.4之间。

(1)外植体与农杆菌的共培养：取上述5-6天苗龄的下胚轴，切成长约0.5-0.8cm长的小段，于1/2MS液体培养基稀释的农杆菌菌液中浸泡15分钟，取出，用滤纸吸干下胚轴表面的菌液后，转入不加任何抗生素的固体CB2.1(4.4g·L^-1MS、30g·L^-1 Glc、KT和2，4-D各0.1mg·L^-1、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、2.0g·L^-1植物凝胶，pH 6.0)培养基中，每皿30-40块下胚轴，于25℃下共培养50-60小时。

(2)愈伤组织(callus)的诱导：用含有cef250mg/l的无菌水洗共培养的下胚轴3-4次，把下胚轴用无菌滤纸吸干下胚轴表面的水后，把下胚轴转入CB3.1(4.4g·L^-1MS、30g·L^-1Glc、KT和2，4-D各0.1mg·L^-1、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、500mg·L^-1Cef、50mg·L^-1Kan、2.0g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)培养基上28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)培养3-4周。小的愈伤组织大约在3周时可以被看到，然后，每隔一个月继代培养，直到愈伤组织达到合适的数量。

(3)胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导：将一定数量的愈伤组织转入到CB4培养基(4.4g·L^-1MS、30g·L^-1Glc、1.9g·L^-1KNO₃、2.0g·L^-1MgCl₂·6H₂O、2.5g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)中，28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)培养，每隔一个月继代培养，直到体细胞胚出现。

(4)体细胞胚的萌发：把体细胞胚转到CB5培养基(MSB-NH₂NO₃、30g·L^-1Glc、1.9g·L^-1KNO₃、0.5g·L^-1Asn、1.0g·L^-1Gln、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、2.5g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)中，让它们萌发并长成小苗。

(5)转基因植株的获得：转移幼苗(2-4cm长，具有叶子的嫩枝)转到CB6培养基中(MSB-NH₂NO₃、30g·L^-1Glc、1.9g·L^-1KNO₃、0.5g·L^-1Asn、1.0g·L^-1Gln、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、2.5g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)，28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)生长4个月。将具有较好根系的转基因植株直接转到含有湿土的小盆中，并在培养室中28℃-30℃(16h光/8h暗，循环光照培养)培养2周，然后，转移这些小盆到温室中。每天对转基因植株进行浇水，对之进行施肥等直到棉铃成熟。然后，收集种子，4℃保存种子。

(7)转基因的PCR鉴定：

用小量抽提植物总DNA的方法得到抗性棉花植株的总DNA，以1.5μl总DNA为模板以P1/P2引物(分别对应于SEQ1中的400-420bp，900-920bp)进行PCR扩增，共检测了56棵无菌棉花苗，其中有15棵被检测到有特异性条带的阳性植株(T0)，部分植株PCR产物电泳结果如图4所示。图4的结果说明，GbWD1基因经过农杆菌介导转化已经转化到棉花植株中。

实施例7利用Southern杂交方法鉴定GbWD1基因的转基因植株；

利用Southern blot分析GbWD1基因在陆地棉基因组中整合情况。

(1)对照和转基因植株基因DNA组的酶切和电泳

按照表2中所述的DNA酶切体系对转基因植株进行DNA酶(BamHI)切。于37℃酶切24-48h后，取5μL产物电泳，于UV灯下检测是否酶切完全，酶切完全的在泳道上为均匀弥散状条带，然后将酶切产物在冷冻干燥离心机上浓缩至50μL，加6μL点样缓冲液后，在1％琼脂糖凝胶电泳。先用120V电泳20min，当DNA全部跑出点样孔后，将电压调为2V/cm，电泳5h。

表2棉花DNA限制性内切酶体系

成分	体积
		棉花基因组DNA	60μg

10×限制性内切酶Buffer	20μL
		限制性内切酶(15U/μL)	5μL
ddH2O	总体积至200μL

(2)转膜

电泳结束后取出凝胶，切去多余的胶块，测量长和宽，切去右上角作为标记，然后放入脱嘌呤液10-15min进行脱嘌呤处理，此时溴酚蓝的颜色变黄。

将胶块转移至一新托盘内，用去离子水漂洗2次，然后将样品转移到变性液中至少50min做DNA变性处理。

变性结束后，将胶块转移至另一新托盘内，用去离子水漂洗2次，然后将样品转移到中和液中30min。

玻璃平板置于陶瓷方盘上，并铺上两张Whatman 3MM滤纸作为虹吸桥，盘中加入足量的转移缓冲液10×SSC，用玻璃棒赶出虹吸桥和玻璃板中的气泡。将一长和宽和凝胶大小一致的硝酸纤维素滤膜，切去一角，在10×SSC溶液浸润3-5min。

将凝胶正面朝下，放置于虹吸桥中央，用玻璃棒赶出滤纸和胶块之间的气泡。将硝酸纤维膜覆盖于凝胶上，并使切角对齐。用Parafilm封凝胶的四边，以防短路。在膜上放三层3MM滤纸，并用玻璃棒赶出气泡。将多层吸水纸覆盖于滤纸上，顶部放一合适大小的玻璃板，并在玻璃板上方放置500g重物，转膜3-5d，期间应不断更换吸水纸。转膜完成后，取下胶体，用EB染色10min，并进行紫外检测，检查转膜效果。用3MM滤纸夹住尼龙膜，置于室温30min晾干，然后置于80℃固定2-3h后，将尼龙膜包裹于锡泊纸中，于4℃保存备用。

(3)探针制备

根据GbWD1的3’端相对非保守区域设计特异引物，扩增300bp长度的片段(1300-1600)作为Southern blot检测的探针。

探针标记步骤如下：取20μL Cross-linker用80μL水(试剂盒内提供)稀释成工作浓度。工作液在2-8℃可保存一个星期。用试剂盒内提供的水将用于标记的DNA稀释到10ng/μL。核酸中的盐浓度必须尽可能低，不超过50mmol/L。取10μL稀释过的DNA样品于微量Eppendorf离心管中，在沸水浴中变性5min。立即将样品置于冰上冷却5min，在微量离心机上轻轻离心，将混合物收集到管底。向冷却的DNA样品中加入10μLReaction buffer，轻轻地混匀，置于冰上。

加入2μL Labeling reagent，轻轻地混匀。加入10μL Cross-linker工作液，彻底混匀，在微量离心机上轻轻离心，将混合物收集到管底。反应混合物于37℃温育30min。标记后的探针可以立即使用，或置于冰上保存2h。长时间保存需要加入50％甘油(v/v)。

(4)杂交：

取所需体积的杂交缓冲液，预热至55℃。Buffer用量一般为0.25mL/cm²杂交膜。对于大的杂交膜，Buffer用量可以减少到0.125mL/cm²；将膜置于Hybridization buffer中，在杂交炉中预杂交至少15min；在预杂交Buffer中加入标记好的探针，一般每毫升Buffer中加入5-10ng探针；在55℃杂交炉中杂交过夜。可通过改变杂交温度(50-75℃)调控严谨度。

(5)洗膜：

将Primary wash buffer预热至55℃，其用量为2-5mL/cm²；小心地将纤维膜转移到Primary wash buffer中，55℃漂洗10min；用Primary wash buffer在55℃漂洗10min；将纤维膜转移至一干净容器，加入过量Secondary wash buffer，在室温下漂洗5min；用Secondary wash buffer再一次漂洗5min。

(6)检测：

去除膜上多余的Secondary wash buffer，并将膜置于一层平整的SanranWrap上面，使样品面朝上；将检测试剂滴于膜上(30-40μL/cm²)，放置2-5min，除去多余检测试剂；

在X光片夹中铺一层干净滤纸，滤纸下面放上增感屏前屏；将膜用保鲜膜包好，正面向上放在滤纸上，用胶带固定；暗室中取一张X光片放在杂交膜上。再放上增感屏后屏，合上光片夹，封上胶带，曝光2h左右；在暗室中将显影液倒入大方盘中，取出X光片，置显影液中，轻轻晃动液体，显影3-5min至黑色曝光条带显现，立即将X光片转移至定影液中，定影20min左右，取出X光片置流水中冲洗过夜；

转GbWD1基因的棉花植株的Southern杂交分析情况见图5。图5中1-5为转GbWD1基因植株，P为阳性质粒对照。图5的实验结果说明GbWD1基因已经整合到棉花的基因组中，拷贝数为1-3个可用于基因的功能分析鉴定。

实施例8转GbWD1基因的棉花植株的抗旱、耐盐能力的分析鉴定

为了进一步了解GbWD1基因在提高棉花抗旱、耐盐能力的具体功能，我们对所获得的转GbWD1基因棉花株系的进行抗旱、耐盐能力试验，比较转GbWD1基因基因棉花植株与非转基因植株之间抗旱、耐盐能差异。所有田间试验是2011年5月1日-10月30日在上海交通大学校区完成。

1、鉴定项目

用于鉴定的转基因株系1-5是经过PCR和Southern杂交分析后获得的植株。转GbWD1基因的棉花植株(株系1～5)与对照非转基因植株的在干旱以及高盐处理条件下棉花的发芽率、生长速度(根长、植株干重和植株的鲜重)。

2、鉴定方法

转基因植株的耐盐水平鉴定：转GbWD1基因的棉花植株(株系1～5)与对照非转基因植株在1.0％NaCl(相当180mMNaCl)水平下进行比较鉴定。先在洁净的搪瓷盘(长40cm、宽30cm)底部放置纱布两层，每个品种20粒种子；在种子上面盖两层纱布，然后加入1％的NaCl溶液，溶液量以上层纱布湿润、倾斜时盘底无明显溶液聚集为宜。将搪瓷盘放置于恒温光照培养箱内培养，光周期为光照12hr(30℃)：黑暗12hr(24℃)。在播种后第7天统计棉花发芽率、植株的根长、植株的干重和鲜重。所有试验重复3次。

转基因植株的抗干旱能力分析：试验在长8m、宽0.7m、深0.2m的水泥池中进行。水泥池放入已经经过清洗消毒的沙子，沙池上方用塑料薄膜拱棚覆盖，防止降雨对土壤水分的影响。转GbWD1基因的棉花植株(株系1～5)与对照非转基因植株随机区组排列，每个株系采用种子20粒，行距7cm，，株距7cm，设3次重复。以沙子含水量3％为干旱指标，土壤水分降为3％时，浇入Hoagland营养液(其中含有300mM山梨醇)使沙子的水分含量恢复到3％的水平。在20天后测定转GbWD1基因的棉花植株(株系1～5)与对照非转基因植株的发芽率、根长、植株的干重和鲜重。

3、结果

从表3中可以看到，在1％盐处理条件下，转GbWD1基因的棉花植株与对照相比，转GbWD1基因的棉花植株与对照相比，根长增加了2.5倍，发芽率增加了20％、达到90％(90％的发芽率为棉花种子在非盐处理条件下正常发芽率)，植株干重和鲜重增加了2倍以上。这些结果说明在盐处理条件下特异表达GbWD1基因具有显著促进棉花的发芽和生长作用，超量表达GbWD1基因具有增强棉花耐盐的功能。

从表4中可以看到，在干旱条件下(300mM山梨醇以及低水分处理)转GbWD1基因的棉花植株与对照相比，转GbWD1基因的棉花植株与对照相比根长平均增加了3倍，发芽率增加了40％、达到90％(90％的发芽率为棉花种子在非盐处理条件下正常发芽率)，植株干重和鲜重平均增加了1.5和0.5倍以上。这些结果说明在干旱条件下特异表达GbWD1基因具有显著促进棉花的发芽和生长作用，超量表达GbWD1基因具有增强棉花抗旱的功能。

4、结论

在棉花植株中超量表达GbWD1基因具有显著提高棉花耐盐与干旱能力的功能。

表3转基因植株与对照植株在盐处理条件下的比较分析

表4转基因植株与对照植株在干旱条件下的比较分析

Claims (10)

1.一种能够提高棉花耐盐与干旱能力的多肽，包含具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2.权利要求1所述的多肽，所述保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是：SEQ ID NO：2序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐盐与干旱能力功能的多肽。

3.权利要求1或2所述的多肽在提高耐盐能力方面的功能与应用。

4.权利要求1或2所述的多肽与液泡形成蛋白AtVC1互作的功能。

5.一种能够提高棉花耐盐与干旱能力的基因，包含：

(a)编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或

(b)与(a)互补的多核苷酸。

6.权利要求5所述的基因，其特征在于，其序列选自：

(a)具有SEQ ID NO：1中160-1404位的序列；或

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1591的序列。

7.权利要求5或6所述的基因在提高棉花耐盐能力方面的功能与应用。

8.一种载体，其特征在于含有权利要求5或6所述的基因。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于含有权利要求8所述的载体。

10.一种提高棉花耐盐与干旱能力的方法，包括：

(a)提供携带权利要求7所述的表达载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所携带的表达载体中的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择出转入有GbWD1蛋白质的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

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