CN111763674A - 一种黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种黄瓜雄性不育基因的启动子ms‑3‑P及其应用。具体是克隆了黄瓜ms‑3基因的候选启动子proms‑3序列，构建了含proms‑3的克隆载体pMD19‑T‑proms‑3和表达载体pCAMBIA1301‑proms‑3。将其导入农杆菌中，获得工程菌并通过gus报告基因表达活性法验证了候选启动子proms‑3具有启动活性。然后对候选启动子proms‑3进行5¢端渐进缺失分析，最终发现ms‑3基因的启动子(ms‑3‑p)位于为‑1~‑1002 bp(包含核心启动子‑1~‑501 bp，增强子‑501~‑1002 bp序列)。本发明为阐明黄瓜ms‑3雄性不育基因的调控机制及其在黄瓜杂交育种和生产上的应用奠定了基础。

Description

一种黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种黄瓜ms-3基因(雄性不育基因)的克隆与功能验证。
背景技术
雄性不育(male sterility，MS)是指植物的雄性器官发生退化、发育不良，或者植物的花粉、精子败育从而导致雄蕊不能发挥原有的生育功能的现象，但是其雌蕊的发育并不受影响。雄性不育的发现对于高效繁殖杂交种子、保护F1代杂交品种亲本的商业价值等实际应用方面具有重要意义，而且又是花粉发育研究的模式材料，所以有着重要的研究价值。在传统的控制植物授粉的过程中，大都采用人工去雄的方法，由于每一株植株都需要去雄，不仅过程繁琐、耗时长，还会产生高昂的人工成本，所以利用雄性不育和基因工程技术，开发新型授粉控制系统，是解决这一问题的有效途径。目前已经在玉米、水稻中发现了雄性不育基因并已较好地应用(Zhenyi Chang et al.,Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear male sterility gene,2016)，但黄瓜雄性不育的应用尚在起步阶段。
在传统不育系制种过程中，通常使用可育杂合体作为半保持系(Msms)，其与隐性核雄性不育系(Msms)杂交只能产生50%的不育系(Msms)，另一半可育的(Msms)必须人工去雄。为创制一种能用于黄瓜雄性不育系种子生产技术SPT (seed production technology，SPT)的完全保持系(full maintainer line, FML)，用FML与不育系杂交可产生100%雄性不育系，可免去人工去雄的繁琐环节，大大节省制种成本，由此可大力推动隐性核雄性不育系在杂交育种上的应用(Yongzhong Wu et al., Development of a novel recessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maize and other cross-pollinating crops，2015)。
本课题组前期首次发现并克隆了黄瓜ms-3雄性不育基因(Yike Han et al.,Theoretical and applied Genetics, 2017)，并构建了黄瓜育性恢复基因(MS-3)、花粉致死基因(ZmAA1)和荧光蛋白标记基因(DsRed2) 的NML表达载体，但由于黄瓜MS-3基因的启动子的具体边界尚未明确，只好先用MS-3基因上游2000 bp和下游455 bp的估测启动子区段替代。
在真核生物中，大部分启动子位于结构基因上游，是一段可以被RNA聚合酶特异性识别的DNA序列。也存在少量位于转录起始位点下游的启动子，甚至有一些启动子存在于结构基因的下游，对基因进行反转录，但这一类启动子的数量较少，且都具有类似的特征。当细胞内存在有效启动子时，RNA聚合酶会被活化并识别启动子序列并与之结合，进而起始基因的转录。在基因表达过程中的起始阶段，RNA聚合酶和启动子的相互作用会直接影响基因的表达和效率(李明刚，高级分子遗传学，科学出版社，2005，351-366)。
启动子是调控基因表达及表达量的重要“开关”，也是研究基因表达调控的关键所在，对阐明基因的转录调控模式和调控机制具有重要意义。本发明通过ms-3基因候选启动子预测区段的生物信息学分析、启动子的克隆、5¢缺失分析等技术确定了黄瓜ms-3基因的具体边界和位置，克隆ms-3基因启动子序列，构建相应的表达载体，并采用瞬时转染技术对所克隆启动子的功能进行验证。
发明内容
本发明公开的启动子具有组织特异性，含有多重核心顺式作用元件TATA框、CAAT框和特定功能性顺式作用元件MYB、ERE、LTR、AAGAA。本发明为阐明黄瓜ms-3不育基因的调控机制及其在黄瓜杂交育种和生产上的应用奠定了基础。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
1）构建一种含有ms-3基因候选启动子的克隆载体pMD19-T-proms-3。
2）构建一种含有ms-3基因候选启动子的表达载体pCAMBIA1301-proms-3和农杆菌工程菌GV3101/ pCAMBIA1301-proms-3。
3）农杆菌侵染烟草，并进行gus报告基因的瞬时表达实验。
4）对候选启动子进行不同长度的5¢端序列缺失分析和功能验证。
本发明是通过以下技术方案实现的：
首先，本发明从载体pCAMBIA1301-SPT中克隆了ms-3基因上游1953 bp的候选序列proms-3（见SEQ ID NO:2）。其中的启动子具有SEQ ID NO:1所示的碱基核苷酸序列：
CATCATCAATTCATACAATTGTTAGACTTAAAACATTGATGAATCAATATTTTCAATGGAAAACTGTAATTAATGTTCATTTTATGAATAATAATTAAGGATGTAGCAACATTTAAAAAAACTTGTAAATATAACAAAACTATCGCTGATAGAATCGTACAATATATAAGTGATAGACCAATATTTGCAACATGATGTATCACTGATACACTTCTATTATTGATATAATTTGACAACTTTTGTTATATTTATTTTTTTTTAAAATGTTACTATATATTTAATTACTTTGAATTTAATTGCTAAATTTGAAACTATCTCTATTTCAATTTTATGGATATCAAATATTTTCTATAAAAAAAATGTACAAAATTCGTTTAAATAGGTAATTAAGTTATTTTTAATCTCCAACTAAATTATGAACATAATTATTATTATTATGAAGAATTGTCAAAAATAGCAAATTTGATAAAAATATTTACAACGTATAACAAATTTTTAGATTTATCAATAATAGACATTGACACTAATATACTTCTATTACTATTGATAGACAGTCATAAAAATCTATCAATTTCTAACATGAATAGAATTCAAAATTTTGCTATAATTTATTTTATTATTTTAAAAAAATACCCATATTATCATTAGTTCCATTCATATTGAATTAGAAGATTAACATATTTTTTAAAAATATTTTACAAACATTTATAAAAAAATAAATATCAAAACATATCATAGACATTTAATATCATCAAACTTTTGATTTAGTATATATATATATCAACATATTCACATCCTTTAGCTTTACAATCTCAACATAACTGCCGAAACTAACTCAACAATATACACTTAACGAACTCAGAAAAACGGTATACTTTCTAAGCATTCTCTCGAGTTCCTTTATCAAAACCTCCAAATCCAAATATGAAACTACCAAAATTCAGTGAATGGTAGAGAAAGAAGAAGAAGAAGAAGATGAAGAAATGAAGTTCATCTTCAGCC
ms-3基因上游1953 bp的候选序列（ms-3-P） SEQ ID NO:2：
ATGAGAATAATAACCATGATAAAGACTAGTGAGTCTCGCGTAAATTTAAAACCAAATGGAATTGTACACTCATAATTTCTCCCATTATGC AACATTCATA TATTACAAAATTTAAAATAG ACCCCACATTTTATTGCATTTAAGAAATATAAGTAAATCAAAGGATATCCATATTTTCCATTATCATCCATTTATTATGTTTGGAAGCACTAAATATTTATAACATTTTTTAGGAATGTTTTTAAATAAACCAAAAAAAATTAAAACTATTTACTTACTTGGAAAAATTTATTAACCTATCGTTAGACCATTTTAGTTTTCTTTTTCTTCGATATTTTATAAATAGTTTGGTTATTTTCTATTTATAATAATTTCTCACATTTTTTTACTCTAACAAATTTTTACAATTTTTGTTTATTAGTTAAAAATAAATTTTGGCCTCTAGATTGAAAAAAAAAGAAAAGTTAAAAGTTCAATGTAATTTGCAACAAACGTTTAGACTAAATAATTTGACAGAACATCATGAGGTTTCGAATCACCCCATAAATAGTCTTCATGGTTTTAGATTATATATAAATATAGGACTCGGAATGTATCATTGTTGAAAACACAAATAAAATTAACAAATCATTTACAACATTTACAATCTTAAATTTTAATGAAAAGTATAGCACATGAGAAAATTTATAAAATAAATTTAAAATATAGCATATGAATTTGTAAAAATAGCAAATGTTAACCGGTGAAGCATACCTTCAATGGTTATCGTTATAGAAATCATCAGGTATAGTTGTTATATCAATGACACTAAACATATTTAAGGAAATATTTGAAATGGTAGTTGGACATAAACATGTTTGTATTTTATCAAATTTGTTCTATATTTATATATATTTTTTTGTTTAAATGTCATCTACACAATTGACCCTAAGCTTTAACAAAATATCAACATCATCAATTCATACAATTGTTAGACTTAAAACATTGATGAATCAATATTTTCAATGGAAAACTGTAATTAATGTTCATTTTATGAATAATAATTAAGGATGTAGCAACATTTAAAAAAACTTGTAAATATAACAAAACTATCGCTGATAGAATCGTACAATATATAAGTGATAGACCAATATTTGCAACATGATGTATCACTGATACACTTCTATTATTGATATAATTTGACAACTTTTGTTATATTTATTTTTTTTTAAAATGTTACTATATATTTAATTACTTTGAATTTAATTGCTAAATTTGAAACTATCTCTATTTCAATTTTATGGATATCAAATATTTTCTATAAAAAAAATGTACAAAATTCGTTTAAATAGGTAATTAAGTTATTTTTAATCTCCAACTAAATTATGAACATAATTATTATTATTATGAAGAATTGTCAAAAATAGCAAATTTGATAAAAATATTTACAACGTATAACAAATTTTTAGATTTATCAATAATAGACATTGACACTAATATACTTCTATTACTATTGATAGACAGTCATAAAAATCTATCAATTTCTAACATGAATAGAATTCAAAATTTTGCTATAATTTATTTTATTATTTTAAAAAAATACCCATATTATCATTAGTTCCATTCATATTGAATTAGAAGATTAACATATTTTTTAAAAATATTTTACAAACATTTATAAAAAAATAAATATCAAAACATATCATAGACATTTAATATCATCAAACTTTTGATTTAGTATATATATATATCAACATATTCACATCCTTTAGCTTTACAATCTCAACATAACTGCCGAAACTAACTCAACAATATACACTTAACGAACTCAGAAAAACGGTATACTTTCTAAGCATTCTCTCGAGTTCCTTTATCAAAACCTCCAAATCCAAATATGAAACTACCAAAATTCAGTGAATGGTAGAGAAAGAAGAAGAAGAAGAAGATGAAGAAATGAAG TTCATCTTCAGCC
将候选启动子proms-3序列与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-proms-3，并将克隆载体转化大肠杆菌DH5α。
其次，本发明构建了表达载体pCAMBIA1301-proms-3：使用BamH I和Nco I同时酶切pCAMBIA1301和pMD19-T-proms-3，分别回收大片段和小片段，进行同源重组连接，构建表达载体pCAMBIA1301-proms-3，并将其转化农杆菌GV3101获得工程菌株。
第三，本发明使用构建的含proms-3的工程农杆菌侵染烟草根、茎、叶，利用pCAMBIA1301载体上携带的gus报告基因进行GUS组织化学染色分析，发现烟草的叶片和茎部可以被染成蓝色(具有启动子活性)。
第四，为进一步确定启动子的具体位置，利用本发明构建的克隆载体pMD19-T-proms-3继续扩增出1500 bp、1002 bp、501 bp、282 bp四种5¢端渐进缺失克隆的片段，通过PCR扩增、克隆载体构建、同源重组连接、抗性筛选、双酶切验证等方法成功构建含有四种5¢缺失启动子片段的表达载体。
将上述构建的四种载体转化农杆菌后侵染烟草，发现1002 bp片段的启动效率最高，其次是501bp、1500 bp、1953 bp的片段，282 bp片段基本不能启动gus基因表达。
上述结果表明，核心启动子位于ms-3基因上游-1~-501 bp内，-501~-1002 bp序列可能为增强子，-1002 bp~-1500 bp之间可能有一个反向调控序列。因此，将ms-3基因上游-1~-1002 bp序列命名为ms-3基因启动子（ms-3-P）。用含有ms-3-P的工程农杆菌分别侵染烟草的根、茎、叶后进行对比，发现烟草的根部不能被染色，而茎部和叶部可被染色，表明：该启动子可能具有组织特异性。对ms-3-P中的核心启动子和增强子进行顺式作用元件分析，发现在该启动子区域含有多重TATA框、CAAT框等核心启动子元件和特定功能性MYB、ERE、LTR、AAGAA顺式作用元件。
本发明进一步公开了黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P在提高ms-3基因表达能力方面的应用，主要指的是：调控该基因的转录调控模式和机制，实验结果显示：本发明运用基因操作技术，获得了候选启动子proms-3序列，构建包含这段序列的克隆载体pMD19-T-proms-3和表达载体pCAMBIA1301-proms-3；将表达载体转化农杆菌GV3101并侵染烟草，利用gus报告基因进行瞬时活性分析，证明ms-3基因ms-3基因上游-1~-1002 bp序列为完整的启动子，具有最高启动活性，将其命名为ms-3基因启动子（ms-3-P）。ms-3-P可作为一种黄瓜花药特异性雄性不育基因的启动子，对研究该基因的转录调控模式和机制，提高ms-3基因的表达有重要意义。可研发新型黄瓜雄性不育系用于杂交育种和黄瓜生产，有效保护优良黄瓜种质资源和品种知识产权。
附图说明
图1 proms-3扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果；泳道1、2、3、4：proms-3序列M：DNA marker DL2000；
图2克隆载体pMD19-T-proms-3的菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；1-8为挑取的8个菌落 M：DNA marker DL2000；
图3表达载体pCAMBIA1301-proms-3的构建；（A）pCAMBIA1301质粒的Nco I和BamH I双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果;泳道1、2：双酶切pCAMBIA1301载体质粒后的产物 M：DNAmarker DL15000；（B）pCAMBIA1301-proms-3表达载体的Nco I和BamH I双酶切验证琼脂糖凝胶电泳结果；泳道1：pCAMBIA1301-proms-3 载体泳道2：双酶切后的pCAMBIA1301-proms- 3载体 M：DNA marker DL10000；
图4含有pCAMBIA1301-proms-3表达载体的农杆菌侵染烟草后的瞬时表达实验结果；（A）试管中的染色结果；1：烟草根部无染色 2：烟草茎部呈现蓝色 3：烟草叶片呈现蓝色；（B）载玻片和显微镜下的染色结果；1、4：烟草根无颜色 2、5：烟草茎呈现蓝色 3、6：烟草叶片呈现蓝色；
图5构建四种5¢端渐进缺失表达载体并使用双酶切验证；（A）1500 bp（B）1002 bp（C）501 bp（D）282 bp双酶切鉴定结果；泳道1：重组载体 2：pCAMBIA1301线性化载体 M：DNAmarker DL10000；
图6含有5 ¢端渐进缺失表达载体的农杆菌侵染烟草茎部的GUS瞬时表达情况；（A）试管中的染色结果（B）载玻片上的观察结果（C）显微镜下的观察结果；结果显示，282 bp实验组基本无染色，501 bp实验组呈现蓝色，1002 bp实验组染色最深，1500 bp和1953 bp的实验组呈现蓝色但均比1002 bp实验组染色浅；
图7含有5 ¢端渐进缺失表达载体的农杆菌侵染烟草叶片的GUS瞬时表达检测结果；（A）试管中的染色结果（B）载玻片上的观察结果（C）显微镜下的观察结果；结果显示，282 bp实验组基本无染色，501 bp实验组呈现蓝色，1002 bp实验组染色最深，1500 bp和1953 bp的实验组呈现蓝色但均比1002 bp实验组染色浅；
图8含有5 ¢端渐进缺失表达载体的农杆菌侵染烟草根部的GUS瞬时表达检测结果；
图9预测核心启动子位置的示意图；
图10核心启动子和增强子中包含的顺式作用元件。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
构建一种含有ms-3基因候选启动子的克隆载体pMD19-T-proms-3，包括如下步骤：
（1）以pCAMBIA1301-SPT为模板（将黄瓜Ms-3基因、花粉致死基因、颜色标记基因的三基因模块插入了pCAMBIA1301载体），通过PCR（用Pfu酶），获得候选启动子proms-3片段。反应条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，后延伸72℃ 5 min。反应后产物末端需要加A，直接向体系中加入1 μL Taq酶和1 μLdATP，混匀后72℃保温30 min。实验所用的PCR引物是根据proms-3的序列设计的：
P1: 5¢-CCGGAATTCCGGAATGAGAATAATAACCATGATAAAGAC-3¢
P2: 3¢-CATGCCATGGCATGGGCTGAAGATGAACTTCATTTCTT-5¢
注：设计时包含了BamHⅠ、NcoⅠ酶切位点
（2）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收proms-3基因片段（图1）。
（3）proms-3片段与pMT19-T载体连接
表1 pMD19-T-proms-3克隆载体的连接体系
Figure DEST_PATH_IMAGE001
将上述得到的pMD19-T-proms-3转化大肠杆菌DH5α，涂布平板过夜培养后挑取阳性菌落进行菌落PCR检测。反应条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火56.5℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，后延伸72℃ 5 min。将上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证（图3），并挑取阳性菌落进行测序，测序结果正确。
实施例2
构建一种含有ms-3基因候选启动子的表达载体pCAMBIA1301-proms-3和农杆菌工程菌GV3101/ pCAMBIA1301-proms-3。包括如下步骤：
提取测序正确的大肠杆菌DH5α的质粒，使用BamHⅠ、NcoⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后胶回收1953bp片段。同时使用BamHⅠ、NcoⅠ双酶切pCAMBIA1301载体，琼脂糖凝胶电泳后胶回收11065 bp片段（图5A）。同源重组连接。为了确保目的片段以正确的方式插入载体，在上游引物的5¢端加入BamHI的酶切位点及表达载体上该酶切位点前15个碱基的序列，在下游引物的5¢端加入NcoI的酶切位点及表达载体上该酶切位点后15个碱基的序列。引物设计如下：
P1:5¢-CGAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGAGAATAATAACCATGATAAAGACTAGTGA-3¢
P2:3¢-GAAATTTACCCTCAGATCTACCATGGGGCTGAAGATGAACTTCATTTCTTCATC-5¢
将proms-3片段与带有15 bp表达载体序列的上下游引物进行PCR反应。PCR条件为：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 10 s，退火58℃ 10 s，延伸72℃ 1 min，后延伸72℃ 5 min。将线性化pCAMBIA1301表达载体与PCR扩增产物用同源重组连接酶重组连接，混匀后在37℃放置30 min，转化大肠杆菌DH5α，并进行双酶切验证（图5B）。将上述表达载体pCAMBIA-proms- 3转入农杆菌GV3101，LB固体培养基抗性筛选后进行菌落PCR验证。
实施例3
农杆菌侵染烟草，并进行gus报告基因的瞬时表达活性检测：
农杆菌侵染烟草：农杆菌活化后，扩大培养，直至OD600为0.4-0.6。将菌液转移至50 mL离心管中，室温条件下5000rpm离心8-10 min，弃去上清液。用1/2MS液体培养基重悬菌体，使得农杆菌的OD600为0.4-0.6。烟草剪下后用蒸馏水洗3次后，再用10%次氯酸钠消毒5 min，然后再用蒸馏水洗5次。将烟草的叶片切成小片，根和茎切成小段，在农杆菌菌液中浸染20min。吸干菌液，培养于1/2MS+6-BA+α-NAA+AS的固体培养基上。注意植物组织要贴紧培养基，在26℃的条件下培养72 h。将材料加入到2 mL的EP管中，加1 mLGUS染色液，遮光。抽真空15 min，37℃过夜染色。加入无水乙醇:冰乙酸脱色液（7：3，现配现用）1 mL；37℃摇床脱色1 h左右，观察并拍照（图6）。
实施例4
候选启动子proms-3的5¢端不同长度序列缺失分析。
在上述构建的pMD19-T-proms-3克隆载体的基础上，继续扩增出1500 bp、1002bp、501 bp、282 bp四种5¢端渐进缺失克隆的片段，并使用Long Taq酶对pMD19-T-proms-3进行PCR反应。
表2 pMD19-T-proms-3克隆载体的连接体系
Figure DEST_PATH_IMAGE002
分别对四段序列进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收1500 bp、1002 bp、501 bp、282 bp的片段，将回收产物与pCAMBIA1301线性化载体同源重组连接，并转化农杆菌GV3101，进行双酶切电泳检测验证（图5）。农杆菌扩大培养，1/2MS液体培养基重悬后分别浸染烟草的根、茎、叶20 min，培养1/2MS+6-BA+α-NAA+AS的固体培养基上，26℃的条件下培养72 h。加1mLGUS染色液，遮光。抽真空15 min，37℃过夜染色。加入无水乙醇:冰乙酸脱色液1 mL；37℃摇床脱色1 h左右，观察并拍照（图6-8）。
对GUS组织化学活性染色结果分析，发现含有282bp启动子的农杆菌侵染烟草后几乎不能使烟草变为蓝色，说明长度仅有282 bp时不能启动下游基因；使用含有501 bp启动子的农杆菌侵染烟草，发现烟草可以被GUS染液染成较明显的蓝色，说明该片段具有启动子的活性；蓝色在启动子长度为1002 bp时达到最大值，在长度为1500 bp、2000 bp时较1002bp时染色较浅。
这些结果表明，核心启动子位于ms-3基因上游-1~-501 bp内，-501~-1002 bp序列可能含有提高表达效率的增强子序列，-1002 bp~-1500 bp之间可能有一个反向调控序列（图9）。因此表明，ms-3基因上游-1~-1002 bp序列含有完整的启动子序列，将其命名为ms- 3-p。用含有ms-3-p的工程农杆菌分别侵染烟草的根、茎、叶后进行GUS组织化学染色分析发现，烟草的根没有颜色，茎和叶有蓝色，表明：该启动子可能具有组织特异性。
对ms-3-p的核心启动子及增强子片段进行分析，发现该区域含有TATA框、CAAT框等核心顺式作用元件和特定功能性MYB、ERE、LTR、AAGAA顺式作用元件（图10）。其中，TATA框是RNA聚合酶的结合位点，CAAT框具有调控下游基因的转录起始和频率的作用，主要集中于靠近基因的上游区域。MYB元件具有水分胁迫、调节类黄酮生物合成作用，ERE元件具有乙烯应答的作用，LTR是低温应答元件，AAGAA基序是光响应元件。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业科学院；天津科润农业科技股份有限公司；天津市蔬菜研究中心
<120> 一种黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catcatcaat tcatacaatt gttagactta aaacattgat gaatcaatat tttcaatgga 60
aaactgtaat taatgttcat tttatgaata ataattaagg atgtagcaac atttaaaaaa 120
acttgtaaat ataacaaaac tatcgctgat agaatcgtac aatatataag tgatagacca 180
atatttgcaa catgatgtat cactgataca cttctattat tgatataatt tgacaacttt 240
tgttatattt attttttttt aaaatgttac tatatattta attactttga atttaattgc 300
taaatttgaa actatctcta tttcaatttt atggatatca aatattttct ataaaaaaaa 360
tgtacaaaat tcgtttaaat aggtaattaa gttattttta atctccaact aaattatgaa 420
cataattatt attattatga agaattgtca aaaatagcaa atttgataaa aatatttaca 480
acgtataaca aatttttaga tttatcaata atagacattg acactaatat acttctatta 540
ctattgatag acagtcataa aaatctatca atttctaaca tgaatagaat tcaaaatttt 600
gctataattt attttattat tttaaaaaaa tacccatatt atcattagtt ccattcatat 660
tgaattagaa gattaacata ttttttaaaa atattttaca aacatttata aaaaaataaa 720
tatcaaaaca tatcatagac atttaatatc atcaaacttt tgatttagta tatatatata 780
tcaacatatt cacatccttt agctttacaa tctcaacata actgccgaaa ctaactcaac 840
aatatacact taacgaactc agaaaaacgg tatactttct aagcattctc tcgagttcct 900
ttatcaaaac ctccaaatcc aaatatgaaa ctaccaaaat tcagtgaatg gtagagaaag 960
aagaagaaga agaagatgaa gaaatgaagt tcatcttcag cc 1002
<210> 2
<211> 1953
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagaataa taaccatgat aaagactagt gagtctcgcg taaatttaaa accaaatgga 60
attgtacact cataatttct cccattatgc aacattcata tattacaaaa tttaaaatag 120
accccacatt ttattgcatt taagaaatat aagtaaatca aaggatatcc atattttcca 180
ttatcatcca tttattatgt ttggaagcac taaatattta taacattttt taggaatgtt 240
tttaaataaa ccaaaaaaaa ttaaaactat ttacttactt ggaaaaattt attaacctat 300
cgttagacca ttttagtttt ctttttcttc gatattttat aaatagtttg gttattttct 360
atttataata atttctcaca tttttttact ctaacaaatt tttacaattt ttgtttatta 420
gttaaaaata aattttggtc ctctagattg aaaaaaaaag aaaagttaaa agttcaatgt 480
aatttgcaac aaacgtttag acttaaataa tttgacagaa catcatgagg tttcgaatca 540
ccccataaat agtcttcatg gttttagatt atatataaat ataggactcg gaatgtatca 600
ttgttgaaaa cacaaataaa attaacaaat catttacaac atttacaatc ttaaatttta 660
atgaaaagta tagcacatga gaaaatttat aaaataaatt taaaatatag catatgaatt 720
tgtaaaaata gcaaatgtta accggtgaag cataccttca atggttatcg ttatagaaat 780
catcaggtat agttgttata tcaatgacac taaacatatt taaggaaata tttgaaatgg 840
tagttggaca taaacatgtt tgtattttat caaatttgtt ctatatttat atatattttt 900
ttgtttaaat gtcatctaca caattgaccc taagctttaa caaaatatca acatcatcaa 960
ttcatacaat tgttagactt aaaacattga tgaatcaata ttttcaatgg aaaactgtaa 1020
ttaatgttca ttttatgaat aataattaag gatgtagcaa catttaaaaa aacttgtaaa 1080
tataacaaaa ctatcgctga tagaatcgta caatatataa gtgatagacc aatatttgca 1140
acatgatgta tcactgatac acttctatta ttgatataat ttgacaactt ttgttatatt 1200
tatttttttt taaaatgtta ctatatattt aattactttg aatttaattg ctaaatttga 1260
aactatctct atttcaattt tatggatatc aaatattttc tataaaaaaa atgtacaaaa 1320
ttcgtttaaa taggtaatta agttattttt aatctccaac taaattatga acataattat 1380
tattattatg aagaattgtc aaaaatagca aatttgataa aaatatttac aacgtataac 1440
aaatttttag atttatcaat aatagacatt gacactaata tacttctatt actattgata 1500
gacagtcata aaaatctatc aatttctaac atgaatagaa ttcaaaattt tgctataatt 1560
tattttatta ttttaaaaaa atacccatat tatcattagt tccattcata ttgaattaga 1620
agattaacat attttttaaa aatattttac aaacatttat aaaaaaataa atatcaaaac 1680
atatcataga catttaatat catcaaactt ttgatttagt atatatatat atcaacatat 1740
tcacatcctt tagctttaca atctcaacat aactgccgaa actaactcaa caatatacac 1800
ttaacgaact cagaaaaacg gtatactttc taagcattct ctcgagttcc tttatcaaaa 1860
cctccaaatc caaatatgaa actaccaaaa ttcagtgaat ggtagagaaa gaagaagaag 1920
aagaagatga agaaatgaag ttcatcttca gcc 1953

Claims (7)

1.一种黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P，具有SEQ ID NO:1所示碱基序列。
2.权利要求1所述的黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P，其特征在于： ms-3基因上游-1~-501 bp内为核心启动子序列，-501~-1002 bp序列为增强子序列，其具有组织特异性，该启动子区域含有多重TATA框、CAAT框核心启动子元件和特定功能性MYB、ERE、LTR、AAGAA顺式作用元件。
3.一种表达载体，其特征在于该表达载体包含权利要求1所述的ms-3基因启动子ms-3-P，具体是指大肠杆菌表达载体pCAMBIA1301-proms-3。
4.一种大肠杆菌工程菌株，其特征在于：它是用权利要求3所述的表达载体pCAMBIA1301-proms-3转化大肠杆菌DH5α所获得的工程菌株DH5α/ pCAMBIA1301-proms-3。
5.一种农杆菌工程菌株，其特征在于是用权利要求4所述的表达载体pCAMBIA1301-proms-3转化农杆菌GV3101所获得的工程菌株GV3101/ pCAMBIA1301-proms-3。
6.权利要求1所述黄瓜雄性不育基因的启动子ms-3-P在提高ms-3基因表达能力方面的应用。
7.权利要求6所述的应用，其中所述的提高ms-3基因表达能力指的是：调控黄瓜ms-3雄性不育基因的杂交育种能力。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450749A (zh) * 2014-11-19 2015-03-25 江西农业大学 黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用
CN105420241A (zh) * 2015-12-22 2016-03-23 武汉市农业科学研究所 西瓜ClCP2基因的启动子及其制备方法和应用
CN106048025A (zh) * 2016-06-21 2016-10-26 黑龙江八农垦大学 与甜瓜雄性不育ms5基因紧密连锁的分子标记BSA3‑2及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450749A (zh) * 2014-11-19 2015-03-25 江西农业大学 黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用
CN105420241A (zh) * 2015-12-22 2016-03-23 武汉市农业科学研究所 西瓜ClCP2基因的启动子及其制备方法和应用
CN106048025A (zh) * 2016-06-21 2016-10-26 黑龙江八农垦大学 与甜瓜雄性不育ms5基因紧密连锁的分子标记BSA3‑2及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIKE HAN等: "Fine mapping of a male sterility gene ms-3 in a novel cucumber(Cucumis sativus L.) mutant" *
韩毅科等: "黄瓜雄性不育突变株的发现及雄性不育基因ms-3的精细定位" *

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