CN106497922A - 抗螟虫抗草甘膦转基因水稻rcrc02的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的构建方法。本发明构建了包含草甘膦抗性基因cp4 epsps和抗螟虫基因cry1C的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将载体的T-DNA区单拷贝整合到水稻基因组中，并培育出抗螟虫、抗草甘膦、农艺性状优良的转基因水稻植株RCRC02，明确了外源T-DNA的插入位置并设计了特异性检测方法。本方法适用于转基因水稻的安全评估和检测，以及由该转化事件获得的转基因水稻为供体而得到的各种转基因水稻新品种。

Description

抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程及作物育种技术领域。具体地说，涉及一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的构建方法。

背景技术

我国是世界上主要的水稻种植国和消费国，目前，中国水稻的种植面积位居全球第二，产量位居世界第一(苏少泉，滕春红。稻田除草剂的新发展。世界农药，2010，32:1-6.)。2011年，我国水稻的种植面积达到了3005.7万公顷，稻谷的年产量达到了20100.1万吨，占所有粮食产量的35.2％(中国统计年鉴，2012)。截至2008年底，我国的耕地面积已缩减至12171.6万公顷，近几年来耕地保有量也仅仅是维持在这一数量之上，而人口却以每年5‰的速度增长(中国统计年鉴，2012)。从以上的统计数据可以看出，水稻的安全、稳定的生产是保障国家粮食安全的关键。但是虫害和杂草等不良环境因素限制了水稻产量潜力的发挥。

(1)昆虫危害问题：虫害是影响水稻生产的重要因素，每年造成的产量损失高达15％左右(张启发。绿色超级稻的构想与实践，2009，科学出版社)。当前对农作物害虫的防治措施还主要依赖化学农药。我国农药使用量全球第一，1990年用量不到30万吨，而2005年用量就已达到140万吨。农药的大量使用，既增加了农民的种植成本，减少了种粮收益，又造成了环境污染、农药残留、害虫抗药性增强以及杀伤天敌等一系列生态环境问题。Bt抗虫蛋白，主要对鳞翅目昆虫如水稻螟虫的幼虫有毒，有很强的专一性，通过培育转基因Bt抗虫水稻，能够有效的防治水稻螟虫的危害，减少农药使用量，增加农民的收入，降低农药使用对环境造成的危害。

(2)杂草危害问题：稻田杂草与水稻在水、肥、生长空间上进行竞争，直接影响水稻的产量。近年来直播和抛秧等栽培方法的使用，使得稻田的杂草危害变得日益严重。另外，随着农村人口往城市迁移速度的加快，水稻种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草的方法变得不现实。施用除草剂是解决这些新出现问题的最佳方案之一。因此，抗除草剂杂交稻将具有很大的实际需求和市场潜力。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的构建方法。

为了实现本发明目的，本发明涉及转基因水稻事件，通过将抗虫抗除草剂基因构建到一个表达载体上使得受体植物同时具有抗虫抗除草剂的特性。通过多代的性状定向筛选和鉴定，得到了抗虫抗除草剂优异株系并分离了外源载体的侧翼序列，确定了其整合位点。该转化事件获得的转基因水稻植株不仅可以用来作为品种改良的供体，而且特异性检测方法的设计为鉴定与RCRC02转化事件含有同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的转基因植株提供了途径。

本发明构建了包含草甘膦抗性基因cp4 epsps(SEQ ID NO:13)和抗螟虫基因cry1C(SEQ ID NO:14)的遗传转化载体pZHZH15003，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将pZHZH15003的T-DNA区单拷贝整合到水稻基因组中，并培育出抗螟虫、抗草甘膦、农艺性状优良的转基因水稻植株RCRC02，明确了外源T-DNA的插入位置并设计了特异性检测方法。

本发明提供抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的T-DNA区核苷酸序列，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的左边界侧翼序列为如SEQ ID NO:2所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

本发明还提供抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的T-DNA区核苷酸序列，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的右边界侧翼序列为如SEQ ID NO:3所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

本发明还提供了用于普通PCR定性检测RCRC02转化事件及基因型的特异性引物对，包括：

LBF:TTTGTTTGTTACTGCCGTCGC；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT；

RBR:ATAATTAGCATGTGTTTCCCTC。

本发明还提供了用于Realtime-PCR定量检测RCRC02转化事件的特异性引物对，包括：

LBF:TTTGTTTGTTACTGCCGTCGC；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT。

本发明还提供了抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测转基因水稻的总DNA；

2)以步骤1)的DNA为模板，利用引物SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5进行普通PCR或Realtime-PCR扩增；

3)凝胶电泳分析PCR扩增产物或分析Realtime-PCR扩增曲线。

本发明还提供所述检测方法在水稻育种中的应用。涉及对上述转化事件的水稻植株的检测，以进行转基因标识、含量分析、基因漂移研究及杂交育种跟踪等应用。所述植株包含但不限于亲本、自交后代、杂交后代的种子、花粉、雌蕊、叶片、根等各器官及植物细胞、植物组织等。

本发明还提供所述检测方法在判断RCRC02转化事件的基因型中的应用，具体为：

只有一条111bp大小带型的材料为RCRC02纯合基因型的材料；

只有一条293bp大小带型的材料为不含RCRC02事件的材料；

有两条带型且大小分别为111bp和293bp的材料为RCRC02杂合基因型的材料。

本发明进一步提供抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工合成草甘膦和螟虫抗性基因cp4 epsps和cry1C；

(2)将步骤(1)中合成的基因构建到同一遗传转化载体pZHZH15003中；

所述转化载体pZHZH15003的具体构建过程为：将CP4片段与PU130载体(该载体为pCambia3300的衍生载体，其构建过程是：pCambia3300经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分别用BamHI和SacI酶切，连接后得到骨架载体Pubi-CP4-T35spolyA；PCR扩增rbcs启动子并在其两端分别添加HindIII和XmaI酶切位点，连接到来自Promega公司的克隆载体pGEM7Z上，获得中间载体7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位点XmaI和SphI；分别用XmaI和SphI切割该片段和中间载体7Z-rbcs，连接后得到中间载体Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI单酶切骨架载体Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP处理去磷酸化；使用SacI酶切中间载体Prbcs-cry1C-Tnos，并补平粘性末端。连接上述处理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，构建得到pZHZH15003载体。

(3)将步骤(2)中获得的重组载体通过农杆菌介导法导入到水稻品种‘R187’中；具体步骤为：将构建得到的表达载体转化入农杆菌中；将农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；将愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选培养，挑选抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因水稻转化体。

(4)对步骤(3)的转化体进行分子鉴定，筛选单拷贝插入且无载体骨架的T0代转化植株，种植并收获T1代种子；

(5)待步骤(4)的T1代种子发芽15天后喷施草甘膦，选取具有草甘膦抗性且符合孟德尔遗传规律的转基因水稻株系，检测基因型，筛选纯合株收获T2代种子；

(6)种植步骤(5)的T2代种子，在植株不同生长阶段鉴定其对水稻螟虫的抗性，筛选抗虫性好的株系收获T3代种子；

(7)将步骤(6)的T3代种子培育成植株，评估株系的农艺性状，选取农艺性状优良的株系检测T-DNA区核苷酸序列，筛选具有T-DNA区单拷贝的转基因水稻植株；所述T-DNA区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；

(8)利用所述检测方法对步骤(7)的转基因水稻植株进行验证，最终获得抗螟虫抗草甘膦转基因水稻；

所述抗螟虫抗草甘膦转基因水稻，其T-DNA左边界侧翼序列如SEQ ID NO:2所示，或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；其T-DNA右边界侧翼序列如SEQ ID NO:3所示，或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

其中，所述步骤5)中草甘膦的喷施浓度范围为0.3％-9％V/V。

本发明还进一步提供了抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的构建方法在杂草控制和害虫防治方面的应用。

本发明获得的抗螟虫抗草甘膦转基因水稻植株RCRC02是以水稻品种‘R187’为受体通过转基因技术获得的，同时该转化事件也适用于具有同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置，而利用其他受体品种改良而获得的植株。

本发明提供了抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的检测方法及应用，适用于转基因水稻的安全评估和检测，以及由该转化事件获得的转基因水稻为供体而得到的各种转基因水稻新品种。

一方面，本发明提供了一种转基因水稻事件，由该转化事件获得的转基因水稻具有抗螟虫抗草甘膦的特性，应用该转基因水稻可以进行转基因水稻新品种的培育和改良以防治螟虫危害及杂草危害。

另一方面，本发明提供了一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的检测方法，应用该方法可以对包含与该转化事件具有同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的转基因水稻(包含亲本、杂种及其后代)及其制品(包括植株、组织、稻谷、大米及其制品)实施检测、监测和安全管理。

附图说明

图1为本发明实施例1中转化事件的T-DNA区及插入位置示意图。箭头表示转化事件检测引物的设计位置，各元件的名称标注在图上。LB，Left Border；RB，Right Border；S，SEQ ID NO。

图2为本发明实施例1中转基因植株分子鉴定结果(抗体试纸检测)。A：Southern杂交鉴定转基因植株拷贝数；B：抗体试纸鉴定外源蛋白表达。星号表示含RCRC02事件的样品。

图3为本发明实施例1中转基因植株的除草剂抗性及性状分离的情况。箭头指示的株系为野生型对照。转基因株系中枯死的植株为分离出来的阴性基因型。星号表示含RCRC02事件的样品。

图4为本发明实施例1中转化事件对不同浓度草甘膦的耐受性的鉴定情况。A：野生型‘R187’喷施0.3％的草甘膦；B、C、D、E、F、G、H、I分别为RCRC02转基因水稻分别喷施0、0.3％、2.4％、4.8％、6％、9％、15％、24％(V/V)的草甘膦。喷施两周后照相。

图5为本发明实施例1中转化事件对水稻螟虫的抗性鉴定情况。A：转化事件叶片对水稻二化螟的抗性；B：转化事件茎秆对水稻二化螟的抗性。

图6为本发明实施例2中转化事件的特异性检测检测结果。A：普通PCR对RCRC02的定性检测及基因型检测。M，DL2000plus DNAmarker，大小标注在旁边；+/+表示RCRC02纯合基因型；+/-表示RCRC02杂合基因型；-/-表示不含有RCRC02的基因型；B：Realtime-PCR对RCRC02的定量检测。1-4分别为RCRC02不同含量模板的扩增曲线产物。1，4000pg基因组DNA；2，500pg基因组DNA；3，62.5pg基因组DNA；4，7.8pg基因组DNA。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的获得

抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的构建方法如下：

1、基因的合成、遗传转化载体的构建以及转基因植株的获得

根据SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的序列，人工合成cp4 epsps和cry1C基因。构建到同一遗传转化载体pZHZH15003中。载体pZHZH15003的具体构建过程为：将CP4片段与PU130载体(该载体为pCambia3300的衍生载体，其构建过程是：pCambia3300经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分别用BamHI和SacI酶切，连接后得到骨架载体Pubi-CP4-T35spolyA；PCR扩增rbcs启动子并在其两端分别添加HindIII和XmaI酶切位点，连接到来自Promega公司的克隆载体pGEM 7Z上，获得中间载体7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位点XmaI和SphI；分别用XmaI和SphI切割该片段和中间载体7Z-rbcs，连接后得到中间载体Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI单酶切骨架载体Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP处理去磷酸化；使用SacI酶切中间载体Prbcs-cry1C-Tnos，并补平粘性末端。连接上述处理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，构建得到pZHZH15003载体。

载体T-DNA区域示意图见图1，T-DNA区核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。将重组pZHZH15003载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入到水稻品种‘R187’中。具体导入的步骤为：将构建得到的表达载体转化入农杆菌中；将农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；将愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选培养，挑选抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因水稻转化体。

2、水稻转基因植株的分子鉴定

对这些转化事件拷贝数和载体骨架进行分析，同时分析CP4EPSPS和cry1C蛋白的表达，筛选到单拷贝且没有T-DNA区域以外载体骨架、蛋白正常表达的转基因T0植株种到温室并收获T1代种子。RCRC02的分子鉴定结果见表1。

表1 RCRC02的DNA阳性鉴定结果

注：RQ值代表外源基因与内源基因Actin的DNA拷贝比值。

RQ值在0.1-0.6区间时，认为靶标基因是单拷贝插入。但由于检测RQ值存在着一定误差，需要Southern方法进行验证，具体操作按照如下步骤进行。

1)CTAB法抽提转化植株总基因组DNA。分单株取叶片0.5-1g，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末，倒入2mL离心管中。加入700μl预热至65℃的1.5％CTAB提取液并摇匀，65℃水浴保温30-60min，期间摇动几次；室温冷却后，加入700μl氯仿，摇匀后，颠倒轻摇10min，室温下8000rpm离心10min；将上清移至另一离心管中，加入等体积的沉淀液(异丙醇)，-20℃下沉淀30分钟，室温下8000rpm离心10min；用700μl 75％乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50μlTE中，-20℃保存备用。

2)基因组DNA的酶切。选用限制性内切酶HindIII酶切转化植株总基因组DNA，酶切反应体系如下：

混匀后于37℃酶切10-18h左右，酶切后先取5μl酶切产物进行预电泳，检测酶切效果。最后将酶切后的总DNA在1％的琼脂糖凝胶中进行低电压(30-40V)电泳过夜。

3)转膜。将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在0.25mol/LHCl至溴酚蓝变黄，蒸馏水洗两次；碱变性液(1.5M NaCl,0.5M NaOH)中变性45min，去离子水漂洗；中和液(1M pH7.4的Tris-HCl，1.5MNaCl)中漂洗30min，更换中和液漂洗15min；置于搭好的转膜台上，用10×SSC作为转膜液，Hybond-N+尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移缓冲液中；用10×SSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜用2×SSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联1min后，室温晾干，用保鲜膜将膜包好，4℃下保存备用。

4)探针合成及杂交与显影。探针标记及杂交与显影采用Roche公司DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I，按照试剂盒的说明进行操作。本发明以CP4基因部分序列作为杂交探针。

5)杂交。加热杂交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm2)，在杂交炉中42℃下预杂交30分钟；95℃下变性探针(25ng/ml)，5分钟后置于冰上；将变性探针加入到预先加热的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm2)，混匀；倒掉预杂交液，加入变性的探针；杂交炉中42℃下杂交4h-O/N。

6)洗膜。倒掉杂交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗涤两次，每次15分钟。

7)显色。同探针检测操作。结果如图2A所示，RCRC02转化事件为外源T-DNA单拷贝插入基因组的事件。

利用上海佑隆生物科技有限公司产品AntiCP4和AntiCry1C试纸条通过如下步骤检测植物组织中的蛋白。取样：取测定组织(叶片、根、花粉等)，加水磨碎样品；检测：取试纸条，检测端浸入样品；结果观察：5-10分钟后观察结果，对照线显出，表示试验正常。检测线是否显出表示是否含有检测蛋白。如图2B所示，PCR检测呈阳性的转基因植株全部可以检测出条带来，而野生型对照材料没有检测出条带。表明外源的cp4 epsps基因和cry1C基因可以在转基因水稻细胞内表达出蛋白。

3、水稻转基因植株的草甘膦抗性鉴定及基因型分析

T1种子发芽，15天后喷施草甘膦，选取草甘膦抗性和敏感植株符合孟德尔遗传规律的株系，取样检测基因型，选取纯合株收获T2种子；

为了检测转基因水稻对草甘膦除草剂的抗性，于两叶期以0.6％(V/V)浓度的草甘膦喷施，一周后观察植株表型。结果显示喷施除草剂后转基因植株可以正常生长而野生型材料逐渐干枯、死亡(如图3所示，照片拍摄于喷施除草剂一周后)。这表明了含有本发明转化事件的转基因水稻对草甘膦除草剂具有抗性。同时因为外源基因的单拷贝插入，在T0代时表现为杂合状态，自交收获T1种子后会有基因和性状分离现象且符合孟德尔遗传规律，因此统计草甘膦抗性和敏感植株的比例可以验证外源基因的整合状况。表2中数据表明，RCRC02转化事件的遗传特点符合孟德尔遗传规律。

表2 RCRC02T1代株系的除草剂抗性及分离情况结果

4、水稻转基因植株的螟虫抗性鉴定

播种T2代种子，鉴定其对草甘膦不同浓度的耐受性及对水稻螟虫的抗性。选取抗性好的株系收获T3种子。

草甘膦耐受性分析通过以下步骤实现。播种：将转基因和对照种子播种在穴盘中，待幼苗长至三叶一心到五叶一心时期进行草甘膦喷洒。施药后二周内观察并记录植株的叶色和长势等情况。草甘膦喷洒设计8个梯度，分别是草甘膦含量为0，0.3％，2.4％，4.8％，6％，9％，15％，24％(V/V)。结果如图4所示(照片拍摄于喷施除草剂两周后)，0.3％为厂家推荐的田间喷施浓度，野生型对照喷施0.3％的草甘膦后即会枯死，而转基因水稻可以耐受9％(V/V)以下的浓度，相当于可以耐受推荐喷施浓度的30倍。在喷施15％和24％浓度的草甘膦后转基因植株会表现出叶尖变黄，生长减缓，但依然能够存活。

螟虫抗性鉴定通过室内生测和田间调查两种方式评估。室内生测实验通过以下步骤实现。播种：将转基因和对照种子播种在穴盘中，待发芽25天左右备用；接虫：在培养皿内加入3-5片水稻叶片或2cm长的茎秆，底部加入一层干净湿润的滤纸，接入10头二化螟初孵幼虫，用透气胶带封口，再用一块大小合适的黑布盖住，橡皮筋固定；培养：接种完毕后放在培养室培养，培养条件：温度28℃，湿度85％±5％，光照时间16L/8D；统计：接虫5天后统计二化螟死亡率和校正死亡率。死亡率以对照植株进行校正，计算公式为：

田间调查方式为随机选取10株水稻，计算整株叶片数和卷叶数以计算卷叶率来评估对稻纵卷叶螟的抗性；计算整株分蘖数和枯心数以计算枯心率来评估对水稻二化螟的抗性。螟虫抗性鉴定结果见表3和图5，数据表明RCRC02对水稻螟虫的抗性较强，能够有效的降低螟虫

的危害，从而减少农药的施用量。

表3 RCRC02对水稻螟虫的抗性。

5、水稻转基因植株的综合农艺性状

农艺性状分析采用随机区组设计，小区面积10.8平米，植株行间距26cm×16.5cm(五八寸)，小区内种植20株×15行，转基因和对照各种植3次重复。整个生育期采用正常的田间管理措施。收获时，排除小区四周两行的植株，在剩余范围内，随机选取10个植株作为样本，测定产量相关性状并进行统计分析，评估株系的综合农艺性状。RCRC02的综合农艺性状表现见表4。数据表明在螟虫没有发生或是害虫防治措施良好的情况，RCRC02的综合农艺性状不会比野生型对照的差。

表4 RCRC02的综合农艺性状

6、T-DNA区的侧翼序列分离及插入位置确定

选取农艺性状优良的株系分离T-DNA区的侧翼序列。得到的侧翼序列与水稻基因组数据库进行比对，明确外源T-DNA插入位置。

利用Adaptor-PCR分析转基因片段插入位置，具体步骤如下：

用2mL离心管法制备基因组DNA备用。

用ddH2O将接头引物AD-L(CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT)和AD-S(Pi-ACCTCCCC-NH2)分别稀释到100μmol/L，等体积混合，94℃水浴变性4min，自然冷却至室温后即为50μmol/L的接头。

在灭菌的0.5mL离心管中加入下列反应体系，室温(25℃)孵育16h：

反应结束后65℃水浴10min终止反应。

以步骤3中的酶切连接产物作为第一轮PCR反应的模板。反应体系如下：

其中，所述SP1和VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示和SEQID NO:13所示。

首轮PCR反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×7cycles；(94℃，30sec；67℃，3min)×32cycles；67℃，7min；25℃，10min。

以步骤4中相应的PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，反应体系如下：

其中，所述SP2和VP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示和SEQID NO:14所示。

二轮PCR反应程序：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×5cycles；(94℃，30sec；67℃，3min)×20cycles；67℃，7min；25℃，10min。

取5μL第二轮PCR的产物于1％(w/v)0.5×TBE琼脂糖凝胶中电泳检测，挑选有250bp以上DNA片段的PCR产物用双脱氧链终止法进行测序。

测序结果在RGAP数据库中(http://rice.plantbiology.msu.edu/)用BLASTN工具与水稻基因组序列进行同源比对，以最好的匹配结果为插入位点。

得到的侧翼序列如SEQ ID NO:2所示和SEQ ID NO:3所示。

利用以上步骤获得的转化事件RCRC02单拷贝插入水稻基因组第一染色体Chr01:3798289-3798299位置，具有螟虫和草甘膦的抗性，且其他农艺性状与‘R187’对照品种无明显差异。包含该转化事件的转基因植株可以用大面积喷洒的方法去除杂草和杂株，提高工作效率。同时该类转基因植株可以防止螟虫对水稻植株的危害，减少农药的施用量，从而保证产量的稳定，减少劳动投入，降低农药对环境的污染。此外，该转化事件可以作为供体通过有性杂交或定点插入等方法导入其他水稻植株中从而使得其他水稻植株获得抗螟虫抗草甘膦的特性。因此只要含有与RCRC02转化事件同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的水稻植株都属于本发明保护范畴。

实施例2 抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的检测方法

依据RCRC02转化事件的外源T-DNA区边界序列及侧翼的水稻基因组序列设计引物，通过PCR方法扩增特异性条带，以检测水稻样品中是否含有与RCRC02转化事件同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的事件以及转化事件的基因型和含量。具体操作按照如下步骤进行。

1)抽提水稻叶片基因组DNA(具体方法见实施例1)。

2)采用普通PCR方法，设计特异性引物LBF、LBR和RBR，序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示进行检测。PCR反应总体积为20μl：DNA模板2μl，10×PCR buffer 2μl，10mM dNTP 0.4μl，10mM LBF1引物0.8μl，10mM LBR和RBR引物各0.4μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，加水到20μl。PCR反应条件如下：①94℃预变性4分钟，②94℃变性0.5分钟，③58℃退火0.5分钟，④72℃延伸0.5分钟，⑤从②－④循环35次，⑥72℃延伸10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果如图6A所示。用此特异性引物进行PCR扩增时，扩出一条111bp大小带型的材料为RCRC02纯合基因型的材料，扩出一条293bp大小带型的材料为不含RCRC02事件的材料，扩出两条带型且大小分别为111bp和293bp的材料为RCRC02杂合基因型的材料。PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

3)采用Realtime-PCR方法，设计特异性引物LBF和LBR，序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示进行检测。PCR反应总体积为10μl：DNA模板0.5μl，10mM LBF2和LBR引物各0.2μl，FastStart UniversalSYBR Green Master[ROX]5μl，加水到10μl。PCR反应条件如下：①95℃预变性10分钟，②95℃变性10秒，③60℃退火延伸30秒，④从②－③循环40次。Realtime-PCR扩增曲线如图6B所示，扩增产物如SEQID NO:7所示。此方法最低检测到的RCRC02基因组DNA含量为8pg，表明该检测方法灵敏度高。

RCRC02转化事件检测方法的建立，可以确认转基因水稻样品是否含有该转化事件以及转化事件的基因型和含量。这不仅能够应用于RCRC02转基因水稻大规模生产时对其转基因成分进行检测、监测和标识，还能在杂交育种过程中的目标片段跟踪方面发挥重要的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的T-DNA区核苷酸序列，其特征在于，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的左边界侧翼序列为如SEQ ID NO:2所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

2.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的T-DNA区核苷酸序列，其特征在于，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的右边界侧翼序列为如SEQ ID NO:3所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

3.用于普通PCR定性检测RCRC02转化事件及基因型的特异性引物对，包括：

LBF:TTTGTTTGTTACTGCCGTCGC；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT；

RBR:ATAATTAGCATGTGTTTCCCTC。

4.用于Realtime-PCR定量检测RCRC02转化事件的特异性引物对，包括：

LBF:TTTGTTTGTTACTGCCGTCGC；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT。

5.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测转基因水稻的总DNA；

2)以步骤1)的DNA为模板，利用权利要求3和权利要求4所述的特异性引物对进行普通PCR或Realtime-PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物或Realtime-PCR扩增曲线。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，DNA模板用量在8pg以上。

7.权利要求5所述检测方法在判断RCRC02转化事件的基因型中的应用，其特征在于，

只有一条111bp大小带型的材料为RCRC02纯合基因型的材料；

只有一条293bp大小带型的材料为不含RCRC02事件的材料；

有两条带型且大小分别为111bp和293bp的材料为RCRC02杂合基因型的材料。

8.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻RCRC02的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人工合成草甘膦和螟虫抗性基因cp4 epsps和cry1C；

(2)将步骤(1)中合成的基因构建到同一遗传转化载体pZHZH15003中；

(3)将步骤(2)中获得的重组载体通过农杆菌介导法导入到水稻品种‘R187’中；

(4)对步骤(3)的转化体进行分子鉴定，筛选单拷贝插入且无载体骨架的T0代转化植株，种植并收获T1代种子；

(5)待步骤(4)的T1代种子发芽15天后喷施草甘膦，选取具有草甘膦抗性且符合孟德尔遗传规律的转基因水稻株系，检测外源基因型，筛选纯合株收获T2代种子；

(6)种植步骤(5)的T2代种子，在植株不同生长阶段鉴定其对水稻螟虫的抗性，筛选抗虫性好的株系收获T3代种子；

(7)将步骤(6)的T3代种子培育成植株，评估株系的农艺性状，选取农艺性状优良的株系检测T-DNA区核苷酸序列，筛选具有T-DNA区单拷贝的转基因水稻植株；所述T-DNA区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；

(8)利用权利要求5所述检测方法对步骤(7)的转基因水稻植株进行验证，最终获得抗螟虫抗草甘膦转基因水稻；

所述抗螟虫抗草甘膦转基因水稻，其T-DNA左边界侧翼序列如SEQ ID NO:2所示，或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；其T-DNA右边界侧翼序列如SEQ ID NO:3所示，或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中草甘膦的喷施浓度范围为0.3％-9％V/V。

10.权利要求8所述的方法在杂草控制和害虫防治方面的应用。