CN114375838A

CN114375838A - 一种杂交构树的遗传转化系统建立的方法及应用

Info

Publication number: CN114375838A
Application number: CN202210040002.8A
Authority: CN
Inventors: 付春祥; 曹英萍; 徐悦; 王玉
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao High Energy Hecheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114375838B

Abstract

本发明公开了一种杂交构树的遗传转化系统建立的方法及应用，属于植物基因工程技术领域，将杂交构树1cm无菌的叶子浸泡到侵染液里，真空抽滤5‑8min；吸干侵染液，置于共培养基N6AS共培养两天；将无菌感染的叶子转移到筛选培养基MS5培养基诱导；将长出的愈伤转移到分化培养基WPMD诱导；将诱导出来的芽转移到生根培养基MS0诱导；将已经生根的树苗长到6‑8cm高，加入抑菌水，开盖炼苗6‑8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡，然后转移到透气湿润的土里；用保鲜膜盖上，待观察构树长出新叶新枝，揭去保鲜膜。本发明方法可以在杂交构树上进行定向改造，同时对构树基因进行功能研究。

Description

一种杂交构树的遗传转化系统建立的方法及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，植物高效遗传转化技术领域，尤其涉及构树遗传转化及相关转基因材料的获得。

背景技术

杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)为桑科构树属落叶乔木，又名鹿仔树等，是构树杂交出的优良种，广泛分布于我国大部分温带以及热点地区。杂交构树的对于干旱、盐碱等特殊恶劣环境有着极强的适应性性，并且能够快速生长，是我国理想的用于城市绿化以及退耕还林治理土地荒漠化的树种。除此之外，杂交构树还是是我国分成重要的经济林木之一，其树皮所含有的纤维品质优良，可广泛用于造纸及创制新型纺纱材料；其树叶可以治疗小鼠肥硕，主要通过能促进小鼠体内的油脂减少，从而改变内脏脂肪变性达到治疗的目的，并且其叶还可以代替苜蓿(牧草之王)草粉和豆粕，作为添加在猪牛羊等家畜的青贮饲料；从其叶提取出的汁液有效地杀死昆虫，人们可以避开化学合成的污染环境的杀虫剂，从构树叶中提纯开发出天然植物生物杀虫剂。基于以上的杂交构树优良性状，通过遗传转化方法对这些特性的深入研究，以及发利用具有非常重要的生产现实意义。

随着世界的急速发展以及人们认知和技术不断更新，基因工程的手段逐渐走入了大众的眼前，相比于常规的杂交育种时间缓慢，诱变育种具有突变频率低变异的方向不确定性，分子育种通过基因工程的方式将基因导入，从而定向培育出新品种，可以更好更快的对杂交构树等这种重要的树木进行开发和利用。

目前，杂交构树已经进行了全基因测序，但是关于杂交构树遗传转化体系建立的研究报道相对较少。主要集中在组培快繁体系的建立上，因此急需建立构树的稳定高效的遗传转化体系，为杂交构树在分子水平改良提供理论依据和技术保障。

发明内容

本发明的目的是在于提供一杂交构树的高效遗传转化系统建立的方法，以叶片为外植体，筛选出适合杂交构树的不同生长阶段的培养基，两种不同的筛选标记以及适合的筛选量，是首次建立了杂交构树高效遗传转化体系。

为了实现上述发明的目的，本发明提供了一下技术方案：

一种杂交构树的高效遗传转化系统建立的方法，步骤如下：

(1)采集杂交构树的叶子，叶子大小为4.5-5.5cm，7％的次氯酸钠消毒10min，无菌水清晰至无菌、无消毒剂残留，吸干水分；

(2)提前制备侵染液：热激发将质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD₆₀₀＝0.4-0.5时加100μmol·L^–1乙酰丁香酮，2h后离心富集菌液，使用N6侵染液重悬为OD₆₀₀＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述N6侵染液是N6基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(3)将叶子剪成1cm小块浸泡到制备好的侵染液中里，同时真空抽滤5-8min；将侵染液吸干，置于共培养基N6AS共培养两天；所述共培养基N6AS是在N6基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(4)将没有出现霉菌和细菌的叶子转移到筛选培养基MS5培养基诱导愈伤1.5-2个月；所述MS5培养基是在MS基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，4mg·L^–1 2,4-D，0.15mg·L^–16-BA，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(5)将长出的愈伤转移到分化培养基WPMD诱导再生芽1.5-2个月；所述的分化培养基WPMD是在WPM基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1 6-BA，0.05mg·L^–1NAA，0.04mg·L^–1TDZ，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(6)将诱导出来的芽转移到生根培养基MS0诱导芽生根2-3周；

所述的生根培养基MS0是在MS基础培养基中，含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1NAA，0.5mg·L^–1IBA，300mg·L^–1特美汀，pH值为6；

将已经生根的树苗长到6-8cm高，加入抑菌水，打开培养容器的盖子炼苗6-8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡25-35min，然后转移到透气湿润的土里；用保鲜膜盖上，待观察构树长出新叶新枝，揭去保鲜膜。

进一步，所述的抑菌水为含有终浓度为2g·L^–1制霉素的无菌水。

进一步，所述步骤(2)将构建好的质粒加入融化好的农杆菌感受态冰浴30min，后液氮速冻3min，37℃热激1min30 s，冰浴2min，加入LB液体培养基，28℃摇床160rpm培养3-4h。

进一步，所述步骤(4)的共培养条件为25℃黑暗培养诱导愈伤组织。

进一步，所述的步骤(5)分化培养的条件为25℃16h光照8h黑暗培养，诱导再生芽1.5-2个月。

进一步，所述步骤(6)生根培养条件为25℃16h光照8h黑暗培养，诱导芽生根2-3周。

本发明还提供利用上述方法对杂交构树进行转基因的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明首次建立了构树植物组织再生体系和遗传转化体系，构树已经进行了全基因测序基于本发明的遗传转化体系，可以的利用基因基因工程分子生物学在杂交构树上进行定向改造，同时对构树基因进行功能研究；

2、本发明中首次筛选出适合构树的在愈伤发育阶段和分化阶段筛选浓度；

3、本发明中首次发明了适合构树的生根方法和移栽方法。

附图说明

图1遗传转化过程图

(A)叶片侵染后共培养(B)在自然光下观察的叶片的细节图(C)在蓝色激发光下观察的叶片的细节图(D)叶片在愈伤诱导培养基上产生愈伤(E)在自然光下观察的叶片愈伤的细节图(F)在蓝色激发光下观察的叶片愈伤的细节图(G)叶片诱导的愈伤生长在分化培养基并且产生不定芽(H)在自然光下观察的叶片愈伤的细节图(I)在蓝色激发光下观察的叶片愈伤的细节图(J)构树由愈伤组织诱导分化再生出转基因的植株(K)转基因植株移到室外长(A、D、G、J Bar＝2cm)(B、C、E、F、H、I Bar＝100mm)(K Bar＝4cm)

图2转基因植物PCR检测。

图3不同载体产生的转基因植株不同Line(K Bar＝4cm)

图4载体图谱。

载体(A)pEarleyGate(B)pCAMBIA 1300(C)CRISPR/Cas9-BpF5H(D)pEarleyGate100-BpF5H的T-DNA区段。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

本实施例提供了一种杂交构树高效遗传转化系统建立的方法，主要是如下步骤：取构树外植体叶片消毒，剪成正方形，置于侵染液中，滤纸吸干水分，共培养两天，诱导叶片愈伤，诱导愈伤分化，长出来芽后置于生根培养基，再将生根后的树苗移栽到土里。获得转基因株系。所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。

实施例1：采集构树叶片外植体消毒具体步骤和方法

(1)取构树新鲜的外植体，构树先应稳定的培养在适合生长阳光充足的培养间，采取稳定生长且具有活力的叶片，叶片大小约为5cm，太大消毒不完全，太小容易被消毒液腐蚀。

(2)将采好的叶片用洗洁剂洗一下，置于流水下轻轻冲洗20min。

(3)将冲洗好的叶子喷上75％的酒精，拿到超净台中。

(4)拿到超净台后，准备好提前用灭菌水配置的7％的次氯酸钠消毒10min，在消毒的过程中将过大的叶片剪小，所有叶片浸泡到消毒液中，一边摇晃一边消毒。整个过程观察叶片状态，防止消毒过度，叶片机械性损伤从而导致叶片死亡。

(5)消毒之后用灭过菌的三级水清晰4-6遍，用灭过菌的滤纸将水分吸干。

实施例2：构树叶片农杆菌侵染过程

(1)热激发将质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；从冰箱取出已经制备好的农杆菌感受态，将构建好的载体取5μL加入融化好的感受态冰浴30min，后液氮速冻3min，37℃热激1min30 s，冰浴2min，加入600μLLB液体培养基，28℃摇床160rpm培养3-4h。

(2)将培养好的农杆菌涂于含有相应抗生素的LB固体培养基，28℃培养48h。

(3)将生长出的单克隆菌落于600μL相应抗生素的LB液体培养基，28℃摇床160rpm培养5-6h，PCR鉴定阳性菌落，选出三个阳性菌落于50mL相应抗生素的LB液体培养基，28℃摇床200rpm培养。

当OD₆₀₀值约为0.4-0.5时加入乙酰丁香酮终浓度为100μmol·L^–1，28℃摇床200rpm培养2h。培养好的菌液离心4000rpm15min富集菌液，使用N6侵染液(N6基础培养基，30g·L^-1蔗糖，pH值为6，100μmol·L^–1乙酰丁香酮)重悬，当OD₆₀₀值约为0.2-0.3，农杆菌侵染液制备完成。

将已经消毒完成的构树叶片剪碎剪成约1cm大小的正方形，浸泡在侵染液中。在侵染的过程中一边摇晃，一边抽真空抽滤5-8min。真空抽滤可以增加侵染效率，后于提前灭菌好的滤纸吸干菌液，置于共培养培养基N6AS(图1中的A)(N6基础培养基，30g·L^-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮)，避光25℃共培养两天。在自然光下观察的叶片的细节图(图1中的B)，在蓝色激发光下观察的叶片的细节图(如图1中的C)。

实施例3：杂交构树转基因愈伤诱导和再生的过程

(1)共培养结束后，将没有霉菌和细菌的叶片转移到愈伤诱导培养基筛选培养基MS5培养基(MS基础培养基，30g·L^-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，4mg·L^–1 2,4-D，0.15mg·L^–1 6-BA，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B)，不同的转基因材料对应不同筛选压的愈伤诱导培养基，25℃黑暗培养诱导愈伤1.5到2个月(图1中的D)。

(2)将外植体的诱导出愈伤转到分化培养基WPMD培养基(WPM基础培养基，30g·L^-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–16-BA，0.05mg·L^–1NAA，0.04mg·L^–1TDZ，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B)，25℃16h光照8h黑暗培养，诱导再生芽1.5到2个月(图1中的G)。

(3)将愈伤诱导出的再生芽，用镊子把每一个芽剥开，并保证每一个都是一个独立完整的幼芽，将芽插入生根培养基MS0(MS基础培养基，15g·L^-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1NAA，0.5mg·L^–1IBA，300mg·L^–1特美汀)，25℃16h光照8h黑暗培养，诱导芽生根2-3周(图1中的J)。生长2-3月后如图1中K所示。

实施例4：不同载体构建过程

其中pEarleyGate载体和pCAMBIA 1300为阳性对照空载体(图4中的A、B)，直接由本实验室提供，也可以从市场上购买。

(1)pEarleyGate 100-BpF5H载体构建过程入下(图4中的D)：

a)从文献中找到构树BpF5H基因，设计相应引物。

使用高保真酶(Phanta)对片段进行扩增使用引物BpF5H F/R，进行常规PCR扩增，PCR反应体系为：2μL cDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，25μL Phanta酶和21μL ddH₂O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s；72℃45s，34个循环；72℃10min。PCR扩增胶回收获得约1.5kb的片段。引物序列如下：

BpF5H F:atggataccaaaagtatcaccctcc

BpF5H R:tcagatggtgcacacgacacgt

b)将扩增的片段one step cloning连入PGWC载体，反应体系为：4μL CE IIbuffer，2μL Exnase II，2μL片段，2μL载体，10μL ddH₂O。反应条件为37℃30min。

c)连接产物转入DH5α，鉴定阳性克隆送测序。

d)将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取中间载体质粒并-20℃保存，用于后续实验。

e)中间载体和pEarleyGate载体进行LR反应。反应体系为2μL中间载体，2μLpEarleyGate载体，1μL LR clonase^TMⅡenzyme mix。反应条件为25℃6h。

f)LR反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆送测序。

g)将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取pEarleyGate 100-BpF5H载体质粒并-20℃保存，用于后续实验。

(2)CRISPR/Cas9-BpF5H载体构建过程入下(图4中的C)

a)根据已经获得的构树BpF5H基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的三个靶位点分别为‘atccccctcctcttcctcct’,‘atcatcgggagcatgtcgat’,‘tcaggtacctgacgtacgac’。

b)选定靶位点后使用高保真酶(Phanta)对片段进行扩增，设计不同靶位点相应的引物(引物序列如下)，从包含tRNA和sgRNA序列的pGTR载体为模板。反应体系为：25μLPhanta(2×)，cDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，2μLpGTR载体，21μL ddH₂O。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s；72℃45s，34个循环；72℃10min。PCR扩增胶回收获得约200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收。

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-1:taggtctcagtcaaacaaagcaccagtg

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-2:gcggtctcagaggagggggattgcaccagccgggaa

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-3:taggtctcacctcttcctcctgttttagagc

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-4:gcggtctcagagcatgtcgattgcaccagccgggaa

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-5:taggtctcagctcccgatgatgttttagagctagaaa

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-6:gcggtctcactgacgtacgactgcaccagccgggaa

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-7:taggtctcatcaggtacctgagttttagagctagaaa

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-8:taggtctcaaaacaaaaaaagcaccgactcggtgcc

c)一步法连接反应体系：Bsa I(购于NEB公司)15U，10ⅹ Bas I buffer 1.5μL，T4连接酶50U，载体0.5μg，目的胶回收片段30μg，去离子水补齐15μL反应总体系。一步法连接PCR程序：37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，3个循环，37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，10个循环，程序结束后4℃保存于冰箱备用。

d)连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆送测序。

e)将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取CRISPR/Cas9-BpF5H载体质粒并-20℃保存，用于后续实验。

实施例5：转基因植株鉴定

使用tap酶(tap mix)对转基因植物(图3)的DNA进行进行鉴定使用引物bar F/R，进行常规PCR扩增，PCR反应体系为：1μL DNA，正/反向引物(10μM)各1μL，10μLtap酶和7μLddH₂O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s；72℃30s，28个循环；72℃10min各取10μL。PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳(1.0％)并拍照，点样时5μL2000bp Ladder Maker作为分子量标准。bar基因、hph基因、Cas9基因和GFP基因的预期PCR产物大小分别为242bp、398bp、1279bp和280bp(图2)。

引物序列如下：

bar-F:agtcgaccgtgtacgtctcc

bar-R:gaagtccagctgccagaaac

hph3:aaggaatcggtcaatacactacatgg

hph4:aagaccaatgcggagcatatacg

Cas9-F:atccaagcgaaacgggagtt

Cas9-R:accgccactccatcaagaag

GFP-F:tgatgccgttcttctgcttgtc

GFP-R:cagtgcttcagccgctaccc。

综上实施例对本发明进行了详尽的叙述。但是它仅仅是本发明中的部分实例，不能完全概括本发明的全部技术细节，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明的贯彻理念和技术范围的梗概下，本发明还会有不同程度的改进。按本发明的发明理念，本发明申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变，对这些全部都进行专利保护。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种杂交构树的遗传转化系统建立的方法及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatacca aaagtatcac cctcc 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagatggtg cacacgacac gt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)

<400> 3

atccccctcc tcttcctcct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)

<400> 4

atcatcggga gcatgtcgat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)

<400> 5

tcaggtacct gacgtacgac 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taggtctcag tcaaacaaag caccagtg 28

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggtctcag aggaggggga ttgcaccagc cgggaa 36

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taggtctcac ctcttcctcc tgttttagag c 31

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggtctcag agcatgtcga ttgcaccagc cgggaa 36

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taggtctcag ctcccgatga tgttttagag ctagaaa 37

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcggtctcac tgacgtacga ctgcaccagc cgggaa 36

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taggtctcat caggtacctg agttttagag ctagaaa 37

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taggtctcaa aacaaaaaaa gcaccgactc ggtgcc 36

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agtcgaccgt gtacgtctcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaagtccagc tgccagaaac 20

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaggaatcgg tcaatacact acatgg 26

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aagaccaatg cggagcatat acg 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atccaagcga aacgggagtt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

accgccactc catcaagaag 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgatgccgtt cttctgcttg tc 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagtgcttca gccgctaccc 20

Claims

1.一种杂交构树的遗传转化系统建立的方法，其特征在于所述方法的步骤如下：

(3)将叶子剪成1cm小块浸泡到制备好的侵染液中，同时真空抽滤5-8min；将侵染液吸干，置于共培养基N6AS共培养两天；所述共培养基N6AS是N6基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(4)将没有出现霉菌和细菌的叶子转移到筛选培养基MS5培养基诱导愈伤1.5-2个月；所述MS5培养基是MS基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，4mg·L^–12,4-D，0.15mg·L^–16-BA，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1 bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(6)将诱导出来的芽转移到生根培养基MS0诱导芽生根2-3周；

所述的生根培养基MS0是在MS基础培养基中，含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1 NAA，0.5mg·L^–1 IBA，300mg·L^–1特美汀，pH值为6；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑菌水为含有终浓度为2g·L^–1制霉素的无菌水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)将构建好的质粒加入融化好的农杆菌感受态冰浴30min，后液氮速冻3min，37℃热激1min30s，冰浴2min，加入LB液体培养基，28℃摇床160rpm培养3-4h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)的共培养条件为25℃黑暗培养诱导愈伤组织。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(5)分化培养的条件为25℃ 16h光照8h黑暗培养，诱导再生芽1.5-2个月。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(6)生根培养条件为25℃ 16h光照8h黑暗培养，诱导芽生根2-3周。

7.根据权利要求1所述的方法对杂交构树进行转基因的应用。