CN114350703A - 利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，属于植物基因工程技术领域，首先构建CRISPR/Cas9基因敲除载体质粒，热激发将载体质粒转到EHA105农杆菌中制备侵染液，将杂交构树叶子浸泡到侵染液里，真空抽滤5‑8min；吸干侵染液，置于共培养基N6AS共培养两天；将叶子转移到筛选培养基MS5中诱导；将长出的愈伤转移到分化培养基WPMD诱导；将诱导出来的芽转移到生根培养基MS0诱导；当树苗长到6‑8cm高，加入抑菌水，开盖炼苗6‑8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡，然后转移到透气湿润的土里进行种植。本发明在杂交构树中敲除F5H蛋白编码基因，其蛋白表达量活性降低或失活，杂交构树S型木质素单体素含量降低，牧草消化率升高。

Description

利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程和基因组编辑技术领域，特别涉及 CRISPR/Case9系统对杂交构树基因定点突变的方法，F5H蛋白在调控杂交构树株型中的应用。

背景技术

杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)为桑科构树属落叶乔木，又名鹿仔树等，是构树杂交出的优良种，广泛分布于我国大部分温带以及热点地区。杂交构树的对于干旱、盐碱等特殊恶劣环境有着极强的适应性性，并且能够快速生长，是我国理想的用于城市绿化以及退耕还林治理土地荒漠化的树种。除此之外，杂交构树还是是我国分成重要的经济林木之一，其树皮所含有的纤维品质优良，可广泛用于造纸及创制新型纺纱材料；其树叶可以治疗小鼠肥硕，主要通过能促进小鼠体内的油脂减少，从而改变内脏脂肪变性达到治疗的目的，并且其叶还可以代替苜蓿(牧草之王)草粉和豆粕，作为添加在猪牛羊等家畜的青贮饲料；从其叶提取出的汁液有效地杀死昆虫，人们可以避开化学合成的污染环境的杀虫剂，从构树叶中提纯开发出天然植物生物杀虫剂。基于以上的杂交构树优良性状，通过遗传转化方法对这些特性的深入研究，以及发利用具有非常重要的生产现实意义。

木质素(lignin)主要沉积在植物的次生细胞壁中，是木本植物的主要成分之一的芳香族多聚物。木质素由三种单体构成，分别为紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)、愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)和对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H- 木质素)。阿魏酸-5-羟基化酶F5H(ferulate-5-hydroxylase)催化阿魏酸、松柏醛和松柏醇发生羟基化，同时产生芥子酸，从而合成S-木质素。因此，F5H是在苯丙素代谢过程中S-木质素合成的关键基因。对F5H基因进行改造，有利于在木质素含量不变的情况下，改变木质素组分含量，提高制浆效率，减少对环境的污染，积极响应国家大力倡导的可持续发展，进而达到林木市场经济的发展和保护环境共赢的局面。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是当下非常热门分子育种工具，是由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分构成。sgRNA对靶位点DNA 进行定向识别，后结合的Cas9蛋白进行切割，切割后DNA自我修复不能恢复。目前CRISPR/Cas9基因组编辑技术，因为其更精准，更高效的优点，广泛的应用于植物分子育种之中。

目前没有研究表明已经获取了杂交构树的F5H纯合编辑和F5H 过表达转基因株系。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在杂交构树上快速、高效的获得木质素缺陷株型的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供CRISPR/Cas9基因组编辑技术在杂交构树上进行应用方法和过程，本发明提供蛋白质调控基因的表达的物质在调控杂交株型中的应用，所述基因编码相应F5H蛋白质；

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案如下：

利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)从文献中获取杂交构树F5H基因序列，设计引物，获得具体杂交构树F5H基因序列；

(2)根据已经获得的构树BpF5H基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的三个靶位点分别为‘atccccctcctcttcctcct’, ‘atcatcgggagcatgtcgat’,‘tcaggtacctgacgtacgac’；

(3)选定靶位点后，使用高保真酶对片段进行PCR扩增，设计不同靶位点相应的引物，以包含tRNA和sgRNA序列的pGTR载体为模板；PCR扩增,凝胶回收获得200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收；引物序列如下：

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-1:taggtctcagtcaaacaaagcaccagtg；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-2:gcggtctcagaggagggggattgcaccagc cgggaa；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-3:taggtctcacctcttcctcctgttttagagc；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-4:gcggtctcagagcatgtcgattgcaccagcc gggaa；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-5:taggtctcagctcccgatgatgttttagagcta gaaa；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-6:gcggtctcactgacgtacgactgcaccagcc gggaa；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-7:taggtctcatcaggtacctgagttttagagcta gaaa；

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-8:taggtctcaaaacaaaaaaagcaccgactcggt gcc；

(4)回收的目的片段通过一步法连接，连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序正确的菌落培养后提取 CRISPR/Cas9-BpF5H载体质粒并在-20℃保存；

(5)采集杂交构树的叶子，叶子大小为4.5-5.5cm，使用7％的次氯酸钠消毒10min，用无菌水清洗至无菌、无消毒剂残留，吸干水分；

(6)提前制备侵染液：热激发将步骤(4)制备的载体质粒转到 EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD₆₀₀＝0.4-0.5时加100μmol·L^–1乙酰丁香酮，2h后离心富集菌液，使用N6侵染液重悬为OD₆₀₀＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述N6侵染液是N6基础培养基中含有终浓度为 30g·L^-1蔗糖，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(7)将步骤(5)处理的叶子剪成1cm小块浸泡到制备好的侵染液中，同时真空抽滤5-8min；将侵染液吸干，置于共培养基N6AS 共培养两天；所述共培养基N6AS是N6基础培养基中含有终浓度为 30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(8)将没有出现霉菌和细菌的叶子转移到筛选培养基MS5诱导愈伤组织1.5-2个月；所述MS5培养基是MS基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，4mg·L^{– 1}2,4-D，0.15mg·L^–16-BA， 300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为 6；

(9)将步骤(8)长出的愈伤组织转移到分化培养基WPMD诱导再生芽1.5-2个月；所述的分化培养基WPMD是WPM基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–16-BA，0.05 mg·L^–1NAA，0.04mg·L^–1TDZ，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^{– 1}bialaphos /3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(10)将步骤(9)诱导出来的再生芽转移到生根培养基MS0诱导芽生根2-3周；

所述的生根培养基MS0是MS基础培养基中含有终浓度为15 g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1NAA，0.5mg·L^–1IBA，300mg·L^–1特美汀，pH值为6；

(11)当步骤(10)已经生根的树苗长到6-8cm高，加入抑菌水，打开培养容器的盖子炼苗6-8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡25-35min，然后转移到透气湿润的土里；用保鲜膜盖上，待观察构树长出新叶新枝，揭去保鲜膜。

进一步，所述步骤(2)CRISPR/Cas9载体设计靶设计原则：靶位点20个碱基并且必须以“NGG”结尾，靶位点的GC含量应该介于 40％到70％，并且避免具有连续4个T碱基，同时与sgRNA配对不应超过6bp，设计三个杂交构树F5H基因的靶位点，提高编辑效率，纯合效率。

进一步，所述步骤(3)PCR的反应体系为：25μL Phanta(2ⅹ)， cDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，2μLpGTR载体，21μL ddH₂O； PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s；72℃45s， 34个循环；72℃10min。

进一步，所述的步骤(4)的连接反应体系：Bsa I15 U，10×Bas I buffer 1.5μL，T4连接酶50U，载体0.5μg，目的胶回收片段30ng，去离子水补齐15μL反应总体系；连接PCR程序：37℃酶切10min， 10℃连接5min，20℃延伸10min，3个循环，37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，10个循环，程序结束后4℃保存于冰箱备用。

进一步，所述步骤(10)抑菌水为含有终浓度为2g·L^–1制霉素的无菌水。

进一步，所述步骤(6)将构建好的质粒加入融化的农杆菌感受态冰浴30min，后液氮速冻3min，37℃热激1min30 s，冰浴2min，加入LB液体培养基，28℃摇床160rpm培养3-4h。

进一步，所述步骤(7)的共培养条件为25℃黑暗培养诱导愈伤组织。

进一步，所述的步骤(9)分化培养的条件为25℃16h光照8h 黑暗培养，诱导再生芽1.5-2个月。

进一步，所述步骤(10)生根培养条件为25℃16h光照8h黑暗培养，诱导芽生根2-3周。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明利用生物技术，尤其是物基因工程和基因组编辑技术，以杂交构树为遗传背景，成功将构树木质纤维的F5H基因进行编辑，获得得木质素缺陷株型。

附图说明

图1遗传转化过程图

(A)叶片侵染后共培养(B)在自然光下观察的叶片的细节图 (C)在蓝色激发光下观察的叶片的细节图(D)叶片在愈伤诱导培养基上产生愈伤(E)在自然光下观察的叶片愈伤的细节图(F)在蓝色激发光下观察的叶片愈伤的细节图(G)叶片诱导的愈伤生长在分化培养基并且产生不定芽(H)在自然光下观察的叶片愈伤的细节图(I)在蓝色激发光下观察的叶片愈伤的细节图(J)构树由愈伤组织诱导分化再生出转基因的植株(K)转基因植株移到室外长(A、 D、G、J Bar＝2cm)(B、C、E、F、H、I Bar＝100mm)(K Bar＝4cm)；

图2转基因植物PCR检测；

图3转基因植物木质素单体分析；

图4转基因植物木质素总量分析；

图5转基因植物纤维素分析；

图6转基因植物半纤维素分析；

图7转基因植物牧草消化率分析；

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明技术方案进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1：CRISPR/Cas9-BpF5H载体构建过程入下

(1)从文献中获取杂交构树F5H基因序列，设计引物，获得杂交构树F5H基因序列；

引物序列如下：

BPF5H-F:atggataccaaaagtatcacctcc

BPF5H-R:tcagatggtgcacacgacacgt

(2)根据已经获得的构树BpF5H基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的三个靶位点分别为‘ATCCCCCTCCTCTTCCTCCT’,‘ATCATCGGGAGCATGTCGAT’,‘TCAGGTACCTGACGTACGAC’。

CRISPR/Cas9载体设计靶设计原则：靶位点20个碱基并且必须以“NGG”结尾，靶位点的GC含量应该介于40％到70％，并且避免具有连续4个T碱基，同时与sgRNA配对不应超过6bp，设计三个杂交构树F5H基因的靶位点，提高编辑效率，纯合效率。

选定靶位点后使用高保真酶(Phanta)对片段进行PCR扩增，设计不同靶位点相应的引物(引物序列如下)，从包含tRNA和sgRNA 序列的pGTR载体为模板。反应体系为：25μLPhanta(2×)，cDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，2μLpGTR载体，21μL ddH₂O。PCR 反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s；72℃45s，34个循环；72℃10min。PCR扩增，DNA凝胶回收，获得约200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收，引物序列如下。

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-1:TAGGTCTCAGTCAAACAAAG CACCAGTG；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-2:GCGGTCTCAGAGGAGGGGG ATTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-3:TAGGTCTCACCTCTTCCTCC TGTTTTAGAGC；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-4:GCGGTCTCAGAGCATGTCG ATTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-5:TAGGTCTCAGCTCCCGATGA TGTTTTAGAGCTAGAAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-6:GCGGTCTCACTGACGTACG ACTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-7:TAGGTCTCATCAGGTACCTG AGTTTTAGAGCTAGAAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-8:TAGGTCTCAAAACAAAAAAA GCACCGACTCGGTGCC。

(3)一步法连接反应体系：Bsa I(购于NEB公司)15U，10ⅹBas I buffer 1.5μL，T4连接酶50U，载体0.5μg，目的胶回收片段30μg，去离子水补齐15μL反应总体系。一步法连接PCR程序：37℃酶切 10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，3个循环，37℃酶切 10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，10个循环，程序结束后4℃保存于冰箱备用。

(4)连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆送测序。

(5)将测序正确的菌落培养后提取CRISPR/Cas9-BpF5H载体质粒并-20℃保存，用于后续实验。

实施例2：纯合编辑转基因杂交构树的获得

(1)采集杂交构树的叶子，叶子大小约为5cm，太大大小会受到消毒剂的影响，7％的次氯酸钠消毒10min，灭过菌的三级水清晰 4-6遍，用灭过菌的滤纸将水分吸干。

(2)提前制备侵染液：热激发将实施例1获得质粒转到EHA105 农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用。取出菌液 Kan(50mg/L)LB中摇菌，当OD₆₀₀＝0.4-0.5时加100μmol·L^–1乙酰丁香酮，2h后离心富集菌液，使用N6(N6基础培养基，30g·L^-1蔗糖， pH值为6，100μmol·L^–1乙酰丁香酮)侵染液重悬为OD600＝0.2-0.3，侵染液制备完成。

(3)再将经过步骤(1)处理的叶子剪成1cm浸泡到制备好的侵染液中里，同时真空抽滤5-8min。用灭过菌的滤纸将菌液吸干。置于共培养N6AS(N6基础培养基，30g·L^-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮)共培养两天。

(4)将部分没有出现霉菌和细菌的叶子转移到筛选培养基MS5 培养基(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂， 4mg·L^–12,4-D，0.15mg·L^–16-BA，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1 bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B)，诱导愈伤组织1.5-2个月。

(5)将长出的愈伤组织转移到分化培养基(WPM基础培养基， 30g·L-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–16-BA，0.05 mg·L^–1NAA，0.04mg·L^–1TDZ，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos /3mg·L^–1潮霉素B)，诱导再生芽1.5-2个月。

(6)将诱导出来的再生芽转移到生根培养基MS0(MS基础培养基，15g·L^-1蔗糖，pH值为6，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1NAA，0.5mg·L^–1 IBA，300mg·L^–1特美汀)，诱导芽生根2-3周。

(7)将已经生根的树苗长到6-8cm高，加入抑菌水(制霉片) 打开盖子炼苗7天，后将生根培养基洗干净，在加入生根粉的水里浸泡30min，转移到混有蛭石湿润、透气的土里，用保鲜膜盖上，待观察构树长出新叶新枝约2-3个周，揭去保鲜膜。

(8)PCR鉴定转基因构树，提取步骤(7)的构树DNA为PCR 模板，反应体系为：10μLTap Mix(2×)，cDNA，正/反向引物(10μM) 各1μL，2μL构树DNA，6μL ddH₂O。PCR反应条件为：95℃3min； 95℃15s，56℃15s；72℃20s，28个循环；72℃10min。PCR鉴定产物进过琼脂糖凝胶电泳，hph片段约398bp，Cas9片段约1279bp，同时具有两个阳性目的片段为转基因植株(图2)。引物序列如下：

hph-F:aaggaatcggtcaatacactacatgg

hph-R:aagaccaatgcggagcatatacg

Cas9-F:atccaagcgaaacgggagtt

Cas9-R:accgccactccatcaagaag

(9)选取阳性杂交构树的DNA为PCR模板，反应体系为：25 μL Phanta(2×)，cDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，2μL构树 DNA，21μL ddH₂O。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃ 15s；72℃45s，34个循环；72℃10min。PCR扩增胶回收获得约 800BP的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收。引物序列如下：

BPF5H测序-F：accaaaagtatcaccctccta

BPFH测序-R：cctcattcttcttcaccacg

(10)胶回收产物连接T载体，热激发转化DH5α，鉴定阳性进行单克隆测序，构树为二倍体，DNA双链同时被编辑为纯合编辑

实施例3转基因杂交构树木质素单体测定

(1)将移栽的构树茎秆进行取材，烘箱120℃2h处理杀青，烘箱65℃48h处理烘干样品，后将样品磨碎。

(2)称取1g左右磨碎的植物材料(茎秆)，加入氯仿：甲醇(体积比2:1)20ml,摇匀，离心(4000rpm 7min)，弃去上清，重复3 次；加入甲醇20ml，摇匀，离心(4000rpm 7min)，弃去上清，重复3次；加入50％甲醇20ml，摇匀，离心(4000rpm 7min)，弃去上清，重复3次；加入超纯水(MiliQ)20ml，摇匀30min，离心 (4000rpm 7min)，弃去上清，重复3次；烘箱烘干(1-2d)。

(3)称取处理好的样品20mg。

(4)分别在样品管里用移液管加入3ml裂解液，样品管用封口膜反向缠紧，在振荡器充分震荡30s-60s；

(5)将样品管放入预热的80℃金属浴，每30min后用点振仪摇一次，时间共计4h。

(6)准备内标溶液，浓度为2.5mg·mL^–1(称取2.5mg固体二十二烷溶于1ml氯仿)配好后每个样品中加入100ul内标。

(7)在样品管中加入3ml超纯水，之后加入0.8ml饱和NaHCO₃，再加入3ml二氯甲烷，混匀后离心2900rpm，10min。

(8)萃取下层，再次加入二氯甲烷3ml，离心2900rpm，10min，萃取下层转移到新的的15ml玻璃管。

(9)再加入Na₂SO₄，直至溶液澄清为止，锡箔纸包好置于通风厨过夜。

(10)第二天，将样品从15ml玻璃管转移到棕色瓶中用氮气吹干，吹干之后离心2900rpm，1min。

(11)管底样品进行衍生化，每个样品中加入40ul吡啶 (pyridine)，之后加入120ul MSTFA，加完之从后倾斜试管浸润管壁，离心2900rpm，1min，37℃放置30min，样品取部分放入进样瓶，装入内插管质谱测样。

(12)计算木质素单体的含量，根据实验结果得出对于野生型构树，超表达F5H转基因构树S型木质素单体含量明显上升，其中OE2 树S型木质素单体含量在300μmol·g^–1以上，G型木质素单体含量明显下降。F5H突变体转基因构树G型木质素单体含量明显上升， S型木质素单体含量明显下降，其中KO2不含有S型木质素单体。(图 3)。

实施例4：转基因杂交构树木质素总量，纤维素半纤维素测定

(1)按照实施例3方法(1)(2)处理好的样品称300mg，每个进行2个技术重复。

(2)称量好的样品加入72％浓硫酸，30℃，30min。

(3)将样品中的72％浓硫酸用去离子水稀释至4％，120℃，1 h，后冷却至室温。

(4)称好与称样数相同数量的滤纸置于玻璃皿中，记好重量，备用。

(5)使用布氏漏斗抽滤已经冷却的样品，抽滤的时候需要慢慢的将样品倒在滤纸上，再将布氏漏斗的沉淀物用清水洗至溶液呈中性。

(6)将滤纸盛在干净的玻璃平皿中放置烘箱烘干，85℃，24h。

(7)取出干燥好的沉淀，在干燥器中室温冷却。

(8)将带有沉淀的滤纸在精密天平上称重，两次滤纸重量差值即为木质素重量(图4)，对比与野生型转基因木质素总量含量没有太多变化。

(9)取出步骤(3)的溶解液与液相色谱仪器进样中，计算出样品纤维素半纤维素含量，对比与野生型转基因纤维素和半纤维素量含量没有太多变化。(图5和6)。

实施例5：转基因杂交构树牧草消化率的测定

(1)首先选用4只体重约为40kg、装有永久性瘤胃瘘管的绵羊作为瘤胃液的供体动物。日粮精粗采取比为3∶7，精饲料为180g混合精料，粗饲料为420g混合牧草。选用的绵羊进行单笼饲养，在每日7：00和18：00定时饲喂，期间绵羊可自由饮水，在稳定预饲14 d以后，可用作瘤胃液的供体动物。

(2)喂养的牧草进行体外发酵以可溶性淀粉和纤维素为碳源，以胰蛋白胨为氮源，添加1.0％延胡索酸二钠，转基因杂交构树为发酵底物，将四种物质置于发酵瓶中。

(3)将发酵瓶在通入CO₂保持厌氧的条件下，进行39℃恒温水浴，然后将新鲜采集的20mL瘤胃液与提前配好的40mL缓冲液注入发酵瓶，继续通入CO₂2 0s，马上盖上胶塞和铝盖，用压盖器压紧密封，然后将发酵液轻微摇动混匀，放入恒温摇床39℃24h。

(4)体外培养结束，记录发酵瓶内的产气量，后培养瓶冰浴停止发酵。

(5)将培养瓶中的液体和残渣转移离心管中，4000rpm离心10 min，取10mL上清液用于测定pH值、氨氮(NH3-N)和总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度。

(6)剩余溶液12000rpm离心10min，弃上清，只取沉淀放入 105℃烘箱烘干直到恒重，用于测定消化率，KO2的牧草消化率对比于野生型上升高达70.29％(图7)。

综上实施例对本发明进行了详尽的叙述。但是它仅仅是本发明中的部分实例，不能完全概括本发明的全部技术细节，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明的贯彻理念和技术范围的梗概下，本发明还会有不同程度的改进。按本发明的发明理念，本发明申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变，对这些全部都进行专利保护。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)

<400> 1

atccccctcc tcttcctcct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)

<400> 2

atcatcggga gcatgtcgat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)

<400> 3

tcaggtacct gacgtacgac 20

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taggtctcag tcaaacaaag caccagtg 28

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggtctcag aggaggggga ttgcaccagc cgggaa 36

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taggtctcac ctcttcctcc tgttttagag c 31

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggtctcag agcatgtcga ttgcaccagc cgggaa 36

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taggtctcag ctcccgatga tgttttagag ctagaaa 37

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggtctcac tgacgtacga ctgcaccagc cgggaa 36

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taggtctcat caggtacctg agttttagag ctagaaa 37

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taggtctcaa aacaaaaaaa gcaccgactc ggtgcc 36

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggatacca aaagtatcac ctcc 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcagatggtg cacacgacac gt 22

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaggaatcgg tcaatacact acatgg 26

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagaccaatg cggagcatat acg 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atccaagcga aacgggagtt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

accgccactc catcaagaag 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

accaaaagta tcaccctcct a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctcattctt cttcaccacg 20

Claims (9)

1.利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)从文献中获取杂交构树F5H基因序列，设计引物；

BPF5H-F:ATGGATACCAAAAGTATCACCTCC

BPF5H-R:TCAGATGGTGCACACGACACGT

(2)根据已经获得的构树BpF5H基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的三个靶位点分别为‘ATCCCCCTCCTCTTCCTCCT’,‘ATCATCGGGAGCATGTCGAT’,‘TCAGGTACCTGACGTACGAC’；

(3)选定靶位点后，使用高保真酶对片段进行PCR扩增，设计不同靶位点相应的引物，以包含tRNA和sgRNA序列的pGTR载体为模板；PCR扩增并进行胶回收获得200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收；引物序列如下：

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-1:TAGGTCTCAGTCAAACAAAGCACCAGTG；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-2:GCGGTCTCAGAGGAGGGGGATTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-3:TAGGTCTCACCTCTTCCTCCTGTTTTAGAGC；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-4:GCGGTCTCAGAGCATGTCGATTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-5:TAGGTCTCAGCTCCCGATGATGTTTTAGAGCTAGAAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-6:GCGGTCTCACTGACGTACGACTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-7:TAGGTCTCATCAGGTACCTGAGTTTTAGAGCTAGAAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-8:TAGGTCTCAAAACAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC；

(4)回收的目的片段通过一步法连接T4连接酶，连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取CRISPR/Cas9-BpF5H载体质粒并在-20℃保存；

(5)采集杂交构树的叶子，叶子大小为4.5-5.5cm，使用7％的次氯酸钠消毒10min，用无菌水清洗至无菌、无消毒剂残留，吸干水分；

(6)提前制备侵染液：热激发将步骤(4)制备的载体质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD₆₀₀＝0.4-0.5时加100μmol·L^–1乙酰丁香酮，2h后离心富集菌液，使用N6侵染液重悬为OD₆₀₀＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述N6侵染液是N6基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(7)将步骤(5)处理的叶子剪成1cm小块浸泡到制备好的侵染液中，同时真空抽滤5-8min；将侵染液吸干，置于共培养基N6AS共培养两天；所述共培养基N6AS是N6基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(8)将没有出现霉菌和细菌的叶子转移到筛选培养基MS5诱导愈伤组织1.5-2个月；所述MS5培养基是MS基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，4mg·L^–1 2,4-D，0.15mg·L^–1 6-BA，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(9)将步骤(8)长出的愈伤组织转移到分化培养基WPMD诱导再生芽1.5-2个月；所述的分化培养基WPMD是WPM基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1 6-BA，0.05mg·L^–1NAA，0.04mg·L^–1TDZ，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(10)将步骤(9)诱导出来的再生芽转移到生根培养基MS0诱导芽生根2-3周；

所述的生根培养基MS0是MS基础培养基中含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1NAA，0.5mg·L^–1IBA，300mg·L^–1特美汀，pH值为6；

(11)当步骤(10)已经生根的树苗长到6-8cm高，加入抑菌水，打开培养容器的盖子炼苗6-8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡25-35min，然后转移到透气湿润的土里；用保鲜膜盖上，待观察构树长出新叶新枝，揭去保鲜膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)CRISPR/Cas9载体设计靶设计原则：靶位点20个碱基并且必须以“NGG”结尾，靶位点的GC含量应该介于40％到70％，并且避免具有连续4个T碱基，同时与sgRNA配对不应超过6bp，设计三个杂交构树F5H基因的靶位点，提高编辑效率，纯合效率。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)PCR的反应体系为：25μLPhanta(2ⅹ)，cDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，2μLpGTR载体，21μL ddH₂O；PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s；72℃45s，34个循环；72℃10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(4)的连接反应体系：Bsa I15U，10×Bas I buffer 1.5μL，T4连接酶50U，载体0.5μg，目的胶回收片段30μg，去离子水补齐15μL反应总体系；连接PCR程序：37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，3个循环，37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，10个循环，程序结束后4℃保存于冰箱备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(10)抑菌水为含有终浓度为2g·L^–1制霉素的无菌水。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(6)将构建好的质粒加入融化的农杆菌感受态冰浴30min，后液氮速冻3min，37℃热激1min30s，冰浴2min，加入LB液体培养基，28℃摇床160rpm培养3-4h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(7)的共培养条件为25℃黑暗培养诱导愈伤组织。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(9)分化培养的条件为25℃16h光照8h黑暗培养，诱导再生芽1.5-2个月。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(10)生根培养条件为25℃16h光照8h黑暗培养，诱导芽生根2-3周。

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