CN103975858A

CN103975858A - 用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素培养基及应用

Info

Publication number: CN103975858A
Application number: CN201410232463.0A
Authority: CN
Inventors: 张友强; 夏时云; 李雁鹏; 刘月兵; 吴金凤; 孙瑞
Original assignee: Tianjin Bin Cheng Tian Long Agricultural Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Bin Cheng Tian Long Agricultural Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2014-08-13

Abstract

一种用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素培养基，包括A、B、C三种培养基：培养基A：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，1.5～2.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；谷胱甘肽20～30mg/L；蔗糖，20～30g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.2～5.5；培养基B和培养基C。使用培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基包括A、B、C三种培养基在培育优质蝴蝶兰实生苗的应用。使用该系列培养基及方法简便、适用。而应用方便的培育适用现有蝴蝶兰属内绝大多数园艺种的自交或品种间杂交种的无菌播种，不仅能获得大量的蝴蝶兰不同品种的优质实生苗，而且因不添加任何激素而减少了实生苗的变异率，加快了优质蝴蝶兰实生苗的培育速度。

Description

用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素培养基及应用

技术领域

本发明属于农林业花卉培养，特别涉及一种用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素培养基及应用。

背景技术

蝴蝶兰属兰科蝴蝶兰属植物，其花形状奇异清秀，花大艳丽，具有极高的观赏价值和经济价值。随着人们生活水平的不断提高，蝴蝶兰的市场需求量也越来越大，但蝴蝶兰为典型的单茎性热带附生兰，植物很少发生侧枝，分株繁殖系数极低。蝴蝶兰需经人工授粉才能获得种子，但其种子发育不全，没有胚乳，只有一层极薄的种皮，自然条件下很难萌发，需经组织培养无菌播种才能获得植株。在蝴蝶兰开花时进行自交或杂交授粉，授粉成功的花朵3—4个月后果荚方便可进行试管无菌播种。由于果荚内种子数量较多，1个果荚便可繁殖出成千上万的植株。采用无菌播种途径快繁蝴蝶兰，能够在短期内获得大量幼小植株，且成本较低，是现阶段经济有效的快速繁殖方法，也是工厂化育苗的重要途径。

蝴蝶兰种苗的繁殖主要通过组培苗培养的方法繁殖。Kundson(1922)经过系列研究，成功地在含糖培养基上用种子培育出兰花幼苗，建立了一套兰花种子无菌萌发实验方法和萌发所需的恰当培养基配方，无菌萌发获得的兰花幼苗可以正常生长开花，此方法为以后的杂交育种和兰花工业的发展提供了必备条件；GavinoRoter(1949)首先对兰花进行组织培养获得成功，他将蝴蝶兰茎节接种于KundsonC培养基上获得再生苗；Morel(1960)开创了兰花茎尖组织培养工业化生产技术，并被兰花生产者应用到新品种的快速繁殖中来，兰花工业从此兴起。Potor(1949)采用蝴蝶兰花梗上的休眠芽作为外植体，进行无菌培养成为完整的植株，引起人们关注，曾一度成为蝴蝶兰的主要无性繁殖方式。Intuwong等(1974)采用蝴蝶兰茎尖作为外植体，诱导PLB(原球茎)分化成植株，为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础。此后，国外兰花组织培养文献大量增加，东洋兰花的组织培养方面，在日本和韩国有大量的应用研究，在此不一一列举。在我国，兰花的组织培养起步较晚，吴应祥(1960)研究了兰花种子无菌萌发；1980年以后，国兰与洋兰组织培养与快速繁殖文献量激增；云南植物研究所(1982)对蕙兰属10个种的种子进行了无菌播种技术的研究；四川省农科院原子能应用研究所(1987)报道了中囯兰45个品种的组织培养繁殖研究，成功诱导了20个品种。进入20世纪90年代后期，日本、韩国特别是台湾地区的蝴蝶兰花企业纷纷涌入我国发展蝴蝶兰花产业，带来了大量兰花新品种和培育新技术，催生了我国“兰花工业”，目前，蝴蝶兰、文心兰、卡特兰、石斛兰、大花蕙兰等洋兰和春兰、春剑、建兰、墨兰、寒兰等国兰巳大部分品种实现了组织培养规模化生产，其中仅蝴蝶兰组培试管苗全国年产量超过4000万株。目前国内外栽培的蝴蝶兰品种绝大多数都是通过杂交育种得到的。在蝴蝶兰杂交育种中，也常遇到雌、雄孢子不亲和性，杂种胚发育不良，没有胚乳，只有一层极薄的种皮，自然条件下很难萌发，需经组织培养无菌播种才能获得大量兰花苗。通过无菌播种与组织培养，获得大量优良植株，可以保持优良品质特征，是进行大规模商品生产和新品种选育的关键，杂种胚培养已成为蝴蝶兰杂交育种中不可缺少的技术手段，也成为兰花育苗的一项标准程序；通过无菌播种与组织培养,缩短了杂交育种周期,提高了育种效率,加快了蝴蝶兰规模化生产的进程。自从Kundson(1922)成功地在含糖培养基上用种子培育出兰花幼苗以来，我国吴应祥(1960)也研究了兰花种子无菌萌发，但这些均是地生兰的研究；对气生热带兰的研究一直不太多。20世纪80年代，国内对蝴蝶兰无菌的播种和组织培养开始起步,近年囯内有许多学者(魏翠华，等，2000年)、(杨美纯，等，2002年)、(王慧瑜，等，2003年)、(徐晓薇，等，2004年)、(姚丽娟，等，2004年)、(梁宏伟，等，2004年)、(章玉平，等，2004年)、(俞继英，等，2004年)、(陈超等，2006年)、(曹君迈，等，2006年)、(杨杞，等，2006年)、(范成五等，2006年)、(余慧琳，等，2009年)、(丘亮伟，等，2009年)、(蒲海萍，等，2011年)先后报道了蝴蝶兰无菌播种的结果，并且有的已应用于蝴蝶兰杂交育种和实生种苗的繁育生产。

所见以上报道所釆用的培养基具有以下特点：

(1)源于种子的再生体系,大多数釆用愈伤组织再生途径和晶胚再生途径及原球茎再生途径等，但所用培养基成分较多，原料保存和配制很不便。例如，ChenY C，等(2000年)采用蝴蝶兰‘Nebula’白花授粉120天的种子作为外植体，诱导的愈伤组织培养基为1/4MS+蛋白胨1.0g/L+AC2.0g/L+香蕉泥50g/LL+肌醇100mg/L+蔗糖20mg/L+Gelrite(凝固剂)3.0g/L，并逐渐形成原球茎；愈伤组织增殖培养基为1/2MS+肌醇100mg/L+烟酸0.5mg/L+VB60.5mg/L+VB10.1mg/L+甘氨酸2.0mg/L+蛋白胨1.0g/L+NaH2PO4170.0mg/L+蔗糖20g/L+Gelrite2.2mg/L+TDZ1.0mg/L。Chen J T，等(2004年)采用蝴蝶兰Pha1.amabilis白花授粉后3个月的种子作为外植体培养基为1/2改良MS+肌醇100mg/L+烟酸0.5mg/L+VB60.5mg/L+VBl0.1mg/L+甘氨酸2.0mg/L+蛋白胨1.0g/L+NaH2PO4170.0mg/L+蔗糖20g/L+Celrite(凝固剂)2.2g/L+TDZ3.0mg/L，可诱导出大量的晶胚，再转入不含激素的上述培养基中，培养4～6周，可形成带有5～6片叶，3～4条根的小苗。王云惠等(2007年)采用白花授粉后120天的蝴蝶兰种子作为外植体，诱导培养基为MS十BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+AC1.0g/L+蔗糖20L+琼脂5.8g/L，可获得大量的PLB。

(2)培养基大多添加了植物激素,不仅延长繁殖周期，也增加了体细胞变异的可能性。例如，杨美纯，等(2002年)认为MS+BA3mg/L+NAA0.05mg/L有利于蝴蝶兰种子的萌发及幼苗生长。代容春等(2003年)以蝴蝶兰无菌幼苗(株高约1.5(3m)为外植体，其分株的最适增殖培养基为：1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L+CM20g/L。徐晓薇，等(2004年)报道蝴蝶种子萌发后,MS+6-BA0.5～1.0mg/L为原球茎最佳分化培养基。章玉平，等(2004年)认为在种子萌发后,附加KT1mg/L+2,4-D0.1mg/L有利于类原球茎状体PLB的诱导,附加1mg/LNAA+1～3mg/LKT或6-BA3～5mg/L有利于PLB的增殖。朱红华等(2006年)在蝴蝶兰试管苗继代及生根培养的研究结果，认为蝴蝶兰的继代培养以MS+6-BA5ms/L+NAA0.5mg/L+活性炭1.5L为最适合，而在生根培养中，以MS+NAA1.0ms/L+活性炭1.5g/L为最好。余慧琳，等(2009年)则认为蝴蝶兰适宜的种子萌发培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.2mg/L+香蕉20g/L+活性碳2g/L+蔗糖20g/L。范成五等(2006年)则将蝴蝶兰种子播种于MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L+AC2g/L的培养基中萌发。

此外，以上研究报道由于釆用的蝴蝶兰品种基因型和培养基配方不同，所得结果还存在不同甚至相反的结论，已有的研究报道都仅在个别品种上获得成功，限制了研究结果的实际应用。

迄今，但尚未见到有关蝴蝶兰无菌播种时使用完全无激素培养基的报道。因此，研发出完全无激素培养基并能在绝大多数蝴蝶兰园艺种的自交或品种间杂交种的无菌播种中使用具有很大的应用推广价值。

发明内容

本发明的目的是在克服上述现有技术中不足的同时，提供一种简便、适用而应用方便的培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基(包括A、B、C三种培养基)及其应用技术，使用该系列培养基及方法，适用现有蝴蝶兰属内绝大多数园艺种的自交或品种间杂交种的无菌播种，不仅能获得大量的蝴蝶兰不同品种的优质实生苗，而且因不添加任何激素而减少了实生苗的变异率，加快了优质蝴蝶兰实生苗的培育速度。

本发明具体方案内容：

本发明所提供的技术方案是：

一种用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基(包括A、B、C三种培养基)及其应，包含下列组分：培养基A：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，1.5～2.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；谷胱甘肽20～30mg/L；蔗糖，20～30g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.2～5.5。培养基B：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，1.5～2.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；苹果酸30～50mg/L；腺嘌呤5.0～10mg/L；香蕉泥30～60g/L；蔗糖，10～15g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.0～5.5。培养基C：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，2.5～3.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；苹果酸30～50mg/L；香蕉泥50～80g/L；蔗糖，10～15g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.0～5.5。

用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基(包括A、B、C三种培养基)及其应用，包括如下步骤：(1)选择优良蝴蝶兰单株进行人工授粉自交或杂交获得果荚；(2)5个月采收果荚，利用权利要求1所述的培养基A对蝴蝶兰杂交种子进行无菌播种：在无菌超净工作台上，将发育成熟的蝴蝶兰果荚用75％酒精擦洗干净，用0.1％的ＨｇＣl2消毒8～10分钟，无菌水冲洗5～6次，用无菌吸水纸吸干多余水份；用消毒手术刀片将果荚内细如粉尘的种子取出，置于权利要求1或2所述的培养基中，播种10～15天，种胚吸水膨大，逐渐撑破种皮，形成淡黄色的原球茎，30天后原球茎转成绿色，并有散射状吸收毛分布；(3)将培育的原球茎转入权利要求1所述的培养基B中培养，转入10～15天，可见绿色的原球茎产生出拟叶并经20～25天进一步分化出具有2～3片叶小苗；(4)将已分化出的小苗定植到权利要求1所述的培养基C上进行壮苗生根培养，经40～45天长成2～3片叶、3～4厘米高、根系4～6条的完整小苗炼苗后可出瓶移栽。

本发明的有益效果：

本发明提供一种简便、适用而应用方便的培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基(包括A、B、C三种培养基)及其应用技术，使用该系列培养基及方法简便、适用。而应用方便的培育适用现有蝴蝶兰属内绝大多数园艺种的自交或品种间杂交种的无菌播种，不仅能获得大量的蝴蝶兰不同品种的优质实生苗，而且因不添加任何激素而减少了实生苗的变异率，加快了优质蝴蝶兰实生苗的培育速度。

具体实施方式

首先配制蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基(包括A、B、C三种培养基)，该系列培养基的制作采用组培常规的培养基配制方法。

用于无菌播种的培养基A，包含以下组分：花多多11号，2.2g/L；胰蛋白胨2.5g/L；活性炭2.0g/L；谷胱甘肽30mg/L；蔗糖20g/L；琼脂粉9.0g/L；最终pH调节为5.2～5.5。

用于原球茎分化小苗培养的培养基B，它包含以下组分：花多多11号，2.2g/L；胰蛋白胨2.0g/L；活性炭1.5g/L；苹果酸30mg/L；腺嘌呤10mg/L；香蕉泥50g/L；蔗糖15g/L；琼脂粉8.0g/L；最终pH调节为5.0～5.5。

用于蝴蝶兰实生小苗的壮苗生根培养的培养基C，它包含以下组分：花多多11号，2.4g/L；胰蛋白胨2.5g/L；活性炭1.0g/L；苹果酸30mg/L；香蕉泥80g/L；蔗糖15g/L；琼脂粉9.0g/L；最终pH调节为5.0～5.5。

培养基中的各种原料平时，保存在4℃冰箱中。配制各将培养基时培养基中的各成分按需要量称取并溶于定量的蒸馏水或纯净水中，用1N NaOH调节pH，煮沸后分装到培养瓶中，在121℃灭菌120分钟，冷却后备用。

选择优良蝴蝶兰单株进行人工授粉自交或杂交以获得果荚；在采用无菌播种进行蝴蝶兰种苗生产时，要对父母本进行严格的选择，以确保后代性状的尽可能一致。

采用授粉后100～135天，果荚外部变得光滑饱满，颜色由绿转黄，蒴果尚未开裂时采收果荚；利用权利要求1所述的培养基A对蝴蝶兰杂交种子进行无菌播种：在无菌超净工作台上，将发育成熟的蝴蝶兰果荚用75％酒精擦洗干净，用0.1％的ＨｇＣl2消毒8～10分钟，无菌水冲洗5～6次，用无菌吸水纸吸干多余水份；用消毒手术刀片将果荚内细如粉尘的种子取出，置于权利要求1或2所述的培养基中，将接种的培养瓶放在800～1000lx，光周期为照光14小时和黑暗10小时的条件下培养，培养温度为25±1℃。播种10～15天，种胚吸水膨大，逐渐撑破种皮，形成淡黄色的原球茎，30天后原球茎转成绿色，并有散射状吸收毛分布；

将培育的原球茎转入权利要求1所述的培养基B中培养，转入10～15天，将培养瓶转移到光照条件。从这以后均为：光照强度1000～1500lx，光周期为照光16小时和黑暗8小时，温度25±1℃的培养条件下培养。可见绿色的原球茎产生出拟叶并经20～25天进一步分化出具有2～3片叶小苗；

将已分化出的小苗定植到权利要求1所述的培养基C上进行壮苗生根培养，经40～45天长成2～3片叶、3～4厘米高、根系4～6条的完整小苗炼苗后可出瓶移栽。

使用上述蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基(包括A、B、C三种培养基)，可以对现有市场所见的所有蝴蝶兰品种的自交或杂交种均成功地诱导出大量的优质实生苗植株；近年我们利用上述蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基，已获得220多蝴蝶兰品种的自交或杂交种的实生苗植株，用于蝴蝶兰新品种选种培育和种苗繁育生产。

Claims

1.一种用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素培养基，其特征在于：用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基，包括A、B、C三种培养基：各包含下列组分：

培养基A：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，1.5～2.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；谷胱甘肽20～30mg/L；蔗糖，20～30g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.2～5.5；

培养基B：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，1.5～2.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；苹果酸30～50mg/L；腺嘌呤5.0～10mg/L；香蕉泥30～60g/L；蔗糖，10～15g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.0～5.5；

培养基C：花多多11号，1.5～2.8g/L；胰蛋白胨，2.5～3.5g/L；活性炭，1.0～3.0g/L；苹果酸30～50mg/L；香蕉泥50～80g/L；蔗糖，10～15g/L；琼脂粉，8.0～9.0g/L；最终pH调节为5.0～5.5。

2.根据权利要求1所述的用于培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素培养基其在培育优质蝴蝶兰实生苗应用：使用培育优质蝴蝶兰实生苗的无激素系列培养基包括A、B、C三种培养基在培育优质蝴蝶兰实生苗的应用：

包括如下步骤：

(1)选择优良蝴蝶兰单株进行人工授粉自交或杂交获得果荚；

(2)5个月采收果荚，利用所述的培养基A对蝴蝶兰杂交种子进行无菌播种：在无菌超净工作台上，将发育成熟的蝴蝶兰果荚用75％酒精擦洗干净，用0.1％的ＨｇＣl2消毒8～10分钟，无菌水冲洗5～6次，用无菌吸水纸吸干多余水份；用消毒手术刀片将果荚内细如粉尘的种子取出，置于所述的培养基中，播种10～15天，种胚吸水膨大，逐渐撑破种皮，形成淡黄色的原球茎，30天后原球茎转成绿色，并有散射状吸收毛分布；

(3)将培育的原球茎转入培养基B中培养，转入10～15天，可见绿色的原球茎产生出拟叶并经20～25天进一步分化出具有2～3片叶小苗；

(4)将已分化出的小苗定植到培养基C上进行壮苗生根培养，经40～45天长成2～3片叶、3～4厘米高、根系4～6条的完整小苗炼苗后可出瓶移栽。