CN111543322B - 一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法。本发明在果荚自然开裂后，用镊子轻敲果荚，种子可自裂口处蹦出，表面灭菌，用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，从而获得了无附属物的无毒种子，然后无菌播种，获得蝴蝶兰无病毒实生苗，配合田间养护做好病毒防控，优选单株在扩繁前进行病毒检测，只选择无病毒的株系进行扩繁，进而在获得新品种的同时获得无病毒种苗，提供无病毒组培母瓶，缓解蝴蝶兰产业中急需的新品种和无病毒种苗需求。

Description

一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法。

背景技术

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物，因其花形奇特、花姿优美、花色艳丽、花期长等优点，深受消费者青睐，被誉为“兰花皇后”，常作盆栽或切花。随着国际花卉产业的迅速发展，我国蝴蝶兰产业呈现出快速化、标准化、规模化的发展态势，发展前景可观。

蝴蝶兰只有一个生长点，属单茎性兰花，所以蝴蝶兰很难进行分株繁殖。目前国际上常用的繁殖方法是组织培养无性繁殖法。但是长期的组织培养引发的病毒传播越来越重，目前，在蝴蝶兰上分离得到的病毒超过25种，其中危害最重、分布最广的是建兰花叶病毒（Cybidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）。病毒传播成为制约兰花产业发展的瓶颈，病毒主要造成植株花叶、畸形、坏死、花瓣变形等症状，导致植株生长不良，花小而少，花期缩短，严重影响其观赏价值和经济价值。

迄今为止，获得无毒苗的主要途径有茎尖剥离、热处理和病毒抑制剂等方法。其中，茎尖培养应用最广，但其脱毒效果常受茎尖大小的影响，而且茎尖褐化和死亡率高；热处理主要利用高温可以抑制病毒的复制及运动蛋白的合成，从而造成病毒钝化失活。然而研究表明CymMV和ORSV都具有一定的耐热性，因此，单独热处理对蝴蝶兰脱除CymMV和ORSV效果不明显；病毒抑制剂方法主要通过抑制剂（孔雀绿、病毒唑和氨基寡糖素等）干扰病毒在植物体内的复制来达到防治病毒病的目的。但是，病毒抑制剂的浓度很难把控，浓度太大会使茎尖死亡，浓度小无法实现脱毒。

由于蝴蝶兰脱毒技术成活率低，蝴蝶兰组培生产所需组培苗母瓶价格昂贵，购买的母瓶往往是很多代扩繁的产物，也会有单病毒或含量比较低的病毒，往往扩繁几代生产种苗后就无法继续使用，需要年年购买。如何获得低成本的无病毒植株是蝴蝶兰产业中的“卡脖子”问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法。本发明通过开裂果荚的无菌播种，获得蝴蝶兰无病毒实生苗，配合田间养护做好病毒防控，优选单株在扩繁前进行病毒检测，只选择无病毒的株系进行扩繁，进而在获得新品种的同时获得无病毒种苗，提供无病毒组培母瓶，缓解蝴蝶兰产业中急需的新品种和无病毒种苗需求。

本发明技术方案是：一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法，其特征是，包括以下步骤：

1）获得杂交果荚

选取性状表现优良的父、母本进行杂交获得果荚；将未开裂但发育成熟的果荚进行消毒；

2）开裂果荚播种

将消毒过的果荚放在无菌组培瓶中，使其自然开裂，待果荚开裂后，轻敲果荚，种子自裂口处蹦出，先次氯酸钠消毒，然后采用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，再播种到培养基上；

3）无菌培养获得组培实生苗

将种子暗处理2周，之后进行正常的培养，实生苗田间养护期间配合做好病毒防控；

4）优秀实生单株扩繁

实生苗开花后，挑选出优秀的实生单株，逐一进行病毒检测，显示不含建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的单株在组培室内进行蝴蝶兰花梗组培扩繁，获得初代母瓶；

5）保留组培母瓶

在经过品种测试后，确定推广应用的品种，直接从组培室内用初代母瓶进行扩繁，确保种苗不含建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，生产过程中根据组培苗长势进行复壮扩增。

优选的，所述步骤1）将未开裂但发育成熟的果荚进行消毒，具体为：将未开裂但发育成熟的果荚，用75%乙醇仔细擦拭果荚表面及沟纹，将一些污垢和尘土擦拭干净，然后将整个果荚放入消毒过的容器中，用0.5%的次氯酸钠消毒15-18分钟，无菌水冲洗2~3次，吸干待用。

优选的，所述步骤2）次氯酸钠消毒为：采用0.5%的次氯酸钠消毒8-10分钟。

优选的，所述步骤2）的培养基为：花宝1号+香蕉50 g/L + 蛋白胨 2g/L +蔗糖20g/L + 琼脂 8g/L + 活性炭 2g/L，pH 5.4~5.6。

优选的，所述步骤2）的正常的培养为：光照强度2500 lx，光周期14 h，温度保持在20 ~ 26℃。

相比现有技术，本发明的优势是：

1、获得无附属物的无病毒蝴蝶兰种子和无病毒实生苗

蝴蝶兰的种子非常特别，每个果荚内种子量巨大，上万至几十万，种子细如粉尘，附着在绒毛上。

现有技术采用果荚切开获得种子，果荚内切出的都是絮状物的绒毛，这些絮状物的绒毛上面有种子，种子细如粉尘，肉眼看不到，无法使用工具取出果荚内细如粉尘的种子，只能得到带绒毛等附属物的种子，绒毛由母本细胞分化而来，因此携带有病毒；而种子为胚细胞发育而来，父母本各提供一半的遗传物质，由于建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒都是RNA病毒，因此胚细胞发育而成的种子不含病毒。

针对上述问题，本发明在果荚自然开裂后，用镊子轻敲果荚，种子可自裂口处蹦出，表面灭菌，用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，从而获得了无附属物的无毒种子。

本发明采用两次灭菌法，果荚灭菌--种子灭菌，利用无附属物的种子进行无菌播种，截断病毒代代传播的途径，通过无菌播种获得无病毒实生苗。

2、将新品种选育和无病毒种苗的获得结合在一起

本发明首先获得开裂果荚的无附属物的无毒种子，通过无菌播种获得无病毒实生苗，制定严格的温室、管理、操作、检测流程，确保生长过程中的病毒无感染；优选单株在扩繁前进行病毒检测，只选择无病毒的株系进行扩繁，进而在获得新品种的同时获得无病毒种苗，提供无病毒组培母瓶，缓解蝴蝶兰产业中急需的新品种和无病毒种苗需求。本发明将新品种选育和无病毒种苗的获得结合在一起，解决了品种脱毒种苗获得极其困难的问题。

备注：本发明中提到的“无病毒”种苗并不是绝对的不含有任何病毒，而是不含在生产中会影响商品性的两种主要病毒；也不是绝对意义上的无毒苗，存在病毒含量极低，检测不出来的情况，但均不影响商品性。

附图说明

图1为不开裂蝴蝶兰果荚通过解剖刀切开后的图片，其中A图为切开果荚的图片，B为从果荚内取出的绒毛图片；从图中可以看出：从果荚内切出的都是絮状物的绒毛，这些絮状物的绒毛上面有种子，种子细如粉尘，肉眼看不到，无法使用工具（如刀片等）取出果荚内细如粉尘的种子，只能得到带绒毛的种子；

图2为蝴蝶兰果荚自然开裂后的种子获取图片，其中A图为镊子轻敲果荚后种子可自裂口处蹦出；B图为种子灭菌图片；C图为将滤纸折成漏洞状，用灭菌滤纸过滤出种子；

图3为蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RT-PCR产物电泳图；其中，M：Marker；A1、A2、A3为切开果荚得到种子后的播种苗；B1、B2、B3为果荚自然开裂得到种子后的播种苗；769bp为建兰花叶病毒特异扩增带。

具体实施方式

实施例1：

1 无菌播种获得无病毒实生苗

1.1获得杂交果荚

选取性状表现优良的父、母本进行杂交（以“V31”为母本，“红太阳”为父本）获得果荚，经检测，父母本均带有两种病毒（建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒）。

1.2外植体消毒

将未开裂但发育成熟的果荚，用75%乙醇仔细擦拭果荚表面及沟纹，将一些污垢和尘土擦拭干净。然后将整个果荚放入消毒过的容器中，用0.5%的次氯酸钠消毒15-18分钟，无菌水冲洗2~3次，吸干待用。

1.3播种

1.3.1 未开裂果荚播种（作为对照）

将一部分消毒过的果荚放在无菌的培养皿中，用消毒过的解剖刀切开果荚（见图1），将果荚内种子（带有绒毛等附属物）移入有少量无菌蒸馏水的培养瓶中，轻轻摇动使之分散均匀，然后用无菌吸管将种子分移到灭菌好的培养基（花宝1号+香蕉50 g/L + 蛋白胨2g/L +蔗糖 20g/L + 琼脂 8g/L + 活性炭 2g/L， pH 5.4~5.6）上。

1.3.2 开裂果荚播种

另一部分消毒过的果荚放在无菌组培瓶（放入无菌干燥剂）中，使其自然开裂。一般15-30天果荚才能裂开。果荚开裂后，用镊子轻敲果荚，种子可自裂口处蹦出（见图2-A），不要用镊子等器物刮取，防治绒毛混杂在种子中。果荚自然开裂后的种子，表面灭菌后再进行播种。由于种子非常细小，需提前准备折成漏斗状的滤纸并灭菌。即把滤纸折成漏洞状，用纸包好后用灭菌锅灭菌。在超净台上，将裂开的种子用0.5%的次氯酸钠消毒10分钟，用灭菌滤纸过滤出种子（见图2-B和2-C），无菌水冲洗2-3次，然后再播种到培养基上。培养基为：花宝1号+香蕉50 g/L + 蛋白胨 2g/L +蔗糖 20g/L + 琼脂 8g/L + 活性炭 2g/L，pH 5.4~5.6。裂开种子由于在瓶子中放置时间较长，不灭菌的话污染率较高。

1.4无菌培养获得组培实生苗

将两种不同播种方法的种子暗处理2周，之后进行正常的培养。光照强度2500 lx，光周期14 h，温度保持在20 ~ 26℃。播种50~60天后长成2~3片叶的小苗，待小苗叶片长至2cm左右，取蝴蝶兰叶片进行病毒检测。

检测方法如下：利用RT-PCR进行病毒检测，用TaKaRa MiniBEST Plant RNAExtraction Kit试剂盒提取蝴蝶兰RNA，用TaKaRa PrimeScript™ II 1st Strand cDNASynthesis Kit进行反转录，用TaKaRa Ex Taq ® DNA Polymerase进行扩增。结果如3所示，由图3可以看出，切开果荚得到种子，然后将其进行播种后得到的种子苗，经检测只含有建兰花叶病毒。用果荚自然开裂后得到的种子进行播种，得到的种子苗经检测不含有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。因此，我们认为，通过播种果荚自然开裂得到的种子（无绒毛等附属物），可以快速得到无毒蝴蝶兰幼苗。

2 无病毒实生苗的田间养护

实生苗田间日常管理参照蝴蝶兰生产技术，为做好田间管理过程中的病毒防护需要符合如下要求：

2.1温室要求

温室出入口、天窗、湿帘、风机等于外界进行气体交换的部位需覆盖40目防虫网，入口及出口处须有缓冲隔离间，防止人员进出时与外界直接进行气体交换；温室地面需全部用水泥硬化，防止土壤中害虫入侵；温室苗床必须用可耐燃烧的材质，不可用木、竹等材料，苗床支柱距离地面70-80cm处用铜片缠绕，可预防害虫。

2.2管理要求

理想状态下，每半年进行一次例行病毒鉴定，发现病毒感染及时剔除；温室进出人员严格管理，减少人为接触造成感染的机会；适当放大实生苗的间距，以叶片互不碰触为准；在换盆以及温室内更换位置时，需事先用0.5%的次氯酸钠溶液对放置区域进行充分淋洗并干燥后才能放置。实生苗需要换盆、整理、杂交授粉时，使用工具需经消毒处理，单株单刀片，随株更换，不得重复使用。人员管理操作时最好佩戴手套，并随植株的更换做好收到消毒。

工具和手套消毒可采用如下方法之一：1）在180℃烘箱中维持1小时；2）沸水煮15分钟；3）工具上接触过植物汁液的部位用火焰烤10-20秒；4）用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡30秒以上，溶液需现用现配。温室内应保持整洁，植株残体随时清除，地面定期清扫，必要时用0.5%次氯酸钠溶液喷洒。人员接触频繁的部位，如门把、电器开关、浇水喷头、扫把或工作台面，定期用0.5%次氯酸钠溶液擦拭。植株生长所用的盆器、基质、花梗固定器材等，采用全新资材，需要更替使用时必须用0.5%次氯酸钠溶液充分浸泡重复使用。

3 优秀实生单株扩繁

实生苗开花后，挑选出优秀的实生单株，逐一检测，显示不含建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的单株进行组培扩繁（避免种子消毒不彻底及田间管理过程中病毒防护不利引起植株带毒，带毒单株不会超过总体单株的5%），参照蝴蝶兰花梗组培扩繁操作流程。

需要注意，组培过程中使用的器皿架、操作盘、刀片等，必须随不同来源（批号）的种苗进行更换，确保不同单株扩繁的群体不会存在交叉感染的风险。

4 保留组培母瓶

在经过品种测试后，确定推广应用的品种，可直接从组培室内用初代母瓶进行扩繁，确保种苗不含建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，生产过程中根据组培苗长势进行复壮扩增。

Claims (4)

1.一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法，其特征是，包括以下步骤：

1)获得杂交果荚

选取性状表现优良的父、母本进行杂交获得果荚；将未开裂但发育成熟的果荚进行消毒；

2)开裂果荚播种

将消毒过的果荚放在无菌组培瓶中，使其自然开裂，待果荚开裂后，轻敲果荚，种子自裂口处蹦出，先次氯酸钠消毒，然后采用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，再播种到培养基上；

3)无菌培养获得组培实生苗

将种子暗处理2周，之后进行正常的培养，实生苗田间养护期间配合做好病毒防控；

4)优秀实生单株扩繁

实生苗开花后，挑选出优秀的实生单株，逐一进行病毒检测，显示不含建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的单株在组培室内进行蝴蝶兰花梗组培扩繁，获得初代母瓶；

5)保留组培母瓶

在经过品种测试后，确定推广应用的品种，直接从组培室内用初代母瓶进行扩繁，生产过程中根据组培苗长势进行复壮扩增。

2.如权利要求1所述的一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法，其特征是，所述步骤2)次氯酸钠消毒为：采用0.5％的次氯酸钠消毒8-10分钟。

3.如权利要求1所述的一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法，其特征是，所述步骤2)的培养基为：花宝1号+香蕉50g/L+蛋白胨2g/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+活性炭2g/L，pH5.4～5.6。

4.如权利要求1所述的一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法，其特征是，所述步骤2)的正常的培养为：光照强度2500lx，光周期14h，温度保持在20～26℃。

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