CN105746356B - 一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法 - Google Patents
一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物组织培养技术领域，尤其是一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法。一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，包括以下步骤：月季组培苗的获得、野蔷薇组培苗的获得、试管嫁接和嫁接后移栽前的准备。本发明的方法具有可以人工控制植物所处的环境，保证了植物所需的光照、温度和湿度，排除了外界环境因素对嫁接成活的影响，有利于成活率的提高，排除了季节对嫁接的限制，节约了土地面积，极大地缩短了嫁接进程的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物组织培养技术领域，尤其是一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法。
背景技术
蔷薇科蔷薇属植物主要分布在北半球温带、亚热带及热带山区等地区。我国是世界野生蔷薇的起源和分布中心之一，有蔷薇属植物95种，约占全世界总数的47％，可利用的种质资源极其丰富。月季(Rosa chinensis)是蔷薇属的多年生落叶或常绿灌木，被誉为“花中皇后”、“花中女王”，作为切花在市场上占有很大份额，是当今世界四大鲜切花之一。目前，规模化种植的月季，大多数是扦插苗。扦插苗一般可种植3-4年，而嫁接苗的种植年限则高于扦插苗。嫁接分为试管外嫁接和试管嫁接。试管外嫁接指的是传统意义的嫁接方法，试管嫁接又称微嫁接，以组织培养为基础在试管内将砧木与接穗进行嫁接获得新植株的技术。试管嫁接可以人工控制植物所处的环境，保证了植物所需的光照、温度和湿度，排除了外界环境因素对嫁接成活的影响，有利于成活率的提高，同时也极大地缩短了种质创新的进程。目前试管嫁接技术已应用在某些植物种类中，但尚未见有应用于月季和野蔷薇的远缘嫁接上。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，包括以下步骤：
(1)月季组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌以及初代培养：以带1个芽的月季茎段为外植体，用中性洗涤剂浸泡10min后用自来水冲干净，然后转入超净工作台工作，先用75％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基上中，周期15-18d；
③生根培养：当增殖出的小苗长至2.0-3.5cm时，接入生根培养基中培养15-25d；
(2)野蔷薇组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌及初代培养：以带1个芽的野蔷薇茎段为外植体，先用中性洗涤剂浸泡10min，并用自来水冲干净后，转入超净工作台上，用75％乙醇仔细拭擦茎段后无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理12min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基中，周期15-20d；
③生根培养：当小苗长至高约2.0-3.5cm时，接入生根培养基中培养15-25d；
(3)试管嫁接：选择野蔷薇组培苗为砧木，月季组培苗为接穗，在超净工作台上操作，先将长至2.5-3.5cm高的野蔷薇小苗切去所有叶片以及顶芽，并在顶部中间纵切，长度为0.2-0.4cm，然后接入生根培养基WPM+6-BA0.5-1.5mg/L+NAA0.5mg/L上；再将高3-4cm的月季小苗或者新芽，要求至少有1-2片叶片，切成1.0-2.5cm长的带茎尖的苗，将其基部切成“V”字形；最后将月季小苗基部小心插入蔷薇小苗的顶部切口中；生根时间为15-20d；
(4)嫁接后移栽前的准备：将生根良好的小苗，真叶已长出，主根有3-4条，根长为2.5-3.5cm，置于室温下炼苗1d，然后除去瓶盖再炼苗1-2d，洗去残余培养基，在50％多菌灵可湿性粉剂800-1000倍溶液或者0.5％高锰酸钾溶液浸泡10min再移栽，移栽后浇透定根水，之后每间早晚浇水一次，10-15d后即可正常生长。
作为优选，步骤(1)中的初代培养基为MS培养基。
作为优选，步骤(1)中的增殖培养基为MS+6-BA 1.5-3.0mg/L+NAA 0.1mg/L。
作为优选，步骤(1)中的生根培养基为WPM+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.5mg/L。
作为优选，所述的WPM培养基的配制方法为：以1000mL WPM培养基为标准，称取WPM培养基固体粉末2.14g，另取硝酸钙0.56g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，蔗糖为20g/L，琼脂3.5-4.0g/L，PH为5.8-6.0。
作为优选，步骤(2)中的增殖培养基为1/2MS+6-BA 1.0-1.5mg/L+IBA 0.05-0.1mg/L。
作为优选，步骤(2)中的生根培养基为WPM+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.5mg/L。
作为优选，步骤(1)、(2)以及(3)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h。
作为优选，步骤(4)中移栽的基质由泥炭和珍珠岩组成，二者的体积比为2:1，pH值为6.0-7.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的方法可以人工控制植物所处的环境，保证了植物所需的光照、温度和湿度，排除了外界环境因素对嫁接成活的影响，有利于成活率的提高，排除了季节对嫁接的限制，
2.本发明的方法可以有效节约土地面积。
3.本发明的方法极大地缩短了嫁接进程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：
一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，包括以下步骤：
(1)月季组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌以及初代培养：以带1个芽的月季茎段为外植体，用中性洗涤剂浸泡10min后用自来水冲干净，然后转入超净工作台工作，先用75％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；初代培养基为MS培养基；
②增殖培养：将茎段上的嫩芽切取下来，接入增殖培养基上进行增殖培养，周期15d；增殖培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L；
③生根培养：当增殖出的小苗长至2.0cm时，转接于生根培养基中培养15d；生根培养基为WPM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；所述的WPM培养基的配制方法为：以1000mL WPM培养基为标准，称取WPM培养基固体粉末2.14g，另取硝酸钙0.56g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，蔗糖为20g/L，琼脂3.5g/L，PH为5.8；步骤(1)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(2)野蔷薇组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌初代培养：以带1个芽的野蔷薇茎段为外植体，先用中性洗涤剂浸泡10min，并用自来水冲干净后，转入超净工作台上，用75％乙醇仔细拭擦茎段后无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理12min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20天；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基中进行增殖15d；增殖培养基为1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.05mg/L；
③生根培养：当小苗长至2.0cm时，转接于生根培养基中培养15d；生根培养基为WPM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；步骤(2)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(3)试管嫁接：选择野蔷薇组培苗为砧木，月季组培苗为接穗，在超净工作台上操作，先将长至2.5cm高的野蔷薇小苗切去所有叶片以及顶芽，并在顶部中间纵切，长度为0.2cm，然后接入生根培养基WPM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L上；再将高3cm的月季小苗或者新芽，要求至少有1片叶片，切成1.0cm长的带茎尖的苗，将其基部切成“V”字形；最后将月季小苗基部小心插入蔷薇小苗的顶部切口中；生根时间为15d；步骤(3)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(4)嫁接后移栽前的准备：将生根良好的小苗，真叶已长出，主根有3条，根长为2.5cm，置于室温下炼苗1d，然后除去瓶盖再炼苗1d，洗去残余培养基，在50％多菌灵可湿性粉剂800倍溶液浸泡10min再移栽，移栽后浇透定根水，之后每间早晚浇水一次，10d后即可正常生长；移栽的基质由泥炭和珍珠岩组成，二者的体积比为2:1，pH值为6.0。
实施例2：
一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，包括以下步骤：
(1)月季组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌以及初代培养：以带1个芽的月季茎段为外植体，用中性洗涤剂浸泡10min后用自来水冲干净，然后转入超净工作台工作，先用75％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；初代培养基为MS培养基；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基上，周期18d；增殖培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
③生根培养：当增殖出的小苗长至3.5cm时，转接于生根培养基中培养25d；生根培养基为WPM+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L；所述的WPM培养基的配制方法为：以1000mL WPM培养基为标准，称取WPM培养基固体粉末2.14g，另取硝酸钙0.56g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，蔗糖为20g/L，琼脂4.0g/L，PH为6.0；步骤(1)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(2)野蔷薇组培苗的获得
①初外植体的消毒灭菌以及代培养：以带1个芽的野蔷薇茎段为外植体，先用中性洗涤剂浸泡10min，并用自来水冲干净后，转入超净工作台上，用75％乙醇仔细拭擦茎段后无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理12min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20天；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入继代增殖培养基中进行增殖20d；增殖培养基为1/2MS+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.1mg/L；
③生根培养：当小苗长3.5cm时，转接于生根培养基中培养25d；生根培养基为WPM+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L；步骤(2)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(3)试管嫁接：选择野蔷薇为砧木，月季为接穗，在超净工作台上操作，先将长至3.5cm高的野蔷薇小苗切去所有叶片以及顶芽，并在顶部中间纵切，长度为0.4cm，然后接入生根培养基WPM+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L上；再将高4cm的月季小苗或者新芽，要求至少有2片叶片，切成2.5cm长的带茎尖的苗，将其基部切成“V”字形；最后将月季小苗基部小心插入蔷薇小苗的顶部切口中，生根时间为20d；；步骤(3)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(4)嫁接后移栽前的准备：将生根良好的小苗，真叶已长出，主根有4条，根长为3.5cm，置于室温下炼苗1d，然后除去瓶盖再炼苗2d，洗去残余培养基，在50％多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液浸泡10min再移栽，移栽后浇透定根水，之后每间早晚浇水一次，15d后即可正常生长；移栽的基质由泥炭和珍珠岩组成，二者的体积比为2:1，pH值为7.0。
实施例3：
一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，包括以下步骤：
(1)月季组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌以及初代培养：以带1个芽的月季茎段为外植体，用中性洗涤剂浸泡10min后用自来水冲干净，然后转入超净工作台工作，先用75％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；初代培养基为MS培养基；
②继代增殖：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基上进行增殖培养，继代周期16d；培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
③生根培养：当增殖出的小苗长至3.0cm时，转接于生根培养基中培养20d；生根培养基为WPM+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L；所述的WPM培养基的配制方法为：以1000mL WPM培养基为标准，称取WPM培养基固体粉末2.14g，另取硝酸钙0.56g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，蔗糖为20g/L，琼脂3.8g/L，PH为5.9；步骤(1)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(2)野蔷薇组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌及初代培养：以带1个芽的野蔷薇茎段为外植体，先用中性洗涤剂浸泡10min，并用自来水冲干净后，转入超净工作台上，用75％乙醇仔细拭擦茎段后无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理12min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入培养基中进行增殖18d；培养基为1/2MS+6-BA 1.3mg/L+IBA 0.08mg/L；
③生根培养：当小苗长至约2.5cm时，转接于生根培养基中培养20d；生根培养基为WPM+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L；步骤(2)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(3)试管嫁接：选择野蔷薇为砧木，月季为接穗，在超净工作台上操作，先将长至3.0cm高的野蔷薇小苗切去所有叶片以及顶芽，并在顶部中间纵切，长度为0.3cm，然后接入生根培养基WPM+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L上；再将高3.5cm的月季小苗或者新芽，要求至少有2片叶片，切成1.5cm长的带茎尖的苗，将其基部切成“V”字形；最后将月季小苗基部小心插入蔷薇小苗的顶部切口中；生根时间为18d；步骤(3)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h；
(4)嫁接后移栽前的准备：将生根良好的小苗，真叶已长出，主根有3条，根长为3.0cm，置于室温下炼苗1d，然后除去瓶盖再炼苗2d，洗去残余培养基，在0.5％高锰酸钾溶液浸泡10min再移栽，移栽后浇透定根水，之后每间早晚浇水一次，13d后即可正常生长；移栽的基质由泥炭和珍珠岩组成，二者的体积比为2:1，pH值为6.9。
分别采用实施例1-3中所述的嫁接方法建立月季和蔷薇的组培快繁体系，对嫁接苗的嫁接成活率、生根率、移栽成活率及生长情况等生长性能进行测定，，测定结果见表1。
表1 本发明的方法得到的月季和蔷薇嫁接苗的生长性能测定
从表1可以看出，采用本发明的方法得到的月季和蔷薇嫁接苗的嫁接成活率均大于97％，生根率均大于94％，移栽成活率均大于98％，嫁接苗的长势好，健壮。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (3)
1.一种月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)月季组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌及初代培养：以带1个芽的月季茎段为外植体，用中性洗涤剂浸泡10min后用自来水冲干净，然后转入超净工作台工作，先用75％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基中，周期15-18d；
③生根培养：当小苗长至2.0-3.5cm时，接入生根培养基中培养15-25d；
(2)野蔷薇组培苗的获得
①外植体的消毒灭菌及初代培养：以带1个芽的野蔷薇茎段为外植体，先用中性洗涤剂浸泡10min，并用自来水冲干净后，转入超净工作台上，用75％乙醇仔细拭擦茎段后无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理12min、无菌水冲洗3次，接入初代培养基培养20d；
②增殖培养：将茎段萌发的嫩芽切取下来，接入增殖培养基中进行增殖培养，周期15-20d；
③生根培养：当小苗长至约2.0-3.5cm时，接入生根培养基中培养15-25d；
(3)试管嫁接：选择野蔷薇组培苗为砧木，月季组培苗为接穗，在超净工作台上操作，先将长至2.5-3.5cm高的野蔷薇小苗切去所有叶片以及顶芽，并在顶部中间纵切，长度为0.2-0.4cm，然后接入生根培养基WPM+6-BA0.5-1.5mg/L+NAA 0.5mg/L上；再将高3-4cm的月季小苗或者新芽，要求至少有1-2片叶片，切成1.0-2.5cm长的带茎尖的苗，将其基部切成“V”字形；最后将月季小苗基部小心插入野蔷薇小苗的顶部切口中；生根时间为15-20d；
(4)嫁接后移栽前的准备：将生根良好的小苗，真叶已长出，主根有3-4条，根长为2.5-3.5cm，置于室温下炼苗1d，然后除去瓶盖再炼苗1-2d，洗去残余培养基，在50％多菌灵可湿性粉剂800-1000倍溶液或者0.5％高锰酸钾溶液浸泡10min再移栽，移栽后浇透定根水，之后每间早晚浇水一次，10-15d后即可正常生长；
步骤(1)中的初代培养基为MS培养基；
步骤(1)中的增殖培养基为MS+6-BA 1.5-3.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
步骤(1)中的生根培养基为WPM+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.5mg/L；
所述的WPM的配制方法为：以1000mL WPM培养基为标准，称取WPM培养基固体粉末2.14g，另取硝酸钙0.56g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，蔗糖为20g/L，琼脂3.5-4.0g/L，pH为5.8-6.0；
步骤(2)中的增殖培养基为1/2MS+6-BA 1.0-1.5mg/L+IBA 0.05-0.1mg/L；
步骤(2)中的生根培养基为WPM+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.5mg/L。
2.根据权利要求1所述的月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，其特征在于，步骤(1)、(2)以及(3)的培养条件为：温度28±2℃，光照时间每天12h。
3.根据权利要求1所述的月季和野蔷薇的远缘试管嫁接方法，其特征在于，步骤(4)中移栽的基质由泥炭和珍珠岩组成，二者的体积比为2:1，pH值为6.0-7.0。
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