CN116286449A - 一株能够促进蜜环菌生长的绿芽孢杆菌ysl-1-5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株能够促进蜜环菌生长的绿芽孢杆菌YSL‑1‑5及其应用，该菌株为绿芽孢杆菌属(Viridibacillus sp.)YSL‑1‑5菌株，保藏登记号为：CCTCCNo.M20221484；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地点：中国，武汉，武汉大学。本发明所述绿芽孢杆菌YSL‑1‑5菌株能够用于接种在与天麻伴栽的蜜环菌上进行批量生产优质蜜环菌菌株。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种绿芽孢杆菌菌株，该菌株可高效促进伴栽天麻生长的一种共生真菌高卢蜜环菌(Armillaria gallica)菌株的生长和产漆酶能力。
背景技术
药用植物天麻(Gastrodia elata)，是一种全真菌异养型多年生腐生草本植物。天麻在整个生活史中无根、无绿叶，本身无吸收和制造营养的器官，成熟后仅有地上花茎和地下块茎。天麻在种子萌发期主要与萌发菌共生，发芽后的原球茎在后期的生长必须与侵入其内部的蜜环菌(Armillaria sp.)建立共生关系，依靠蜜环菌分解木材以及降解菌丝来为其提供营养，用于天麻块茎形成和有性生殖以完成其36个月的生命周期。
蜜环菌作为药用植物天麻块茎后期生长不可或缺的共生真菌，二者间存在着特殊的营养关系。蜜环菌在与天麻共生期间其菌索不但是侵入天麻的部分，而且也是提供天麻生长发育营养的主要来源。蜜环菌的优劣与否，不仅表现在自身菌索和菌丝的大小、数量、产分解木质素的漆酶能力及其生命力是否旺盛等方面，也与天麻的产量和质量息息相关。
蜜环菌菌种的生物学特性与天麻品质、产量呈正相关性，因此优良的蜜环菌菌种是影响天麻品质和产量的关键。近年来，由于人们对天麻的需求量增加，野生天麻供不应求，人工种植天麻面积在不断扩大。然而，市面上的蜜环菌工程菌包在用于种植天麻的过程中，经多代无性繁殖后，会发生退化现象，导致天麻产量和质量严重降低。目前大多数麻农通过从山林里寻找野生蜜环菌来作为解决办法，然而，野生蜜环菌菌种资源有限，而且山林里采集难度大，往往无法满足天麻种植的需求。
鉴于此，探索出一种可促进蜜环菌生长和提高其生物活性的第三者微生物—促生细菌，不仅可以满足麻农对优质蜜环菌的需求，也对种植出优质天麻具有重要的现实意义。
以前的研究指出了细菌与菌根真菌间存在着共生关系，例如固氮菌，但迄今为止，关于蜜环菌内是否存在内生细菌与其伴生以及其内生细菌是否会影响蜜环菌发挥作用尚未得到较为详细的描述。
发明内容
本发明解决了背景技术中的问题，提供了一株能够促进蜜环菌生长的绿芽孢杆菌YSL-1-5及其应用。
本发明采用如下技术方案实现。
一株细菌，本发明所述的细菌为绿芽孢杆菌属(Viridibacillus sp.)YSL-1-5菌株，保藏登记号为：CCTCC No.M20221484；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地点：中国，武汉，武汉大学。保藏时间：2022年9月26日。
本发明菌株从伴栽天麻的蜜环菌菌索内分离得到。
本发明该菌株应用为将其与蜜环菌混合后做成菌包种植天麻，促进天麻生长。
本发明的菌株应用为提高蜜环菌生长速率和生物量。
本发明的菌株应用为促进蜜环菌产分解木材组织的胞外漆酶。
本发明的菌株应用为使用该菌株生产IAA。。
本发明的菌株应用方法为作为促生细菌与蜜环菌伴栽天麻。
本发明的菌株应用方法为作为生产优良蜜环菌菌包的辅助细菌。
本发明所述细菌的鉴定引物为：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3')、1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3')。
本发明的有益效果在于，本发明提供的一株能够促进蜜环菌生长的绿芽孢杆菌YSL-1-5可显著提高蜜环菌生长速率和生物量，促进蜜环菌产分解木材组织的胞外漆酶；将其与蜜环菌混合后种植天麻，促进天麻生长。
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步解释和说明。
附图说明
图1为不接种/接种菌株YSL-1-5单培养/共培养后蜜环菌生长状态结果图。(A)对照组，即不接种细菌在PDA上生长27d的蜜环菌；(B)实验组，即在PDA上生长7d后接种菌株YSL-1-5共培养20d的蜜环菌。
图2为接种菌株YSL-1-5共培养后蜜环菌菌株的菌体生物量(A)和蜜环菌漆酶酶活性(B)结果图。
图3为菌株形态观察图。(A)菌株YSL-1-5在LA平板上的背面图；(B)菌株YSL-1-5在LA平板上生长5天形成的单菌落。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施实例仅为了阐明本发明，本发明的保护范围并不局限于以下实施实例。
一株细菌，本发明所述的细菌为绿芽孢杆菌属(Viridibacillus sp.)YSL-1-5菌株，保藏登记号为：CCTCC No.M20221484；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地点：中国，武汉，武汉大学。保藏时间：2022年9月26日。
本发明菌株从伴栽天麻的蜜环菌菌索内分离得到。
本发明该菌株应用为将其与蜜环菌混合后种植天麻，促进天麻生长。
本发明的菌株应用为提高蜜环菌生长速率和生物量。
本发明的菌株应用为促进蜜环菌产分解木材组织的胞外漆酶。
本发明的菌株应用为使用该菌株生产IAA。。
本发明的菌株应用方法为作为促生细菌与蜜环菌伴栽天麻。
本发明的菌株应用方法为作为生产优良蜜环菌菌包的辅助细菌。
本发明所述细菌的鉴定引物为：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3')、1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3')。
下述实施实例中的培养基及实验试剂如下：
LB液体培养基：用于细菌的活化培养和做共培养接种的发酵液：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1000mL。
LA固体培养基：用于细菌的分离纯化培养：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂16g，蒸馏水1000mL。
PDA固体培养基：用于蜜环菌的培养：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，蒸馏水1000mL。
pH＝4.5HAc-NaAc缓冲液：18.0g NaAc，9.8mL HAc，蒸馏水定容至1000mL，用pH计校准其pH值。
5mmol/L ABTS醋酸-醋酸钠混合液：精确称取0.137g ABTS加入到50mL pH＝4.5HAc-NaAc缓冲液中，混匀，现配现用。
实施实例1、菌株的分离、鉴定和保藏
一、菌株的分离与纯化
定量取蜜环菌菌索0.1g，用自来水将菌索周围泥土冲洗干净。先用无菌水冲洗3遍，然后用2％NaClO消毒2min，再用75％酒精消毒2min，最后再用无菌水冲洗6次。用无菌滤纸蘸干菌索表面水分，用无菌剪刀剪碎后装入2mL离心管中，加入0.5mL无菌水，充分研磨成浆液，12000r/min离心1min去除大部分菌索，取上清液进行梯度稀释10-1～10-2，取每个梯度及原液100μL分别涂布在LA平板上，用平板划线法反复纯化，得到细菌单菌落。
二、菌株的鉴定
2.1形态鉴定
对菌株YSL-1-5进行形态学特征观察：如图3所示，菌株在LA培养基上呈乳白色，菌体粘稠，菌落规则呈圆形，表面光滑、湿润。
2.2分子鉴定
细菌基因组DNA的提取采用Ezup Column Bacteria Genomic DNA PurificationKit试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行提取。以基因组DNA为模板，用细菌16SrDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3')/1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，送生物公司测序。
测序结果(如下)在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及进化树分析，确定其为绿芽孢杆菌属(Viridibacillus sp.)。
AGTCGAGCGAATGATGAAGAAGCTTGCTTCTTCTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCTAGTAGATTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATTCATTTCACCTCATGGTGAGATGCTGAAAGGCGGTTTCGGCTGTCACTACTAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTACGTTAGTAACTGAACGTACCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCAATGACCGCTCTAGAGATAGAGTTTTCCCTTCGGGGACATTGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG。
三、菌株的保藏
将该菌株进行保藏，保藏登记号为：CCTCC No.M20221484；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地点：中国，武汉，武汉大学。
实施实例2、菌株促生长效应测定
一、菌株促蜜环菌生长效应
先在PDA上接种蜜环菌，25℃暗培养7d；挑取菌株YSL-1-5单菌落接种在5ml LB培养基中，28℃，180rpm培养至OD值为0.5，取100μL细菌菌液，加入到培养7d的蜜环菌PDA上，共培养20d，对照为不加任何液体处理的培养，各做5个重复。
1.1蜜环菌菌体生物量测定
待至共培养最后一天，将长有菌体的平板里的整个琼脂块取出放在(15×10cm)尼龙网袋中，沸水浴两次，直至琼脂块全部融净，用滤纸蘸干菌体上的水分，称其质量。
经称量发现，接种菌株YSL-1-5能够显著增加蜜环菌菌体生物量，如图2A所示。
1.2蜜环菌漆酶活力测定
待至共培养最后一天，定量取菌丝和菌索周围的培养基1g，加pH＝4.5的HAc-NaAc缓冲液2mL，加入1颗小钢珠用组织研磨仪在50Hz强度下破碎4min，4℃下13000rpm下离心10分钟，吸取1mL上清液，用pH＝4.5的HAc-NaAc定容至10mL，即为制备好的粗酶液。
酶活性测定体系为0.8mL：取粗酶液200μL,，再加入600μL 5mmol/L pH＝4.5的ABTS与醋酸-醋酸钠混合液，混匀后，取200μL加入96孔酶标板，每个样加3个孔，立即测定OD420值，继续放室温25℃下反应5min后再次测定OD420值，记录反应前后的OD420值，并计算ΔOD。
定义1min氧化1μmol底物ABTS，或是转化底物中1μmol相关基团所需的酶量，称为1个酶活力单位(U)，这里酶活性用E表示，单位为U/L。每个样品做3个重复，漆酶活性计算公式为
(1)式中：ε420(ABTS)＝3.6×104L/(mol·cm)；△t＝5min反应时间；△OD为5min内吸光度的变化值；V1为酶反应中反应液的总体积，0.8mL；V2为酶反应中酶液的体积，0.2mL。
经测量发现，接种菌株YSL-1-5能够显著促进蜜环菌产漆酶能力，如图2B所示。
注：显著性水平*p＜0.5，**p＜0.1，***p＜0.001
二、菌株产IAA能力测定
将菌株YSL-1-5挑取其单菌落接种于含有100mg/L L-色氨酸的LB培养基中，置于28℃、180rpm摇床上振荡培养24h。
取1mL菌悬液于1.5mL离心管中，12000rpm，离心5min，分别取500μL上清液和500μLSalkowski比色液(50mL 35％HClO4+1mL 0.5mol/L Fe Cl3)于新的1.5mL离心管中，上下混匀后，室温黑暗静置反应30min，取混合液200μL，加入至96孔酶标板，用酶标仪测定OD530值，对照标准曲线计算单位体积发酵液中的IAA含量，对照为LB培养基。
经测得该菌株能产IAA，且含量高达12.919(±0.165)mg/L。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一株细菌，其特征在于，所述的细菌为绿芽孢杆菌属(Viridibacillus sp.)YSL-1-5菌株，保藏登记号为：CCTCC No.M20221484；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地点：中国，武汉，武汉大学。
2.根据权利要求1所述细菌的应用，其特征在于，该菌株应用为将其与蜜环菌混合后做成菌包种植天麻，促进天麻生长。
3.根据权利要求1所述细菌的应用，其特征在于，该菌株应用为提高蜜环菌生长速率和生物量。
4.根据权利要求3所述细菌的应用，其特征在于，该菌株应用为促进蜜环菌产分解木材组织的胞外漆酶。
5.根据权利要求3所述细菌的应用，其特征在于，该菌株应用为使用该菌株生产IAA。
6.根据权利要求2所述细菌的应用方法，其特征在于，所述的应用方法为作为促生细菌与蜜环菌伴栽天麻。
7.根据权利要求3或4或5所述细菌的应用方法，其特征在于，所述的应用方法为作为生产优良蜜环菌菌包的辅助细菌。
8.根据权利要求1所述细菌，其特征在于，所述细菌的鉴定引物为：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3')、1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。
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