CN114774294A - 一株防病促生的木霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株防病促生的木霉及其应用，涉及一株菌株及其应用。本发明防病促生的木霉，其为木霉(Trichoderma sp.)MH，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40084。本发明木霉(Trichoderma sp.)MH菌株生长迅速、产孢量大，对天麻曲霉病(Aspergillus flavus)、苍术根腐病(Fusarium oxysporum)和细辛叶斑病(Alternaria tenuissima)多种药用植物病原真菌有竞争抑制作用；同时木霉(Trichoderma sp.)MH能够产生吲哚乙酸、嗜铁素和蛋白酶等生防活性物质，以及提高药用植物种子萌发。

Description

一株防病促生的木霉及其应用
技术领域
本发明涉及一株菌株及其应用。
背景技术
天麻、苍术和细辛作为东北主要道地药材，具有较高的药用价值和经济价值。天麻曲霉病会干扰蜜环菌的生长，侵染天麻块茎，引发天麻病害。苍术根腐病是苍术生长期较为普遍发生的一种系统侵染的土传病害。细辛叶斑病会侵染叶片并逐渐扩大，切断输导组织，造成根部腐烂枯萎。目前控制天麻霉菌病害、苍术根腐病和细辛叶斑病的主要方法仍是以化学农药为主，但化学农药存在着农药残留隐患。
发明内容
为防治天麻曲霉病、苍术根腐病、细辛叶斑病，并避免因使用化学农药而存在的农药残留隐患；本发明提供一株防病促生的木霉及其应用。
本发明防病促生的木霉，其为木霉(Trichoderma sp.)MH，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40084。
本发明防病促生的木霉在药用植物病害防治中的应用。
进一步的，所述药用植物为天麻、苍术和细辛。
进一步的，防病促生的木霉用于防治天麻曲霉病。
进一步的，防病促生的木霉用于防治苍术根腐病。
进一步的，防病促生的木霉用于防治细辛叶斑病。
本发明防病促生的木霉在药用植物促生中的应用。
进一步的，所述药用植物为板蓝根。
本发明木霉(Trichoderma sp.)MH菌株生长迅速、产孢量大，对天麻曲霉病(Aspergillus flavus)、苍术根腐病(Fusarium oxysporum)和细辛叶斑病(Alternariatenuissima)多种药用植物病原真菌有竞争抑制作用；同时木霉(Trichoderma sp.)MH能够产生吲哚乙酸、嗜铁素和蛋白酶等生防活性物质，以及提高药用植物种子萌发。
本发明木霉(Trichoderma sp.)MH菌株菌落深厚、致密，生长迅速；培养1～3天左右为白色，4～5天左右转为绿色，背面呈浅绿色，孢子梗致密丛束状；分生孢子梗直立分枝，分枝较多呈轮状排列。显微镜下观察，菌丝较细长，有隔膜；分生孢子呈圆球形表面光滑，单孢，靠粘液在小梗上聚集成球状。
木霉(Trichoderma sp.)MH为木霉菌，属于木霉属(Trichoderma)；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2022年2月24日，保藏编号为CGMCC No.40084。
附图说明
图1为木霉(Trichoderma sp.)MH在PDA平板上培养的菌落形态观察图，其中图1左侧图为培养1～3天的菌落形态观察图，图1右侧图为培养4～5天的菌落形态观察图；
图2为木霉(Trichoderma sp.)MH显微镜下菌株形态观察图；
图3是由木霉(Trichoderma sp.)MH构建的系统发育树；
图4为木霉(Trichoderma sp.)MH与天麻曲霉病的拮抗效果图，图4左侧图为对照实验图，图4右侧图为对峙培养实验图；
图5为木霉(Trichoderma sp.)MH菌株与苍术根腐病的拮抗效果图，图5左侧图为对照实验图，图5右侧图为对峙培养实验图；
图6为木霉(Trichoderma sp.)MH菌株与细辛叶斑病的拮抗效果图，图6左侧图为对照实验图，图6右侧图为对峙培养实验图；
图7为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液对天麻曲霉病的抑制效果图，图7左侧图为对照实验图，图7中间图为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液实验图，图7右侧图为多菌灵实验图；
图8为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液对苍术根腐病的抑制效果图，图8左侧图为对照实验图，图8中间图为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液实验图，图8右侧图为恶霉灵实验图；
图9为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液对细辛叶斑病的抑制效果图，图9左侧图为对照实验图，图9中间图为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液实验图，图9右侧图为代森锰锌实验图；
图10为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液和多菌灵对天麻曲霉病抑制效果的对比图；
图11为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液和恶霉灵对苍术根腐病抑制效果的对比图；
图12为木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液和代森锰锌对细辛叶斑病抑制效果的对比图；
图13为木霉(Trichoderma sp.)MH不同发酵液浓度对板蓝根种子萌发的影响图，其中CK：无菌水、YY：原液、10-2、10-4、10-6；
图14为木霉(Trichoderma sp.)MH产IAA含量时间柱形图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式防病促生的木霉，其为木霉(Trichoderma sp.)MH，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40084。
菌株筛选：采用平板稀释涂布法，称取来源于2021年6月从吉林通化的天麻根际土样10g置于90ml无菌水中，120rpm、30min后静置，取上清液进行10倍浓度梯度稀释。分别取10-1、10-2、10-3浓度的稀释液各100μL，每个梯度涂布3个PDA培养基平板上；然后倒置于28℃培养箱中培养3～7天，观察菌落的生长情况。采用灭菌的接种针将疑似木霉菌株挑出，置于新的PDA培养基中28℃培养箱中培养；待菌落长至适当大小时，刮取适量纯化，之后置于4℃冰箱中保存。
选取纯化菌株进行鉴定，其中编号为MH的菌株在PDA培养基上的菌落深厚、致密，生长迅速；培养1～3天左右为白色，4～5天左右转为绿色，背面呈浅绿色，孢子梗致密丛束状；分生孢子梗直立分枝，分枝较多呈轮状排列(如图1所示)。显微镜下观察，菌丝较细长，有隔膜；分生孢子呈圆球形表面光滑，单孢，靠粘液在小梗上聚集成球状(如图2所示)。
DNA提取与序列分析：
利用基因组提取试剂盒(Ezup Column Fungi Genomic DAN Purification Kit)提取菌株MH的基因组，进行18SrDNA的扩增。PCR引物为：ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)，ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)。PCR反应体系为25μL：Taq酶12.5μL、ITS1(10nM)1μL、ITS4(10nM)1μL、菌株MH基因1μL、无菌水补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃终延伸7min。PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，有明显的特征条带。将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到Genbank。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用MEGA5.1软件中Neihbor-Joinhing构建系统发育进化树(如图3所示)。菌株MH与木霉的同源性最高，达99％；再根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》鉴定，最终将菌株MH命名为木霉(Trichoderma sp.)MH。
实施例1
挑取PDA平板上直径为7mm的木霉(Trichoderma sp.)MH菌饼和药用植物病原真菌菌饼，分别对称接种于PDA培养基距中心2.5cm的位置，对照不接种木霉Trichoderma sp.)MH菌饼，只接种药用植物病原真菌菌饼，每个处理三次重复，28℃培养5d观察病原真菌生长情况。本实施例中药用植物病原真菌分别为天麻黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、苍术根腐病菌(Fusarium oxysporum)、细辛叶斑病菌(Alternaria tenuissima)。
对峙培养条件下，木霉(Trichoderma sp.)MH能够不同程度的抑制天麻黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、苍术根腐病菌(Fusarium oxysporum)、细辛叶斑病菌(Alternariatenuissima)的菌丝生长，抑制率分别为85.54％、84.9％、76.92％(如图4～6所示)。对峙培养实验结果表明木霉(Trichoderma sp.)MH对天麻黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、苍术根腐病菌(Fusarium oxysporum)、细辛叶斑病菌(Alternaria tenuissima)生长均有抑制作用。对峙培养过程中，木霉(Trichoderma sp.)MH生长迅速，能有效地竞争有限的空间和营养，覆盖靶标病原真菌菌落，产生大量的分生孢子。
实施例2
挑取PDA平板上直径为7mm的木霉(Trichoderma sp.)MH菌饼接种于装有150mL液体PDA的三角瓶中，于160rpm、28℃震荡摇床中发酵培养3天，得到木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液。
将市售的恶霉灵(30％)、代森锰锌(80％)和多菌灵(50％)分别进行了800倍稀释。
取100μL木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液、800倍恶霉灵(30％)稀释液、800倍代森锰锌(80％)稀释液、800倍多菌灵(50％)稀释液分别涂布于PDA平板，平皿中央分别接种直径为7mm天麻黄曲霉菌、苍术根腐病菌、细辛叶斑病菌的菌饼，以无菌水为对照，每组3个重复，28℃下恒温培养，并在第5天测量病原菌的直径，计算抑菌率(如图7～12所示)。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-病原菌菌落直径)/对照菌落直径×100％
实验证明，木霉(Trichoderma sp.)MH对天麻曲霉病、苍术根腐病和细辛叶斑病有很好的拮抗作用，木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液对天麻曲霉病的抑制效果达到88.46％，对苍术根腐病的抑制效果达到88.75％，对细辛叶斑病的抑制效果达到68.33％。
实施例3
木霉(Trichoderma sp.)MH产生物活性物质(1)蛋白酶、(2)纤维素酶、(3)嗜铁素、(4)IAA等活性。
脱脂牛奶琼脂培养基：脱脂奶粉100g/L，琼脂18g/L，pH自然，113℃灭菌20min。
嗜铁素检测培养基：铬天青S(CAS)60.5mg/L，十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)72.9mg/L，FeCl3·6H2O 2.645mg/L，NaH2PO4·2H2O 295.25mg/L，Na2HPO4·12H2O 1213.5，NH4Cl 125mg/L，KH2PO4 37.5mg/L，NaCl 62.5mg/L，琼脂18g，pH值6.8±0.1。
纤维素刚果红培养基：NaNO3 1.0g/L，Na2HPO4.7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.9g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.5g/L，酵母粉0.5g/L，酸水解酪蛋白0.5g/L，刚果红0.2g/L，纤维素粉5.0g/L，琼脂15.0，pH值7.0±0.125℃。
IAA培养基：L-色氨酸10g/L，酵母粉5g，NaCl 10g/L，pH值7.0±0.125℃，115℃灭菌20min。
灭菌牙签蘸取木霉(Trichoderma sp.)MH分别点接于脱脂牛奶琼脂培养基、嗜铁素检测培养基平板上，28℃培养3d后观察是否出现透明圈，并计算D值(透明圈直径-菌落直经)，作为检测蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素的活性水平依据。
表1
菌株 透明直径 菌落直径 D值 活性水平
蛋白酶 MH 4.2 2.6 1.6 +++
纤维素酶Cellulase MH 3.2 3.1 0.1 +
嗜铁素Siderophore MH 2.4 0.9 1.5 +++
注：++++：D≥2cm；+++：D＝1-2cm；++：D＝0.5-1cm；+：D﹤0.5cm
采用灭菌的打孔器从培养5d的木霉(Trichoderma sp.)MH平板上打取直径7mm的菌饼，接种于装有100mL PDA液体培养基的三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床振荡培养2d，得到种子液，按1％的接种量将种子液转接到装有100mL IAA液体培养基的三角瓶中，28℃、200rpm摇床振荡培养9d，获得的培养液12000rpm离心10min，取2ml上清液与4ml的Salkowski比色液(50ml 35％HClO4+1ml 0.5mol/L FeCl3)混合，黑暗放置30min，测其OD530值。对照标曲计算发酵液IAA量，测定反应液在530nm下的吸光值。结果表明当木霉(Trichoderma sp.)MH发酵至9d时分泌的IAA的含量达63.054mg/L。
结果表明：木霉(Trichoderma sp.)MH具有产蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素等生防活性物质活性，并且蛋白酶和嗜铁素的活性水平较高。同时，木霉(Trichoderma sp.)MH具有产植物生长激素IAA的含量，并且在培养至9d时分泌的IAA的含量达63.054mg/L。
实施例4
选取颗粒饱满的板蓝根种子统一用自来水冲洗后，用无菌水冲洗一次，浸泡于浓度为2％的次氯酸钠溶液消毒2h，再用无菌水反复冲洗后分别用不同浓度木霉(Trichoderma sp.)MH发酵液(10-2、10-4、10-6)浸泡24h，之后放入无菌的浸湿滤纸和培养皿中培养3-7d，每个处理设三次重复，每次重复设10粒种子。观察出当木霉(Trichodermasp.)MH发酵液浓度为10-4时芽率最高为60％。
实验结果表明，木霉(Trichoderma sp.)MH发酵滤浓度为10-4处理的板蓝根种子，显著增加了种子的发芽率。说明木霉(Trichoderma sp.)MH在适宜的稀释倍数下对板蓝根种子发芽具有促进作用。

Claims (8)

1.一株防病促生的木霉，其为木霉(Trichoderma sp.)MH，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40084。
2.如权利要求1所述防病促生的木霉在药用植物病害防治中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药用植物为天麻、苍术和细辛。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于防病促生的木霉用于防治天麻曲霉病。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于防病促生的木霉用于防治苍术根腐病。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于防病促生的木霉用于防治细辛叶斑病。
7.如权利要求1所述防病促生的木霉在药用植物促生中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述药用植物为板蓝根。
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