CN115918542A - 一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，包括如下步骤：选择当年新发的4~5月健康枝条，剪取长7~8cm的带腋芽的紫魁茶树嫩绿枝条，剪去叶片，保留腋芽附近的叶柄，消毒处理后，用无菌刀片将枝条切成带有1~2个腋芽的小段外植体，接种至腋芽萌发培养基中，待萌发培养基中的腋芽萌发到3cm左右时，将腋芽切下，基部斜切，接种至腋芽增殖培养基中，之后将长势基本一致，生长至2~3cm的丛生芽剪成1~3株单芽，接种至壮苗培养基中，选取长势好、高度5cm的无根苗，下端斜切，用无菌IBA溶液浸泡后接种到生根培养基中。本发明实现了紫魁茶树高效的快繁体系，为建立紫魁茶树工厂化育苗提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法。
背景技术
紫魁茶树是从贵州本地茶树湄潭苔茶群体种中筛选获得的茶树新品系，属于典型紫化茶树，茶苗短缺成为紫魁推广和应用的瓶颈。长期以来，紫化芽叶因制茶品欠佳而受到忽略，但随着茶叶市场需求的变化以及对紫化茶树资源的不断挖掘和创新利用，紫化茶树品种以其独具一格的茶叶品质、园林价值和保健功能得到重视，因此对紫化茶树品种的开发和品质提升的研究不断增加。
自茶树组织培养技术开展，已经从花药、茎段、胚状体等外植体中相继获得再生植株。茶树组培技术从最初的以茶树幼茎为外植体，研究茶树中咖啡碱的合成机理，到以茶树子叶、花药为材料诱导愈伤并分化得到再生植株，由于茶树材料不断多样和技术不断取得提高，在快速繁殖等方面取到了巨大的进展
快繁技术也叫离体繁殖或快速无性繁殖技术，茶树的离体快繁是指在无菌条件下，以人工控制环境作为辅助，使茶树的器官、组织或细胞在培养基中培养，短时间产生较多植株的技术。茶树快繁具有培养周期短、增殖率高和管理方便等优点，可使珍稀濒危茶种得以保存。其中腋芽培养因在后续培养中繁殖系数高，可以连续产生丛生芽，并且遗传稳定，所以通常作为首选材料。一般认为带腋芽茎段的培养中，使用MS培养基更优。目前，茶树茎段的分化研究与分子生物技术密切结合，愈伤的形成和植物生长调节剂诱发植物细胞增殖有关，而芽的分化则与光合作用、次生代谢等有关。因此，针对紫魁茶树育苗数量不足的问题，可通过组培快繁体系为途径，从而为紫魁工厂化育苗与规模化种植提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以贵州特色紫化茶树“紫魁”带腋芽茎段为外植体建立高效快速繁殖体系的方法，实现了紫魁茶树的高效快繁，为建立紫魁茶树工厂化育苗提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，包括如下步骤：
S1、带腋芽茎段消毒处理：选择当年新发的4~5月健康枝条，剪取长7~8cm的带腋芽的紫魁茶树嫩绿枝条，剪去叶片，保留腋芽附近的叶柄，消毒处理后，用无菌刀片将枝条切成带有1~2个腋芽的小段外植体；
S2、腋芽萌发：将所述的小段外植体接种至含有0.20g/L活性炭（AD，ActivatedCarbon）的腋芽萌发培养基中，该腋芽萌发培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.90mg/L IBA+1.20mg/L GA3+0.20g/L活性炭，观察记录腋芽萌发生长情况45d，发现腋芽萌发率为94.29%，且芽苗生长快速，腋芽健壮，叶片舒展；
S3、腋芽增殖：待萌发培养基中的腋芽萌发到3cm左右时，将腋芽切下，基部斜切，接种至腋芽增殖培养基中，观察记录增殖芽的长势情况；
S4、 壮苗：将长势基本一致，生长至2~3cm的丛生芽剪成1~3株单芽，接种至壮苗培养基中，观察记录植株的长势情况并统计植株株高；
S5、生根：选取长势好、高度5cm左右的无根苗，用刀片将下端斜切，用无菌IBA溶液浸泡后接种到生根培养基中；
S6、炼苗和移栽：待生根培养基中的紫魁植株的根长和根数适宜时，选择长势基本一致的无菌苗移至温室，打开瓶盖自然光条件下炼苗6d，移栽基质选择V黄壤土：V蛭石=2:1。
进一步地，所述的步骤S1中，消毒处理时，将紫魁茶树腋芽茎段在立白洗洁剂溶液中浸泡8min，期间不断轻轻搅拌，用自来水细流反复冲洗0.5h以上；再将紫魁茶树嫩绿枝条在浓度为0.50%的多菌灵溶液中浸泡10min，期间不断搅拌，浸泡后用自来水细流冲洗3h以上；然后用2.00g/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP,polyvinylpyrrolidone）浸泡20min，用75%酒精消毒2min，无菌水震荡洗涤紫魁茶树嫩绿枝条3次，再以20%次氯酸钠消毒13min，消毒后使用无菌水荡涤7次以上，防止因消毒试剂的残留对腋芽茎段造成伤害，荡涤后使用无菌吸水纸将茎段吸干，待水分干后，在超净工作台用无菌刀片将带腋芽茎段切成带有1~2个腋芽的小段外植体，小段外植体上端横切，下端斜切。
进一步地，所述的步骤S3中，腋芽增殖培养基为MS+3.50mg/L 6-BA+0.20mg/LIBA,观察记录增殖芽生长情况45d后，增殖系数达到了4.36。
进一步地，所述的步骤S4中，壮苗培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA,观察记录植株的长势情况，在第45d后发现株高为2.12cm。
进一步地，所述的步骤S5中，生根培养基为1/2MS+1.60mg/L IBA,60d后观察生根率达到68.57%，平均生根数8.67，平均根长2.23cm。
进一步地，所述的步骤S6中，60d后将无菌苗移至温室，打开瓶盖自然光条件下炼苗6d，移栽基质选择V黄壤土：V蛭石=2:1。发现移栽后生长旺盛，叶片舒展，根部继续向下延伸。
进一步地，植物组织培养各个阶段的培养条件均为光照强度为2100 lx，每日光照12 h，培养温度(23±2)℃，以上培养基pH均调整为5.80。
本发明以紫魁茶树带腋芽茎段作为材料，成功建立了茶树高效的快繁体系，可在组织培养和工厂化育苗的步骤中进行使用。
附图说明
图1为本发明实施例外植体各阶段的状态图；
图中：A.培养0 d时带腋芽茎段的萌发情况；B.培养50 d时带腋芽茎段的萌发情况；C.培养0 d时腋芽的增殖情况；D.培养45 d时腋芽的增殖情况； E.培养45 d时的壮苗情况； F-G.培养65 d后无根苗诱导生根情况； H.茶树的移栽生长情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
材料
本研究所使用的紫魁茶树材料均种植于贵州省花溪区农业生物工程研究院和贵州省湄潭县茶叶研究所的茶树种质资源圃内，本实验采摘4~5月份当年生新梢带腋芽茎段作为外植体，用于进行组织培养离体快繁的建立。
研究方法
带腋芽茎段消毒处理
剪取7~8cm长的紫魁茶树中嫩绿的枝条，尽量选择无病虫害，当年新发的4~5月健康枝条，剪去叶片，保留腋芽附近的部分叶柄；将紫魁茶树腋芽茎段在立白洗洁剂溶液中浸泡8min，期间不断轻轻搅拌，用自来水细流反复冲洗0.5h以上；再将腋芽茎段在浓度为0.50%的多菌灵溶液中浸泡10min，期间不断搅拌，浸泡后自来水细流冲洗3h以上，用2.00g/L的聚乙烯吡咯烷（PVP,polyvinylpyrrolidone）浸泡20min后，置于超净台备用，以75%消毒酒精（1、2、3min）和20%次氯酸钠（7、10、13min）两种消毒试剂设计试验共9个处理组。以75%消毒酒精消毒后，使用无菌水荡涤腋芽茎段3次，再以20%次氯酸钠消毒，消毒后使用无菌吸水纸将茎段吸干，待水分干后，在超净工作台用无菌刀片将带腋芽茎段外植体接种至含有0.20g/L活性炭（AD，Activated Carbon）的腋芽萌发培养基中，每个处理组重复3次，每次接种110个。20d后统计带腋芽茎段的污染率、存活率和死亡率用来确定最适消毒时间，计算公式如下：
污染率(%) = (污染外植体个数/外植体总接种数)×100%
存活率(%) = (有生长活力的外植体书/外植体总接种数)×100%
死亡率(%) = (无生长活力的外植体数/外植体总接种数)×100%
腋芽萌发培养基确定
将上述经过消毒处理后的带腋芽小段外植体接种至不同植物生长调节剂配比的腋芽萌发培养基中，腋芽萌发培养基是以MS为基础培养基，添加0.20g/L活性炭（AC,Activated Carbon），再添加有不同浓度的6-BA（0.00~2.80mg/L）、IBA（0.00、0.60、1.20mg/L）配比的15个处理组，每个处理组重复3次，每次接种80个。观察记录腋芽萌发的生长状况并在45d后统计腋芽的萌发数，计算出萌发率，计算公式如下。
腋芽增殖系数= 腋芽增殖的芽数/腋芽接种数
腋芽增殖培养基确定
待萌发培养基中的腋芽萌发到3cm左右时，将腋芽切下，基部斜切，接种至添加不同植物生长调节剂配比的腋芽增殖培养基中，腋芽增殖培养基是以MS为基础培养基，添加有不同浓度的6-BA（2.50mg/L、3.50mg/L）和IBA（0.00、0.20、0。50mg/L）配比的8个处理组，每个处理组重复3次，每次接种68个。观察记录增殖芽的长势情况并在50d后统计每个腋芽的增殖芽数，最终计算出增殖系数，计算公式如下。
腋芽增殖系数= 腋芽增殖的芽数/腋芽接种数
植株壮苗培养基确定
将长势基本一致，生长至2~3cm的丛生芽剪成1~3株单芽，接种至添加不同生长调节剂配比的壮苗培养基中。壮苗培养基是以MS为基础培养基，添加有不同浓度的6-BA（0.00、1.20、2.00mg/L）、IBA（0.00、0.60、0.90mg/L）和GA3（0.00、0.60、1.20mg/L）配比的7个处理组，每个处理组重复3次，每次接种120个。观察记录植株的长势情况，并在接种第0d和第45d统计植株株高，最终计算出株高差，计算公式如下：
株高差（cm）= 接种45d后平均株高-接种第0d时平均株高
植株生根培养基确定
将长势好、高度5cm左右的茶树无根苗用刀片将下端斜切，用60.00mg/L无菌IBA溶液浸泡8min，接种到不同培养基中，生根培养基是以MS、1/2MS、WPM、1/2WPM为基础培养基的4个处理组，再不添加不同浓度的IBA（0.00~1.60mg/L）的7个处理组，每个处理组重复3次，每次接种35个。观察记录根的长势，并在60d后统计植株生根数目、生根数和根长，最终计算出生根率和平均生根数，计算公式如下：
生根率(%) =（生根的外植体数/接种外植体数）×100%；
平均生根率 = 60d后生根植株生根总数/60d后生根的外植体个数；
平均根长 = 60d后生根植株根长总和/60d后生根的外植体个数。
炼苗时间和移栽基质确定
将待生根培养基中紫魁植株的根长和根数适宜时，选择长势基本一致的无菌苗进行后续的炼苗和移栽，炼苗时，将培养瓶里的无菌苗移至温室，设计不同的炼苗时间（4 d、6d、8d）和移栽基质（V黄壤土：V蛭石=2:1、V营养土：V蛭石=2:1）进行试验，共计6个处理组，每个处理组重复3次，每个处理组移栽35棵植株。炼苗过程中打开瓶盖，自然光条件下进行炼苗。炼苗完成后，将带有培养基的植株进行冲洗干净，移栽至先前配置好的移栽基质中，移栽过后第一次浇透水，用塑料薄膜罩住。观察记录植株的生长情况，并在60d后统计其存活数量，最终计算出植株的成活率，计算公式如下：
植株成活率（%）=（移栽60d成活植株数/移栽植株总数）×100%。
培养条件
在紫魁茶树离体快繁和再生培养过程中，除了胚轴愈伤分化和植株生根采用WPM位基础培养基，其余均采用MS为基础培养基。胚轴愈伤分化过程中，WPM粉为29.78g/L、蔗糖为10.00g/L、琼脂1.00g/L。生根诱导时WPM分为14.89g/L、蔗糖为5.00g/L、琼脂0.50g/L。生根诱导时MS粉为2.22g/L、植物凝胶为2.50g/L、蔗糖为15.00g/L。其他过程均是MS粉称量4.43g/L、蔗糖称量30g/L、琼脂称量8.00g/L。培养基pH值在5.80~6.00之间，光照强度为2000 lx，温度为(23±2)℃，光照时间为12 h/d。
数据及图片处理
为外植体取材和接种都随机进行；实验数据采用Microsoft Excel进行统计、整理和归纳；使用GraphPad Prism 8进行图表制作；对原始数据进行转换后，使用SPSS22.0对实验数据进行方差分析和LSD多重分析比较。
结果
消毒时间对带腋芽茎段存活率的影响
无菌材料的获得是组培快繁的建立基础和关键环节。研究表明，不同灭菌时间对带腋芽茎段的污染率、存活率及死亡率具有显著性影响（表1）。综合污染率、存活率和死亡率来考虑，当消毒处理条件为75%酒精2min，20%次氯酸钠13min时，污染程度居中为25.45%，死亡程度居中为6.67%，这时候存活率达到67.88%，为9个处理组中的最高。紫魁茶树带腋芽茎段最适消毒时间为75%酒精消毒2min、20%次氯酸钠浸泡13min。
当20%次氯酸钠消毒时间不变，随着75%酒精消毒时间的增加，茶胚污染率逐渐降低，死亡率随之增加，存活率逐渐降低，死亡率随之增加，存活率先增加后降低；消毒处理条件为75%酒精1min，20%次氯酸钠7min时，污染率最高为44.24%，死亡率最低为3.64%，而存活率也随之最低为53.82%，消毒处理条件为75%酒精3min，20%次氯酸钠13min时，污染率最低为21.21%，死亡率达到了最高为16.97%，存活率也仅为61.82%，可以看出消毒处理的时间并不是越长越好，时间过长会导致外植体死亡数增加，时间过短则会导致外植体消毒不彻底。
植物生长调节剂对腋芽萌发的影响
提高腋芽萌发效率，缩短腋芽萌发时间是外植体快速繁殖的重要前提。研究表明，不同植物生长调节剂配比对腋芽具有显著影响（表2）。15个处理组中最优为第11处理组，当腋芽萌发培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.90mg/L IBA+1.20mg/L GA3+0.20g/L活性炭时，腋芽萌发率为整个处理组中最高，为94.29%，并且45d后芽苗生长快速，腋芽健壮，叶片舒展（图A~B）。
当未空白培养基时，腋芽萌发率仅为54.76%，并且腋芽生长速度缓慢。当培养基中添加GA3后，萌发率增加到了61.90%，生长速度加快，当培养基添加6-BA和IBA后，萌发率增加到了67.14%以上，生长速度也加快，因此添加适宜的植物生长调节剂有利于腋芽萌发率增加，还能加快萌发速度：与6-BA、IBA两种组合相比较，6-BA、IBA和GA3三种生长调节剂组合后的腋芽萌发率更高；随着6-BA浓度的逐渐增加，腋芽萌发率呈先增加后降低的趋势，当6-BA浓度达到2.80mg/L时，展开的叶片出现边缘发黄的现象；随着IBA浓度的逐渐增加，腋芽萌发率呈现逐渐增加的趋势，可看出对萌发率的影响6-BA＞IBA。
植物生长调节剂对腋芽增殖的影响
母腋芽增殖的成功是茶树快繁体系建立的第一步。研究表明，不同植物生长调节剂配比对腋芽增殖具有显著影响（表3）。综合增殖系数和芽苗的长势情况来看，当培养基为MS+3.50mg/L 6-BA+0.20mg/L IBA时，45d后增殖系数达到了4.36，并且在该种条件下，芽苗在切口膨大出芽(图C~D）。研究发现：随着6-BA浓度上升，增殖系数也增大，当6-BA浓度达到3.50mg/L时，增殖系数达到了3.78以上；当6-BA浓度一定时，IBA组合相对于NAA组合来说增殖效果更好，并且0.20mg/L的IBA浓度比0.50mg/L 的IBA浓度的增殖效果更好。
植物生长调节剂对植株壮苗的影响
壮苗培养可以使植株生长更为粗壮，可为后续的生根阶段打下基础。以不同植物生长调节剂配比的培养基设计试验进行壮苗（表4）。当在MS培养基中附加2.00mg/L 6-BA和0.90mg/L IBA时，45d后株高差达到了2.12cm，为整个处理组中最高（图E），并且在该种条件下，茎粗而高，植株整体长势好，无枯萎现象，因此该培养基为最优组合。
当不添加任何生长调节剂时，株高差为1.51cm,该种条件下茎段高度能增加，但茎细而高，部分植株叶片伴有枯萎的现象；6-BA和IBA组合与6-BA和GA3组合发现，6-BA和IBA组合下45d后茎段更为粗壮，株高差距更明显，更有利于后续生根的进行；在2.00mg/L 6-BA条件下，第6和第7处理组株高差均达到1.81cm以上，因此2.00mg/L 6-BA条件是植株壮苗适宜浓度。
基础培养基对植株生根的影响
基础培养基是人工配制的含有多种营养成分的营养液，对植物的生长发育提供基础营养供给的。本实验选用MS、1/2MS、WPM和1/2WPM为基本培养基，对茶树组培苗生根培养，在不添加任何植物生长调节剂的情况下，基础培养基的选择对植株生根具有显著影响（表5）。研究发现第一组处理和第二组处理差异显著，说明半量的MS培养基比全量的MS培养基更能促进茶树组培根的生苗；1/2MS培养基中的组培苗，生根率为8.89%，为整个处理组中最高，且茶苗长势旺盛，生根速度快，因此适宜茶树组培根生根的培养基为1/2MS培养基。
植物生长调节剂对植株生根的影响
NAA和IBA是由人工合成的植物生长调节剂，二者可单独或混合施用，不仅促进细胞分裂，还能诱导根系形成和发育，研究表明，不同植物生长调节剂配比对组培苗植株生根具有显著影响（表6）。在1/2MS+1.60mg/L IBA条件下，60d后生根率为68.57%，平均生根数为8.67，平均根长2.23，为处理组中最优（图F~G），因此该培养基为最适培养基。
炼苗时间与移栽基质对植株成活率的影响
6组数据结果表示（表7），随着炼苗时间逐渐增加，成活率由高到低，炼苗时间为6d时成活率为59.42%以上，是最适宜炼苗天数。炼苗时间一定时，V黄壤土：V蛭石=2:1配比。当在V黄壤土：V蛭石=2:1配比，炼苗时间为6d时，成活率为6个处理组中最高，为65.22%，而且该种条件下植株移栽后生长旺盛，叶片舒展，根部继续向下延伸（图H），因此紫魁茶树炼苗时间为6d，移栽基质选择V黄壤土：V蛭石=2:1
注: 均值±标准偏差，表中的不同字母是在0.05水平下的显著性
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、带腋芽茎段消毒处理：选择当年新发的4~5月健康枝条，剪取长7~8cm的带腋芽的紫魁茶树嫩绿枝条，剪去叶片，保留腋芽附近的叶柄，消毒处理后，用无菌刀片将枝条切成带有1~2个腋芽的小段外植体；
S2、腋芽萌发：将所述的小段外植体接种至含有0.20g/L活性炭的腋芽萌发培养基中，该腋芽萌发培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.90mg/L IBA+1.20mg/L GA3+0.20g/L活性炭；
S3、腋芽增殖：待萌发培养基中的腋芽萌发到3cm时，将腋芽切下，基部斜切，接种至腋芽增殖培养基中，观察记录增殖芽的长势情况；
S4、 壮苗：将长势基本一致，生长至2~3cm的丛生芽剪成1~3株单芽，接种至壮苗培养基中，观察记录植株的长势情况并统计植株株高；
S5、生根：选取长势好、高度5cm的无根苗，下端斜切，用无菌IBA溶液浸泡后接种到生根培养基中；
S6、炼苗和移栽：待生根培养基中的紫魁植株的根长和根数适宜时，选择长势基本一致的无菌苗移至温室，打开瓶盖自然光条件下炼苗6d，移栽基质选择V黄壤土：V蛭石=2:1。
2.如权利要求1所述的一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：所述的步骤S1中，消毒处理时，将紫魁茶树腋芽茎段在立白洗洁剂溶液中浸泡8min，期间不断轻轻搅拌，用自来水细流反复冲洗0.5h以上；再将紫魁茶树嫩绿枝条在浓度为0.50%的多菌灵溶液中浸泡10min，期间不断搅拌，浸泡后用自来水细流冲洗3h以上；然后用2.00g/L 聚乙烯吡咯烷酮浸泡20min，用75%酒精消毒2min，无菌水震荡洗涤紫魁茶树嫩绿枝条3次，再以20%次氯酸钠消毒13min，消毒后使用无菌水荡涤7次以上，防止因消毒试剂的残留对腋芽茎段造成伤害，荡涤后使用无菌吸水纸将茎段吸干，待水分干后，在超净工作台用无菌刀片将带腋芽茎段切成带有1~2个腋芽的小段外植体，小段外植体上端横切，下端斜切。
3.如权利要求1所述的一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：所述的步骤S3中，腋芽增殖培养基为MS+3.50mg/L 6-BA+0.20mg/L IBA。
4.如权利要求1所述的一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：所述的步骤S4中，壮苗培养基为MS+2.00mg/L 6-BA+0.60mg/L IBA。
5.如权利要求1所述的一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：所述的步骤S5中，生根培养基为1/2MS+1.60mg/L IBA。
6.如权利要求1所述的一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：所述的步骤S6中，60d后将无菌苗移至温室，打开瓶盖自然光条件下炼苗6d，移栽基质选择V黄壤土：V蛭石=2:1。
7.如权利要求1所述的一种以紫魁茶树带腋芽茎段为外植体快速建立繁殖体系的方法，其特征在于：植物组织培养各个阶段的培养条件均为光照强度为2100 lx，每日光照12h，培养温度(23±2)℃，以上培养基pH均调整为5.80。
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