CN116508649A - 一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法：取一年生带芽枝条，剪去叶片后将茎段截成含腋芽的茎段，消毒后接种于启动培养基上，暗培养7‑15 d后，光照培养；将新萌发的嫩芽沿基部切下，转入增殖培养基增殖培养20‑30 d后，转入壮苗培养基壮苗培养，取壮苗培养15‑25 d的组培苗，挑选新展开幼嫩、厚实叶片为外植体，划断叶中脉至一侧叶缘；将叶片远轴面朝上，置于脱分化培养基上暗培养；经再分化培养、再生芽增殖与壮苗培养、液体生根培养及移栽，即得。该方法可应用于杜梨无菌苗快繁、工厂化育苗、根癌农杆菌介导的遗传转化技术、基因编辑技术等。

Description

一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，主要涉及在进行苹果亚科主要梨砧木品种的组培苗快繁、根癌农杆菌介导遗传转化和基因编辑研究时，以杜梨叶片、叶柄为外植体的再生体系，即具体涉及一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法。

背景技术

我国梨砧木主要来源于种子苗或扦插苗。种子苗遗传背景复杂，抗性和适应性参差不齐，扦插苗则因多年繁育导致携带病毒和病菌情况严重，严重影响梨产量和优质果率。通过建立稳定高效的组培苗快繁体系，可以实现脱毒和扩繁苗遗传背景和长势一致，便于生产管理，促进梨产业稳定快速发展。

砧木育种已成为果树品种改良的重要组成部分。我国可应用梨砧木品种较少，现阶段培育品种主要有：中矮系、青砧系等，主要通过自然群体或杂交群体筛选，筛选效率较低(姜淑苓等1991，1999，2003)，目前还未大规模应用，适应性还需进一步验证。目前我国广泛应用于梨树栽培的砧木仍以杜梨种子苗为主。

以杜梨为代表的组培苗快繁体系、子叶的再生、遗传转化体系、基因编辑体系已取得较大发展(叶宇等，2022；宋平丽等，2022；杨冠宇等，2022；杜宜楠等，2018；林静，2015)。但杜梨叶片外植体再生频率还较低(杜宜南等，2018)。我们在构建杜梨再生体系的过程中发现，要获得稳定再生频率还存在诸多未报道的问题需要解决，包括：组培苗易玻璃化或老化，杜梨叶片再生过程中因光诱导色素产生抑制脱分化与再分化，杜梨生根率低、生根炼苗周期长等。

针对无菌苗玻璃化问题，杜梨高光照能恢复为正常苗(杜宜南等，2018)，但培养过程较复杂、效率低、组培苗生长状态不稳定。我们研究过程中发现，基本培养基和激素类型和浓度是调控组培苗基部分蘖和壮苗的关键，也受温度、组培瓶内湿度等的影响，可通过改变基本培养基循环继代的方式，避免组培苗玻璃化和恢复困难，同时实现稳定的快繁和壮苗。这种方法与豆梨在MS中继代2次后转入空白培养基培养不同(王宏伟，2011)。

通过遗传转化或基因编辑的方法能加快梨砧木种质资源的进程，但目前报道中应用于遗传转化体系和基因编辑体系的主要为子叶外植体，遗传背景复杂，不同株系间存在较大差异。同时组培苗和外植体的生长状态、外植体类型、基本培养基、激素类型与浓度、培养条件等，均成为完善杜梨快繁、再生、遗传转化和基因编辑技术的关键阻碍。

目前，梨再生体系的建立方法，大部分通过调节细胞分裂素和生长素浓度，使用两因素方法筛选，具盲目性，且筛选周期长。通过多因素正交试验可以快速获得多种激素种类和组合，提高再生体系的建立效率。

脱分化阶段的暗培养与光照强度对再生频率存在影响。与其它物种此阶段的培养不同，梨脱分化阶段暗培养和暗培养时间对梨再生的影响非常大，通过暗培养时间的优化，可以提高再生频率。我们在研究中发现，过早见光后诱发产生大量红色色素物质，严重抑制愈伤团脱分化进程。为提高效率，我们改变策略，使用多因素正交试验法，以脱分化愈伤性状和见光后色素分泌情况为条件，进行激素类型和浓度筛选，实现脱分化进程向再分化的顺利转变，提高再生频率。

通过一步法或两步法，针对杜梨组培苗的生根培养已获得进展，但存在生根、炼苗周期长等问题。目前液体生根方法已应用于蓝莓(关丽霞等，2011)、红掌(郭云贵等，2012)、山新杨(王娜等，2012)、非洲菊(刘静，2016)，但针对梨组培苗的培养液生根方法还有待建立。

本发明“一种杜梨再生体系与组培苗液体生根的建立方法与应用”，通过增殖和壮苗循环继代培养稳定外植体生长状态；利用脱分化与再分化两步培养法，降低光敏色素产生，提高再生频率；建立液体生根培养方案提高生根效率、缩短生根炼苗时间，提高移栽苗存活率；构建了一套完整的稳定高效的杜梨再生体系。为加快梨遗传转化体系、基因编辑体系的建立奠定基础。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法与应用，其通过避免组培苗玻璃化和老化，提供稳定外植体，保证再生体系的稳定性。该方法可应用于杜梨无菌苗快繁、工厂化育苗、根癌农杆菌介导的遗传转化技术、基因编辑技术等。

此外，本发明所述方法通过激素和培养条件的优化，降低脱分化见光后色素抑制的影响，降低对愈伤生长的抑制，提高再生频率；同时还通过优化的液体生根培养方案，提高生根效率、缩短生根炼苗时间，提高移栽苗存活率。本发明整体目标在于构建了一套稳定高效的杜梨再生和组培苗液体生根体系。为因脱分化后光诱导色素抑制再生的培养方案提供参考。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其包括如下步骤：

1)组培苗的获得：取一年生带芽枝条，剪去叶片后将枝条剪成含腋芽的茎段，消毒后，将茎段截成带2-3个腋芽的茎段，消毒后接种于启动培养基上，暗培养7-15d后，光照培养；光照培养具体为：25-28℃，光照/黑暗为16h/8h，光照强度为20-40μmol·m²·s^-1的条件下培养；

2)组培苗的获得：待步骤1)光照培养过程中新生的腋芽长至1-3cm时沿基部切下，转入增殖培养基增殖培养20-30d后，转入壮苗培养基壮苗培养15-25d，备用(25±3℃)，用于获得叶片外植体；在实际实验过程中，为了保持继代苗的方便稳定，获得适宜再生、遗传转化的叶片材料，而进行增殖、壮苗循环继代培养，增殖培养周期为20-30d、壮苗培养周期为20-30d，通过增殖和壮苗循环继代，保持组培苗增殖和健壮；

3)外植体的获得：取壮苗培养15-25d左右的壮苗培养组培苗，挑选新展开幼嫩、厚实叶片为外植体，用解剖刀垂直叶中脉切断至一侧叶缘，备用；

4)脱分化培养：将叶片远轴面朝上，置于脱分化培养基上暗培养(25±3℃，暗培养20-30d)；

5)再分化培养：脱分化培养20-30d后，转入再分化培养基中10-20μmol·m²·s^-1弱光培养10-15d，后转入20-40μmol·m²·s^-1正常光培养至产生再生芽；培养温度25±3℃；

6)再生芽增殖与壮苗：待再生芽长至1-2cm时，此时具有完整茎结构，沿茎基部切下，置于增殖培养基培养20±2d后，转入壮苗培养基20-40μmol·m²·s^-1正常光培养；该步骤用于扩繁，培养温度25±3℃；

7)液体生根：切取壮苗培养20-30d的无菌苗，置于生根培养液中浸泡暗培养3-4d后，转湿润蛭石中覆膜培养7-10d后，揭膜培养以生根炼苗；

8)移栽：将生根苗转入草炭土中培养10-20d。

具体的，步骤1)中，一年生带芽枝条的消毒方法为：将含腋芽的茎段用肥皂水清洗5min左右后，用流水冲洗30±10min；在超净工作台上，用75％酒精消毒30±10s后，灭菌水清洗；用0.1％HgCl₂消毒10±2min后，用灭菌水冲洗3-5次，再用0.1％ HgCl₂消毒5-8min，用灭菌水冲洗3-5次，置于灭菌报纸上，剥去鳞片等，在腋芽两端0.5cm左右处切取2-3个腋芽；将带腋芽的茎段接种于启动培养基上；所述启动培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。

进一步的，步骤2)和步骤6)中，所述增殖培养基为：WPM+0.5mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8，所述壮苗培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5mg/L琼脂粉pH5.8。

具体的，步骤4)中，所述的脱分化培养基为：WPM+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+0.5mg/L IAA+0.5mg/L ZT+1mg/L FA+0.05mg/L GA₃+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。该步骤4)中，通过两轮多因素正交设计优化激素种类和浓度，比较愈伤形态、大小、颜色等性状，筛选获得具有降低脱分化培养后光诱导产生色素的最佳激素组合，降低脱分化与再分化阶段生长发育抑制，提高再生频率。

进一步的，步骤5)中，所述再分化培养基为：WPM+5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+1mg/L FA+1mg/L ZT+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。

具体的，步骤7)中，所述生根培养液为：1/2霍格兰营养液+0.2mg/L IBA，pH 7.0；覆膜培养条件为：25±3℃左右，RH为80-95％，16h/8h光照/黑暗，40-80μmol·m²·s^-1；揭膜培养条件为：25±3℃左右，RH为60±10％，16h/8h光照/黑暗，100-200μmol·m²·s^-1。

进一步的，步骤8)中，培养条件为：25±3℃，相对湿度RH为65±10％，16h/8h光照/黑暗，100-200μmol·m²·s^-1。草炭土的颗粒径≤0.5cm。

和现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过增殖和壮苗循环继代培养稳定外植体的生长状态；利用脱分化与再分化两步培养法，降低光敏色素的产生，提高再生频率；通过优化液体生根培养方案来提高生根效率、缩短生根炼苗时间，提高移栽苗的存活率；构建了一套完整的稳定高效的杜梨再生体系，为梨遗传转化体系、基因编辑体系的建立奠定基础。

附图说明

图1为本发明中杜梨组培苗的获得；

图2为再生、生根、炼苗和组培盆栽苗获得图；

图3为液体生根法快速生根炼苗图；A:生根培养液浸泡(增氧泵通气)；B：蛭石生根炼苗；A1和B1来源于壮苗培养的组培苗；A2和B2来源于增殖培养的组培苗；C为不同生根培养液培养后，在湿润蛭石中的生根状态；

图4为增殖和壮苗培养对组培苗生长的影响；A为壮苗培养阶段的组培苗状态；B为增殖培养阶段组培苗的状态；C为连续使用增殖培养基培养组培苗的状态：D为连续使用壮苗培养基的组培苗状态：

图5脱分化培养阶段不同激素组合对愈伤形态和颜色的影响；A为小而致密愈伤；B为绿色致密愈伤；C为疏松淡绿色愈伤；D为褐色颗粒愈伤；E为浅绿色颗粒愈伤；F为第一轮再生的I-14号再生芽状态。

具体实施方式

结合具体实施方式对本发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

本发明实施例所使用的MS培养基、WPM培养基、NN69培养基、BTB培养基、赤霉素(GA₃)均购自PhytoTech公司。噻苯隆(TDZ)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、吲哚-3-乙酸(IAA)均购自Sigma公司。玉米素(ZT)、叶酸(FA)均购自Duchefa公司，蔗糖、琼脂粉均购自Biosharp公司。

实施例1

一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其具体包括如下步骤：

(1)组培苗的获得

2019年，从国家梨产业技术体系郑州综合试验站资源圃中，采集生长旺盛的一年生带腋芽枝条，去除叶片后置于冰盒中暂存。用流水冲洗后，剪去叶片后将枝条剪成含有3-5个腋芽的茎段，用肥皂水清洗干净(清洗5min左右)，用流水冲洗30min。在超净工作台上，用75％(体积百分比)酒精浸泡30s后，灭菌水清洗3min。用0.1％ HgCl₂浸泡消毒10min后，用灭菌水冲洗3-5次；再用0.1％ HgCl₂浸泡消毒8min后，用灭菌水冲洗3-5次；每次1min。将茎段置于灭菌纸上，吸干表面水分，剥去鳞片等，切去茎段两端，在腋芽两端0.5cm左右处切取2-3个腋芽；将带腋芽的茎段接种于启动培养基中，25℃±3℃暗培养约10d后，进行光照培养；光照培养具体为：25-28℃，光照/黑暗为16h/8h，光照强度为20-40μmol·m²·s^-1的条件下培养。所述组培苗获得过程如图1所示。启动培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。

(2)组培苗的获得

待步骤(1)光照培养过程中新生的腋芽长至1-3cm时，沿基部切下，转入增殖培养基培养(见图1)。每瓶5-6株，每种重复处理5瓶。30d左右后基部生出3-7个幼嫩芽；将单株芽从基部切下，转入壮苗培养基培养20d左右(25±3℃)。所述增殖培养基成分为：WPM+0.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8；所述壮苗培养基成分为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。

(3)外植体的获得和脱分化培养

取步骤(2)壮苗培养20d左右的组培苗，挑选新展开幼嫩、厚实叶片为外植体试验材料，在超净工作台上，用解剖刀垂直叶中脉切断至一侧叶缘后，将叶片远轴面朝上，接种至脱分化培养基上暗培养；所述的脱分化培养基组成为：WPM+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+0.5mg/L IAA+0.5mg/L ZT+1mg/L FA+0.05mg/L GA₃+30g/L蔗糖+6.5mg/L琼脂粉pH5.8，25℃。每个组合重复3次，每个重复3瓶。

(4)再分化培养(见图2)

待步骤(3)暗培养25d左右后，转入再分化培养基中，每30d更换一次再分化培养基，培养条件为25℃，16h/8h光照/黑暗，弱光(10-20μmol·m²·s^-1)培养12d左右，后转入正常光(20-40μmol·m²·s^-1)培养至产生再生芽，所述再分化培养基为：WPM+5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+1mg/L FA+1mg/L ZT+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。每个组合重复3次，每个重复3瓶。

(5)再生芽增殖与壮苗、以及液体生根培养(见图2和图3)

待步骤(4)再生芽长至1-2cm后，此时具有完整茎结构，沿茎基部切下，转入增殖培养基培养20d左右。切取单株转入壮苗培养基培养25d左右。增殖培养基、壮苗培养基组成同上述步骤(2)。培养温度25℃。

切取壮苗培养25d的无菌苗单株转入生根培养液中浸泡暗培养3-4d，转湿润蛭石中覆膜培养7d后，揭膜培养至长出明显根系。所述生根培养液为：1/2霍格兰营养液+0.2mg/L IBA，pH 7.0；覆膜培养条件为：25±3℃左右，RH为80-95％，16h/8h光照/黑暗，40-80μmol·m²·s^-1；揭膜培养条件为：25±3℃左右，RH为60±10％，16h/8h光照/黑暗，100-200μmol·m²·s^-1。

(6)移栽获得组培盆栽苗

将长出明显根系的生根苗转入颗粒粒径≤0.5cm的草炭土中覆膜培养15d左右，后揭膜培养。培养温度为25℃左右，16h/8h光照/黑暗，RH为65-75％，100-200μmol·m²·s^-1。

实施例2

与实施例1的不同之处在于：步骤(3)中脱分化培养基成分为：WPM+0.5mg/L TDZ+0.05mg/L NAA+0.1mg/L IBA+0.3mg/L IAA+1mg/L ZT+1mg/L FA+0.05mg/L GA₃+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH5.8。相较于实施例1，本实施例步骤(3)中脱分化培养基为多因素正交试验中再生频率次高的激素组合，主要区别在于NAA和IAA的含量偏低，ZT的含量偏高。

实施例3

与实施例1不同之处在于：步骤(4)中再分化培养基成分为：1/2MS+5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+1mg/L FA+1mg/L ZT+30g/L蔗糖+6.5mg/L琼脂粉pH5.8。相较于实施例1，本实施例步骤(4)中再分化培养基的组成用1/2MS替换了WPM。

实施例4

与实施例1不同之处在于：步骤(4)中再分化培养基成分为：1/2MS+1mg/L TDZ+0.05mg/L IBA+1mg/L FA+1mg/L ZT+30g/L蔗糖+6.5mg/L琼脂粉pH5.8。相较于实施例1，本实施例步骤(4)中再分化培养基的组成用1/2MS替换了WPM，1mg/L TDZ替换了5mg/L 6-BA。

实施例5

与实施例1不同之处在于：步骤(5)中的生根培养液为1/2霍格兰营养液+0.15mg/LIBA+2mg/L IAA。相较于实施例1，本实施例步骤中的培养液激素由0.2mg/L IBA换成了0.15mg/L IBA+2mg/L IAA(见图3中C)。

对比例1

与实施例1不同在于：组培苗的获得过程中始终用增殖培养基或始终用壮苗培养基，所述增殖培养基为：WPM+0.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8；所述壮苗培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉pH5.8。

对持续壮苗培养基培养、持续增殖培养基培养和本发明增殖、壮苗组合培养的增殖阶段和壮苗阶段进行了增殖系数、植株生长状态进行了统计。持续增殖培养时，导致玻璃化情形越来越严重(图4中C)。持续壮苗培养时，苗老化且生长缓慢(图4中D)。采用本发明增殖、壮苗组合培养后，壮苗阶段长势旺盛、叶片质地厚实(图4中A)，同时获得一定数量增殖，并保持组培材料幼嫩(图4中B)。

表1增殖和壮苗循环培养对组培苗生长的影响

对比例2

以MS为基本培养基，附加不同浓度的激素组合、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉。所述激素种类和浓度采用多因素正交设计法建立初步优化方案(见表2)。25℃左右暗培养，分别在1周、2周和4周后统计愈伤形态、颜色、质地。统计了8周后再生频率、再生芽数(见表3)。用SPSS软件进行多因素线性模型分析，表明TDZ、IBA显著影响愈伤形态和再生频率，IAA、FA、ZT影响愈伤形态和再生频率。

表2脱分化培养基激素种类和浓度初步优化

表3不同激素组合对叶片脱分化影响

根据观察，愈伤见光后显色严重，抑制生长和再生芽的产生，且仅I-14号获得再生(见图5)。随后根据显著性分析结果重新设置了因素和浓度。对脱分化培养阶段的激素种类和浓度优化筛选，重新建立多因素正交设计优化组合(见表4)。取(2)壮苗培养20d左右的组培苗，挑选新展开幼嫩、厚实叶片为外植体试验材料，将叶片垂直叶中脉切断至一侧叶缘，将叶片远轴面朝上，接种至脱分化培养基上，25℃左右暗培养。每30d后更换一次新的培养基。30d左右时记录愈伤的形态、颜色、质地及见光后的反应。

表4多因素正交设计优化组合

将(3)愈伤培养30d后转入所述优化培养基中培养，60d后记录再生频率和再生芽数，获得最优的再分化培养基。所述再分化培养基为：WPM+5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+1mg/L FA+1mg/L ZT+30g/L蔗糖+6.5mg/L琼脂粉pH5.8。

对比例3

对比例3与实施例1不同，采用两步组培法进行生根培养。整个培养周期包含：诱导生根培养、空白培养和洗苗移栽，三阶段所需培养时间分别为：7d、20d和30d。而实施例1生根炼苗过程两阶段，包括生根液浸泡、转入湿润蛭石生根炼苗所需培养时间分别为：3-4d、7-10d，培养时间大大缩短，且生根壮实、不易污染。

综上，本发明通过降低脱分化阶段对光敏感，诱导色素产生引起抑制脱分化和再生化，提高再生频率；通过基本培养基、激素种类和浓度对组培苗增殖与壮苗的影响；通过多因素正交设计，优化脱分化与再分化基本培养基、激素种类和浓度的影响，建立了适用于杜梨离体叶片高效再生体系。

以上所述是本发明依据基本理论，获得的最佳培养步骤，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）组培苗的获得：取一年生带芽枝条，剪去叶片后将枝条剪成含腋芽的茎段，消毒后，将茎段截成带2-3个腋芽的茎段，接种于启动培养基上，暗培养7-15 d后，光照培养；

2）组培苗的获得：待步骤1）光照培养过程中新生的腋芽长至1-3 cm时沿基部切下，转入增殖培养基增殖培养20-30 d后，转入壮苗培养基壮苗培养15-25 d，备用；

3）外植体的获得：取壮苗培养15-25 d的壮苗培养组培苗，挑选新展开幼嫩、厚实叶片为外植体，用解剖刀垂直叶中脉切断至一侧叶缘，备用；

4）脱分化培养：将叶片远轴面朝上，置于脱分化培养基上暗培养；

5）再分化培养：脱分化培养20-30 d后，转入再分化培养基中10-20 μmol·m²·s^-1弱光培养10-15 d，后转入20-40 μmol·m²·s^-1正常光培养至产生再生芽；

6）再生芽增殖与壮苗：待再生芽长至1-2 cm时，沿茎基部切下，置于增殖培养基培养20±2 d后，转入壮苗培养基培养；

7）液体生根：切取壮苗培养20-30 d的无菌苗，置于生根培养液中暗培养3-4 d后，转湿润蛭石中覆膜培养7-10 d后，揭膜培养；

8）移栽：将生根苗转入草炭土培养。

2.如权利要求1所述杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，步骤1）中，消毒方法为：将含腋芽的茎段用肥皂水清洗后，用流水冲洗；在超净工作台上，用75%酒精消毒30±10 s后，灭菌水清洗；用0.1% HgCl₂消毒10±2 min后，用灭菌水冲洗3-5次，再用0.1% HgCl₂消毒5-8 min，用灭菌水冲洗3-5次，置于灭菌报纸上，剥去鳞片，在腋芽两端0.5 cm左右处切取2-3个腋芽；将带腋芽的茎段接种于启动培养基上；所述启动培养基为：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂粉 pH5.8。

3.如权利要求1所述杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，步骤2）和步骤6）中，所述增殖培养基为：WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5g/L琼脂粉 pH5.8，所述壮苗培养基为：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 mg/L 琼脂粉 pH5.8。

4.如权利要求1所述杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，步骤4）中，所述的脱分化培养基为：WPM+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+0.5 mg/LIAA+0.5 mg/L ZT +1 mg/L FA+0.05 mg/L GA₃+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L琼脂粉 pH5.8。

5.如权利要求1所述杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，步骤5）中，所述再分化培养基为：WPM+ 5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA+1 mg/L FA+1 mg/L ZT+30g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂粉 pH5.8。

6.如权利要求1所述杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，步骤7）中，所述生根培养液为：1/2霍格兰营养液+0.2 mg/L IBA，pH 7.0；覆膜培养条件为：25±3℃，RH为80-95%，16h/8h 光照/黑暗，40-80 μmol·m²·s^-1；揭膜培养条件为：25±3℃，RH为60±10 %，16h/8h 光照/黑暗，100-200 μmol·m²·s^-1。

7.如权利要求1所述杜梨再生与组培苗液体生根体系的建立方法，其特征在于，步骤8）中，培养条件为：25±3℃，相对湿度RH为65±10 %，16 h/8 h 光照/黑暗， 100-200 μmol·m²·s^-1。