CN116235781B - 一种含有芦荟凝胶的植物组织培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有芦荟凝胶的植物组织培养基及其制备方法，涉及植物组织培养技术领域。本发明的植物组织培养基包括诱导培养基和再生培养基，本发明以MS培养基为基础，根据不同阶段组织培养需求，在培养基中添加芦荟凝胶、生长素等活性成分，保证了愈伤组织高诱导率、植株高再生率及炼苗高成活率，显著提高了组织培养效率，为培养基的改良提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种含有芦荟凝胶的植物组织培养基及其制备方法。
背景技术
植物组织培养是取植物体的细胞、组织或者器官的一部分，于无菌环境下接种到培养基中进行培养以获得植物新个体的方法。
现有组织培养基主要以MS、B5、N6及GS培养基为代表，其中，MS培养基中钾盐、铵盐及硝酸盐的含量比较高，广泛用于植物器官、细胞及原生质体的培养；B5、N6和GS培养基中也含有较高含量的硝酸钾，比较适合豆科和十字花科植物的培养，其中GS培养基应用较为广泛。
目前，MS培养基的使用已经非常广泛，其是一种比较稳定的平衡溶液，许多植物的细胞、组织和器官在MS培养基上表现出良好的生长和发育，但尽管如此，MS培养基依然有待改良，以提升其组织培养效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有芦荟凝胶的植物组织培养基及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，实现高效率组织培养，保证较高成苗率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明技术方案之一：提供含有芦荟凝胶的植物组织培养基，包括诱导培养基和再生培养基；其中：
所述诱导培养基配方为：1/2MS+萘乙酸0.03-0.05mg/L+赤霉素GA3 0.01-0.02mg/L+氯吡脲1.0-2.0mg/L+谷氨酰胺150-200mg/L+芦荟凝胶3-6g/L+蔗糖25-30g/L+琼脂6-7g/L，PH5.8；
所述再生培养基配方为：1/2MS+芦荟凝胶8-10g/L+吲哚-3-乙酸0.05～0.5mg/L+吲哚丁酸0.01-0.03mg/L+TDZ 0.02-0.03mg/L+蛋白胨0.2-0.4g/L+甘氨酸1.5-2mg/L+蔗糖8-10g/L+琼脂6-7g/L，PH5.8。
作为本发明的进一步优选，所述再生培养基中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的质量比为3:1。
本发明技术方案之二：提供上述含有芦荟凝胶的植物组织培养基的制备方法，包括以下步骤：
以1/2MS为基础培养基，将各原料组分按照质量百分含量与之复配，得到所述含有芦荟凝胶的植物组织培养基。
本发明技术方案之三：提供上述含有芦荟凝胶的植物组织培养基在百香果和葡萄组织培养中的应用。
本发明中，组织培养所用外植体优选为植物体的茎。
本发明技术方案之四：提供一种百香果组织培养的方法，包括以下步骤：
(1)将百香果外植体接种到上述诱导培养基中，诱导培养得到愈伤组织；
(2)将所述愈伤组织接种到上述再生培养基中进行培养，得到幼苗。
作为本发明的进一步优选，步骤(1)中诱导培养的条件为：光照周期为10-12h/d，光照强度为2500-3500lx，培养温度为25-27℃，相对湿度为55-60％，每天采用紫外灯灭菌10-15min。
作为本发明的进一步优选，步骤(2)中培养的条件为：光照周期为8-12h/d，光照强度为3000-3500lx，培养温度为25-27℃，相对湿度为55-60％，每天采用紫外灯灭菌10-15min。
作为本发明的进一步优选，在培养得到幼苗后，还包括将所述幼苗进行炼苗的步骤。
本发明技术方案之五：提供一种葡萄组织培养的方法，包括以下步骤：
利用上述再生培养基对葡萄外植体进行培养，得到再生外植体。
作为本发明的进一步优选，所述培养的条件为：光照周期为10-12h/d，光照强度为2500-3500lx，培养温度为25-27℃，相对湿度为55-60％，每天采用紫外灯灭菌10-15min。
本发明发现，在芦荟凝胶添加的情况下，氯吡脲和谷氨酰胺的添加能显著改善诱导培养基的组织培养效率。
截至目前，MS培养基已经开发出许多改良形式，例如增加氮至50-60mM能够明显刺激烟草细胞的生长。本发明在MS培养基的基础上，根据不同阶段组织培养需求，在培养基中添加芦荟凝胶、生长素等活性成分，保证了愈伤组织高诱导率、植株高再生率及炼苗高成活率。
芦荟凝胶是芦荟叶内区薄壁管状细胞内生成的透明粘液，主要含有蒽醌类化合物、多糖、蛋白质、酶、氨基酸、维生素等多种活性成分，本发明根据不同阶段诱导需求，将芦荟凝胶与其他活性成分复配，添加于组织培养基中，保证了各阶段营养所需。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以MS组织培养基为基础进行了改良，得到的该组织培养基可实现愈伤组织诱导率和植株再生率高达100％，炼苗成活率显著提高，显著提高了组织培养效率，为培养基的改良提供了新的方向。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)培养基的配制:
按照1/2MS+萘乙酸0.04mg/L+赤霉素GA3 0.02mg/L+氯吡脲1.2mg/L+谷氨酰胺160mg/L+芦荟凝胶5g/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，将组分进行混合，得到诱导培养基，PH5.8；
按照1/2MS+芦荟凝胶8g/L+吲哚-3-乙酸0.06mg/L+吲哚丁酸0.02mg/L+TDZ0.03mg/L+蛋白胨0.2g/L+甘氨酸2mg/L+蔗糖8g/L+琼脂7g/L，将组分进行混合，得到再生培养基，PH5.8；
(2)外植体处理
选取生长旺盛无病虫害的百香果新枝条，去除叶片后利用清水进行清洗，之后利用0.1％的次氯酸钠溶液对枝条浸泡10min进行消毒处理，清水冲洗后，再用75％酒精浸泡灭菌15s，最后用无菌水冲洗5次。
(3)愈伤组织培养
无菌条件下，将处理后的百香果枝条切割成1cm的小段，接种于诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；培养条件为：光照周期为8h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每天采用紫外灯灭菌15min。
(4)再生培养
无菌条件下，将得到的愈伤组织接种到再生培养基中进行培养，得到幼苗。
培养条件为：光照周期为12h/d，光照强度为3200lx，培养温度为25℃，相对湿度为58％，每天采用紫外灯灭菌10min。
(5)幼苗移栽
将得到的幼苗移栽至温室中炼苗，进行常规管理。
实施例2
(1)培养基的配制:
按照1/2MS+萘乙酸0.05mg/L+赤霉素GA3 0.01mg/L+氯吡脲2.0mg/L+谷氨酰胺200mg/L+芦荟凝胶3g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，将组分进行混合，得到诱导培养基，PH5.8；
按照1/2MS+芦荟凝胶9g/L+吲哚-3-乙酸0.1mg/L+吲哚丁酸0.01mg/L+TDZ0.02mg/L+蛋白胨0.4g/L+甘氨酸1.5mg/L+蔗糖10g/L+琼脂7g/L，将组分进行混合，得到再生培养基，PH5.8；
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选取生长旺盛无病虫害的百香果新枝条，去除叶片后利用清水进行清洗，之后利用0.1％的次氯酸钠溶液对枝条浸泡10min进行消毒处理，清水冲洗后，再用75％酒精浸泡灭菌15s，最后用无菌水冲洗5次。
(3)愈伤组织培养
无菌条件下，将处理后的百香果枝条切割成1cm的小段，接种于诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；培养条件为：光照周期为12h/d，光照强度为2500lx，培养温度为27℃，相对湿度为60％，每天采用紫外灯灭菌15min。
(4)再生培养
无菌条件下，将得到的愈伤组织接种到再生培养基中进行培养，得到幼苗。
培养条件为：光照周期为10h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每天采用紫外灯灭菌15min。
(5)幼苗移栽
将得到的幼苗移栽至温室中炼苗，进行常规管理。
实施例3
(1)培养基的配制:
按照1/2MS+萘乙酸0.03mg/L+赤霉素GA3 0.015mg/L+氯吡脲1.5mg/L+谷氨酰胺180mg/L+芦荟凝胶5g/L+蔗糖28g/L+琼脂6g/L，将组分进行混合，得到诱导培养基，PH5.8；
按照1/2MS+芦荟凝胶9g/L+吲哚-3-乙酸0.25mg/L+吲哚丁酸0.03mg/L+TDZ0.025mg/L+蛋白胨0.25g/L+甘氨酸2mg/L+蔗糖8g/L+琼脂6.5g/L，将组分进行混合，得到再生培养基，PH5.8；
(2)外植体处理
选取生长旺盛无病虫害的百香果新枝条，去除叶片后利用清水进行清洗，之后利用0.1％的次氯酸钠溶液对枝条浸泡10min进行消毒处理，清水冲洗后，再用75％酒精浸泡灭菌15s，最后用无菌水冲洗5次。
(3)愈伤组织培养
无菌条件下，将处理后的百香果枝条切割成1cm的小段，接种于诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；培养条件为：光照周期为10h/d，光照强度为3000lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每天采用紫外灯灭菌15min。
(4)再生培养
无菌条件下，将得到的愈伤组织接种到再生培养基中进行培养，得到幼苗。
培养条件为：光照周期为12h/d，光照强度为3300lx，培养温度为27℃，相对湿度为60％，每天采用紫外灯灭菌15min。
(5)幼苗移栽
将得到的幼苗移栽至温室中炼苗，进行常规管理。
对比例1
与实施例1不同之处仅在于，不添加氯吡脲和谷氨酰胺。
对比例2
与实施例1不同之处仅在于，将谷氨酰胺替换为N-二甲氨基琥珀酰胺酸。
对比例3
与实施例1不同之处仅在于，不添加吲哚丁酸。
对比例4
与实施例1不同之处仅在于，将吲哚丁酸替换为吲哚-3-乙酸。
表1为本发明实施例1-3及对比例1-4的愈伤组织诱导率、植株再生率及炼苗成活率情况：
表1
其中：
愈伤组织诱导率(％)＝实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100；
植株再生率(％)＝再生植株的外植体数/接种愈伤组织总数×100；
炼苗成活率(％)＝成活苗木数/总栽种苗木数×100。
可见，本发明的组织培养基的愈伤组织诱导效果及植株再生效果极为优异，炼苗成活率高，极大的提高了组织培养效率。
本发明的再生培养基还可用于葡萄试管苗培养：
实施例4
取生长期为30天的葡萄试管苗，将茎尖及茎基部去除，按照一芽一段的原则将得到的中间茎段进行剪切，之后接种于与实施例1相同配方的再生培养基中，培养3周后的个体指标数值(平均数)见表2；
培养条件：光照周期为10h/d，光照强度为3000lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每天采用紫外灯灭菌15min。
实施例5
操作同实施例4，不同之处仅在于，接种于与实施例2相同配方的再生培养基中。
实施例6
操作同实施例4，不同之处仅在于，接种于与实施例3相同配方的再生培养基中。
对比例5
与实施例4不同之处仅在于，再生培养基中不添加吲哚丁酸。
对比例6
与实施例4不同之处仅在于，将再生培养基中的吲哚丁酸替换为吲哚-3-乙酸。
实施例4-6及对比例5-6的葡萄试管苗生长情况见表2。
表2
| 根数/条 | 根长/cm | 叶数/片 | 株高/cm | |
| 实施例4 | 12.01 | 3.52 | 4.32 | 7.62 |
| 实施例5 | 11.82 | 3.43 | 4.24 | 7.73 |
| 实施例6 | 12.13 | 3.55 | 4.35 | 7.64 |
| 对比例5 | 9.32 | 2.74 | 3.62 | 7.22 |
| 对比例6 | 9.65 | 2.93 | 3.94 | 7.44 |
可表2可以看出，本发明的植物组织再生培养基能够显著促进葡萄试管苗的根系生长，保证了试管苗更加充分的吸收营养物质，进而促进茎叶的生长，组织培养效果优异。
针对生根培养基，虽然吲哚-3-乙酸主要促进根须生长，吲哚丁酸主要促进主根生长，但本发明经实验发现，吲哚-3-乙酸与吲哚丁酸以3:1的质量比例进行复配时，生根效果最好，在葡萄生根培养中尤为明显。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.用于百香果和葡萄组织培养的含有芦荟凝胶的植物组织培养基，其特征在于，包括诱导培养基和再生培养基；其中：
所述诱导培养基配方为：1/2MS+萘乙酸0.03-0.05mg/L+赤霉素GA3 0.01-0.02mg/L+氯吡脲1.0-2.0mg/L+谷氨酰胺150-200mg/L+芦荟凝胶3-6g/L+蔗糖25-30g/L+琼脂6-7g/L，PH5.8；
所述再生培养基配方为：1/2MS+芦荟凝胶8-10g/L+吲哚-3-乙酸0.05～0.5mg/L+吲哚丁酸0.01-0.03mg/L+TDZ 0.02-0.03mg/L+蛋白胨0.2-0.4g/L+甘氨酸1.5-2mg/L+蔗糖8-10g/L+琼脂6-7g/L，PH5.8；
其中，组织培养所用外植体为茎。
2.根据权利要求1所述含有芦荟凝胶的植物组织培养基，其特征在于，所述再生培养基中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的质量比为3:1。
3.如权利要求1-2任一项所述含有芦荟凝胶的植物组织培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以1/2MS为基础培养基，将各原料组分按照质量百分含量与之复配，得到所述含有芦荟凝胶的植物组织培养基。
4.如权利要求1-2任一项所述含有芦荟凝胶的植物组织培养基在百香果和葡萄组织培养中的应用；其中，组织培养所用外植体为茎。
5.一种百香果组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将百香果外植体接种到权利要求1中所述诱导培养基中，诱导培养得到愈伤组织；
(2)将所述愈伤组织接种到权利要求1-2中任一项所述再生培养基中进行培养，得到幼苗；其中，组织培养所用外植体为茎。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中诱导培养的条件为：光照周期为10-12h/d，光照强度为2500-3500lx，培养温度为25-27℃，相对湿度为55-60％，每天采用紫外灯灭菌10-15min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中培养的条件为：光照周期为8-12h/d，光照强度为3000-3500lx，培养温度为25-27℃，相对湿度为55-60％，每天采用紫外灯灭菌10-15min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在培养得到幼苗后，还包括将所述幼苗进行炼苗的步骤。
9.一种葡萄组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求1-2任一项中所述再生培养基对葡萄外植体进行培养，得到再生外植体；其中，组织培养所用外植体为茎。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为：光照周期为10-12h/d，光照强度为2500-3500lx，培养温度为25-27℃，相对湿度为55-60％，每天采用紫外灯灭菌10-15min。
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| CN108012932A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-05-11 | 山东省农作物种质资源中心 | 一种香叶天竺葵的组织培养快速繁殖方法 |
| CN113261506A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-17 | 宁夏农林科学院农业生物技术研究中心（宁夏农业生物技术重点实验室） | 芦竹体细胞胚再生的培养基及种苗快速繁育方法 |
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