CN101180950A - 春石斛组织培养快繁方法 - Google Patents

Abstract

春石斛组织培养快繁方法，属于植物快夹繁方法技术领域。其特征在于包括以下步骤：1)选择春石斛幼茎作外植体，幼茎长度为3－5cm；2)外植体的处理；3)在无菌接种室中接种，于无菌培养室中培养10－15天；4)将存活的茎尖转接到诱导培养基上诱导不定芽或原球茎，培养30－40天后转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养2－3个月；5)继代生根培养；6)单株移栽到128孔穴盘中。上述春石斛组织培养快繁方法，不受季节约束，四季皆宜，环境容易控制，适合全国各地繁殖，解决了春石斛繁殖难、品种易退化和变异快、种苗参差不齐等问题，生产得到的春石斛种苗品质高，一致性好，具有广阔的市场前景。

Description

春石斛组织培养快繁方法

技术领域

本发明属于植物快繁方法技术领域，具体为春石斛组织培养快繁方法。

背景技术

春石斛(Dendrobium)，兰科(Orchidaceae)石斛属，多年生草本，附生性，茎丛生，有节，黄绿色，叶近革质，卵状披针形，长9-12cm，总状花序。我国有76种原生种，主要分布于云南、广东、广西、台湾、海南等地。日本、泰国、新加坡等国家石斛兰产业化规模已非常成熟，而且育种工作突出，培育出丰富的杂交品种，花色有红色、白色、黄色及各种复合色，是当前国内外市场盆栽欣赏和切花生产的高档花卉。石斛兰杂交品种主要分为三大类：高贵石斛系(Dendrobium nobile)、美丽石斛系(Dendrobium formidible)、蝴蝶石斛系(Dendrobium phaloenopsis)。高贵石斛系的花朵着生在茎的各节上，每节开花2-4朵，花梗短小只有1cm长，开花前必须经过干燥低温处理才能进行花芽分化，花期主要集中在春季，冬季叶片往往会掉落，因此又叫春石斛；美丽石斛系开花时花朵聚生在假鳞茎的上部，一般在初夏时开花，也有在冬季和不定期开花，叶背面被有黑色细毛是其特征之一；蝴蝶石斛系花梗虽自假鳞茎顶部抽出，但长达50-80cm，着花5-20朵，冬季也需要高温高湿才能正常生长，花期一般在秋冬季，为常绿不落叶类型，又叫秋石斛。春石斛传统的扦插繁殖技术成苗率低，品质差异明显，使春石斛的繁殖技术面临巨大的工厂化栽培压力。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种春石斛组织培养快繁方法的技术方案，生产得到的春石斛种苗品质高，一致性好。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选择具有较好品种特征且生长健壮的春石斛幼茎作外植体，幼茎长度为3-5cm；

2)外植体的处理：剥去幼茎外面节上的叶片，洗净后先用70-75％酒精浸润或擦洗带叶和叶鞘的幼茎，再剥去下部叶和叶鞘，留下包裹茎尖的1-2片叶，在0.1-0.15％升汞中浸泡6-8分钟，然后在8-10％的NaClo溶液中浸泡15-20分钟，最后用蒸馏水洗至无异味；

3)切除与消毒剂接触过的外植体切面，在无菌接种室中，采用刀背挤压法挤出茎尖，接种到具有初始培养基的试管中，一个试管接一个茎尖，于无菌培养室中培养10-15天；

4)诱导和增殖培养：将存活的茎尖转接到诱导培养基上诱导不定芽或原球茎，培养30-40天后转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养2-3个月；

5)继代生根培养：

a)将步骤4)中生成的不定芽切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽；

b)取步骤4)中诱导成的原球茎转接到增殖培养基中进行增殖培养30-40天，再转接到催芽培养基中催芽，生长30-40天后，将其切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽；

6)移栽：移栽前5-6天放于大棚中练苗，并提前1-2天把瓶盖全部打开或打开一半，从试管中取出的幼苗用水将附着在根上的培养基冲掉，采用纯水苔作为培养基质，单株移栽到128孔穴盘中；

上述采用的培养基分别为初始培养基1/2Ms、诱导培养基1/2Ms+BA1.0+NAA0.5、增殖培养基MS+BA1.5+NAA0.5+CH1g/L+5％香蕉、生根培养基1/2MS+IBA0.3mg/L+10％香蕉、催芽培养基1/2Ms+BA0.2+NAA0.1；所述培养基的pH值为5.4-5.8，并在121-125℃、1.10-1.15Pa的条件下灭菌20-25分钟。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗二周内采用喷雾保持叶面湿润状态，二周后按干透湿透的原则浇水。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗第一周进行70％遮光处理，一周以后进行50％遮光处理。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗20-25天后每周施一次肥，前期肥料选择花宝5号(3000*)或花多多N∶P∶K＝9∶45∶15(3000*)进行叶面喷洒促使长根，后期选择花多多N∶P∶K＝20∶20∶20(3000*)进行叶面喷洒或根部浇灌。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于灭菌后的培养基放入准备区备用，准备区每天用紫外灯消毒至少2小时。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于在0.1-0.15％升汞中加2-3滴Tween 20。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于无菌接种室在接种前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，20分钟后关上，再过10分钟进行接种。

所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于无菌培养室使用前一个星期用40％甲醛溶液每平方10ml进行培养室薰蒸，关闭三天后开门通风一天，再用紫外灯消毒6小时。

所述的升汞可由华东医药股份有限公司器材化剂分公司购得；Tween20可由温州清明化工有限公司购得；NaClo可由华东医药股份有限公司器材化剂分公司购得；花宝5号可由美国Scotts公司购得；花多多N∶P∶K为20-20-20，可由美国Scotts公司购得；水苔可由西洋园艺资材(广州)有限公司购得。

采用的培养基中的MS配方中的药品可由浙江省华东医药股份有限公司化剂分公司购得；BA(6-苄基腺嘌呤)可由上海伯奥生物科技公司购得，NAA(1-萘乙酸)、IBA(3-吲哚丁酸)可由国药集团化学试剂有限公司购得，CH(水解酪蛋白)可由sigma公司购得；MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，在此不再赘述。

上述春石斛组织培养快繁方法，不受季节约束，四季皆宜，环境容易控制，适合全国各地繁殖，解决了春石斛繁殖难、品种易退化和变异快、种苗参差不齐等问题，生产得到的春石斛种苗品质高，一致性好，具有广阔的市场前景。

本专利申请文件中涉及的含量除另有说明外，其余均为重量百分含量。

具体实施方式

春石斛组织培养快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选择具有较好品种特征且生长健壮的春石斛茎尖作外植体，幼茎长度为3-5cm。

2)外植体的处理：剥去幼茎外面节上的叶片，洗净后先用70-75％酒精浸润或擦洗带叶和叶鞘的幼茎，再剥去下部叶和叶鞘，留下包裹茎尖的1-2片叶，在0.1-0.15％升汞(加2-3滴Tween 20)中浸泡6-8分钟，然后在8-10％的NaClo溶液中浸泡15-20分钟，最后用蒸馏水洗4-5次至无异味。

3)切除与消毒剂接触过的外植体切面，刀片一定要保持锋利，在无菌接种室中，采用刀背挤压法挤出茎尖，接种到具有初始培养基的试管中，一个试管接一个茎尖，于无菌培养室中培养10-15天，芽点转绿且无污染。

无菌接种室在接种前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，20分钟后关上，再过10分钟进行接种；接种用具在121-125℃、1.1-1.15Pa条件下灭菌25分钟，每接完一个母瓶需要更换一个接种盘，器械需要在300℃的高温灭菌器中消毒15-20秒种，员工的手需要用70-75％的乙醇进行擦洗。

无菌培养室使用前一个星期用40％甲醛溶液每平方10ml进行培养室薰蒸，关闭三天后开门通风一天，再用紫外灯消毒6小时，常用的培养室每天进行一次紫外灯消毒，时间控制在20-30分钟。

4)诱导和增殖培养：将存活的茎尖转接到诱导培养基上诱导不定芽或原球茎，培养30-40天后转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养2-3个月，倍数可达到3倍以上。

5)继代生根培养：

a)将步骤4)中生成的不定芽切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽。

b)取步骤4)中诱导成的原球茎转接到增殖培养基中进行增殖培养30-40天，再转接到催芽培养基中催芽，生长30-40天后，将其切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽。

6)移栽：移栽前5-6天放于大棚中练苗，并提前1-2天把瓶盖全部打开或打开一半，从试管中取出的幼苗用水将附着在根上的培养基冲掉，采用纯水苔作为培养基质，单株移栽到128孔穴盘中。

7)移栽苗第一周进行70％遮光处理，一周以后进行50％遮光处理。移栽苗20-25天后每周施一次肥，前期肥料选择花宝5号(3000*)或花多多N∶P∶K＝9∶45∶15(3000*)进行叶面喷洒促使长根，后期选择花多多N∶P∶K＝20∶20∶20(3000*)进行叶面喷洒或根部浇灌，移栽成活率达到93％以上。

上述采用的培养基分别为初始培养基1/2Ms、诱导培养基1/2Ms+BA1.0+NAA0.5、增殖培养基MS+BA1.5+NAA0.5+CH1g/L+5％香蕉、生根培养基1/2MS+IBA0.3mg/L+10％香蕉、催芽培养基1/2Ms+BA0.2+NAA0.1；所述培养基的pH值为5.4-5.8，并在121-125℃、1.10-1.15Pa的条件下灭菌20-25分钟，灭菌后的培养基放入准备区备用，准备区每天用紫外灯消毒至少2小时。培养基用自动分装机进行分装，初始培养基、增殖培养基每瓶装110ml，生根培养基每瓶装130ml。培养瓶在洗涤液中进行浸泡，用常规洗瓶剂进行洗涤，标准为瓶壁干净透明，瓶口向下倒放时没有成股水流下。移栽苗二周内采用喷雾保持叶面湿润状态，二周后按干透湿透的原则浇水。

病虫害防治：病害主要为炭疽病，以加强通风来预防，杜绝病株的进入，清除附近的糜烂物，一般不宜用药；虫害主要为红蜘蛛，通过清除周边环境的杂草和装防虫网来预防，或喷800-1000倍的低毒杀螨剂防治。

Claims (8)

1.春石斛组织培养快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选择具有较好品种特征且生长健壮的春石斛幼茎作外植体，幼茎长度为3-5cm；

2)外植体的处理：剥去幼茎外面节上的叶片，洗净后先用70-75％酒精浸润或擦洗带叶和叶鞘的幼茎，再剥去下部叶和叶鞘，留下包裹茎尖的1-2片叶，在0.1-0.15％升汞中浸泡6-8分钟，然后在8-10％的NaClo溶液中浸泡15-20分钟，最后用蒸馏水洗至无异味；

3)切除与消毒剂接触过的外植体切面，在无菌接种室中，采用刀背挤压法挤出茎尖，接种到具有初始培养基的试管中，一个试管接一个茎尖，于无菌培养室中培养10-15天；

4)诱导和增殖培养：将存活的茎尖转接到诱导培养基上诱导不定芽或原球茎，培养30-40天后转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养2-3个月；

5)继代生根培养：

a)将步骤4)中生成的不定芽切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽；

b)取步骤4)中诱导成的原球茎转接到增殖培养基中进行增殖培养30-40天，再转接到催芽培养基中催芽，生长30-40天后，将其切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽；

6)移栽：移栽前5-6天放于大棚中练苗，并提前1-2天把瓶盖全部打开或打开一半，从试管中取出的幼苗用水将附着在根上的培养基冲掉，采用纯水苔作为培养基质，单株移栽到128孔穴盘中；

上述采用的培养基分别为初始培养基1/2Ms、诱导培养基1/2Ms+BA1.0+NAA0.5、增殖培养基MS+BA1.5+NAA0.5+CH1g/L+5％香蕉、生根培养基1/2MS+IBA0.3mg/L+10％香蕉、催芽培养基1/2Ms+BA0.2+NAA0.1；所述培养基的pH值为5.4-5.8，并在121-125℃、1.10-1.15Pa的条件下灭菌20-25分钟。

2.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗二周内采用喷雾保持叶面湿润状态，二周后按干透湿透的原则浇水。

3.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗第一周进行70％遮光处理，一周以后进行50％遮光处理。

4.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗20-25天后每周施一次肥，前期肥料选择花宝5号(3000*)或花多多N∶P∶K＝9∶45∶15(3000*)进行叶面喷洒促使长根，后期选择花多多N∶P∶K＝20∶20∶20(3000*)进行叶面喷洒或根部浇灌。

5.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于灭菌后的培养基放入准备区备用，准备区每天用紫外灯消毒至少2小时。

6.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于在0.1-0.15％升汞中加2-3滴Tween 20。

7.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于无菌接种室在接种前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，20分钟后关上，再过10分钟进行接种。

8.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于无菌培养室使用前一个星期用40％甲醛溶液每平方10ml进行培养室薰蒸，关闭三天后开门通风一天，再用紫外灯消毒6小时。