CN111955347A - 一种石斛继代增殖培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种石斛继代增殖培养基及其制备方法，石斛继代增殖培养基包括以下重量配比的原料：花宝1号；花宝2号；硫酸亚铁；乙二胺四乙二钠盐；生长调节剂；盐酸硫胺素；盐酸吡哆辛；烟酸；肌醇；营养剂；水解酪蛋白；糖类和凝固剂。本发明培养基的成苗生产周期短，繁殖速度可达5～7倍，成苗率至少达到95％，90天移栽存活率至少达到98％，成本较低，该石斛继代增殖培养基培养出来的牙苗健壮、翠绿、苗整齐，有大量根产生，生长情况较佳。

Description

一种石斛继代增殖培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种石斛继代增殖培养基及其制备方法。

背景技术

石斛为兰科植物，常见品种有金钗石斛、铁皮石斛、和流苏石斛等。大部分品种具有益胃生津，滋阴清热之功效。例如铁皮石斛，被誉为“中华十大仙草”常用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺等。

兰科植物多为附生草本植物，长于高海拔的山地半阴湿的岩石上，并常与苔藓植物伴生，喜温暖。由于生长条件特殊和分布局限，以及长期采挖，很多石斛的自然资源濒临枯竭，更由于市场需求增加，供应紧缺，供需严重失衡。而利用组织培养技术可以有效扩大石斛的种植规模，以提高石斛的产量、品质，满足人们对石斛日益増长的需求。

石斛的组织培养技术影响因素繁多，包括有外植体的选择、培养基的种类、天然有机物的添加、培养条件和接种方法等等。组织培养技术中外植体的选择极很重要的，研究发现石斛的种子、茎尖、根尖、无菌苗的带芽茎段等都能够很好的分化、发育能力。选择优势的植物组织可以保持母株优良的性状，并且可以缩短组培时间。

近年来国内外对铁皮石斛的组织培养的培养基进行了深入的研究，这使得铁皮石斛发展规模化、人工育种成为可能。例如，中国专利CN103181316A公开了一种野生铁皮石斛的前体培养基，该培养基包括B5培养基、萘乙酸、吲哚乙酸、香蕉提取物、马铃薯提取物、蔗糖、琼脂和钾，通过对铁皮石斛培养基的调节，促进铁皮石斛新品种试管苗增加次生代谢物质的有效积累；中国专利CN104429975A公开了一种铁皮石斛组培苗培养基，包括琼脂、白糖、活性炭、香蕉、自制有机液肥、灭菌剂等组分，对培育出来的苗株粗度、高度、叶片数均有增加且对根系有良好的促进作用；

但是，这些培养基都没有在继代增殖阶段的，而且在培养基中添加的有机添加物也比较少，而且都是专一为铁皮石斛设计，只能用于铁皮石斛的组织培养。因此，有必要提供一种生长周期短、繁殖快速、移栽存活率高、成本低的能用于石斛类组织培养继代增殖广普培养基及其制备方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种石斛继代增殖培养基，生产周期短，繁殖速度可达5～7倍，成苗率至少达到95％，90天移栽存活率至少达到98％，成本较低，该石斛继代增殖培养基培养出来的牙苗健壮、翠绿、苗整齐，有大量根产生，生长情况较佳，并且可用于石斛属大部分种。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种石斛继代增殖培养基，包括以下重生长调节量配比的原料：

花宝1号600～1200mg/L；花宝2号600～1200mg/L；硫酸亚铁10～40mg/L；乙二胺四乙二钠盐20～50mg/L；生长调节剂1～4mg/L；盐酸硫胺素0.05～0.2mg/L；盐酸吡哆辛0.2～1mg/L；烟酸0.2～1mg/L；肌醇80～120mg/L；营养剂40～80mg/L；水解酪蛋白0.1～0.5mg/L；糖类10～40mg/L和凝固剂5～10mg/L。

优选地，石斛继代增殖培养基包括以下重量配比的原料：

花宝1号800～1200mg/L；花宝2号800～1200mg/L；硫酸亚铁20～40mg/L；乙二胺四乙二钠盐30～50mg/L；生长调节剂1～3mg/L；盐酸硫胺素0.05～0.15mg/L；盐酸吡哆辛0.2～0.8mg/L；烟酸0.2～0.7mg/L；肌醇90～120mg/L；营养剂40～70mg/L；水解酪蛋白0.1～0.4mg/L；糖类10～30mg/L和凝固剂6～10mg/L。

优选地，所述生长调节剂包括甘氨酸和奈乙酸。

更优选地，所述甘氨酸和奈乙酸的质量比为(5～9):1。

优选地，所述营养剂包括苹果泥、香蕉泥和蛋白胨。

更优选地，所述苹果泥、香蕉泥和蛋白胨的质量比为(8～13):(31～66):1。

优选地，所述石斛继代增殖培养基的pH值为4.2～6.3。

优选地，所述糖类为蔗糖或葡萄糖。

本发明的目的之二是提供一种石斛继代增殖培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的生长调节剂、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、糖类、凝固剂、水解酪蛋白和营养剂搅拌混合，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至40～60℃，不断搅拌，直到糖类和凝固剂完全溶解，调节pH值为4.2～6.3，得石斛继代增殖培养基。

优选地，所述步骤S2的搅拌速度为800～1200rpm/min，搅拌时间为20～40min。

目前市场上，常用的基本培养基有MS、KC、B5、N6、1/2MS、改良N6等，而在基础培养基中添加不同种类的植物激素和有机物是石斛培养基的关键。在石斛组织快繁过程中，培养基的pH值、自身因素、光照、温度、外界环境、接种方式等有影响着石斛的培养，因此，本发明人经过不断的筛选和优化，创造性的提出了一种石斛继代增殖培养基，将花宝1号、花宝2号和铁盐的基础上添加烟酸、肌醇和水解酪蛋白复配，再搭配盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、生长调节剂和营养剂组成该培养基的组成成分，减少石斛继代培养成苗的生产周期，与市场常规培养基生长周期90～100天相比，本发明培养基培养成苗的生长周期为70～80天，缩短了培养周期，本发明培养基成苗的繁殖速度达5～7倍，较市场常规培养基繁殖速度3～4倍效果较佳；并且成苗率至少达到95％，90天移栽存活率至少达到98％，该石斛继代增殖培养基培养出来的牙苗健壮、翠绿、苗整齐，有大量根产生，生长情况佳。

在本发明中，添加甘氨酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆辛提供植物生长发育所需要的氨基酸和维生素，搭配奈乙酸用于诱导、形成愈伤组织以及诱导根的分化，本发明还可以用吲哚乙酸、玉米素、脱落酸以及赤霉素等成分去诱导、形成愈伤组织以及诱导根的分化。

在组培过程中，添加苹果泥、香蕉泥等天然有机物，能够为外植体提供一些必要的微量营养成分，可以促进石斛原球茎的增殖和分化。

在本发明中，该继代增殖培养基可以培养多种石斛类植物，包括铁皮石斛、金钗石斛、秋石斛、多花石斛等。

综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

本发明提供了一种石斛继代增殖培养基及其制备方法，配方简单，通过改良基础培养基、添加有机物、激素等获得高效的继代增殖组织培养基，生产周期短，繁殖速度可达5～7倍，成苗率至少达到95％，90天移栽存活率至少达到98％，该石斛继代增殖培养基培养出来的牙苗健壮、翠绿、苗整齐，有大量根产生，生长情况较佳。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

以下实施例及对比例中，部分的原料及厂家如表1所示：

表1

实施例1

一种石斛继代增殖培养基，包括以下重量配比的原料：

花宝1号600mg/L；花宝2号600mg/L；硫酸亚铁10mg/L；乙二胺四乙二钠盐20mg/L；甘氨酸0.9mg/L、奈乙酸0.1mg/L；盐酸硫胺素0.05mg/L；盐酸吡哆辛0.2mg/L；烟酸0.2mg/L；肌醇80mg/L；苹果泥6.5mg/L；香蕉泥33mg/L；蛋白胨0.5mg/L；水解酪蛋白0.1mg/L；蔗糖10mg/L和卡拉胶5mg/L。

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，搅拌速度为400rpm/min，搅拌时间为20min，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的甘氨酸、奈乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、蔗糖、卡拉胶、水解酪蛋白、苹果泥、香蕉泥和蛋白胨搅拌混合，搅拌速度为1200rpm/min，搅拌时间为20min，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至40℃，不断搅拌，直到蔗糖和卡拉胶完全溶解，调节pH值为4.2，得石斛继代增殖培养基，将培养基分装至培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上，然后放入高压灭菌锅进行消毒灭菌。

实施例2

一种石斛继代增殖培养基，包括以下重量配比的原料：

花宝1号800mg/L；花宝2号1000mg/L；硫酸亚铁20mg/L；乙二胺四乙二钠盐30mg/L；甘氨酸1.7mg/L、奈乙酸0.3mg/L；盐酸硫胺素0.1mg/L；盐酸吡哆辛0.5mg/L；烟酸0.4mg/L；肌醇90mg/L；苹果泥9mg/L；香蕉泥40mg/L；蛋白胨1mg/L；水解酪蛋白0.2mg/L；蔗糖20mg/L和卡拉胶6mg/L。

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，搅拌速度为500rpm/min，搅拌时间为30min，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的甘氨酸、奈乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、蔗糖、卡拉胶、水解酪蛋白、苹果泥、香蕉泥和蛋白胨搅拌混合，搅拌速度为1000rpm/min，搅拌时间为40min，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至50℃，不断搅拌，直到糖类和凝固剂完全溶解，调节pH值为4.6，得石斛继代增殖培养基，将培养基分装至培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上，然后放入高压灭菌锅进行消毒灭菌。

实施例3

一种石斛继代增殖培养基，包括以下重量配比的原料：

花宝1号1000mg/L；花宝2号1200mg/L；硫酸亚铁30mg/L；乙二胺四乙二钠盐40mg/L；甘氨酸2.5mg/L、奈乙酸0.5mg/L；盐酸硫胺素0.15mg/L；盐酸吡哆辛0.8mg/L；烟酸0.7mg/L；肌醇100mg/L；苹果泥12mg/L；香蕉泥56.5mg/L；蛋白胨1.5mg/L；水解酪蛋白0.5mg/L；蔗糖30mg/L和卡拉胶8mg/L。

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，搅拌速度为550rpm/min，搅拌时间为35min，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的甘氨酸、奈乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、蔗糖、卡拉胶、水解酪蛋白、苹果泥、香蕉泥和蛋白胨搅拌混合，搅拌速度为800rpm/min，搅拌时间为40min，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至55℃，不断搅拌，直到蔗糖和卡拉胶完全溶解，调节pH值为5.9，得石斛继代增殖培养基，将培养基分装至培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上，然后放入高压灭菌锅进行消毒灭菌。

实施例4

一种石斛继代增殖培养基，包括以下重量配比的原料：

花宝1号1200mg/L；花宝2号800mg/L；硫酸亚铁40mg/L；乙二胺四乙二钠盐50mg/L；甘氨酸3.2mg/L、奈乙酸0.8mg/L；盐酸硫胺素0.2mg/L；盐酸吡哆辛1mg/L；烟酸1mg/L；肌醇120mg/L；苹果泥16mg/L；香蕉泥62mg/L；蛋白胨2mg/L；水解酪蛋白0.3mg/L；蔗糖40mg/L和卡拉胶10mg/L。

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，搅拌速度为600rpm/min，搅拌时间为40min，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的甘氨酸、奈乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、蔗糖、卡拉胶、水解酪蛋白、苹果泥、香蕉泥和蛋白胨搅拌混合，搅拌速度为1200rpm/min，搅拌时间为20～40min，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至60℃，不断搅拌，直到蔗糖和卡拉胶完全溶解，调节pH值为6.3，得石斛继代增殖培养基，将培养基分装至培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上，然后放入高压灭菌锅进行消毒灭菌。

实施例5

一种石斛继代增殖培养基，包括以下重量配比的原料：

花宝1号1000mg/L；花宝2号1000mg/L；硫酸亚铁27.8mg/L；乙二胺四乙二钠盐37.3mg/L；甘氨酸2mg/L、奈乙酸0.3mg/L；盐酸硫胺素0.1mg/L；盐酸吡哆辛0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L；苹果泥10mg/L；香蕉泥50mg/L；蛋白胨1mg/L；水解酪蛋白0.2mg/L；蔗糖20mg/L和卡拉胶7mg/L。

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，搅拌速度为550rpm/min，搅拌时间为35min，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的甘氨酸、奈乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、蔗糖、卡拉胶、水解酪蛋白、苹果泥、香蕉泥和蛋白胨搅拌混合，搅拌速度为950rpm/min，搅拌时间为25min，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至60℃，不断搅拌，直到蔗糖和卡拉胶完全溶解，调节pH值为6.1，得石斛继代增殖培养基，将培养基分装至培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上，然后放入高压灭菌锅进行消毒灭菌。

实施例6

一种石斛切割平铺接种方法：包括以下步骤：

1、用无菌纱布蘸消毒酒精抹净工作台上，摆放石斛继代增殖培养基，每行之间留一定的间隔以利消毒。在台上备好红外线消毒炉、酒精灯、经高温湿热消毒过的碟子、镊子、手术刀、消毒纱布等及石斛增殖继代的无菌材料。

2、准备好后，关闭超净工作台风机、照明灯，开台上的紫外灯消毒20分钟。同时开接种室和过渡室的紫外灯对室内进行全面消毒。消毒结束后开超净工作台风机通风15分钟。

3、准备工作完成后，接种人员开始操作。扭开瓶盖，把瓶颈螺纹部位放在酒精灯火焰上转2～3个圈。石斛材料夹出后，放进无菌碟子中。一手拿镊子，一手拿手术刀，把已放进碟子的石斛材料单芽一个个剥开后，用镊子挟住单芽尽快接种到新的培养瓶中。接种的石斛需要平铺在培养基表面上并与培养基要接触良好。接种完把瓶口螺纹再烧一下，旋紧瓶盖。

4、接种时双手避免在碟子上方晃动；每瓶材料接种后，镊子、手术刀用消毒纱布擦干净后，插入红外线消毒炉进行灭菌，以防止污染；多套镊子和刀交替使用，以避免工具烧得太热烫伤材料；每接种一瓶石斛需更换一个碟子，接种4-5瓶后，要用消毒酒精擦手一次；在操作中，要养成左手拿左边的东西，右手取右边的东西的习惯，尽量避免扰乱超净工作台上的气流；操作人员的手不能接触材料、镊子、刀的前端部位，操作动作要轻，速度要快，禁止谈话。

5、接种完成后，把瓶子材料分类放在车子上，接好种的瓶子要写上种类和接种日期，然后用消毒纱布蘸消毒酒精把台面擦干净，关机切断电源。

对比例1

与实施例5相同，区别在于，石斛继代增殖培养基不含有烟酸和水解酪蛋白，其余原料及参数与实施例5相同。

对比例2

与实施例5相同，区别在于，石斛继代增殖培养基不含有烟酸，其余原料及参数与实施例5相同。

对比例3

与实施例5相同，区别在于，石斛继代增殖培养基不含有水解酪蛋白，其余原料及参数与实施例5相同。

对比例4

与实施例5相同，区别在于，石斛继代增殖培养基不含有苹果泥，其余原料及参数与实施例5相同。

试验例、对比试验

原料：实施例1～5及对比例1～4配制得到的石斛继代增殖培养基；使用MS+6BA+NAA+马铃薯泥+香蕉泥配制得到的对照组；

试验方法：采用实施例6的接种方法分别将相同的石斛材料单芽接种于实施例1～5及对比例1～4配制的石斛继代增殖培养基中进行培养，光照时间12h/d，光照强度1600lux，培养室温度控制在25℃左右，培养3个月后，记录石斛的生长周期、繁殖速度、芽苗生长情况、成苗率及90天移栽存活率。

其中石斛的生长周期为从接种开始到相应的培养基营养物质消耗已无法满足芽苗生长发育需要，芽苗开始变黄枯死时所需时间；

计算平均值。结果见表2。

表2

根据表2的数据可知，由本发明实施例1～5配制得到的石斛继代增殖培养基培养得到的芽苗健壮正常、颜色翠绿、芽苗整齐、且有大量根产生，根的形态正常；与对照组培养基相比，对照组培养基培养得到的芽苗正常、淡绿、参差不齐、有假鳞茎团产生，有少量根产生。本发明实施例1～5配制得到的石斛继代增殖培养基成苗的繁殖速度达5～7倍，成苗的生长周期为70～80天，缩短了培养周期，成苗率至少达到95％，90天移栽存活率至少达到98％，其中以实施例5的继代增殖培养基为最佳实施例培养基。

与实施例5相比，对比例1(缺少烟酸和水解酪蛋白)配制的培养基成苗的周期较长，对比例1的成苗繁殖速度下降，成苗率和90天移栽存活率均下降，但是仍然比对照组的生长周期短，比对照组的成苗繁殖速度、成苗率和90天移栽存活率高，说明烟酸和水解酪蛋白对石斛继代培养成苗生长周期、繁殖速度、成苗率和移栽存活率影响较大。

对比例2(缺少烟酸)或对比例3(缺少水解酪蛋白)配制的石斛继代增殖培养基对成苗的影响不及对比例1的影响大，说明烟酸和水解酪蛋白复配，可以缩短成苗的培养周期，提高成苗率和90天移栽存活率。

对比例4的培养基缺少苹果泥，与实施例5的培养基相比，成苗率和移栽存活率不及实施例5；本发明将花宝1号、花宝2号和铁盐的基础上添加烟酸、肌醇和水解酪蛋白复配，再搭配盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、生长调节剂和营养剂组成该培养基的组成成分，减少石斛继代培养成苗的生产周期，与市场常规培养基生长周期90～100天相比，本发明培养基培养成苗的生长周期为70～80天，缩短了培养周期，本发明培养基，较市场常规培养基繁殖速度3～4倍效果较佳；并且，该石斛继代增殖培养基培养出来的芽苗健壮、翠绿、苗整齐，有大量根产生，生长情况佳。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种石斛继代增殖培养基，其特征在于，包括以下重量配比的原料：

花宝1号600～1200mg/L；花宝2号600～1200mg/L；硫酸亚铁10～40mg/L；乙二胺四乙二钠盐20～50mg/L；生长调节剂1～4mg/L；盐酸硫胺素0.05～0.2mg/L；盐酸吡哆辛0.2～1mg/L；烟酸0.2～1mg/L；肌醇80～120mg/L；营养剂40～80mg/L；水解酪蛋白0.1～0.5mg/L；糖类10～40mg/L和凝固剂5～10mg/L。

2.根据权利要求1所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，包括以下重量配比的原料：

花宝1号800～1200mg/L；花宝2号800～1200mg/L；硫酸亚铁20～40mg/L；乙二胺四乙二钠盐30～50mg/L；生长调节剂1～3mg/L；盐酸硫胺素0.05～0.15mg/L；盐酸吡哆辛0.2～0.8mg/L；烟酸0.2～0.7mg/L；肌醇90～120mg/L；营养剂40～70mg/L；水解酪蛋白0.1～0.4mg/L；糖类10～30mg/L和凝固剂6～10mg/L。

3.根据权利要求1-2任一所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，所述生长调节剂包括甘氨酸和奈乙酸。

4.根据权利要求3所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，所述甘氨酸和奈乙酸的质量比为(5～9):1。

5.根据权利要求1-2任一所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，所述营养剂包括苹果泥、香蕉泥和蛋白胨。

6.根据权利要求5所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，所述苹果泥、香蕉泥和蛋白胨的质量比为(8～13):(31～66):1。

7.根据权利要求1-2任一所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，所述石斛继代增殖培养基的pH值为4.2～6.3。

8.根据权利要求1-2任一所述的石斛继代增殖培养基，其特征在于，所述糖类为蔗糖或葡萄糖。

9.一种石斛继代增殖培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.取上述重量配比的花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁和乙二胺四乙二钠盐搅拌混合，形成混合液A；

S2.在混合液A中加入上述重量配比的生长调节剂、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇、糖类、凝固剂、水解酪蛋白和营养剂搅拌混合，形成混合液B；

S3.将混合液B的温度加热至40～60℃，不断搅拌，直到糖类和凝固剂完全溶解，调节pH值为4.2～6.3，得石斛继代增殖培养基。

10.根据权利要求9所述的石斛继代增殖培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的搅拌速度为800～1200rpm/min，搅拌时间为20～40min。