CN109220802B - 一种捕虫堇组培快繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明现提供一种捕虫堇组培快繁的方法，其特征在于：步骤包括第一阶段、第二阶段和第三阶段。传统只有第一和第三两个阶段，增加的第二阶段是一个撤销细胞分裂素同时添加生长素的短期培养过程，增加这一阶段的培养有利于提高植株的木质化程度，更有利于促进第三阶段的植株生根，提高生根率和种苗的移栽成活率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体地涉及一种捕虫堇组培快繁的方法。
背景技术
捕虫堇原名：高山捕虫堇（学名：Pinguicula alpina L.） 狸藻科、捕虫堇属多年生草本。根多数，基生呈莲座状，脆嫩多汁，干时膜质；叶片长椭圆形，可直接称为捕虫堇，是一种粘液型的食虫植物。它们最主要的特点是喜欢干爽、凉爽的环境，在春秋较寒冷的季节时生长较快，夏季时特别怕热。捕虫堇对湿度也比较敏感，当湿度连续数天低于40%时也有可能影响其生长。捕虫堇是一种美丽而脆弱的食虫植物，分布于除澳洲以外的各大陆，全属共有约130种，其中30多种为亚种、变种或者变型。 捕虫堇拥有温文秀雅的线条，它的叶片通透洁净却又暗藏杀机，它的花朵也非常鲜艳美丽，是一种人见人爱的食虫植物，在园艺中也被广泛栽培。可以作为家庭或者办公场所的小盆栽之一，也是近几年来我国杠杆流行的奇异花卉之一。目前该品种市场主要还是以进口为主，国内能生产该品种的企业极少，还不能满足国内市场的需求。捕虫堇主要以播种、扦插、分株和冬芽等方式返繁殖，对于栽培技术要求很高，而且传统的繁殖方式有成活率低、繁殖效率慢等问题，目前在捕虫堇的种苗繁殖方面的将研究比较少，在一定程度上制约了捕虫堇的工厂化生产。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明围绕捕虫堇快速繁育优质种苗为目的，研究出经济实惠、快速成苗技术，解决捕虫堇繁殖速度慢的难题。同时还具有成本低，周期短，繁殖材料易得，技术相对简单，可规模化生产等优点。本发明方法简单实惠，应用价值高，成苗快，生长良好等优势。
为实现本发明的目的，本发明提供了以下技术方案：
一种捕虫堇组培快繁的方法，步骤包括第一阶段、第二阶段和第三阶段，第一阶段为：将少量已经驯化的增殖芽团在无菌的洁净工作台上按以下方式：以3-4芽/团为一个增殖单位，或以团块直径1cm左右为一个增殖单位，分割时应尽避免伤害生长点，剔除黄枯叶，一般不去顶，除非拔节徒长。完成切割后按6团/瓶将芽团均匀的放入装有培养基NW+6-BA0.5-1mg/l的玻璃瓶中，按6框/层，不叠瓶，放到24-26℃培养，用LED灯管1.5支的光照强度，光照时间控制8小时/天， 培养6周，有新的侧芽长出来，平均每个芽团有6-9个小芽，一瓶的总芽数合计有36-50个小芽（增殖率在2.5-3左右），这些小芽几乎已经铺满了瓶内的空间；
第二阶段：将第一阶段的芽团在无菌环境（超净工作台上）取出来按第二阶段的切割工艺：以单芽为一生根单位，去枯黄叶，剔除基部愈伤，切割之后选取高度一般1cm以上的单株，按6芽/瓶，装入有培养基：NW+IAA0.1 mg/l，40ml/jar，琼脂，胶质中等的瓶子里，放在5框/层（不叠框），不叠瓶，23-25℃， LED灯管2支， 光照9小时/天的培养室里面培养6周，获得植株；
第三阶段：用水和琼脂（即无糖培养）同时增加凝固剂琼脂的用量使培养基的胶质更硬；将第二阶段获得的高度3cm以上植株，以单株或者团块出货，基部愈伤完整并无切伤；完成切割后将合格植株装入所料四线袋中，按 30袋/框，4-5框/层，不叠框，放入20-22℃，LED灯管2支的培养室中，光照时间控制在11-14小时/天，培养2周成为捕虫堇植株包装出货。
本发明采用的培养基NW和MS具体配方如下：
本发明的优点在于：
1、将传统组织培养的两个阶段细分成三个阶段：传统只有第一和第三两个阶段，增加的第二阶段是一个撤销细胞分裂素同时添加生长素的短期培养过程，增加这一阶段的培养有利于提高植株的木质化程度，更有利于促进第三阶段的植株生根，提高生根率和种苗的移栽成活率；
2、每个培养阶段的培养基不同，尤其是NW基本培养基的使用结合凝固剂的用量以及培养基的湿度控制很特别，这是本发明的创新亮点。
第一阶段的培养基：NW+6-BA0.5-1mg/l（NW基本培养基的详细配方以及与MS的区别后附）；第二阶段的培养基：NW+IAA0.1 mg/l；第三阶段的培养基：水+琼脂（即无糖培养）。
因为捕虫堇的生长习性不喜肥，所以在第一和第二阶段使用的NW基本培养基的成分中比业内常用的MS基本培养基中硝酸盐的用量减少了一大半（用一定量的硫酸钾替代硝酸钾，大量减少铵盐的用量），同时大量增加了硝酸钙和钾的用量（硝酸钙较氯化钙更有利于植株对钙离子的吸收，有利于缓解其培养过程中的玻璃化现象，也能让植株不那么肉质和脆弱，而硫酸镁的用量成倍的增加的有利于让其叶色更好的显现绿色。
第一阶段在基本培养基硝酸盐的用量减少的前提下使用了浓度相对较高的细胞分裂素6-BA(0.5-1mg/l)，结合在继代接种切割时候以一定大小的芽团作为一个继代单位，这样有利于得到更多的性状一致的新芽。同时，第一阶段必须注意，很容易出现玻璃化现象，所以凝固剂琼脂的用量需要加大，一般用7-9g/l。在接种装瓶后必须将瓶子里面培养基表面的冷凝水倒干净。
到第二阶段将培养基中的细胞分裂素6-BA撤掉不用同时增加了生长素IAA(0.1mg/l)的用量，可以减少植株体内残留多余的细胞分裂素，结合切割时候选择一定大小和高度的单芽有利于防止植株基部出现大块的愈伤组织而影响植株生根和后期的移栽成活率（松软的愈伤组织在移栽后容易腐烂）。
到了第三阶段的培养基只用水和琼脂（即无糖培养）同时增加凝固剂琼脂的用量使培养基的胶质更硬，这样不仅有利于降低污染同时由于保持植株在包装运输过程中有一定湿度，不至于干枯而影响后期的移栽成活率。
3、各个培养阶段的光周期、光照强度和温度不同， LED植物生长灯的应用，节能环保，能起到促进植株生长健壮，提高移栽成活率的作用
第一阶段的植株在24-26℃， LED灯管1.5支， 光照8小时/天的培养室里面培养；第二阶段在23-25℃， LED灯管2支， 光照9小时/天的培养室里面培养；第三阶段20-22℃，LED灯管2支， 光照11小时/天的培养室里面培养；
我公司经过多年实验研发的LED植物生长灯在组培条件下能满足植物光合作用和形态建成对460nm-470nm蓝光区和660nm红光区的特殊要求，LED植物生长灯有体积小、质量轻、寿命长、能耗小等优点，我公司在研发使用了这种光源后不仅改变了我们在行业内高能耗、低效能的尴尬局面，更加节能环保，而且在捕虫堇等好几个品种的组培快繁过程中，尤其是第二和第三阶段的壮苗生根期间，明显能起到促进植株生长健壮，提高移栽成活率的作用。
4、每个培养阶段的切割方法都不同：
第一阶段的切割方法：以3-4芽/团为一个增殖单位，或以团块直径1cm左右为一个增殖单位，分割时应尽避免伤害生长点，剔除黄枯叶，除非拔节徒长一般不去顶。按每瓶6个芽团均匀装入有培养基的瓶子里。经过6周培养，有新的侧芽长出来，平均每个芽团几乎都有6-9个小芽，一瓶的总芽数合计有36-50个小芽（增殖率在2.5-3左右），这些小芽几乎已经铺满了瓶内的空间。
第二阶段的切割方法：以单芽为一生根单位，去枯黄叶，剔除基部愈伤，切割之后选取高度一般1cm以上的单株，按6芽/瓶，装入有培养基的瓶子里。
第三阶段的切割方法：一般要求选取植株高度3cm以上的单株或者团块，为单位完成分割下来， 完成切割后将合格植株装入所料四线袋中，要求选取基部愈伤完整并无切伤的单株或者团块入袋包装。
5、注重培养过程湿度的控制，改良培养瓶的盖子以便于更好的控制湿度
捕虫堇对湿度也比较敏感，当湿度连续低于40%时有可能影响其生长。湿度高于90%以上又容易出现玻璃化现象。在组培的过程中我们通过改良培养瓶的盖子以便于更好的控制湿度，即在圆形的塑料培养瓶盖中心部位开一个直径1CM的圆孔，然后贴上一片相应尺寸的生物透气膜，膜上的小孔能过滤掉空气中的各种污染物保持瓶内培养环境洁净。
6、低糖与无糖培养
在第一和第二阶段的培养过程中采用低糖培养，即每升培养基中添加15克糖（常规每升培养基中添加30克糖）。低糖培养不仅能减低成本而且能缓解该品种在组培过程中容易出现玻璃化现象的难题。
在第三阶段采用无糖培养能有效降低培养过程和运输以及移栽过程中意外的污染损耗。
以上6个技术要点在捕虫堇的组培快繁过程中的配合使用成功的在短期内繁育出大量优质的捕虫堇种苗，解决了该品种工厂化生产的难题。
具体实施方式
为了更详细地说明本发明，给出下述制备实例。但本发明的范围并不局限于此。
实施例1
一种捕虫堇组培快繁的方法，操作步骤如下：
1）稳定获得大量性状一致的增殖芽
第一阶段将少量已经驯化的增殖芽团在无菌的洁净工作台上按以下方式: 即以3-4芽/团为一个增殖单位，或以团块直径1cm左右为一个增殖单位，分割时应尽避免伤害生长点，剔除黄枯叶，一般不去顶，除非拔节徒长。完成切割后按6团/瓶将芽团均匀的放入装有培养基NW+6-BA0.5-1mg/l的玻璃瓶中，按6框/层，不叠瓶，放到24-26℃培养，用LED灯管1.5支的光照强度，光照时间控制8小时/天。经过6周培养，有新的侧芽长出来，平均每个芽团几乎都有6-9个小芽，一瓶的总芽数合计有36-50个小芽（增殖率在2.5-3左右），这些小芽几乎已经铺满了瓶内的空间。如果还需要更多的芽团，那么在培养了6周后将芽团取出来经过上述同样的切割方法分割后在装入上述同样的培养基中经过几个周期的循环重复，就可以得到大量的增殖芽团。
2）撤掉细胞分裂素，提高植株木质化程度，诱导植株生根
第一阶段的植株在培养基NW+6-BA0.5-1mg/l中经过6周培养，有新的侧芽长出来，平均每个芽团几乎都有6-9个小芽，一瓶的总芽数合计有36-50个小芽（增殖率在2.5-3左右），这些小芽几乎已经铺满了瓶内的空间。这时候将这些芽团在无菌环境（超净工作台上）取出来按第二阶段的切割工艺：以单芽为一生根单位，去枯黄叶，剔除基部愈伤，切割之后选取高度一般1cm以上的单株，按6芽/瓶，装入有培养基：NW+IAA0.1 mg/l，40ml/jar，琼脂，胶质中等的瓶子里，放在5框/层（不叠框），不叠瓶，23-25℃， LED灯管2支， 光照9小时/天的培养室里面培养就进入了第二阶段，第二阶段是以增加植株的木质化程度，促进植株生根为目的，光照强度也比第一阶段要求更高，不能叠框。经过6周的培养就可以继代转入三阶段的培养，第二阶段的增殖率在2左右。
3）无糖培养，炼苗
到了第三阶段的培养基只用水和琼脂（即无糖培养）同时增加凝固剂琼脂的用量使培养基的胶质更硬。按以下切割方法：植株高度一般要求3cm以上，以单株或者团块出货，基部愈伤完整并无切伤。 完成切割后将合格植株装入所料四线袋中，按 30袋/框，4-5框/层，不叠框，放入20-22℃， LED灯管2支的培养室中，光照时间控制在11-14小时/天。经过2周的培养就可以包装供货了。
对比例1
将实施例1中的第二阶段一个撤销细胞分裂素同时添加生长素的短期培养过程去掉，其他与实施例1操作相同。
对比例2：
将培养基全部用实施例1中的NW培养基，其他与实施例1相同。
对比例3：
在第一和第二第三阶段的培养过程中均采用低糖培养，即每升培养基中添加15克糖（常规每升培养基中添加30克糖。
对比例4：
在第一和第二第三阶段的培养过程中均无糖培养。
通过实施例1和对比例1-4培养的植株进行对比，发现实施例1培养的植株健壮，成活率高，并且性状保持完好，欣赏价值高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种捕虫堇组培快繁的方法，其特征在于：步骤包括第一阶段、第二阶段和第三阶段，第一阶段为：将少量已经驯化的增殖芽团在无菌的洁净工作台上按以下方式：以2-8芽/团为一个增殖单位，或以团块直径0.5-3cm为一个增殖单位，剔除黄枯叶，完成切割后按6团/瓶将芽团均匀的放入装有由NW+6-BA0.5-1mg/l+7~9g/l琼脂+ 15g/l糖组成的培养基的玻璃瓶中，按6框/层，不叠瓶，放到24-26℃培养，用LED灯管1.5支的光照强度，光照时间控制8小时/天，培养6周，有新的侧芽长出来，平均每个芽团有6-9个小芽，一瓶的总芽数合计有36-50个小芽，增殖率在2.5-3，这些小芽几乎已经铺满了瓶内的空间；第二阶段：将第一阶段的芽团在无菌环境取出来按第二阶段的切割工艺：以单芽为一生根单位，去枯黄叶，剔除基部愈伤，切割之后选取高度0.5cm以上的单株，按3-10芽/瓶，以40ml/jar的规格将由NW+IAA0.1 mg/l+琼脂+15g/l糖组成的中等胶质的培养基装入瓶子里，放在5框/层，不叠框，不叠瓶，23-25℃，LED灯管2支，光照9小时/天的培养室里面培养6周，获得植株；第三阶段：用水和琼脂作为培养基的成分同时增加凝固剂琼脂的用量使培养基的胶质更硬；将第二阶段获得的高度2cm以上植株，以单株或者团块出货，基部愈伤完整并无切伤；完成切割后将合格植株装入塑料四线袋中，按 30袋/框，4-5框/层，不叠框，放入20-22℃，LED灯管2支的培养室中，光照时间控制在11-14小时/天，培养2周成为捕虫堇植株包装出货；其中培养基NW由816mg/l的硝酸铵、1385mg/l的4水合硝酸钙、0.83mg/l的碘化钾、0.025mg/l的6水合氯化钴、112.5mg/l的氯化钙、755mg/l的7水合硫酸镁、16.9mg/l的1水合硫酸锰、8.6mg/l的7水合硫酸锌、0.025mg/l的5水合硫酸铜、1369mg/l的硫酸钾、170mg/l的磷酸二氢钾、0.25mg/l的2水合钼酸钠、6.2mg/l的硼酸、27.8mg/l的7水合硫酸亚铁、37.3mg/l的乙二胺四乙酸二钠盐、1mg/l的VB1、0.5mg /l的烟酸、0.5mg/l的VB6、2mg/l的甘氨酸、100mg/l的肌醇组成。
2.根据权利要求1所述的捕虫堇组培快繁的方法，其特征在于：第一阶段的切割方法：以3-4芽/团为一个增殖单位，或以团块直径0.8-1.5cm为一个增殖单位，分割时避免伤害生长点，剔除黄枯叶。
3.根据权利要求1所述的捕虫堇组培快繁的方法，其特征在于：第二阶段的切割方法：以单芽为一生根单位，去枯黄叶，剔除基部愈伤，切割之后选取高度1cm以上的单株，按6芽/瓶，装入有培养基的瓶子里。
4.根据权利要求3所述的捕虫堇组培快繁的方法，其特征在于：第三阶段的切割方法：选取植株高度3cm以上的单株或者团块为单位并分割下来，完成切割后将合格植株装入所料四线袋中，要求选取基部愈伤完整并无切伤的单株或者团块入袋包装。
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