CN105145369A - 一种硬叶兰组培快繁方法 - Google Patents

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温四民
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Abstract

本发明公开了一种硬叶兰组培快繁方法，属于植物组织培养研究领域。硬叶兰为兰属附生植物，生于林中或灌丛中的树木上，具有极高的观赏和药用价值。本方法包括如下步骤：蒴果灭菌、种子萌发培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗移栽。通过以上步骤实现了硬叶兰的组织培养和快速稳定繁殖，本方法重复性好，繁殖系数高，获得的再生幼苗健壮、整齐，植物学性状稳定，可短时间内大量繁殖，对硬叶兰种质资源保护和优质种苗产业化生产具有重要意义。

Description

一种硬叶兰组培快繁方法
技术领域
本发明属于植物组织培养研究领域，具体涉及一种硬叶兰组培快繁方法。
背景技术
硬叶兰（CymbidiumbicolorLindl）为兰属附生植物，生于林中或灌丛中的树木上，海拔可达1600米，主要产于广东、海南、广西、贵州和云南西南部至南部，具有极高的观赏和药用价值。叶带型、厚革质，花期3～4月，总状花序具10～20枚花，花色艳丽，全草可入药，具有清热润肺、化痰止咳、散瘀止血等功效。硬叶兰跟其它兰科植物一样，种子通常发育不完全，在自然条件下通过种子繁殖需要较长时间才能获得开花植株，而且发芽率和成活率都极低，因此野生硬叶兰十分稀少，另外，由于长期以来过度采掘及生境的破坏，硬叶兰将处于濒危状态。随着市场需求量逐年增加，野生资源的大量减少将无法满足人们对硬叶兰的需求，利用组织培养技术生产组培苗将是硬叶兰规模化栽培的主要种苗来源，目前技术中未见其组培快繁的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，可在短时间内提供大量优质硬叶兰种苗，采用的技术方案包括以下步骤：
（1）蒴果灭菌：采集八成熟的硬叶兰蒴果，用75%酒精灭菌20s，0.1%升汞灭菌10min，无菌水冲洗4～5次，再用0.1%升汞灭菌3min，无菌水冲洗4～5次，吸干表面水分；
（2）种子萌发培养：将消毒后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，种子萌发培养基组成为VW+6-BA0.2～0.5mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+AC1.0～1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.6～6.5，光照培养45～50d后种子发育成原球茎；
（3）增殖培养：将原球茎切成小块接种于增殖培养基，增殖培养基成分为：1/2VW+6-BA4～7mg/L+NAA0.6～1.0mg/L+AC1.0～1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.6～6.5，光照培养30～35d得到大量的原球茎团；
（4）分化培养：将增殖培养得到的原球茎团接种于分化培养基，分化培养基成分为：1/2VW+6-BA0.1～0.3mg/L+NAA0.3～0.6mg/L+KT0.5～0.8mg/L+AC1.0～1.5g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L，PH为5.6～6.5，光照培养30～35d后，每个原球茎团分化成8～10个丛生芽，将丛生芽切割分成单芽，备用；
（5）生根培养：将单芽转入生根培养基，生根培养基成分为：1/2VW+IBA0.2～0.5mg/L+NAA0.2～0.5mg/L+AC1.0～1.5g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.6～6.5，光照培养30～35d可得到试管苗；
（6）炼苗移栽：挑选生长健壮、根系长至2～3cm的试管苗带瓶置于常温、自然光条件下炼苗7～15d，取出试管苗，用清水洗去培养基，用多菌灵50%可湿性粉剂800～1000倍液浸苗12min，移栽至苗床，苗床基质由碎树皮、泥炭和珍珠岩按体积比3:2:1混合而成，环境要求通风良好，遮光70%，空气相对湿度75%～80%，15～20d即可成活。
以上步骤（2）、（3）、（4）和（5）中所述光照培养条件为：温度25±2℃，光照10～12h/d，光照强度1200～1500Lx。
本发明的有益效果体现在：采用本方法实现了硬叶兰的组织培养和快速稳定繁殖，得到的再生植株，植物学性状稳定，繁殖系数高，能有效抑制褐变，移栽成活率达95～98%，可短时间内大量繁殖，对于野生硬叶兰种质资源保护及开发利用具有有重要意义。
具体实施方式
实施例1
1.一种硬叶兰组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）蒴果灭菌：采集八成熟的硬叶兰蒴果，用75%酒精灭菌20s，0.1%升汞灭菌10min，无菌水冲洗4～5次，再用0.1%升汞灭菌3min，无菌水冲洗4～5次，吸干表面水分；
（2）种子萌发培养：将消毒后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，种子萌发培养基组成为VW+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.8，培养20～25d后种子由浅黄色转为绿色，再培养30～35d后发育成原球茎。兰花原球茎生命力强，遗传性状稳定，对快繁及种质资源保存极为有利，因此，在此阶段需及时切割转瓶，进行增殖，否则，再过50d原球茎便开始发芽分化成幼苗；
（3）增殖培养：将原球茎切成小块接种至增殖培养基，增殖培养基成分为：1/2VW+6-BA5mg/L+NAA0.8mg/L+AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.8，培养30～35d得到大量的原球茎团；
（4）分化培养：将增殖培养得到的原球茎团接种于分化培养基，分化培养基成分为：1/2VW+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+KT0.6mg/L+AC1.0g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L，PH为5.8，培养30d后，每个原球茎团分化成8～10个丛生幼芽，将丛生幼芽切割分成单芽，备用；
（5）生根培养：将单芽转入生根培养基，生根培养基成分为：1/2VW+IBA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+AC1.0g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.8，培养30～35d可得到试管苗，生根率达90%以上；
（6）炼苗移栽：挑选生长健壮、根系长至2～3cm的试管苗带瓶置于常温、自然光条件下炼苗7～15d，取出试管苗，用清水洗去培养基，用多菌灵50%可湿性粉剂800～1000倍液浸苗12min，移栽至苗床，浇透水，移栽至苗床，苗床基质由碎树皮、泥炭和珍珠岩按体积比3:2:1混合而成。硬叶兰喜温暖湿润、半荫环境，移栽环境要求通风良好，遮光70%，空气相对湿度75%～80%，适时淋水和定期喷洒杀菌剂，15～20d即可成活，成活率达95%以上。试管苗定植长出新根后再浇叶面肥，浇水以间干间湿为宜。
以上步骤（2）、（3）、（4）和（5）中所述光照培养条件为：温度25±2℃，光照10～12h/d，光照强度1200～1500Lx。
实施例2
1.一种硬叶兰组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）蒴果灭菌：采集八成熟的硬叶兰蒴果，用75%酒精灭菌20s，0.1%升汞灭菌10min，无菌水冲洗4～5次，再用0.1%升汞灭菌3min，无菌水冲洗4～5次，吸干表面水分；
（2）种子萌发培养：将消毒后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，种子萌发培养基组成为VW+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+AC1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为6.0，培养20～25d后种子由浅黄色转为绿色，再培养30～35d后发育成原球茎；
（3）增殖培养：将原球茎切成小块接种至增殖培养基，增殖培养基成分为：1/2VW+6-BA4/L+NAA0.6mg/L+AC1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为6.0，培养30～35d得到大量的原球茎团；
（4）分化培养：将增殖培养得到的原球茎团接种于分化培养基，分化培养基成分为：1/2VW+6-BA0.1mg/L+NAA0.3mg/L+KT0.5mg/L+AC1.5g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L，PH为6.0，培养30d后，每个原球茎团分化成8～10个丛生幼芽，将丛生幼芽切割分成单芽，备用；
（5）生根培养：将单芽转入生根培养基，生根培养基成分为：1/2VW+IBA0.2mg/L+NAA0.2mg/L+AC1.5g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为6.0，培养30～35d可得到试管苗，生根率达88%以上；
（6）炼苗移栽：挑选生长健壮、根系长至2～3cm的试管苗带瓶置于常温、自然光条件下炼苗7～15d，取出试管苗，用清水洗去培养基，用多菌灵50%可湿性粉剂800～1000倍液浸苗12min，移栽至苗床，浇透水，移栽至苗床，苗床基质由碎树皮、泥炭和珍珠岩按体积比3:2:1混合而成，遮光70%，空气相对湿度75%～80%，15～20d即可成活，成活率达97%以上。
以上步骤（2）、（3）、（4）和（5）中所述光照培养条件为：温度25±2℃，光照10～12h/d，光照强度1200～1500Lx。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种硬叶兰组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）蒴果灭菌：采集八成熟的硬叶兰蒴果，用75%酒精灭菌20s，0.1%升汞灭菌10min，无菌水冲洗4～5次，再用0.1%升汞灭菌3min，无菌水冲洗4～5次，吸干表面水分；
（2）种子萌发培养：将消毒后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，种子萌发培养基组成为VW+6-BA0.2～0.5mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+AC1.0～1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.6～6.5，光照培养45～50d后种子发育成原球茎；
（3）增殖培养：将原球茎切成小块接种于增殖培养基，增殖培养基成分为：1/2VW+6-BA4～7mg/L+NAA0.6～1.0mg/L+AC1.0～1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.6～6.5，光照培养30～35d后得到大量的原球茎团；
（4）分化培养：将增殖培养得到的原球茎团接种于分化培养基，分化培养基成分为：1/2VW+6-BA0.1～0.3mg/L+NAA0.3～0.6mg/L+KT0.5～0.8mg/L+AC1.0～1.5g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L，PH为5.6～6.5，光照培养30～35d后，每个原球茎团分化成8～10个丛生芽，将丛生芽切割分成单芽，备用；
（5）生根培养：将单芽转入生根培养基，生根培养基成分为：1/2VW+IBA0.2～0.5mg/L+NAA0.2～0.5mg/L+AC1.0～1.5g/L+土豆泥80g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH为5.6～6.5，光照培养30～35d可得到试管苗；
（6）炼苗移栽：挑选生长健壮、根系长至2～3cm的试管苗带瓶置于常温、自然光条件下炼苗7～15d，取出试管苗，用清水洗去培养基，用多菌灵50%可湿性粉剂800～1000倍液浸苗12min，移栽至苗床，苗床基质由碎树皮、泥炭和珍珠岩按体积比3:2:1混合而成，环境要求通风良好，遮光70%，空气相对湿度75%～80%，15～20d即可成活。
2.根据权利要求1所述的一种硬叶兰组培快繁方法，其特征在于，步骤（2）、（3）、（4）和（5）中光照培养条件为：温度25±2℃，光照10～12h/d，光照强度1200～1500Lx。
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