CN107926707A - 一种玫瑰石斛组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种玫瑰石斛组织培养方法，包括玫瑰石斛种子培养萌发成原球茎，壮苗培养，诱导生根，炼苗四个步骤，所述玫瑰石斛种子培养萌发成原球茎中使用的种子培养基包含以下组分：硝酸钾1600mg/L、硝酸铵1250mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2‑EDT A 37.3mg/L、硫酸亚铁21.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、NAA 0.5‑2.0mg/L、6‑BA 0.5‑3.0mg/L、马铃薯100000mg/L、碳粉250mg/L、蔗糖30000mg/L、水解乳蛋白700mg/L、琼脂4500mg/L。该方法的玫瑰石斛种子萌发率高，在90％以上，繁殖率得到极大的提高。

Description

一种玫瑰石斛组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种玫瑰石斛组织培养方法。
背景技术
玫瑰石斛(学名：Dendrobium crepidatum Lindl.ex Paxt.)：茎悬垂，肉质状肥厚，青绿色，圆柱形，不分枝，具多节，节间长3-4厘米。叶近革质，狭披针形。总状花序很短，从落了叶的老茎上部发出，具1-4朵花；花质地厚，开展；萼片和花瓣白色，中上部淡紫色，干后蜡质状；花瓣宽倒卵形，长2.1厘米，宽1.2厘米，先端近圆形，具5条脉；唇瓣中部以上淡紫红色，中部以下金黄色，近圆形或宽倒卵形。花期3-4月。生于海拔1000-1800米的山地疏林中树干上或山谷岩石上。分布于中国、印度、尼泊尔、锡金、不丹、缅甸、泰国、老挝、越南。此花观赏价值极高，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一，既可作切花，也可盆栽观赏，家有数盆热闹非凡。此外，花朵剪下2-3天也不凋萎，生命力旺盛令人赞叹，具有较高的园艺价值。
玫瑰石斛是一种喜阴凉的多年生草本植物，喜在温暖、潮湿、以年降雨量1000毫米以上、半阴半阳的环境，1月平均气温高于8℃的亚热带深山老林中生长为佳，适宜生长温度为15到28度，适宜生长空气湿度为60％以上，对土肥要求不甚严格，野生多在疏松且厚的树皮或树干上生长，有的也生长于石缝中。属气生根系，主要要求根部通透性好，采用的基质最好能通风透气滤水，在适宜的温度湿度下，生长速度快，生存能力非常强。每年春末夏初，二年生茎上部节上抽出花序，开花后从茎基长出新芽发育成茎，秋冬季节进入休眠期。为了满足市场需求，玫瑰石斛可通过人工培养方式进行快速繁殖，通常采用的繁殖方式有扦插繁殖和组织培养快繁。其中，组织培养快繁虽然在一定程度上加快了玫瑰石斛繁殖。但是不管采用瓶外生根或者瓶内生根的方法，仍然存在萌发率低及生根率低的问题，而且苗的成活率很低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玫瑰石斛组织培养方法。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：一种玫瑰石斛组织培养方法，包括玫瑰石斛种子培养萌发成原球茎，壮苗培养，诱导生根和炼苗四个步骤，其中，所述玫瑰石斛种子培养萌发成原球茎中使用的种子培养基包含以下组分：
表1：种子培养基配方
试剂名称 含量(mg/L) 试剂名称 含量(mg/L)
硝酸钾 1600 硫酸亚铁 21.8
硝酸铵 1250 甘氨酸 2.0
硫酸镁 370 盐酸硫胺素 0.1
磷酸二氢钾 170 盐酸吡哆醇 0.5
氯化钙 440 烟酸 0.5
硫酸铜 0.025 肌醇 100
氯化钴 0.025 NAA 0.5-2.0
硫酸锰 16.9 6-BA 0.5-3.0
硫酸锌 8.6 马铃薯 100000
硼酸 6.2 碳粉 250
碘化钾 0.83 蔗糖 30000
钼酸钠 0.25 水解乳蛋白 700
Na2-EDTA 37.3 琼脂 4500
所述壮苗培养中使用的壮苗培养基包含以下组分：
表2：壮苗培养基配方
试剂名称 含量(mg/L) 试剂名称 含量(mg/L)
硝酸钾 2000 硫酸亚铁 27.8
硝酸铵 1750 甘氨酸 2.0
硫酸镁 370 盐酸硫胺素 0.2
磷酸二氢钾 170 盐酸吡哆醇 0.65
氯化钙 550 烟酸 0.5
硫酸铜 0.025 肌醇 50
氯化钴 0.025 NAA 0.5-2.0
硫酸锰 16.9 6-BA 0.5-3.0
硫酸锌 8.6 香蕉 200000
硼酸 6.2 碳粉 500
碘化钾 0.83 蔗糖 30000
钼酸钠 0.25 琼脂 4500
Na2-EDTA 37.3
所述诱导生根中使用的生根培养基包含以下组分：
表3：生根培养基配方
所述种子培养萌发成原球茎步骤中，成熟玫瑰石斛种子经消毒处理后播种于种子培养基中培养，7-10天转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大、萌发形成绿色原球茎；培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为8-12h/d。
所述的消毒处理过程为：玫瑰石斛种子经自来水加洗洁精冲洗三分钟后用75％酒精消毒30秒，之后用35％双氧水消毒10min，然后用无菌水冲洗三次。
所述壮苗步骤中，原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，获得高度达到1.5-4cm的幼苗，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为10-15h/d。
本发明具有以下优点：
1.本发明提供玫瑰石斛的组织培养方法，玫瑰石斛种子萌发率高，在90％以上，获得的幼苗粗壮，主根系发达，种植成活率在95％以上。
2.种子培养基对玫瑰石斛种子的萌发有重要影响，本发明提供的种子培养基可以使玫瑰石斛种子萌发在90％以上。
3.本发明采用的壮苗培养基可以促进原球茎生成粗壮的幼苗。
4.本发明采用的生根培养基可以促进幼苗生根，所得的主根系发达，有利于在炼苗及种植中成活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实验例1
取成熟玫瑰石斛种子进行消毒处理，用自来水加洗洁精冲洗3分钟，然后75％酒精消毒30秒，再用35％双氧水消毒10分钟，最后用无菌水冲洗三次后播种于种子培养基中培养，待转绿后，继续培养20-30天，经过种胚膨大并萌发形成绿色原球茎。培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为10h/d。
本发明采用的种子培养基为在种子改良MS培养基(以下简称为种子改良MS)的基础上添加NAA 0.5-2.0mg/L、6-BA0.5-3.0mg/L、马铃薯100000mg/L和水解乳蛋白700mg/L构成。其中的种子改良MS培养基包含以下组分：硝酸钾1600mg/L、硝酸铵1250mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、硫酸亚铁21.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、碳粉250mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂4500mg/L。
表4萌发率对比实验
培养基及组合 萌发率％ 转绿时间(天)
MS培养基 55 18
种子改良MS 75 12
种子改良MS+水解乳蛋白+马铃薯 75 10
种子改良MS+水解乳蛋白+马铃薯+NAA0.5+6-BA0.8 90 10
种子改良MS+水解乳蛋白+马铃薯+NAA0.8+6-BA1.2 95 7
种子改良MS+水解乳蛋白+马铃薯+NAA1.2+6-BA1.5 93 8
种子改良MS+水解乳蛋白+马铃薯+NAA2.5+6-BA3.0 35 15
由表4结果可见，本发明提供的种子培养基较普通MS培养基大大地提高了种子萌发率，而且芽转绿时间也明显缩短，说明本发明的种子培养基与现有MS培养基相比更适合玫瑰石斛种子的萌发和生长，而且其中，激素组合优选为NAA0.8mg/L，6-BA1.2mg/L。
实验例2
将玫瑰石斛原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，进行80-90天壮苗培养，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为12h/d。
本发明采用的壮苗培养基为在壮苗改良MS培养基(以下简称为壮苗改良MS)的基础上添加NAA0.5～2.0mg/L、6-BA0.5～3.0mg/L和香蕉200000mg/L构成。其中，壮苗改良MS培养基包含以下组分：硝酸钾2000mg/L、硝酸铵1750mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙550mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、盐酸吡哆醇0.65mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇50mg/L、碳粉500mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂4500mg/L。
表5壮苗培养对比实验
从表5中可以看出，培养基中种苗激素浓度过高时会对种苗产生毒害作用，导致种苗畸形、生长异常等。只有当种苗处于最适激素配比的改良培养基中时，种苗才长的壮而且长得快。其中，激素的组合优选为NAA1.5mg/L，6-BA2.0mg/L。
实验例3
将步骤(2)得到的幼苗转入生根培养基进行诱导生根，长成具有发达主根系的生根苗。
本发明采用的生根培养基为在生根改良MS培养基(以下简称为生根改良MS)的基础上添加NAA0.5-2.0mg/L、6-BA0.5-3.0mg/L和艾比蒂生根粉0.5-2.5mg/L构成。其中，生根改良MS培养基包含以下组分：硝酸钾1650mg/L、硝酸铵1350mg/L、硫酸镁270mg/L、磷酸二氢钾130mg/L、氯化钙450mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、盐酸吡哆醇0.65mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇5mg/L、碳粉500mg/L、蔗糖18000mg/L、香蕉100000mg/L、琼脂4500mg/L。相对于现有MS培养基，生根改良MS培养基的大量元素、有机添加物、糖等都适量减少，特别是肌醇大幅度减少以促进生根，更加适合玫瑰石斛生根培育。
表6生根培养对比实验
由表6的结果可见，本发明的生根改良MS能有效地提高幼苗的生根率，添加适量的艾比蒂生根粉能够促进根系生长。由表中可见，当艾比蒂生根粉添加量大于2.0mg/L时，不仅不能促进根系生长，还会使种苗出现畸形甚至是死苗。在本发明中，激素的组合优选为NAA1.5mg/L，6-BA2.0mg/L，艾比蒂生根粉添加量优选为2.0mg/L。
实施例一
玫瑰石斛组织培养分四个阶段，分别是种子萌发、壮苗培养、诱导生根和炼苗四个阶段，所以在本发明提供的玫瑰石斛组织培养方法包括玫瑰石斛种子萌发成为原球茎，壮苗，生根，炼苗四个步骤，具体培养过程如下：
(1)种子萌发成为原球茎：取成熟玫瑰石斛种子进行消毒处理，先用自来水加洗洁精冲洗3分钟，然后75％酒精消毒30秒，再用35％双氧水消毒10分钟，最后用无菌水冲洗三次后播种于种子培养基中培养，10天转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大、萌发形成绿色原球茎，种子的萌发率在90％以上。培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为10h/d。
种子培养基包含以下组分：硝酸钾1600mg/L、硝酸铵1250mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁21.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、NAA 0.5mg/L、6-BA0.8mg/L、马铃薯100000mg/L、碳粉250mg/L、蔗糖30000mg/L、水解乳蛋白700mg/L、琼脂4500mg/L。
(2)壮苗培养：将步骤(1)中产生的原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，高度达到1.79cm，1/2苗高处的直径为1.5mm的粗壮幼苗出现，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为12h/d。
壮苗培养基包含以下组分：硝酸钾2000mg/L、硝酸铵1750mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙550mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、盐酸吡哆醇0.65mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇50mg/L、NAA 0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、香蕉200000mg/L、碳粉500mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂4500mg/L。
(3)诱导生根：将步骤(2)得到的幼苗转入生根培养基进行诱导生根，长成具有2条主根系的生根苗，根到底平均长度为32.2mm，根系平均直径为1.2mm。
生根培养基包含以下组分：硝酸钾1650mg/L、硝酸铵1350mg/L、硫酸镁270mg/L、磷酸二氢钾130mg/L、氯化钙450mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、盐酸吡哆醇0.65mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇5mg/L、NAA0.5mg/L、6-BA0.8mg/L、香蕉100000mg/L、碳粉500mg/L、蔗糖18000mg/L、艾比蒂生根粉0.8mg/L、琼脂4500mg/L。
(4)炼苗：将步骤(3)得到的生根苗进行炼苗驯化，使其适应外部生长环境。完成炼苗后，所得驯化苗移栽大棚或室外，同时种植管理，种植一个月后成活率在95％以上并开始发芽。
实施例二
与实施例一不同的是：
种子培育基中的激素含量为NAA 0.8mg/L、6-BA1.2mg/L，种子萌发率为95％，转绿时间为7天。
培苗培养基中的激素含量为NAA 1.5mg/L、6-BA2.0mg/L，种苗平均高度为3.46cm，1/2苗高处的平均直径为2.2mm。
生根培养基中的激素含量为NAA 1.5mg/L、6-BA2.0mg/L，艾比蒂生根粉含量为1.0mg/L。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为48.6mm，根系平均直径为2.2mm。
炼苗移栽后种植一个月的成活率为100％，所有玫瑰石斛苗均开始发芽。
实施例三
与实施例一不同的是：
种子培育基中的激素含量为NAA 1.2mg/L、6-BA 1.5mg/L，种子萌发率为93％，转绿时间为8天。
培苗培养基中的激素含量为NAA 1.5mg/L、6-BA 1.0mg/L，种苗平均高度为3.04cm，1/2苗高处的平均直径为1.9mm。
生根培养基中的激素含量为NAA 1.5mg/L、6-BA 1.0mg/L，艾比蒂生根粉含量为1.5mg/L。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为42.3mm，根系平均直径为1.9mm。
炼苗移栽后种植一个月的成活率接近100％，所有玫瑰石斛苗均开始发芽。
实施例四
与实施例一不同的是：
培苗培养基中的激素含量为NAA 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L，种苗平均高度为2.73cm，1/2苗高处的平均直径为1.7mm。
生根培养基中的激素含量为NAA 1.0mg/L、6-BA0.5mg/L，艾比蒂生根粉含量为1.0mg/L。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为39.7mm，根系平均直径为1.5mm。
炼苗移栽后种植一个月的成活率为99％，成活的玫瑰石斛苗均开始发芽。
实施例五
与实施例一不同的是：
种子培育基中的激素含量为NAA 1.8mg/L、6-BA1.0mg/L，种子萌发率为90％，转绿时间为7天。
培苗培养基中的激素含量为NAA 1.5mg/L、6-BA1.0mg/L，种苗平均高度为2.46cm，1/2苗高处的平均直径为1.8mm。
生根培养基中的激素含量为NAA 1.5mg/L、6-BA2.0mg/L，艾比蒂生根粉含量为2.0mg/L。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为35.6mm，根系平均直径为1.8mm。
炼苗移栽后种植一个月的成活率为96％，成活的玫瑰石斛苗均开始发芽。

Claims (6)

1.一种玫瑰石斛组织培养方法，包括玫瑰石斛种子培养萌发成原球茎，壮苗培养，诱导生根和炼苗四个步骤，其特征是，所述玫瑰石斛种子培养萌发成原球茎中使用的种子培养基包含以下组分：
硝酸钾1600mg/L、硝酸铵1250mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDT A 37.3mg/L、硫酸亚铁21.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、NAA0.5-2.0mg/L、6-BA0.5-3.0mg/L、马铃薯100000mg/L、碳粉250mg/L、蔗糖30000mg/L、水解乳蛋白700mg/L、琼脂4500mg/L。
2.根据权利要求2所述的玫瑰石斛组织培养方法，其特征是，所述壮苗培养中使用的壮苗培养基包含以下组分：硝酸钾2000mg/L、硝酸铵1750mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、氯化钙550mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、盐酸吡哆醇0.65mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇50mg/L、NAA 0.5-2.0mg/L、6-BA 0.5-3.0mg/L、香蕉200000mg/L、碳粉500mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂4500mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的玫瑰石斛组织培养方法，其特征是，所述诱导生根中使用的生根培养基包含以下组分：硝酸钾1650mg/L、硝酸铵1350mg/L、硫酸镁270mg/L、磷酸二氢钾130mg/L、氯化钙450mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸锰16.9mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、钼酸钠0.25mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、盐酸吡哆醇0.65mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇5mg/L、NAA0.5-2.0mg/L、6-BA0.5-3.0mg/L、香蕉100000mg/L、碳粉500mg/L、蔗糖18000mg/L、艾比蒂生根粉0.5-2.5mg/L、琼脂4500mg/L。
4.根据权利要求3所述的玫瑰石斛组织培养方法，其特征是，所述种子培养萌发成原球茎步骤中，成熟玫瑰石斛种子经消毒处理后播种于种子培养基中培养，一星期转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大、萌发形成绿色原球茎；培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为8-12h/d。
5.根据权利要求4所述的玫瑰石斛组织培养方法，其特征是，所述的消毒处理过程为：玫瑰石斛种子经自来水加洗洁精冲洗3分钟后用75％酒精消毒30秒，之后用35％双氧水消毒10分钟，然后用无菌水冲洗三次。
6.根据权利要求3所述的玫瑰石斛组织培养方法，其特征是，所述壮苗步骤中，将所述原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，获得高度达到1.5-3cm的幼苗，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为10-15h/d。
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