CN106212276B - 一种柳南香的初代培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柳南香的初代培养方法，包括：以柳南香的嫩梢为外植体，消毒后，接种于诱导培养基上进行培养；所述的诱导培养基的配方为1/2MS+6‑BA0.4～1mg/L+NAA 0.04～0.1mg/L+7～9g/L琼脂。本发明成功建立了柳南香的初代培养体系，优化了柳南香的消毒方法和诱导培养基。通过适宜浓度的消毒剂、适宜时间的消毒处理，消毒效果好，外植体的成活率可达80％；另外，采用适宜的激素种类和浓度，与相应的基础培养基搭配，外植体的成活率、愈伤组织形成率、新枝生长数和不定芽形成率可达到较高的水平。

Description

一种柳南香的初代培养方法

技术领域

本发明涉及组织培养，尤其涉及一种柳南香的初代培养方法。

背景技术

柳南香(Crowea saligna)为芸香科的一种低矮灌木，分布于澳大利亚南部，其花为可爱的星形花，花色有白色和粉色。叶细长针形，花径1～3cm，5枚花瓣，单朵花可开一周以上，花开时满株是花，可连续不断开花。柳南香有一定的耐寒性，耐旱，是一种很受欢迎的盆栽花卉。国外早己经规模化生产并进入市场，对柳南香的栽培和繁殖方面的研究更是空白。

由于柳南香是新的花卉品种，且芸香科内相关的组培研究很少，所以能参照的组培方法不多。有学者对吴茱萸组织培养和快速繁育技术进行研究，他们以吴茱萸的雌株嫩叶为外植体，研究成分各不相同的植物生长调节剂和其不同浓度配比对其生根、诱导和增殖培养的影响，研究得出诱导培养基最佳为：MS+1.0mg/LBA+0.3mg/LNAA，最佳增殖培养基为MS+2.0mg/LBA+0.1mg/LKT+0.3mg/LNAA。王小敏等人为了建立两面针的无菌试管苗体系，对两面针进行组织培养研究，并诱导出无菌苗。他们选用了植株的不同部位，再接种于不同培养基中形成对比实验，选择最优秀的试验方案。结果表明：外植体最好选用带有腋芽的嫩茎，培养基选用MS附加BA 5.0mg/L和NAA 0.5mg/L为最佳。

从文献资料来看，还没有学者进行过柳南香相关的组培繁殖技术研究，尽管已有少数芸香科组培的研究，但是科内不同属，属内不同种之间的组培条件差异很大且难以预测，因此很难进行借鉴，有必要针对柳南香的组培进行系统研究。

发明内容

技术问题：本发明提供了一种柳南香的初代培养方法，建立了柳南香的初代培养体系。

技术方案：本发明所述的柳南香的初代培养方法，包括：以柳南香的嫩梢为外植体，消毒后，接种于诱导培养基上进行培养；所述的诱导培养基的配方为1/2MS+6-BA0.4～1mg/L+NAA0.04～0.1mg/L+7～9g/L琼脂。

优选的，所述的诱导培养基的配方为1/2MS+6-BA0.4～0.6mg/L+NAA 0.04～0.06mg/L+7～9g/L琼脂。

更优选的，所述的诱导培养基的配方为1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+7～9g/L琼脂。采用该培养基配方，外植体的成活率、愈伤组织形成率、新枝生长数和不定芽形成率均较高。

所述消毒的方法包括：将所述的外植体用70～75％酒精沉浸30～40s，无菌水冲洗后用0.1～0.2％升汞浸泡2～3min，再用无菌水冲洗干净。

优选的，酒精的浓度为75％，沉浸的时间为40s；升汞的浓度为0.1％，浸泡的时间为2min。在给外植体消毒时，消毒时间太短，不利于污染的控制；消毒时间太长，又会破坏外植体的细胞，特别是升汞对外植体的破坏更大，由于细胞会对自身形成保护，会因受到破坏而不断产生大量次生物质，这样会引起细胞毒害，使植物产生褐化物质甚至死亡，直接导致外植体的存活率下降。在本实验中，采用75％酒精40s，0.1％升汞消毒2min左右，能达到较好的消毒效果。

所述嫩梢的长度为0.5～1cm。

所述培养的温度为23～27℃，光照强度2900～3100lx，光照时间10～12h/d。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

本发明成功建立了柳南香的初代培养体系，优化了柳南香的消毒方法和诱导培养基。通过适宜浓度的消毒剂、适宜时间的消毒处理，消毒效果好，外植体的成活率可达80％；另外，采用适宜的激素种类和浓度，与相应的基础培养基搭配，外植体的成活率、愈伤组织形成率、新枝生长数和不定芽形成率可达到较高的水平。

附图说明

图1为实施例2采用最优诱导培养基培养1周后的状态；

图2为实施例2采用最优诱导培养基培养1个月后不定芽发生的状态。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。

试验材料：

以从国外引进的柳南香嫩梢作为外植体，在玻璃温室选取健康没有病虫害的植株嫩梢。用洗衣粉搅拌清洗10min后，用纱布封住杯口，再用流水冲洗1h，将冲洗好的外植体用潮湿的棉花覆盖，防止外植体因水分的流失而枯萎死亡。

实施例1消毒方法对外植体诱导的影响

取柳南香外植体，用75％酒精分别沉浸20s、30s、40s，再用无菌水冲洗3～4遍，然后分别用0.1％升汞浸泡1min、2min和3min，再用无菌水冲洗3～4遍。然后在超净工作台上接种于MS培养基中，10天后统计污染率、死亡率和成活率。

柳南香外植体的消毒所需时间较短，原因可能是我们选择在玻璃温室中生长的柳南香，人工条件较好，植物组织细嫩，采集的外植体又是较为幼嫩的，其与外界环境的接触时间较短，受到杂菌的污染几率较小，所以升汞的消毒时间不需要太长就可以达到抑制污染的目的。如果使用0.1％升汞处理时间过长时，对外植体的毒害也会相应的加深，降低了外植体的活性，导致死亡率增高。从表1可以看出，酒精浸泡20s外植体成活率不超过升汞消毒1min的55％，而成活率最高的是酒精浸泡40s、升汞消毒2min为80％，酒精浸泡20s、30s、40s的平均成活率为46.7％、61.7％、75％，说明时间太短，消毒效果不好。说明过长时间的消毒会使外植体失去生命力；综合来看最佳消毒方法为：用75％酒精沉浸40s，再用无菌水冲洗3～4遍，然后用0.1％升汞浸泡2min，再用无菌水冲洗3～4遍。

表1不同消毒方法对外植体的影响

^*成活率(％)＝100％-污染率(％)-死亡率(％)

实施例2培养基对外植体诱导的影响

1、基本培养基的选择

实验方法：以MS、1/2MS、B₅、WPM4四种培养基为基础培养基，添加琼脂7g/L后灭菌制成固体培养基备用。将柳南香的外植体经实施例1最佳方法消毒后接种于各培养基上进行培养，培养温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为12h/d。30天后统计不同培养基培养的分枝数、增殖率及诱导率。

结果见表2，1/2MS固体培养基的诱导率明显比其它培养基的好，分枝数、增殖率及诱导率都较高。

表2

2、生长调节剂的选择

实验方法：培养容器用试管型培养瓶(H100mm，￠20mm)，每管诱导培养基10ml。采集温室内柳南香植株上幼嫩的嫩梢，用75％酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗3～4遍，然后分别用0.1％升汞浸泡3min，再用无菌水冲洗3～4遍。取0.5mm大小的梢头置于诱导培养基上培养。

1/2MS培养基添加7g/L琼脂，灭菌锅内121℃灭菌半小时，冷却后分别添加不同浓度的激素6-BA和NAA制成诱导培养基，添加的6-BA浓度分别设定为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，NAA浓度分别设定为0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L和0.2mg/L，每个激素处理接种外植体20个，30d后统计萌芽数、诱导率，以此确定此基本培养基下理想的激素浓度。期间培养温度为25±2℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d。在接种一个星期之后去观察外植体的污染情况，清理已经污染的外植体，之后每隔两天去观察外植体的生长状况，并作好记录。

结果如表3，对柳南香的嫩梢采用1/2MS培养基进行培养，6-BA采用3种浓度，NAA采用4种浓度进行混合处理，从结果看来，6-BA浓度为0时，愈伤组织形成率为0，其它组合在21.2～96.2％之间，所以6-BA对愈伤组织的形成至关重要。各组合的成活率在58.2～99.6％之间。新芽的生长数和不定芽的形成，在6-BA为0添加的组合中较少，而在其它组合中显著增多，说明6-BA对芽的促发效果也很明显，新枝生长数和不定芽形成率以处理6最多，分别达到10.2个和98％，其次是处理11，分别达到6.9个和78％。因此，最佳的嫩梢诱导培养基为1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L。

表3生长调节剂各类和浓度组合对愈伤组织和芽生长的影响

Claims (3)

1.一种柳南香的初代培养方法，其特征在于，包括：以柳南香的嫩梢为外植体，消毒后，接种于诱导培养基上进行培养；所述的诱导培养基的配方为1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+7～9g/L琼脂；所述消毒的方法包括：将所述的外植体用70～75％酒精沉浸30～40s，无菌水冲洗后用0.1～0.2％升汞浸泡2～3min，再用无菌水冲洗干净。

2.根据权利要求1所述的柳南香的初代培养方法，其特征在于，酒精的浓度为75％，沉浸的时间为40s；升汞的浓度为0.1％，浸泡的时间为2min。

3.根据权利要求1所述的柳南香的初代培养方法，其特征在于，所述培养的温度为23～27℃，光照强度2900～3100lx，光照时间10～12h/d。