CN105145366A - 一种沿阶草ems同质突变体库快速构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，本发明利用沿阶草EMS体细胞诱变结合体细胞胚再生可实现短时间内获得大量多种多样的同质突变体，避免嵌合体的形成，容易产生表型可见并且遗传稳定的同质突变体库。所以此项发明不但在短时间内可快速地构建起沿阶草EMS同质突变体库，而且有利于今后沿阶草功能基因组学、遗传育种与生理发育等问题系统深入的研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法

技术领域

本发明属于植物育种领域，特别涉及一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法。

背景技术

沿阶草又名麦冬(Ophiopogonbodinieri)，是我国特有的观叶地被植物，属百合科沿阶草属中沿阶草种多年生常绿草本植物，因其植株低矮，耐荫性强，抗病抗虫性好，终生免修剪等特性，而作为许多地方理想的观叶地被植物或园林绿化中的构景植物；沿阶草还具有药用性，其块根，常为滋阴中药,《神农本草经》列为上品,还是“药食同源”品种,在保健食品的开发方面也有大量的应用。沿阶草作为我国特有的一种重要的无性繁殖植物,不但品种改良近年来不断得到重视，其特有的一些生物学性状如强耐荫性和药效好等也使得它成为寻找某些有重要利用价值的基因如耐荫基因、药用性好等基因资源发掘利用的典型材料。

分析鉴定基因的功能及基因之间的相互作用,基因对生长发育的影响，是功能基因组学的重点研究内容。目前尽管已经开发出了多种分析鉴定基因的新技术新方法,但最直接最有效的方法是构建饱和基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因的功能。所以突变体库的构建是功能基因组学的研究基础。目前模式植物拟南芥、水稻等作物均已构建了饱和突变体库并进行了相关功能基因组学的研究，获得了一批有重要价值的创新种质资源。

突变体库的构建类型：按照生物产生突变体的过程分为：自发突变体库(大约只有万分之一以上的生殖细胞会发生突变,所以突变频率很低)；理化诱变突变体库(受限于个体和器官组织水平的再生，而导致诱变后代中嵌合体现象很严重,同质突变频率很低)；和插入突变体库(易受受体材料及组培方法的影响而导致转化效率不高)等。其中，利用理化诱导剂获得突变体是目前许多植物构建突变体库的主要方法。主要原因是其操作简便，产生的突变可随机分布于整个基因组、密度高，成本低，特别适宜于饱和突变体库的创制，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。

在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate，EMS)因其可在一个基因组上产生多个点突变，且分布均匀，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体库而成为应用最广泛，即高效又稳定的一种化学诱变剂。

同质突变体的获得：最快速有效的方法就是通过单个突变细胞的组培再生获得。由同质突变体获得的变异性状由于突变体无嵌合现象，所以是能够稳定遗传的，是组成同质突变体库的基础。

但如何使一个单细胞发育成一棵完整植株，一直是许多植物组培再生的难题。目前的研究表明绝大多数植物体细胞胚起源于单细胞，体细胞胚胎发生途径重演了合子胚形态发生的过程，所以体细胞胚再生途径是再生种子来源、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转化的理想的受体系统。

长期以来大部分植物组培再生都不是依赖于细胞水平上的再生，而是局限于个体或器官组织水平的再生。由多细胞组织器官诱变产生的再生植株后代，因其众多细胞基因突变的差异性往往导致突变体嵌合现象很严重，性状不稳定、重复性差、再生筛选时间延长，同质突变体频率很低、由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊端。

研究表明：体细胞诱变、体细胞胚再生是快速获得广泛变异的同质突变体、避免嵌合体形成的理想方法，很容易在短时间内获得大量的多性状的同质突变体，产生表型可见并且遗传稳定的突变体库。所以体细胞化学诱变技术结合体细胞胚再生技术，是保证快速获得EMS同质突变体库的关键技术。

目前国内外尚未发现利用遗传背景相同的细叶沿阶草体细胞通过EMS诱变处理,体细胞胚再生植株构建具有丰富变异材料的饱和同质突变体库的方法报道。因此本发明突破了以往大多数植物：1)尽管以化学诱变方法创制了突变体，但构建突变体库的亲本材料的遗传背景不相同；2)尽管以化学诱变方法创制了突变体，但突变体大多是以个体或器官组织发生途径再生的植株，从而导致突变体嵌合现象非常严重；3)由于突变体嵌合现象很严重，所以产生的性状很不稳定，延长了再生筛选时间，很难快速获得同质突变体，也就难以快速构建起遗传稳定的变异丰富的饱和同质突变体库。本项发明提供的一种快速构建沿阶草EMS饱和同质突变体库的方法，不但有利于沿阶草功能基因组学、遗传育种与生理发育等问题进行系统深入研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的实用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明主要解决的问题是提供一种体细胞EMS诱变与体细胞胚再生相结合，快速构建沿阶草EMS饱和同质突变体库的一种优化方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，该方法包括如下步骤：

1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶并带3-4片幼叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；

2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25-28℃无菌室暗培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；

3)化学诱变剂准备：包括不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液准备；

4)早期体细胞胚外植体的EMS处理：将早期体细胞胚外植体先分成6个大组，每个大组再分成3份，6个大组用于6个不同浓度的EMS诱变剂的处理；每个大组分成的3份分别用于3个不同浸泡时间的处理；EMS溶液浸泡处理时间分为：1.0小时、1.5小时和2.0小时；

5)体细胞胚分化培养：将经EMS诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新接种于体胚发生诱导培养基继续在温度为25-28℃无菌室暗培养至50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；

6)突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的突变胚状体；

7)成熟突变胚状体再生植株：将成熟突变胚状体转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的再生植株；

8)突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1-1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；成活率可达100％。揭去培养瓶的封口膜,在室内炼苗1～2d，用镊子小心取出小苗,洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石＝1:1)的花盆中，放入温室温度为24℃～26℃，适当遮荫,或将小苗放到苗床下,自动间歇喷雾装置浇水。

9)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草理化饱和突变体库，用于后续沿阶草选择育种和基因功能组学等方面的研究。

由于小苗生长旺盛,对移栽大田的条件要求也不高,极易种植,小苗的成活率可达100％。

其中，所述EMS溶液配制成0.0-1.0％6个不同浓度；EMS浓度优选0.4％，EMS溶液浸泡处理时间优选1.5小时。

其中，所述无菌培养基培养为1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+0.7％琼脂。

其中，所述诱导培养基为MS+0.2mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel。

其中，所述步骤4)中EMS溶液处理步骤为：在无菌环境下取出已准备好的用于EMS处理的外植体浸泡于各浓度的EMS溶液中处理1.5±0.5小时，处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后，重新接种于体胚发生诱导培养基中进行体细胞胚分化培养。

其中，所述步骤6)中体细胞胚快繁增殖培养基为MS+2mg/LBA+0.2mg/LNAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时。

其中，所述步骤7)中植株再生培养基为1/2MS+20g/L白糖+0.7％琼脂。

其中，本发明所述的高频体胚再生系统是指将初生胚状体转入高频体细胞胚培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)上光下培养50-60d，中间继代一次，就会持续不断大量地产生次生胚状体即体细胞胚(球形胚、鱼雷胚和子叶胚)。为保证得到遗传背景一致的沿阶草EMS诱导饱和突变体库，需将成熟的胚状体(子叶胚)转入无激素的成苗培养基(MS+白糖30g/L+0.7％琼脂)光下培养，20-25d后形成完整再生植株，以其作为高频体细胞胚材料来源，切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块作为高频体细胞胚外植体材料，放在体胚发生诱导培养基上暗培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚(胚性单细胞)作为诱变剂处理材料。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate，EMS)是应用最广泛，即高效又稳定的化学诱变剂。其中EMS可在一个基因组上产生多个点突变，产生的突变可随机分布于整个基因组，且分布均匀，密度高，成本低，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体库；而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。本发明利用EMS化学诱变剂的明显优点，又克服了以往利用其获得的突变体通常因其起源于多细胞，由于不同细胞突变基因的差异性，往往就导致突变体嵌合现象特别严重，后代性状很难稳定，导致重复性差，影响突变体再生性、延长了突变体筛选时间，使得获得同质突变体频率很低，由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊端。本发明利用沿阶草EMS体细胞诱变结合体细胞胚再生可实现短时间内获得大量多种多样的同质突变体，避免嵌合体的形成，容易产生表型可见并且遗传稳定的同质突变体库。所以此项发明不但在短时间内可快速地构建起沿阶草EMS同质突变体库，而且有利于今后沿阶草功能基因组学、遗传育种与生理发育等问题系统深入的研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1胚性单细胞；

图2球形胚和鱼雷胚；

图3子叶胚(左)和快繁突变体再生植株(右：细叶沿阶草)；

图4盆栽细叶沿阶草同质突变体库(左)和亲本种质(右)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1以沿阶草中细叶沿阶草为实验材料进行说明。步骤是：

1)高频体细胞胚外植体材料准备和早期体细胞胚外植体的培养：

选取健康无病虫害的沿阶草植株，剥去老叶，取其幼嫩茎基并带3-4片幼叶，无菌消毒后放入无菌培养基培养(1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+蔗糖20g/L+0.7％琼脂)50-60d，中间继代一次，组培成试管苗，取其试管苗叶、茎基部0.5-1.0cm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基(MS+BA(0.2mg/L)+NAA(0.5mg/L)+2，4-二氯苯氧乙酸(0.5mg/L)+蔗糖30g/L+3.5g/Lphytagel)上暗培养50-60d，中间继代一次，将产生的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel(植物凝胶))上光下培养50-60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生各个发育时期的体细胞胚(球形胚、鱼雷胚和子叶胚)，将成熟胚状体(子叶胚)转入无激素的成苗培养基(MS+白糖30g/L+0.7％琼脂)培养，20-25天后形成完整再生植株，以其作为高频体细胞胚材料来源。切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块作为高频体细胞胚外植体材料，放在体胚发生诱导培养基上培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚(图1：胚性单细胞)，在体胚发生的早期作为诱变剂处理材料。

2)EMS溶液准备：配制0.01mol/L、pH5.8的磷酸缓冲液：将1mol/L的Na₂HPO₄溶液定为A液，将1mol/L的Na₂HPO₄溶液定为B液，分别取A液9.21mL和B液0.79mL，加入到量筒中，定容至1L，高压灭菌后冷却至室温；不同浓度EMS溶液配制：EMS浓度以重量百分比计，配制成0.0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％6个不同浓度，要求在无菌条件下用一次性注射器吸取相应浓度的EMS经0.22μm的微孔过滤器注射到上述磷酸缓冲液中；

3)早期体细胞胚外植体的EMS处理：将在体胚发生诱导培养基上培养的早期体细胞胚外植体分成6组，每组再分成3份，用于6个不同浓度3个不同侵泡时间EMS溶液处理，即在无菌环境下取出已准备好的用于EMS处理的外植体浸泡于上述各浓度的EMS溶液中处理1.5±0.5小时，处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后，重新接种于体胚发生诱导培养基中进行下一步筛选培养；

4)体细胞胚分化培养：将经EMS诱变处理过的体细胞胚外植体转移到温度为25-28℃无菌室进行暗培养50-60d左右，可见外植体上大大小小生长发育出几十个突变胚状体(图2：球形胚、鱼雷胚)。常温暗培养可保证快速获得同质饱和突变体库。

5)突变胚状体快繁増殖培养：将上述突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)，放在25-28℃光下培养50-60d，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时。中间继代一次，可获得大量成熟的突变胚状体(图3：子叶胚和快繁突变体再生植株)，可保证快速获得同质饱和突变体库。

6)突变胚状体再生植株：将突变胚状体转接于植株再生培养基中(1/2MS+白糖20g/L+0.7％琼脂)，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的再生植株。

7)突变体再生植株炼苗移栽：当根生长到1-1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水。成活率可达100％。揭去培养瓶的封口膜，在室内炼苗1～2d，用镊子小心取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石＝1:1)的花盆中，放入温室温度为24℃～26℃，适当遮荫，或将小苗放到苗床下，自动间歇喷雾装置浇水。

8)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系分别编号，移栽到室外林下或田间区试圃。由于小苗生长旺盛，对移栽大田的条件要求也不高，极易种植，小苗的成活率可达100％。后期根据生育期记载突变体相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选。以此建立起沿阶草EMS饱和同质突变体库，(图4：盆栽细叶沿阶草同质突变体库和亲本种质)，用于后续沿阶草选择育种和基因功能组学等方面的研究。

Claims (7)

1.一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；

2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25-28℃无菌室暗培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；

3)化学诱变剂准备：包括不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液准备；

4)早期体细胞胚外植体的EMS处理：将早期体细胞胚外植体先分成6个大组，每个大组再分成3份，6个大组用于6个不同浓度的EMS诱变剂的处理；每个大组分成的3份分别用于3个不同浸泡时间的处理；EMS溶液浸泡处理时间分为：1.0小时、1.5小时和2.0小时；

5)体细胞胚分化培养：将经EMS诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新接种于体胚发生诱导培养基继续在温度为25-28℃无菌室暗培养至50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；

6)突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的突变胚状体；

7)成熟突变胚状体再生植株：将成熟突变胚状体转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的再生植株；

8)突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1-1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；

9)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草理化饱和突变体库。

2.根据权利要求1所述的一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，所述EMS溶液配制成0.0-1.0%6个不同浓度；EMS浓度优选0.4%，EMS溶液浸泡处理时间优选1.5小时。

3.根据权利要求1所述的一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，所述无菌培养基培养为1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+0.7%琼脂。

4.根据权利要求1所述的一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，所述诱导培养基为MS+0.2mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel。

5.根据权利要求1所述的一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，所述步骤4）中EMS溶液处理步骤为：在无菌环境下取出已准备好的用于EMS处理的外植体浸泡于各浓度的EMS溶液中处理1.5±0.5小时，处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后，重新接种于体胚发生诱导培养基中进行体细胞胚分化培养。

6.根据权利要求1所述的一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，所述步骤6）中体细胞胚快繁增殖培养基为MS+2mg/LBA+0.2mg/LNAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时。

7.根据权利要求1所述的一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，所述步骤7）中植株再生培养基为1/2MS+20g/L白糖+0.7%琼脂。