CN105123530A - 一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法。甲基磺酸乙酯和⁶⁰Co-γ射线是应用最广泛，即高效又稳定的理化诱变剂。其中EMS可在一个基因组上产生多个点突变，产生的突变可随机分布于整个基因组，且分布均匀，密度高，成本低，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体库；而r射线诱变主要是引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族基因功能缺失的突变体库的创建；所以这两种方法同时使用，通过优势互补，既可以增加突变体库的容量，又能满足饱和突变体库的要求，更加丰富了饱和突变体库的内容，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。

Description

一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法

技术领域

本发明属于植物育种领域，涉及一种高效快速构建植物突变体库的方法，尤其涉及一种通过理化诱变剂复合诱变(r射线和甲基磺酸乙酯(EMS))高效快速创制沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法。

背景技术

沿阶草又名麦冬(Ophiopogonjaponicus)，有三个种，沿阶草(Ophiopogonbodinieri.)；矮生沿阶草(Ophiopogonjaponicusf.nanus)和黑沿阶草(O.japonicus(L.f.)Ker-Gawl.)，均属于百合科沿阶草属。沿阶草是我国特有的观叶多年生常绿草本地被植物，因其植株低矮，具强喜荫性，抗病抗虫性好，终生免修剪等特性，而作为许多地方理想的观叶地被植物或园林绿化中的构景植物；沿阶草还具有药用性，其块根，常为滋阴中药,《神农本草经》列为上品,还是“药食同源”品种，其丰富的多糖和高异黄铜类化合物在保健食品的开发方面也有大量的应用。沿阶草野生种质资源在我国非常丰富，生产上主要以开发利用为主，研究方面主要集中在组培快繁方面，近年来随着开发力度的增大,其品种改良不断得到重视，其特有的一些生物学性状如矮生性、强耐荫性、药理活性和化学成分的分析研究等也不断得到加强，使得它成为寻找某些有重要利用价值的基因如矮生基因、耐荫基因和控制多糖和高异黄铜类化合物等基因资源发掘利用的典型材料。所以创建沿阶草突变体库，不但对于进行大规模、高通量的沿阶草功能基因组研究意义重大，还对加速获得具有自主知识产权的重要基因(外可用于鉴定和分离基因，内可用于筛查特殊基因)和培育优质、耐逆性强、生态安全性高的沿阶草新品种具有重要的战略意义；同时，也为沿阶草正向遗传学和功能基因组学分析提供丰富的研究材料，具有重要的现实意义。

目前模式植物拟南芥、水稻等作物均已构建了饱和突变体库并进行了相关功能基因组学的研究，获得了一批有重要价值的创新种质资源。随着新技术和新方法在植物功能基因组研究中的发展完善，高效快速大规模地创制与品质、抗逆性等密切相关的同质突变体库已成为很多植物某类特定功能基因组学研究或如抗寒遗传学、分子生物学机理等非常重要的材料，目前有关沿阶草饱和高抗同质突变体库的创建国内外均未见报道。

利用化学或物理诱导剂获得突变体是目前许多植物构建突变体库的主要方法。因其操作简便，产生的突变可随机分布于整个基因组、密度高，成本低，特别适宜于饱和突变体库的创制，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。

在众多理化诱变剂中，甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate，EMS)和⁶⁰Co-γ射线是应用最广泛，即高效又稳定的理化诱变剂。其中EMS可在一个基因组上产生多个点突变，且分布均匀，有利于等位基因突变体的获得，特别是其较小的突变群体便可获得饱和的突变体库；而r射线主要引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族基因功能缺失的突变体库的创建。所以如果这两种方法结合在一起使用，即通过一种复合诱变方法，不但通过优势互补，增加突变体库的容量，还能满足对饱和突变体库的要求。目前两种方法相结合一起使用构建植物突变体库还未见报道，尤其是利用两种方法相结合构建沿阶草饱和突变体库国内外未见报道。

在理化诱变后及时使用选择压力对基因突变的细胞进行筛选可在一定程度上实现定向诱变，也可以发展为定向诱导基因组某一类型突变或者以其高通量筛选技术高效快速大量获得定向细胞突变体，由此产生定向同质突变体库。

长期以来大部分植株再生都不是依赖于细胞水平上的再生，而是局限于个体或器官组织水平的再生，由多细胞组织器官诱变产生的再生植株后代，因其个体众多细胞基因突变的差异性往往导致突变体嵌合现象很严重，性状不稳定、重复性差、再生筛选时间延长，同质突变体频率很低、由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊端。

如何使一个单细胞发育成一棵完整植株，一直是许多植物组培再生的难题。目前的研究表明绝大多数植物体细胞胚起源于单细胞，体细胞胚胎发生途径重演了合子胚形态发生的过程，所以体细胞胚是高效再生种子来源、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转化的理想的受体系统。

研究表明：体细胞诱变、体细胞定向筛选及体细胞胚再生是高效快速定向获得同质突变体、避免嵌合体形成的理想方法，很容易在短时间内获得大量的某一类型多性状的同质突变体，产生表型可见并且遗传稳定的突变体库。所以体细胞理化诱变技术结合体细胞突变筛选技术及体细胞胚再生技术，不但是保证高效快速获得饱和同质突变体库的关键技术，还是保证高效快速定向获得同质突变体库的关键技术。

目前国内外尚未发现利用沿阶草体细胞通过r射线和EMS复合诱变再通过体细胞胚直接再生植株或通过沿阶草体细胞r射线和EMS复合诱变后再紧接着进行体细胞定向筛选，之后再通过体细胞胚直接再生植株，以其构建具有丰富变异材料的饱和高抗同质突变体库的方法报道。因此本发明突破了以往：1)只以物理或化学等一种诱变方法创建突变体库；2)以器官发生再生植株而导致突变体嵌合现象非常严重；对嵌合突变体进行筛选，不仅延长筛选时间有时甚至是无意义的筛选，很难通过定向筛选快速获得同质突变体；3)由于突变体嵌合现象很严重，导致后代性状不稳定、重复性差、突变体筛选鉴定时间延长，同质突变体频率很低。所以以往方法很难快速获得遗传稳定的变异丰富的及定向突变的同质突变体，也就难以高效快速地构建起遗传稳定的饱和定向同质突变体库。此项发明不但有利于沿阶草功能基因组学、分子生物学机理、遗传育种与药理机制等方面的研究，还是沿阶草抗逆遗传学、抗逆基因克隆非常重要的材料，具有重要的理论意义与使用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明主要解决的技术问题是提供一种沿阶草体细胞r射线和EMS复合诱变后直接通过体细胞胚再生植株，及体细胞经r射线和EMS复合诱变后再通过体细胞耐冷性定向筛选，之后通过体细胞胚再生植株的一种复合技术的优化组合，通过其高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的一种优化方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，该方法包括如下步骤：

1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；

2)早期体细胞胚外植体的培养：切取上述具高频体细胞胚再生能力的外植体的叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；

3)γ射线和EMS理化诱变剂准备：包括⁶⁰Co-γ射线源准备及辐射剂量的设置和不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液准备；⁶⁰Co-γ射线源：由江苏里下河地区农业科学研究所提供；EMS溶液准备：配制0.01mol/L、pH5.8的磷酸缓冲液并将诱导剂甲基磺酸乙酯(EMS)溶于该磷酸缓冲液中，制得EMS溶液。其中所述0.01mol/L、pH5.8的磷酸缓冲液和EMS溶液的配制方法是：将1mol/L的Na2HPO4溶液定为A液，将1mol/L的NaH2PO4溶液定为B液，分别取A液9.21mL和B液0.79mL，加入到量筒中，定容至1L，高压灭菌后冷却至室温。在无菌条件下用一次性注射器吸取EMS经0.22um的微孔过滤器注射到磷酸缓冲液中，制成从0.0、0.3％、0.6％3个不同浓度的EMS溶液；

4)早期体细胞胚外植体的γ射线和EMS复合处理：将早期体细胞胚外植体先分成6个大组用于6个不同剂量γ射线处理，每个大组待γ射线处理结束后，再分成3份用于3个不同浓度EMS诱变剂的处理；其中⁶⁰Co-γ射线处理：将已准备好的用于⁶⁰Co-γ射线处理的6个大组的外植体直接放在不同辐射剂量⁶⁰Co-γ射线下照射，处理结束后，拿回无菌室再进行EMS溶液处理：在无菌环境下将经γ射线处理的外植体再分成3份用于3个不同浓度EMS诱变剂的处理。每份外植体浸泡于上述各浓度的EMS溶液中处理1.5小时，处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后，重新接种于体胚发生诱导培养基中进行下一步筛选培养。

5)细胞突变体筛选处理：将上述经γ射线和EMS复合处理过的早期体细胞胚外植体分成2大类分别编号，取其中1大类进行低温筛选处理，即放入5-8℃低温无菌培养箱中暗培养7-10d；通过低温逆境筛选，可以保证高效定向筛选到抗逆(冷)性较强的突变体细胞。

6)体细胞胚分化培养：将2大类早期体细胞胚外植体即经低温筛选处理和未经低温筛选处理的均转移到温度为25-28℃无菌室暗培养50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期同质突变胚状体；常温暗培养可保证快速获得同质饱和突变体库。

7)同质突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期同质突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；

8)成熟同质突变胚状体的耐冷性筛选及快繁増殖培养：取上述经低温筛选并经快繁増殖的那1类成熟同质突变胚状体，切成0.5cm大小块，分别编号接种于体细胞胚快繁增殖培养基，放入5-8℃低温无菌培养箱中弱光下(500-800lx)培养25-30d后，再继代转入25-28℃光下(1500-2000lx)培养25-30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；

9)成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗逆(冷)性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；

10)同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1-1.5cm时,将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；成活率可达100％。揭去培养瓶的封口膜,在室内炼苗1～2d，用镊子小心取出小苗,洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石＝1:1)的花盆中，放入温室温度为24℃～26℃，适当遮荫,或将小苗放到苗床下,自动间歇喷雾装置浇水。

11)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的过程中进行突变体筛选、种质遗传多样性鉴定，以此高效快速构建起沿阶草理化诱变饱和高抗同质突变体库。用于后续沿阶草遗传育种、生理药理机制分析和基因功能组学等方面的研究。由于小苗生长旺盛,对移栽大田的条件要求也不高,极易种植,小苗的成活率可达100％。

其中，辐射剂量和EMS溶液浓度：辐射剂量设置为0.0、5Gy10Gy15Gy20Gy25Gy6个不同处理；EMS溶液配制成0.0、0.3％和0.6％3个不同浓度。

其中，所述⁶⁰Co-γ射线辐射剂量为15Gy；EMS浓度为0.3％，EMS溶液浸泡处理时间1.5小时。

其中，所述无菌培养基培养为1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+0.7％琼脂。

其中，所述诱导培养基为MS+0.2mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel。

其中，所述步骤1)高频体胚再生系统的培养：是指将初生胚状体转入高频体细胞胚培养基上光下培养50-60d，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时，中间继代一次，就会持续不断大量地产生次生胚状体即体细胞胚。

其中，所述高频体细胞胚培养基为MS+2mg/LBA+0.5mg/LNAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel。

其中，所述步骤7)中体细胞胚快繁增殖培养基为MS+2mg/LBA+0.2mg/LNAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时。

其中，所述步骤9)中植株再生培养基为1/2MS+20g/L白糖+0.7％琼脂。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate，EMS)和⁶⁰Co-γ射线是应用最广泛，即高效又稳定的理化诱变剂。其中EMS可在一个基因组上产生多个点突变，产生的突变可随机分布于整个基因组，且分布均匀，密度高，成本低，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体库；而r射线诱变主要是引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族基因功能缺失的突变体库的创建；所以这两种方法同时使用，通过优势互补，既可以增加突变体库的容量，又能满足饱和突变体库的要求，更加丰富了饱和突变体库的内容，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。对诱变细胞利用选择压力进行筛选可实现定向诱变，也可以定向诱导基因组某一类型特定突变或者以其高通量筛选技术高效快速大量获得定向地细胞突变体。体细胞诱变结合体细胞筛选及体细胞胚再生可实现短时间内获得大量多种多样的定向同质突变体，容易产生表型可见并且遗传稳定的高抗同质突变体库。通常突变体因其起源于多细胞，由于不同细胞突变基因的差异性，往往容易导致突变体嵌合现象特别严重，后代性状很难稳定，导致重复性差，影响突变体再生性、延长了突变体筛选时间，使得获得同质突变体频率很低，由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊端。所以此项发明不但在短时间内高效快速构建了饱和高抗沿阶草同质突变体库，而且有利于今后沿阶草功能基因组学、抗性遗传育种与生理药理发育等问题系统深入的研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1细叶沿阶草；矮生沿阶草和黑沿阶草；

图2胚性单细胞(左：细叶沿阶草；右：矮生沿阶草)；

图3鱼雷胚、子叶胚和同质突变体(左：细叶沿阶草；右：黑沿阶草)；

图4高抗同质突变体(黑沿阶草)；

图5高抗同质突变体(细叶沿阶草)；

图6盆栽沿阶草饱和高抗同质突变体库；

图7AAG/CTC引物组合在30份沿阶草种质中扩增的AFLP指纹；

图8根据AFLP遗传相似系数计算的30份沿阶草种质的聚类图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1以细叶沿阶草高效快速饱和高抗同质突变体库构建的优化方法为例进行说明。步骤是：

1)高频体细胞胚外植体材料准备和早期体细胞胚外植体的培养：选取健康无病虫害的细叶沿阶草植株(图1：细叶沿阶草；矮生沿阶草和黑沿阶草)，剥去老叶，取其幼嫩茎基并带3-4片幼叶，无菌消毒后放入无菌培养基培养(1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+蔗糖20g/L+0.7％琼脂)50-60d，中间继代一次，组培成试管苗，取其试管苗叶、茎基部0.5-1.0cm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基(MS+BA(0.2mg/L)+NAA(0.5mg/L)+2.4D(0.5mg/L)+蔗糖30g/L+3.5g/Lphytagel)上培养50-56d，中间继代一次，将产生的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)上光下培养50-60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生各个发育时期的体细胞胚(球形胚、鱼雷胚)和胚状体，将胚状体转入无激素的成苗培养基(MS+白糖30g/L+0.7％琼脂)培养，20-25天后形成完整再生植株，以其作为高频体细胞胚材料来源。切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块作为高频体细胞胚外植体材料，放在体胚发生诱导培养基上培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚(图2：胚性单细胞左：细叶沿阶草)在体胚发生的早期作为诱变剂处理材料。

2)⁶⁰Co-γ射线诱变剂准备和EMS溶液准备：⁶⁰Co-γ射线诱变剂准备：⁶⁰Co-γ射线源由江苏里下河地区农业科学研究所提供；辐射剂量设置为0.0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy6个不同处理；EMS溶液准备：配制0.01mol/L、pH5.8的磷酸缓冲液：将1mol/L的Na2HPO4溶液定为A液，将1mol/L的NaH2PO4溶液定为B液，分别取A液9.21mL和B液0.79mL，加入到量筒中，定容至1L，高压灭菌后冷却至室温；不同浓度EMS溶液配制：EMS浓度以重量百分比计，配制成0.0、0.3％、0.6％3个不同浓度，要求在无菌条件下用一次性注射器吸取相应浓度的EMS经0.22um的微孔过滤器注射到上述磷酸缓冲液中；

3)早期体细胞胚外植体的γ射线处理和EMS处理：γ射线处理：将在体胚发生诱导培养基上培养的早期体细胞胚外植体分成6个大组用于不同⁶⁰Co-γ射线的处理，6组外植体直接放在6个不同辐射剂量γ射线下照射，处理结束后，拿回无菌室每组再分成3份用于3个不同EMS溶液处理；EMS处理：将经⁶⁰Co-γ射线处理的外植体每个处理分成3份用于3个不同EMS溶液处理：在无菌环境下取出已准备好的外植体浸泡于上述各浓度的EMS溶液中处理1.5小时，处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后，重新接种于体胚发生诱导培养基中进行下一步培养；

4)细胞突变体筛选处理：是将上述经γ射线和EMS复合诱变处理过的早期体细胞胚外植体分成2大类分别编号，取其中1大类进行低温筛选处理，即放入5-8℃低温无菌培养箱中暗培养7-10d。通过低温逆境筛选，可以保证高效定向筛选到抗逆(冷)性较强的突变体细胞。

5)体细胞胚分化培养：将上述2大类早期体细胞胚外植体即经低温筛选处理和未经低温筛选处理的均转移到温度为25-28℃无菌室暗培养50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期同质突变胚状体。常温暗培养可保证快速获得同质饱和突变体库。

6)突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期同质突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体(图3：鱼雷胚、子叶胚和同质突变体(左：细叶沿阶草)。

7)同质突变胚状体的耐冷性筛选及快繁増殖培养：是取上述经低温筛选并经快繁増殖的那1类成熟同质突变胚状体，切成0.5cm大小块，分别编号继续转接于体细胞胚快繁增殖培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)，放入5-8℃低温无菌培养箱中弱光下(500-800lx)培养25-30d，之后再继代转入25-28℃光下培养25-30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体。

8)成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗逆(冷)性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中(1/2MS+白糖20g/L+0.7％琼脂)，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株(图5：高抗同质突变体(左：细叶沿阶草)。

9)突变体再生植株炼苗移栽：当根生长到1-1.5cm时,将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水。成活率可达100％。揭去培养瓶的封口膜,在室内炼苗1～2d，用镊子小心取出小苗,洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石＝1:1)的花盆中，放入温室温度为24℃～26℃，适当遮荫，或将小苗放到苗床下,自动间歇喷雾装置浇水。成活率可达100％(图6：盆栽矮生沿阶草同质突变体库)。

10)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系分别编号，移栽到室外林下或田间区试圃。由于小苗生长旺盛,对移栽大田的条件要求也不高,极易种植,小苗的成活率可达100％。后期根据生育期记载突变体相关性状，在同质突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选、种质遗传多样性鉴定等。(表1：30份沿阶草种质样品编号及名称；图7：AAG/CTC引物组合在30份沿阶草种质中扩增的AFLP指纹；表2：9个AFLP引物组合在30份沿阶草种质中检测到的遗传变异信息；图8：根据AFLP遗传相似系数计算的30份沿阶草种质的聚类图)。以此高效快速建立起细叶沿阶草理化诱变饱和高抗突变体库，用于后续沿阶草遗传育种、生理药理机制分析和基因功能组学等方面的研究。

表1：30份沿阶草种质样品编号及名称

表2：9个AFLP引物组合在30份沿阶草种质中检测到的遗传变异信息

实施例2以沿阶草中的黑沿阶草高效快速饱和高抗同质突变体库构建的优化方法为例进行说明。步骤是：

1)高频体细胞胚外植体材料准备和早期体细胞胚外植体的培养：选取健康无病虫害的黑沿阶草植株，剥去老叶，取其幼嫩茎基并带3-4片幼叶，无菌消毒后放入无菌培养基培养(1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+蔗糖20g/L+0.7％琼脂)50-60d，中间继代一次，组培成试管苗，取其试管苗叶、茎基部0.5-1.0cm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基(MS+BA(0.2mg/L)+NAA(0.5mg/L)+2.4D(0.5mg/L)+蔗糖30g/L+3.5g/Lphytagel)上培养50-56d，中间继代一次，将产生的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)上光下培养50-60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生各个发育时期的体细胞胚(球形胚、鱼雷胚)和胚状体，将胚状体转入无激素的成苗培养基(MS+白糖30g/L+0.7％琼脂)培养，20-25天后形成完整再生植株，以其作为高频体细胞胚材料来源。切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块作为高频体细胞胚外植体材料，放在体胚发生诱导培养基上培养7-10d，在体胚发生的早期作为诱变剂处理材料。

2)⁶⁰Co-γ射线诱变剂准备和EMS溶液准备：⁶⁰Co-γ射线诱变剂准备：⁶⁰Co-γ射线源由江苏里下河地区农业科学研究所提供；辐射剂量设置为0.0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy6个不同处理；EMS溶液准备：配制0.01mol/L、pH5.8的磷酸缓冲液：将1mol/L的Na2HPO4溶液定为A液，将1mol/L的NaH2PO4溶液定为B液，分别取A液9.21mL和B液0.79mL，加入到量筒中，定容至1L，高压灭菌后冷却至室温；不同浓度EMS溶液配制：EMS浓度以重量百分比计，配制成0.0、0.3％、0.6％3个不同浓度，要求在无菌条件下用一次性注射器吸取相应浓度的EMS经0.22um的微孔过滤器注射到上述磷酸缓冲液中；

3)早期体细胞胚外植体的γ射线处理和EMS处理：γ射线处理：将在体胚发生诱导培养基上培养的早期体细胞胚外植体分成6个大组用于不同⁶⁰Co-γ射线的处理，6组外植体直接放在6个不同辐射剂量γ射线下照射，处理结束后，拿回无菌室每组再分成3份用于3个不同EMS溶液处理；EMS处理：将经⁶⁰Co-γ射线处理的外植体每个处理分成3份用于3个不同EMS溶液处理：在无菌环境下取出已准备好的外植体浸泡于上述各浓度的EMS溶液中处理1.5小时，处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后，重新接种于体胚发生诱导培养基中进行下一步培养；

4)细胞突变体筛选处理：是将上述经γ射线和EMS复合诱变处理过的早期体细胞胚外植体分成2大类分别编号，取其中1大类进行低温筛选处理，即放入5-8℃低温无菌培养箱中暗培养7-10d。通过低温逆境筛选，可以保证高效定向筛选到抗逆(冷)性较强的突变体细胞。

5)体细胞胚分化培养：将上述2大类早期体细胞胚外植体即经低温筛选处理和未经低温筛选处理的均转移到温度为25-28℃无菌室暗培养50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期同质突变胚状体。常温暗培养可保证快速获得同质饱和突变体库。

6)突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期同质突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体(图3：鱼雷胚、子叶胚和同质突变体(右：黑沿阶草)。

7)同质突变胚状体的耐冷性筛选及快繁増殖培养：是取上述经低温筛选并经快繁増殖的那1类成熟同质突变胚状体，切成0.5cm大小块，分别编号继续转接于体细胞胚快繁增殖培养基(MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel)，放入5-8℃低温无菌培养箱中弱光下(500-800lx)培养25-30d，之后再继代转入25-28℃光下培养25-30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体(图4：高抗同质突变体(右：黑沿阶草)。

8)成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗逆(冷)性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中(1/2MS+白糖20g/L+0.7％琼脂)，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株。

9)突变体再生植株炼苗移栽：当根生长到1-1.5cm时,将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水。成活率可达100％。揭去培养瓶的封口膜,在室内炼苗1～2d，用镊子小心取出小苗,洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石＝1:1)的花盆中，放入温室温度为24℃～26℃，适当遮荫,或将小苗放到苗床下,自动间歇喷雾装置浇水。成活率可达100％(图6：盆栽矮生沿阶草同质突变体库)。

10)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系分别编号，移栽到室外林下或田间区试圃。由于小苗生长旺盛,对移栽大田的条件要求也不高,极易种植,小苗的成活率可达100％。后期根据生育期记载突变体相关性状，在同质突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选。以此高效快速建立起黑沿阶草理化饱和高抗突变体库，用于后续沿阶草遗传育种、生理药理机制分析和基因功能组学等方面的研究。

Claims (9)

1.一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；

2)早期体细胞胚外植体的培养：切取上述具高频体细胞胚再生能力的外植体的叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；

3)γ射线和EMS理化诱变剂准备：包括⁶⁰Co-γ射线源准备及辐射剂量的设置和不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液准备；

4)早期体细胞胚外植体的γ射线和EMS复合处理：将早期体细胞胚外植体先分成6个大组用于6个不同剂量γ射线处理，每个大组待γ射线处理结束后，再分成3份用于3个不同浓度EMS诱变剂的处理；

5)细胞突变体筛选处理：将上述经γ射线和EMS复合处理过的早期体细胞胚外植体分成2大类分别编号，取其中1大类进行低温筛选处理，即放入5-8℃低温无菌培养箱中暗培养7-10d；

6)体细胞胚分化培养：将2大类早期体细胞胚外植体即经低温筛选处理和未经低温筛选处理的均转移到温度为25-28℃无菌室暗培养50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期同质突变胚状体；

7）同质突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期同质突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；

8)成熟同质突变胚状体的耐冷性筛选及快繁増殖培养：取上述经低温筛选并经快繁増殖的那1类成熟同质突变胚状体，切成0.5cm大小块，分别编号接种于体细胞胚快繁增殖培养基，放入5-8℃低温无菌培养箱中弱光下（500-800lx）培养25-30d后，再继代转入25-28℃光下（1500-2000lx）培养25-30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；

9)成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗逆（冷）性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；

10）同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1-1.5cm时,将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；

11)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的过程中进行突变体筛选、种质遗传多样性鉴定，以此高效快速构建起沿阶草理化诱变饱和高抗同质突变体库。

2.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，辐射剂量和EMS溶液浓度：辐射剂量设置为0.0、5Gy10Gy15Gy20Gy25Gy6个不同处理；EMS溶液配制成0.0、0.3%和0.6%3个不同浓度。

3.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述⁶⁰Co-γ射线辐射剂量为15Gy；EMS浓度为0.3%，EMS溶液浸泡处理时间1.5小时。

4.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述无菌培养基培养为1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+0.7%琼脂。

5.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述诱导培养基为MS+0.2mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel。

6.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述步骤1）高频体胚再生系统的培养：是指将初生胚状体转入高频体细胞胚培养基上光下培养50-60d，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时，中间继代一次，就会持续不断大量地产生次生胚状体即体细胞胚。

7.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述高频体细胞胚培养基为MS+2mg/LBA+0.5mg/LNAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel。

8.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述步骤7）中体细胞胚快繁增殖培养基为MS+2mg/LBA+0.2mg/LNAA+40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagel，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天10-14小时。

9.根据权利要求1所述的一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，所述步骤9）中植株再生培养基为1/2MS+20g/L白糖+0.7%琼脂。