KR20110050871A - 제초제 저항성 백합의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 제초제 저항성 백합 - Google Patents

제초제 저항성 백합의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 제초제 저항성 백합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제초제 저항성 백합의 제조 방법 및 그에 따른 제초제 저항성 백합에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (1) 백합의 기내 배양 소자구의 인편을 횡축으로 2~3mm 크기로 썰어 피클로람(Picloram)이 첨가된 MS 고체 배지에 배양하여 배발생 캘러스를 유도하는 단계; (2) 상기 유도된 백합 캘러스에 제초제 저항성 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 입자충격(particle bombardment)을 실시하여 공배양하는 단계; (3) 상기 공배양한 식물세포를 제초제가 첨가된 선발 배지에서 12~16주간 선발하는 단계; (4) 상기 선발된 백합 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성 백합의 제조 방법, 상기 방법에 따라 제조된 제초제 저항성 백합 식물체 및 상기 식물체의 종자에 관한 것이다.
백합, 입자충격, 형질전환, 제초제, 저항성, 종자

Description

제초제 저항성 백합의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 제초제 저항성 백합{Method for producing herbicide-resistant lily plants and herbicide -resistant lily plants produced by the method}
본 발명은 제초제 저항성 백합의 제조 방법 및 그에 따른 제초제 저항성 백합 및 이의 종자에 관한 것이다.
나리과 (Liliaceae) 나리속 (lilium)에 속하는 나리는 한국, 중국, 일본 등 아시아에 71종, 유럽 및 러시아에 22종, 북아메리카에 37종 등, 약 130 여종의 자생종이 북반구 온대 및 난대지역 (10°~ 60°)에 넓게 분포하고 있으며, 변종까지 포함하면 600 여종 이상의 품종이 있는 것으로 알려져 있다. 1967년 영국 왕립원예학회 (RHS; Royal Horticultural Society) 발행인 ‘The international lily register'에서는 나리를 교잡 친화성에 따라 7개의 그룹으로 분류하였는데, Asiatic group, Martagon group, Candidum group, American group, Longiflorum group, Trumpet group, Oriental group 이며, 이 중 아시아 지역에 분포하고 있는 Asiatic, Longiflorum, Oriental group에 속하는 종들이 고전육종에 사용되어 왔다 (Shimizu, 1987, Seibundo Shinkosha, Tokyo pp 148-165).
세계적으로 1960년 이래 등록된 품종 수는 7,000 여종 이상인데, 현재는 화란 및 일본 등에서 육종사업이 활발히 이루어지고 있으며, 국내에서는 1990년대 초 나리가 화훼작물 중에서 수출경쟁력이 있고, 부가가치가 높은 작물로 평가되면서 본격적인 육종연구가 시작되어 1998년부터 원예연구소에서 나리 품종이 육성되기 시작하여 2005년 초까지 '선유', '미르', '아려' 등 국내에서 40여 품종이 등록되었다 (2002, 농촌진흥청 품종해설집). 그러나 우리나라에서 육성된 품종 대부분은 고전적인 교배육종 방법을 통하여 재배된 Asiatic 계통들이며, 최근 새로이 시도되고 있는 형질전환 방법을 통하여 육성된 품종은 아직까지 보고된 바 없다.
최근 유전공학 기법의 발달로 유용 유전자(바이러스 저항성 유전자 및 제초제 저항성 유전자, 화색 관련 유전자 등)를 식물에 도입하는 형질전환 기술이 개발되어 많은 연구가 이루어지고 있으며, 형질전환 식물체에 대하여 보고되고 있다.
나리의 형질전환에 관련된 연구로는 Hoshi 등(2004, Plant Cell 9:1251-1264)은 오리엔탈 나리의 수술대 유래 세포괴에 아그로박테리움 형질전환법을 시도하여 유전자 도입 식물에서 gus 발현을 확인하였고, PCR을 통하여 식물체 genomic DNA에 유전자의 도입을 확인하였다고 보고하였다.
한국특허등록 제0529005호에는 찰콘 신쎄이즈 안티센스 유전자를 발현하는 형질전환 나리 식물체 및 아그로박테리아 매개 형질전환을 통한 그의 제조 방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 입자충격법에 의한 방법과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 제초제 저항성 유전자를 입자충격법(Particle Bombardment)을 이용하여 백합에 형질전환하여 제초제 저항성 백합을 제조하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 백합의 기내 배양 소자구의 인편을 횡축으로 2~3mm 크기로 썰어 피클로람(Picloram)이 첨가된 MS 고체 배지에 배양하여 배발생 캘러스를 유도하는 단계; (2) 상기 유도된 백합 캘러스에 제초제 저항성 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 입자충격(particle bombardment)을 실시하여 공배양하는 단계; (3) 상기 공배양한 식물세포를 제초제가 첨가된 선발 배지에서 12~16주간 선발하는 단계; (4) 상기 선발된 백합 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성 백합의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 따라 제조된 제초제 저항성 백합 식물체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제초제 저항성 백합 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 제초제 저항성 백합을 제공함으로써 백합 재배에 있어 문제가 되는 제초 노력 및 비용을 절감할 수 있어 농가 소득에 기여할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 백합의 기내 배양 소자구의 인편을 횡축으로 2~3mm 크기로 썰어 피클로람(Picloram)이 첨가된 MS 고체 배지에 배양하여 배발생 캘러스를 유도하는 단계;
(2) 상기 유도된 백합 캘러스에 제초제 저항성 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 입자충격(particle bombardment)을 실시하여 공배양하는 단계;
(3) 상기 공배양한 식물세포를 제초제가 첨가된 선발 배지에서 12~16주간 선발하는 단계;
(4) 상기 선발된 백합 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성 백합의 제조 방법을 제공한다.
우선 배발생 캘러스를 얻기 위하여, 백합의 인편을 식물생장 조절물질 등을 포함하는 무라시게 및 스쿡(Murashige & Skoog, MS) 배지에 배양하여 식물 체세포배 캘러스를 유기한다. 이때 식물생장 조절물질로는 피클로람 0.5~2mg/L, 바람직하게는 1mg/L를 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (1) 단계의 백합 캘러스 유도 단계는 MS 배지에 피클로람(Picloram) 0.5~2mg/L, 4~6% 수크로스, 0.2~1g/L 카제인, 0.3~0.5% 젤라이트를 첨가하는 것이 바람직하며, 피클로람(Picloram) 1mg/L, 5% 수크로스, 0.5g/L 카제인, 0.4% 젤라이트를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 인편을 미리 기내 배양하여 소자구를 얻은 후 그 소자구로부터 인편을 각각 떼어내어 횡축으로 2~3mm 크기로 썰어 치상하는 것이 더욱 바람직하며 유도기간은 8~12주가 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (1) 단계의 인편으로부터 얻어진 캘러스는 MS 배지에 피클로람 1mg/L와 3% 수크로스가 첨가된 액체 배지에서 진탕배양하여 증식하고 5~10일에 한 번씩 계대배양하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 7일이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (2) 단계의 백합 캘러스의 입자충격은 수행 1일 전 직경 1~3mm로 잘게 썰어 1mg/L 피클로람이 첨가된 MS 액체 배지에 진탕배양하고, 1시간 전 삼투압조절제인 소르비톨 0.125M이 첨가된 고체 배지에서 옮겨 입자충격을 실시하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (2) 단계의 식물 발현 벡터는 제초제 저항성 유전자가 삽입된 것이며, 제초제 저항성 유전자는 bar, aroA, bxn 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 bar 유전자이다. 상기 bar 유전자가 형질전환된 백합은 제초제인 바스타를 이용하여 형질전환체를 선발할 수 있다. 상기 식물 발현 벡터는 도 2에 기재된 pDM302 벡터인 것이 더욱 바람직하다. 상기 벡터는 Actl 프로모터 아래 bar 유전자로 구성된 pDM302 벡터이다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입 된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역 이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (2) 단계의 입자충격 실험은 PDS-1000/He System(BidRad, Richmond, Calif.)을 이용하였고, 금 입자에 재조합 식물발현 벡터의 플라스미드 DNA를 코팅하는 방법은 에탄올과 증류수를 이용하여 입자를 세척한 후 50% 글리세롤을 첨가하여 micro-carrier를 준비하였다. 준비된 micro-carrier에 플라스미드 DNA(1㎍/㎕), 2.5M CaCl2, 0.1M 스퍼미딘을 첨가해 혼합하고 원심분리 후 상등액은 제거하여 70% 에탄올을 첨가하여 세척하였다. 마지막으로 100% 에탄올을 이용해 재현탁시켜 micro-carrier당 10㎕로 분주하고 무균배양대에서 건조시켜 사용하였다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (2) 단계의 입자충격은 1회 충격 당 1g의 배발생 캘러스와 2㎍ 플라스미드 DNA를 사용하였으며, 금 입자 500㎍, 헬륨 1,100psi, 비행거리는 9cm로 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (2) 단계의 공배양 기간은 6~8일, 바람직하게는 7일이다. 공배양 기간이라 함은 백합 캘러스에 재조합 식물발현 벡터 pDM302의 플라스미드 DNA를 금 입자에 코팅한 뒤 입자충격을 실시한 후 상기 벡터를 백합 캘러스에 도입시키기 위한 기간을 말한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (3) 단계의 선발 배지에서 공배양한 백합 세포를 선발하는 기간은 12~16주가 바람직하며, 항생제는 재조합 식물 발현 벡터에 이용된 항생제 내성 유전자에 따라 포스피노트리신을 이용하였다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (3) 단계의 선발은 MS 배지에 피클로람 0.5~2mg/L, 2~4% 수크로스, 2~5mg/L 포스피노트리신 및 0.3~0.5% 젤라이트를 첨가한 고체 배지에서 8주, 4~6mg/L 포스피노트리신이 첨가된 배지에서 2주를 20일 간격으로 계대배양하고, 피클로람 0.5~2mg/L, 2~4% 수크로스 및 4~6mg/L 포스피노트리신이 첨가된 액체 배지에서 6주를 7일 간격으로 계대배양하며 50~150rpm으로 회전 진탕배양할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 (3) 단계의 선발은 MS 배지에 피클로람 1mg/L, 3% 수크로스, 2~5mg/L 포스피노트리신 및 0.4% 젤라이트를 첨가한 고체 배지에서 실시하며 선발기간은 8~10 주 젤라이트가 들어가지 않은 액체 배지에서 5~8주가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2mg/L 포스피노트리신이 첨가된 배지에서 8주, 5mg/L 포스피노트리신이 첨가된 배지에서 2주를 20일 간격으로 계대배양하고 피클로람 1mg/L, 3% 수크로스 및 5mg/L 포스피노트리신이 첨가된 액체 배지에서 6주를 7일 간격으로 계대배양하며 100rpm으로 진탕배양하여 포스피노트리신에 저항성을 보이는 캘러스를 얻었다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 (4) 단계의 재분화는 호르몬이 들어가지 않은 MS 배지에 5~10mg/L 포스피노트리신 및 0.3~0.5% 젤라이트(바람직하게는 0.4% 젤라이트)가 첨가된 고체 배지에 옮겨 8주간 선발과 재분화를 같이하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상온 암상태에서 배양하여 포스피노트리신에 저항성을 보이는 백합 자구를 얻는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 따라 제조된 제초제 저항성 백합 식물체를 제 공한다. 상기 제조된 백합 식물체는 제초제 저항성 유전자에 따라 다양한 제초제에 대해 저항성을 가질 것이다. 예를 들면, 제초제 저항성 유전자가 bar인 경우에 제초제 바스타에 대해 저항성을 가질 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 제초제 저항성 백합은 백합 재배에 있어 문제가 되는 제초의 노력을 절감하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 상기 제초제 저항성 백합 식물체의 종자를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 기내식물체로부터 캘러스 형성 및 식물체 재분화
오리엔탈 나리 'Marco Polo'의 기내 배양 소자구의 인편을 각각 떼어내어 횡축으로 2~3mm 크기로 썰어 피클로람 1mg/L, 5% 수크로스, 0.5g/L 카제인, 0.4% 젤라이트(gelrite)가 첨가된 MS 고체 배지에 배양하여 배발생 캘러스를 유도하였다. 인편으로부터 유도된 배발생 캘러스들을 떼어 동일 배지에서 2주 간격으로 계대배양을 실시하였고, 유도된 배발생 캘러스 중 일부는 젤라이트를 첨가하지 않은 피클로람 1mg/L, 3% 수크로스, 0.5g/L 카제인 액체 배지에 옮겨 100rpm으로 회전 진탕배양하여 증식을 하였다. 배발생 캘러스의 계대배양은 1주마다 배지의 4/5를 동일한 양의 새 배지로 교체하며 대량 증식하여 형질전환에 사용하였다.
2. 형질전환 방법 및 선발
입자충격 실험은 PDS-1000/He System(BidRad, Richmond, Calif.)을 이용하였고, 금 입자는 Sanford 등(1991, Technique 3:3-16)의 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 코팅하였다. 에탄올과 증류수를 이용하여 입자를 세척한 후 50% 글리세롤을 첨가하여 micro-carrier를 준비하였다. 준비된 micro-carrier에 플라스미드 DNA(1㎍/㎕), 2.5M CaCl2, 0.1M 스퍼미딘을 첨가해 혼합하고 원심분리 후 상등액은 제거하여 70% 에탄올을 첨가하여 세척하였다. 마지막으로 100% 에탄올을 이용해 재현탁시켜 micro-carrier당 10㎕로 분주하고 laminar air flow 하에서 건조시켜 사용하였다. 나리 캘러스의 입자충격은 실행 1일 전 직경 1~3mm로 잘게 썰어 1mg/L 피클로람이 첨가된 MS 액체 배지에 진탕배양하고, 1시간 전 삼투압조절제인 소르비톨 0.125M이 첨가된 고체 배지에서 처리한 후 입자충격을 실시하였다. 1회 충격 당 1g의 배발생 캘러스와 2㎍ 플라스미드 DNA를 사용하였으며, 금 입자 500㎍, 헬륨 1,100psi, 비행거리는 9cm로 실시하였다.
입자충격 후 캘러스들은 피클로람이 1mg/L 첨가된 MS 고체 배지에서 일주일간 선발 없이 공배양을 실시하였고, 선발 배양은 피클로람 1mg/L와 3% 수크로스에 2~5mg/L 포스피노트리신과 0.4% 젤라이트를 첨가한 고체 배지에서 8~10 주, 젤라이트가 들어가지 않은 액체 배지에서 5~8주 간 배양하고 5mg/L 포스피노트리신이 첨가된 액체 배지에서 6주간 배양하여 포스피노트리신에 저항성을 보이는 캘러스를 얻었다. 재분화 배지는 호르몬이 들어가지 않은 MS 배지에 5~10mg/L 포스피노트리 신과 0.4% 젤라이트가 첨가된 고체 배지에 옮겨 암상태로 8주간 선발과 및 재분화를 실시하였다.
3. 형질전환체 분석
형질전환체 분석을 위해서는 순화를 거쳐 온실에서 생육중인 식물의 잎 100mg을 액체질소와 함께 넣고 pestle로 분쇄한 다음 DNA 키트(iNtRON사의 G-spin For Plant Genomic DNA Extraction Kit)를 이용하여 DNA을 분리한 다음 Bar 유전자 정방향 프라이머 5'-GTC AAC TTC CGT ACC GAG CCG CAG-3'(서열번호 1)와 역방향 프라이머 5'-CAT GCC AGT TCC CGT GCT TGA AG-3'(서열번호 2)를 이용하여 PCR 분석을 실시하였다. DNA 증폭반응은 Palm cycler (Corbett Research, 2003)를 이용하여 95℃에서 5분 변성시킨 후, 다시 94℃에서 1분 (denature), 62℃에서 1분 (annealing), 72℃에서 1분 (extension)을 40 사이클을 반복하고 72℃에서 10분 동안 마지막 연장하여 25℃로 PCR 반응을 마무리한 뒤 -20℃에 저장했다.
PCR 산물은 1.5㎕의 로딩 버퍼(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% 글리세롤)와 함께 5㎕씩 로딩하여 에티디움 브로마이드가 첨가된 1% 아가로스 겔에 80V로 전기영동 하였다. Running buffer로는 0.5X TBE 버퍼 (pH 8.0)를 사용하여 2시간 전기영동 후 분리된 DNA 밴드를 U.V 램프 아래에서 디지탈 카메라를 사용하여 촬영하였다.
< 실시예 1. 기내식물 인편으로부터의 캘러스 유도 및 식물체 재분화>
기내에서 배양된 백합 인편으로부터의 캘러스 유기는 MS 배지에 피클로람 1mg/L와 5% 수크로스, 0.4% 젤라이트를 첨가한 배지에서 8주 정도 소요되었고 유도된 캘러스는 MS 배지에 피클로람 1mg/L와 3% 수크로스가 첨가된 액체 배지에서 100rpm으로 회전 진탕배양하여 증식하여 4주간 배양하면 형질전환에 이용할 충분한 양의 캘러스를 얻을 수 있다. 식물체 재분화는 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지에서 2~3개월간 암배양하면 캘러스로부터 소자구가 생성되는 것을 관찰할 수 있었다.
< 실시예 2. 형질전환 방법 및 선발>
입자충격 실험에 사용될 백합 캘러스는 입자충격 수행 1일 전 직경 1~3mm로 잘게 썰어 1mg/L 피클로람이 첨가된 MS 액체 배지에 진탕배양하고, 1시간 전 삼투압조절제인 소르비톨 0.125M이 첨가된 고체 배지에서 옮겨 입자충격을 실시했다. 재조합 벡터의 플라스미드 DNA pDM302는 bar 유전자를 가지며 DNA를 추출한 뒤 입자충격을 실시하였다. 1회 충격 당 1g의 배발생 캘러스와 2㎍ 플라스미드 DNA를 사용하였으며, 금 입자 500㎍, 헬륨 1,100psi, 비행거리는 9cm로 실시하였다.
입자충격 후 캘러스들은 피클로람이 1mg/L 첨가된 MS 고체 배지에서 7 일간 선발 없이 공배양을 실시하였고, 선발 배양은 피클로람 1mg/L와 3% 수크로스에 2~5mg/L 포스피노트리신과 0.4% 젤라이트를 첨가한 고체 배지에서 8~10 주 젤라이트가 들어가지 않은 액체 배지에서 5~8주 간 배양하고, 5mg/L 포스피노트리신이 첨가된 액체 배지에서 6주 간 배양하여 포스피노트리신에 저항성을 보이는 캘러스를 얻었다. 포스피노트리신에 저항성을 보이는 캘러스는 색이 밝은 노란색이며 계속 생장하는 모습을 보였으며 저항성이 없는 캘러스들은 갈변하거나 색이 어둡고 자라지 못하는 것을 관찰할 수 있었다. 재분화 배지는 호르몬이 들어가지 않은 MS 배지에 5~10mg/L 포스피노트리신과 0.4% 젤라이트가 첨가된 고체 배지로 캘러스 직경을 2~4mm로 잘라서 암상태로 8주간 선발과 재분화를 함께 실시한 결과 캘러스에서 백합의 구가 바로 생겨나는 것을 관찰할 수 있었다.
< 실시예 3. 형질전환체 분석>
입자충격을 통해 bar 유전자로 형질전환된 'Marco polo' 형질전환체 126 계통을 사용하여 유전분석 및 포장 검정을 실시하였다. 총 126 계통의 형질전환 식물체를 PCR 분석과 1,000 mg/L의 포스피노트리신을 살포한 제초제 저항성 포장검정으로 bar 유전자의 전입 및 발현을 확인한 결과, 2년간 지속적으로 bar 유전자의 전입이 확인된 계통은 105 계통이었고, 2년 동안 제초제 저항성을 나타낸 계통은 102 계통이었으며, PCR 분석과 포장검정의 결과가 서로 일치하는 계통은 85계통으로 나타났다.
도 1은 형질전환 캘러스의 GUS 발현과 기내 선발중인 백합 캘러스와 소자구 사진이다.
A: 입자충격 후 캘러스의 GUS 발현,
B: 기내 선발중인 백합 캘러스,
C: 선발배지의 비형질전환체 백합구,
D: 선발배지의 형질전환 백합구
도 2는 pDM302 벡터의 모식도이다.
도 3은 순화 후 온실 생육사진이다.
도 4는 포스피노트리신 적정 농도 확인을 위한 테스트 사진이다.
도 5는 포스피노트리신 유효성분 1,000 mg/L로 바스타를 살포하여 수행한 제초제 저항성 실험이다.
도 6은 형질전환체의 bar 유전자를 확인하기 위한 PCR 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 100bp DNA ladder marker
도 7은 백합 형질전환체 126 계통의 PCR 및 제초제 저항성 결과이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Method for producing herbicide-resistant lily plants and herbicide -resistant lily plants produced by the method <130> PN09241 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gtcaacttcc gtaccgagcc gcag 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 catgccagtt cccgtgcttg aag 23

Claims (9)

  1. (1) 백합의 기내 배양 소자구의 인편을 횡축으로 2~3mm 크기로 썰어 피클로람(Picloram)이 첨가된 MS 고체 배지에 배양하여 배발생 캘러스를 유도하는 단계;
    (2) 상기 유도된 백합 캘러스에 제초제 저항성 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 입자충격(particle bombardment)을 실시하여 공배양하는 단계;
    (3) 상기 공배양한 식물세포를 제초제가 첨가된 선발 배지에서 12~16주간 선발하는 단계; 및
    (4) 상기 선발된 백합 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성 백합의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계는 MS 고체 배지에 피클로람 0.5~2mg/L, 4~6% 수크로스, 0.2~1g/L 카제인 및 0.3~0.5% 젤라이트를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 제초제 저항성 유전자는 bar 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 공배양 기간은 6~8일인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2에 기재된 pDM302 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 선발은 MS 배지에 피클로람 0.5~2mg/L, 2~4% 수크로스, 2~5mg/L 포스피노트리신 및 0.3~0.5% 젤라이트를 첨가한 고체 배지에서 8주, 4~6mg/L 포스피노트리신이 첨가된 배지에서 2주를 20일 간격으로 계대배양하고, 피클로람 0.5~2mg/L, 2~4% 수크로스 및 4~6mg/L 포스피노트리신이 첨가된 액체 배지에서 6주를 7일 간격으로 계대배양하며 50~150rpm으로 회전 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계의 재분화는 호르몬이 들어가지 않은 MS 배지에 5~10mg/L 포스피노트리신 및 0.3~0.5% 젤라이트가 첨가된 고체 배지에 옮겨 암상태에서 8주간 선발과 재분화를 같이 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 제초제 저항성 백합 식물체.
  9. 제8항에 따른 제초제 저항성 백합 식물체의 종자.
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