CN104186319A - 一种百合的根尖脱毒与快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种百合的根尖脱毒与快繁方法，该方法为：采用百合根尖作为外植体，将该外植体接种在根尖伸长培养基上培养，使得外植体根尖拉长；将前述根尖拉长的外植体接种在体胚诱导培养基上培养，诱导所述拉长的根尖产生胚性愈伤组织，达到脱毒和再生的目的。将前述胚性愈伤组织接种到分化生根培养基上培养即发育为完整的试管苗。发育后的试管苗可采用RT-PCR方法检测是否含有病毒。利用本发明，将传统的茎尖脱毒改为根尖脱毒，简化了操作程序，避免了脱毒过程中的高污染率，显著提高了工作效率，且接种体在培养基上生长良好，试管苗繁殖系数高，脱毒彻底，移栽成活率达98％以上。
Description
技术领域
本发明属于植物脱毒与组培快繁技术领域，具体涉及一种百合的根尖脱毒与快繁方法。
背景技术
百合(Lilium spp.)属于百合科(Liliaceae)百合属多年生具地下鳞茎的草本球根植物，花朵硕大、花色艳丽、香气怡人，是世界著名的“五大”切花之一，也是我国重要的农业经济作物，具有很高的观赏、食用及药用价值。中国是世界重要的百合遗传资源分布地之一，现有百合属植物约115个种，其中起源于中国的就有55个种和18个变种，占世界百合属植物的一半以上。近年来，百合的市场需求逐年增加，因此，它具有很好的研究开发和利用价值。
本项目组在对田间百合品种种质资源收集利用及组培快繁过程中发现其存在以下两个问题：
一是百合田间植株病毒病发病严重。目前已报道的百合病毒病约有20余种，其中以百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)和黄瓜花叶病毒(CMV)最为严重，其他各种病毒病均为局部地区发生。这三种病毒分布广、危害大，常常复合侵染百合植株，侵染症状表现为脉明症、叶片斑驳、叶片有镶嵌并萎黄变色，叶片卷曲、出现褐色坏死斑点等，使品种严重退化，花小且少，甚至畸形变色，严重影响其观赏品质。不同的病毒在百合上常常表现出相似的症状，而同种病毒在不同的条件下的症状又有很大变异，这给病害的田间诊断和防治带来极大困难。针对这一问题，本实验室已成功采用RT-PCR的检测方法，对百合病毒进行检测。
二是传统的百合茎尖脱毒技术对植株损伤太大，材料不易获取，脱毒成活率低。目前，对于百合进行脱毒的技术研发仍然集中在：对茎尖脱毒技术进行进一步优化，比如将热处理脱毒或试剂脱毒与茎尖脱毒结合。例如，申请号为201210050972.2的专利“东方百合种球脱毒方法”即是通过综合运用热处理脱毒和茎尖脱毒来提高脱毒率和组培苗成活率。又例如，申请号为201010506318.9的专利“使用病毒灵药剂对百合脱毒培养的方法”则是在培养基上加入抗病毒药物，然后在加入抗病毒药物的培养基上进行组培苗培养，之后再进行茎尖脱毒。
而关于采用以百合根尖为外植体进行脱毒和组培快繁的技术，目前尚未见有文献报导。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种百合的根尖脱毒与快繁方法。主要解决的技术问题是：百合组织培养过程中传统的茎尖脱毒技术存在一些缺陷，例如操作繁琐、对植株损伤太大、材料不易获取，脱毒成活率低、组培苗污染率高等。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种百合的根尖脱毒与快繁方法，该方法包括以下步骤：
步骤1，采用百合根尖作为外植体，将该外植体接种在根尖伸长培养基上培养，使得外植体根尖拉长；
步骤2，将前述根尖拉长的外植体接种在体胚诱导培养基上培养，诱导所述拉长的根尖产生胚性愈伤组织，达到脱毒和再生的目的。
进一步地，所述步骤1之前还包括百合根尖外植体的获得，其获得方法为：将百合无菌苗接种到生根培养基上，待根长至1-2cm时，将根前端0.3-0.5mm的根尖切下作为外植体。另外，为了检测根尖脱毒效果，还可将携带百合病毒的无菌苗接种到生根培养基上，待根长至1-2cm时，将根前端0.3-0.5mm的根尖切下作为外植体；待外植体分化为试管苗后，检测分化后的试管苗是否还含有之前携带的百合病毒，如果不含有则说明已经达到脱毒效果，如果含有则说明未达到脱毒效果。
所述生根培养基的配方为：MS培养基+NAA 0.4-0.6mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-6.0。其中，生根培养基的优选配方为：MS培养基+NAA 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l，PH 5.8。
进一步地，所述步骤1中根尖伸长培养基的配方为：MS培养基+NAA0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，pH 5.6-6.0。其中，根尖伸长培养基的优选配方为：MS培养基+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
进一步地，所述体胚诱导培养基的配方为：MS培养基+毒莠定0.8-1.2mg/L+6-BA 0.4-0.6mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。其中，体胚诱导培养基的优选配方为：MS培养基+毒莠定1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
进一步地，所述步骤2之后还包括：将所述胚性愈伤组织接种到体胚增殖培养基上培养，使所述胚性愈伤组织增殖。所述体胚增殖培养基的配方为：MS培养基+毒莠定0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH5.6-7.0。其中，体胚增殖培养基的优选配方为：MS培养基+毒莠定0.2-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
进一步地，将前述获得的胚性愈伤组织或增殖后的胚性愈伤组织接种到分化生根培养基上培养，将体胚发育成完整的试管苗。所述分化生根培养基的配方为：MS培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。其中，分化生根培养基的优选配方为：MS培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
进一步地，所述通过根尖脱毒方式获得的试管苗可通过RT-PCR病毒检测方法确定是否含有百合病毒。
本发明中所述的MS培养基是指：用于植物组织培养的基础培养基，其配方为本领域的常规技术。可以自己根据MS配方配制获得，也可以直接通过市场购买获得。所述的毒莠定，其化学名称为4-氨基-3,5,6-三氯吡啶-2-羧酸。所述的NAA是一种植物激素生长素，其化学名称为萘乙酸。所述6-BA是一种植物生长调节剂，主要用于促进细胞分裂，其化学名称为6-苄氨基腺嘌呤。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、相对于百合茎尖脱毒的方式，操作简单、效率提高。因为百合“茎尖”是由外围叶原基、芽原基包裹着，在显微镜下用手术工具连续剥除多层叶原基和芽原基是一项难度较大且效率很低的工作，而百合“根尖”在显微镜下相对容易操作，效率可提高几十倍至上百倍。
2、对外植体材料伤害小：一株外植体茎尖只有一个，而根尖可以多次取样，且不会对外植体植株造成毁灭性的伤害。
3、提高了组培苗的质量：本发明以根尖为外植体不仅成功培育出百合组培苗；并通过试验验证，根尖组培苗比茎尖组培苗在外植体成活率及脱毒种苗繁殖速度上均有提高。大田种植试验数据表明，根尖脱毒组培苗其生根率和移栽成活率高达98％以上。
4、本发明针对百合根尖特点，对各级培养基作了适应性改进和调整，确保根尖组培的成功。
5、本发明结合百合根尖脱毒、百合根外植体体细胞胚胎诱导及RT-PCR病毒检测技术相结合，确保了百合组培苗一定的脱毒率，从而为百合种苗优质、安全、高产和大面积推广奠定了基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
(一)培养基的配制
1)生根培养基：MS培养基+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
2)根尖伸长培养基：MS培养基+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
3)体胚诱导培养基：MS培养基+毒莠定1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
4)体胚增殖培养基：MS培养基+毒莠定0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
5)分化生根培养基：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.8。
以配置1L的生根培养基为例，其具体配制过程是：称取1L培养基所需的MS培养基的各质量份依次溶解、混合；然后依次称取生根培养基配方中的NAA 0.5mg、蔗糖30g、琼脂7g，分别加入到MS溶液中依次溶解，定容，调节PH值为5.8；最后进行分装，在高温121℃、高压0.1MPa灭菌15-20分钟，培养基冷却后使用。
本发明中，对于各阶段使用的培养基，其配方中的各组分含量可以在一定范围内变化。例如，所述生根培养基的配方为：MS培养基+NAA0.4-0.6mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-6.0。所述根尖伸长培养基的配方为：MS培养基+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，pH 5.6-6.0。所述体胚诱导培养基的配方为：MS培养基+毒莠定0.8-1.2mg/L+6-BA 0.4-0.6mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。所述体胚增殖培养基的配方为：MS培养基+毒莠定0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。所述分化生根培养基的配方为：MS培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。
上述培养基质量份数以及PH值的变化基本不会对百合外植体的组织培育过程产生影响。
(二)百合根尖脱毒与快繁
1)根尖外植体的选取：将携带百合病毒的材料接种到前述配制的生根培养基上培养，待根长至1-2cm时，在超净工作台中的解剖镜下将前端0.3-0.5mm的根尖切下作为外植体，备用。
2)根尖伸长培养：将外植体接种到前述配制的根尖伸长培养基上，在25±2℃的培养条件下暗培养1个月，待根尖外植体伸长。
3)体胚诱导培养：将伸长的根尖外植体接种到前述配制的体胚诱导培养基上，在25±2℃的培养条件下暗培养2个月，诱导胚性愈伤组织。
4)体胚增殖培养：将胚性愈伤组织接种到前述配制的体胚增殖培养基上，在25±2℃的培养条件下暗培养1个月，增殖胚性愈伤组织。
5)体胚分化生根培养：将胚性愈伤组织接种到前述配制的分化生根培养基上，在25±2℃、光强为50μmol m-2s-1、光照16h/d的培养条件下培养1个月，体胚发育为完整的试管苗。
(三)百合试管苗的病毒检测
1)百合RNA的制备：选取侵染了百合无症病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)的叶片为材料，采用Omega E.Z.N.A植物RNA提取试剂盒提取基因组RNA，保存于-20℃，备用。
2)cDNA合成：根据百合病毒CP(coat protein)基因序列设计出百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)的特异性引物对；cDNA合成每个反应总体积为20ul，反应试剂包括总RNA 2ul，10umol Oligo(dT)151ul，ddH2O 7.5ul，70℃水浴5min，冰浴5min；添加2.5mM/l dNTP 4ul，5×buffer 4ul，40U/ul RNA酶抑制剂0.5ul，200U/ul M-MLV反转录酶1ul，反应程序为42℃反转录60min，70℃灭活15min。
所述的百合病毒特异性引物对为下表所示：
3)PCR扩增：PCR反应总体积为25ul，取1ul反转录合成的cDNA作为PCR模板，PCR反应体系包括：10×buffer 2.5ul，25mM/l Mg2+2ul，2.5mM/l dNTP 2ul，10uM/l正反向引物各1ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，15.3ul ddH2O；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃终止反应。
4)观察电泳条带：以电泳条带对照，确立百合试管苗是否仍感染相应病毒。
(四)百合茎尖脱毒快繁与根尖脱毒快繁的效果对比试验
该试验在上海市农业科学院林木果树研究所组织培养中心内进行。
选取观赏百合品种“康卡多”携带LMoV病毒的组培苗，在超净工作台中的显微镜下将前端0.3-0.5mm的根尖切下作为外植体；另选取百合品种“康卡多”携带LMoV病毒的组培苗，在超净工作台中的显微镜下将0.1-0.3mm的茎尖切下作为外植体；
按照前述(一)中配制的各阶段培养基作为百合组培过程中的培养基；并按照前述(二)百合根尖脱毒与快繁的描述方法，分别将上述根尖、茎尖组培用外植体进行接种、管理和培养；培养后的试管苗按照前述(三)百合试管苗的病毒检测的描述方法，检测组培后的百合试管苗是否含有侵染的病毒。组培过程中各阶段的对比结果见表1。
表1 百合根尖脱毒与茎尖脱毒的效果对比
由表1可见，通过根尖脱毒方式获得的试管苗，其中污染的试管苗为4个，也就是说污染率为8.0％；而通过茎尖脱毒方式获得的试管苗，污染的苗数为9个，污染率达18.0％。这里的污染率是指：脱毒操作过程中因为茎尖或根尖操作的难易程度不同而导致的根尖和茎尖发生细菌或真菌污染的比例。
根尖快繁方式获得的试管苗成活38个，成活率76.0％，茎尖快繁方式获得的试管苗成活21个，成活率42.0％。根尖外植体从接种到产生愈伤组织需80天，而茎尖外植体从接种到产生愈伤组织需50天。根尖外植体先在培养基上延伸，其诱导的胚性愈伤组织及再生植株多于茎尖外植体，根尖外植体的繁殖倍数为37，茎尖外植体的繁殖倍数为20。由此可见根尖组培苗比茎尖组培苗在外植体成活率、再生植株繁殖倍数等方面均有提高。根尖脱毒方式中LMoV病毒脱除率为58.3％，虽然略低于茎尖脱毒方式的LMoV病毒脱除率(66.7％)，但是仍确保了百合组培苗一定的脱毒率。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明方法范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (10)
1.一种百合的根尖脱毒与快繁方法，包括以下步骤：
步骤1，采用百合根尖作为外植体，将该外植体接种在根尖伸长培养基上培养，使得外植体根尖拉长；
步骤2，将前述根尖拉长的外植体接种在体胚诱导培养基上培养，诱导所述拉长的根尖产生胚性愈伤组织，达到脱毒和再生的目的。
2.如权利要求1所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述步骤1之前还包括百合根尖外植体的获得：将百合无菌苗接种到生根培养基上，待根长至1-2cm时，将根前端0.3-0.5mm的根尖切下作为外植体。
3.如权利要求2所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述生根培养基的配方为：MS培养基+NAA 0.4-0.6mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-6.0。
4.如权利要求1所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述步骤1中根尖伸长培养基的配方为：MS培养基+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-6.0。
5.如权利要求1所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述步骤2中的体胚诱导培养基的配方为：MS培养基+毒莠定0.8-1.2mg/L+6-BA 0.4-0.6mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。
6.如权利要求1所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述步骤2之后还包括：将所述胚性愈伤组织接种到体胚增殖培养基上培养，使所述胚性愈伤组织增殖。
7.如权利要求1所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述体胚增殖培养基的配方为：MS培养基+毒莠定0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。
8.如权利要求1或6所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，还包括：将胚性愈伤组织或增殖后的胚性愈伤组织接种到分化生根培养基上培养，将体胚发育成完整的试管苗。
9.如权利要求8所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于，所述分化生根培养基的配方为：MS培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。
10.如权利要求8所述的一种百合的根尖脱毒与快繁方法，其特征在于：所述试管苗通过RT-PCR病毒检测方法确定是否含有百合病毒。
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