CN112655558B - 一种用于草乌组织培育的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于草乌组织培育的培养基，包括初代培养基、继代培养基、生根培养基，所述初代培养基为GS+6‑BA 1mg/L+NAA 0.45‑0.55mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L；所述继代培养基为改良MS+6‑BA 3mg/L+NAA 0.45‑0.55mg/L+AC 5mg/L；所述生根培养基配方为1/2MS+6‑BA 0.095‑0.105mg/L+B90.5mg/L。通过本发明培育方法,实现了有效降低愈伤组织的褐化率和育苗成活率高的功能，解决了传统的沙藏处理育苗成活率低的问题，提高了育苗的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体是一种用于草乌组织培育的培养基。
背景技术
草乌，中药名；为毛茛科植物北乌头的干燥块根；秋季茎叶枯萎时采挖，除去须根和泥沙，干燥；培育，指培养幼小生物，使其发育成长；用于风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛及麻醉止痛；用于治寒湿瘀血留滞经络，肢体筋脉挛痛，关节屈伸不利：与川乌、地龙、乳香等同用；常作为麻醉止痛药，多以生品与生川乌并用，配伍羊踯躅、姜黄等。
草乌种子萌发前需要进行沙藏处理，在沙藏处理后苗期成活率较低，无法提高草乌的苗的生存率，使得大规模的种植难度大；因此，针对上述问题提出一种用于草乌组织培育的培养基。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种用于草乌组织培育的培养基，实现了有效降低愈伤组织的褐化率和育苗成活率高的功能，解决了传统的沙藏处理育苗成活率低、沙藏育苗周期长的问题，提高了育苗的存活率、缩短育苗时间；采用本发明技术幼苗污染率降低到3％以下，褐化率降低到了0％，生根条数达到45-60根/瓶。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种用于草乌组织培育的培养基，包括初代培养基、继代培养基、生根培养基所述初代培养基为：GS+6-BA 1mg/L+NAA 0.45-0.55mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L；
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.45-0.55mg/L+AC 5mg/L，改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3；有机成分中的VB1在原基础上增加1/2；微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜；
所述生根培养基配方为1/2MS+6-BA 0.095-0.105mg/L+B9 0.5mg/L。
优选地，所述初代培养基为：GS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L。
优选地，所述继代培养基为：改良MS+6-BA3mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5mg/L，改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3；有机成分中的VB1在原基础上增加1/2；微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜。
优选地，所述生根培养基配方为1/2MS+6-BA 0.1mg/L+B9 0.5mg/L。
本发明的有益之处在于：
1、通过本发明培养基,实现了有效降低愈伤组织的褐化率和育苗成活率高的功能，解决了传统的沙藏处理育苗成活率低的问题，提高了育苗的存活率；采用本发明技术幼苗污染率降低到3％以下，褐化率降低到了0％，生根条数达到45-60根/瓶。
2、本发明操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。本发明系统地研究了草乌不同阶段的最佳培养基，提高组培苗成活率，为实现草乌的工厂化生产奠定了可靠的基础；
3、本发明技术中确定的草乌组织培养过程中各生阶段的最佳培养基能充分满足了草乌各个时期的营养需要和生长发育，是保证草乌组织培养成功实施，达到流程化生产的关键和核心，由于初代诱导、继代培养、生根培养各阶段的相互影响，上述培养基的选择可以使草乌在组培扩繁的各个阶段不断促进，利用本发明技术培养的草乌幼苗移栽至大田后长势茁壮；大大提高工厂化草乌育苗的产量。
4、本发明中用GS培养基替换MS培养基，能够有效降愈伤组织的褐化率，而且使用MS培养基进行诱导培养时会导致生长点坏死，降低诱导率；利用本发明培养基培养草乌无菌苗，能够提高苗期成活率，而且外植体材料易于获取，与播种扩繁相比组培扩繁的繁殖系数较高。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中：改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3，1/3是指浓度(mg/L)变为原来的1/3；有机成分中的VB1在原基础上增加1/2，1/2是指浓度(mg/L)变为原来的1/2；微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜，1/4是指浓度(mg/L)变为原来的1/4。
本发明中：MS为MS培养基；GS为GS培养基；6-BA为6-苄氨基嘌呤；B9为维生素B9；NAA为1-萘乙酸。
褐化率、诱导率、污染率、分化率、成活率的计算公式如下：
褐化率＝(褐化愈伤组织数量/总接种数量)×100％
诱导率＝(愈伤组织的数量/总接种数量)×100％；
污染率＝(受污染组培苗数量/总数)×100％；
分化率＝(已分化的外植体数/接种外植体总数)×100％；
本实验前期经过近3年的时间筛选出各培养阶段比较适宜的培养条件，在此基础上进行各阶段培养基的优选，以提高幼苗的生根条数，实例及对比例中的培养条件按下述方法操作：
S1：选取外皮软嫩的草乌枝条作为外植体，外植体大小为3-5mm；
S2：将选取的外植体进行消毒，具体方法为：先用农用链霉素浸泡5min，然后用无菌水装置冲洗5次，每次60S，再用0.1％升汞溶液浸泡8min，再用无菌水装置冲洗5次；
S3：将消毒处理后的外植体置入初代培养基进行诱导培养形成愈伤组织；
所述初代诱导培养的条件为培养温度22℃，光照强度3000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是22天；
S4：将诱导培养的愈伤组织置入继代培养基进行分化培养形成分化组织；
所述的继代培养条件为培养温度22℃，光照强度3000Lx，除白天自然光照外，夜间补光1小时/天，培养周期是15天；
S5：将继代培养基中的分化组织置入生根培养基中，进行生根培养，所述的生根培养条件为培养温度19℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是8天；
S6：将上述诱导生根后的草乌无菌苗进行移栽。
实施例1
所述初代培养基为：GS+6-BA 1mg/L+NAA 0.45mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L；
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.45mg/L+AC 5mg/L，改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3；有机成分中的VB1在原基础上增加1/2；微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜；
所述生根培养基配方为1/2MS+6-BA 0.095mg/L+B9 0.5mg/L；
培养工艺具体为：
S1：选取外皮软嫩的草乌枝条作为外植体，外植体大小为3-5mm；
S2：将选取的外植体进行消毒，具体方法为：先用农用链霉素浸泡5min，然后用无菌水装置冲洗5次，每次60S，再用0.1％升汞溶液浸泡8min，再用无菌水装置冲洗5次；
S3：将消毒处理后的外植体置入初代培养基进行诱导培养形成愈伤组织；
所述初代诱导培养的条件为培养温度22℃，光照强度3000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是22天；
S4：将诱导培养的愈伤组织置入继代培养基进行分化培养形成分化组织；
所述的继代培养条件为培养温度22℃，光照强度3000Lx，除白天自然光照外，夜间补光1小时/天，培养周期是15天；
S5：将继代培养基中的分化组织置入生根培养基中，进行生根培养，所述的生根培养条件为培养温度19℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是8天；
S6：将上述诱导生根后的草乌无菌苗进行移栽。
实施例2
所述初代培养基为：GS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L；
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5mg/L，改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3；有机成分中的VB1在原基础上增加1/2；微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜；
所述生根培基配方为1/2MS+6-BA 0.1mg/L+B9 0.5mg/L；
其余步骤均与实施例1相同。
实施例2
所述初代培养基为：GS+6-BA 1mg/L+NAA 0.55mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L；
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.55mg/L+AC 5mg/L，改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3；有机成分中的VB1在原基础上增加1/2；微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜；
所述生根培养基配方为1/2MS+6-BA 0.105mg/L+B9 0.5mg/L；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例1
所述初代培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5.0mg/L+KT 0.05mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比例2
所述初代培养基为：GS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.3mg/L+AC 5.0mg/L+KT 0.05mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比例3
所述S2：将选取的外植体进行消毒，具体方法为：先用浓度为75％的酒精消毒1分钟，然后用无菌水装置冲洗2次、每次50S，再用0.1％升汞溶液浸泡7min，再用无菌水装置冲洗4次；其余步骤与实施例1相同。
实施例1、2、3，对比例1、2、3试验结果如表1所示：
表1不同诱导培养基对愈伤组织诱导影响
| 培养基组分(浓度/mg·L-1) | 诱导率(％) | 褐化率(％) |
| 实施例1 | 65 | 0 |
| 实施例2 | 65 | 0 |
| 实施例3 | 60 | 0 |
| 对比例1 | 30 | 60 |
| 对比例2 | 40 | 10 |
| 对比例3 | 50 | 50 |
由表1数据可知：本发明中诱导培养基中用GS培养基替换MS培养基，GS培养基中能够有效降愈伤组织的褐化率，而且使用MS培养基进行诱导培养时会导致生长点坏死，降低诱导率；对比例3中说明，本发明在外植体消毒处理时，与常规消毒手段相比去掉了酒精消毒的过程，酒精消毒时渗透势较高，后期导致愈伤组织褐化严重；对比例2的诱导率减低和褐化率升高说明诱导培养基每一组分参数的改变，都会直接影响诱导率(％)和褐化率(％)，选取合适的初代诱导培养基是保证草乌组织培养成功实施的关键点。
对比例4
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.3mg/L+AC 5.0mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比例5
所述继代培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5.0mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比例4、5试验结果如表2所示：
表2继代培养基对愈伤组织分化的影响
| 培养基组分(浓度/mg·L-1) | 分化率(％) | 污染率(％) |
| 实施例1 | 82 | 3 |
| 实施例2 | 85 | 4 |
| 实施例3 | 83 | 3 |
| 对比例4 | 60 | 8 |
| 对比例5 | 70 | 5 |
从表2中可以得知：继代培养基任一参数的变化将对分化率和污染率产生直接的影响，采用本发明的继代培养基配方分化率能达到80％以上，污染率降低到4％以下，选取合适的继代诱导培养基是保证草乌组织培养成功实施的关键点。
对比例6
所述生根培养基：1/2MS+6-BA 0.3mg/L+B9 0.5mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比例7
所述生根培养基：1/2MS+6-BA 0.1mg/L+B9 0.3mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比例6、7试验结果如表3所示：
表3不同生根培养基对生根数量的影响
| 培养基组分(浓度/mg·L-1) | 接种数量(个) | 生根数量(条) |
| 实施例1 | 3 | 50-60 |
| 实施例2 | 3 | 50-55 |
| 实施例3 | 3 | 55-65 |
| 对比例6 | 3 | 30-45 |
| 对比例7 | 3 | 24-36 |
从表3中可以得知：生根培养基任一参数的变化将对生根数量产生直接的影响，采用本发明的生根培养基配方生根数能达到45根以上，选取合适的生根培养基是保证草乌组织培养成功实施的关键点。
通过实施例1-3，对比例1-7可以得知，本发明中的用GS培养基替换MS培养基，因为GS培养基中能够有效降愈伤组织的褐化率，而且使用MS培养基进行诱导培养时会导致生长点坏死，降低诱导率；草乌种子萌发前需要进行沙藏处理，且苗期成活率较低，而利用本发明培养基培养草乌无菌苗，能够提高苗期成活率，而且外植体材料易于获取，与播种扩繁相比组培扩繁的繁殖系数较高。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (4)
1.一种用于草乌组织培育的培养基，由初代培养基、继代培养基、生根培养基组成
其特征在于：
所述初代培养基为：GS+6-BA 1mg/L+NAA 0.45-0.55mg/L+AC 5mg/L+KT 0.05mg/L；
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.45-0.55mg/L+AC 5mg/L；改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3，有机成分中的VB1在原基础上增加1/2，微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜；
所述生根培养基配方为：1/2MS+6-BA 0.095-0.105mg/L+维生素B9 0.5mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于草乌组织培育的培养基，其特征在于：
所述初代培养基为：GS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5.0mg/L+KT 0.05mg/L。
3.根据权利要求1-2任一所述的一种用于草乌组织培育的培养基，其特征在于：
所述继代培养基为：改良MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 5.0mg/L；改良MS培养基配方为硝酸钾、硝酸铵改为原来的1/3，有机成分中的VB1在原基础上增加1/2，微量元素中的硫酸锰减少1/4，去除硫酸铜。
4.根据权利要求1所述的一种用于草乌组织培育的培养基，其特征在于：
所述生根培养基配方为1/2MS+6-BA 0.1mg/L+维生素B9 0.5mg/L。
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