CN112772416B - 一种小叶桢楠的组织培养育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小叶桢楠的组织培养育苗方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择和处理；(2)愈伤组织的培养；(3)芽诱导培养；(4)增殖培养；(5)生根培养；(6)移栽炼苗；该育苗方法通过在小叶桢楠组织培养过程中，针对性的调整培养基配方和培养条件，使组织培养得到的小叶桢楠组培苗芽更壮硕，抗病性和成活率显著增强；并且，本发明育苗方法育苗周期短，数量大，小叶桢楠幼苗的成活率高，适合小叶桢楠幼苗的大规模培育。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种小叶桢楠的组织培养育苗方法。
背景技术
小叶桢楠又叫楠木、金丝楠或小叶楠等，为樟科楠属高达40余米的慢生常绿大乔木，生 长缓慢，近千年的大树都未曾有衰老迹象，是国家二级重点保护树种。小叶桢楠芽鳞被灰黄色贴伏长毛。小枝通常较细，有棱或近于圆柱形，被灰黄色或灰褐色长柔毛或短柔毛。叶革质，披针形或倒披针形，先端渐尖，尖头直或呈镰状，基部楔形，最末端钝或尖，上面光亮无毛或沿中脉下半部有柔毛，下面密被短柔毛，脉上被长柔毛，中脉在上面下陷成沟，下面明显突起，侧脉每边8-13条，斜伸，上面不明显，下面明显，近边缘网结，并渐消失，横脉在下面略明显或不明显，小脉几乎看不见，不与横脉构成网格状或很少呈模糊的小网格状;叶柄细，长1-2.2厘米，被毛，花期4-5月，果期9-10月，核果，卵圆形。小叶桢楠树高干直，形态优美，是理想的庭院树种和园林绿化树种，小叶桢楠木材致密坚硬，不变形，味道清新，纹理简单大方，显有金丝，抗腐蚀、抗虫害，是用于建筑、家具、雕刻等的绝佳材料。
小叶桢楠树高干直，其木材作为一种上佳的用材树种，深受喜爱，是大多数的人的选择，其市场需求量也在逐年增加。但是目前小叶桢楠的繁殖方式主要还是播种和扦插，但是繁殖系数小，成活率低，生长缓慢，导致小叶桢楠远不能满足市场需求，严重影响了小叶桢楠的开发利用。同时，虽然已经有采用组织培养的方法（专利公开号CN108651284A）对桢楠进行育苗，且也显著提高了小叶桢楠的育苗速度，但是由于培养方法和培养条件不合理，导致现有组织培养育苗得到小叶桢楠幼苗移栽后得病率较高，成活率较低，不利于小叶桢楠的大规模种植和开发利用，也显著提高了小叶桢楠的种植成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有小叶桢楠组织培养育苗方法得到的幼苗抗病能力差、成活率低的缺陷，提出一种能有效提高小叶桢楠幼苗成活率和抗病能力的组织培养育苗方法；该育苗方法通过对组织培养过程中培养条件的改变与培养基配方的调整相配合产生的协同增效的作用，使小叶桢楠组培苗抗病性和成活率显著提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种小叶桢楠组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择和处理：选取无病虫害野生植株的当年枝条上的幼嫩叶，消毒后切成切割成大小为0.5cm*0.5cm的方块，选取叶片部位带有叶缘、 叶肉、叶脉或叶基部的方块为作为培养的外植体；
（2）愈伤组织的培养：将步骤（1）的外植体接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，得到愈伤组织；
（3）芽诱导培养：将步骤（2）培养得到的愈伤组织接入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得到组培芽；
（4）增殖培养：将步骤（3）的组培芽切割成芽丛或带腋芽茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，得到芽苗；每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，继代培养代数控制在10代内，培养室的温度控制在23℃±2℃，光照强度为1300～1500lx，光照时间为每天10～12h；
（5）生根培养：将步骤（4）的芽苗接入生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；
（6）移栽炼苗：将步骤（5）的组培苗除去培养基后移栽入基质中，进行炼苗，炼苗完成后得到小叶桢楠幼苗。
本发明一种小叶桢楠组织培养育苗方法，通过在小叶桢楠组织培养过程中，针对性的调整培养基组分和培养条件，使组织培养得到的小叶桢楠组培苗芽更壮硕，抗病性和成活率显著增强；并且，本发明育苗方法育苗周期短，数量大，小叶桢楠幼苗的成活率高，适合小叶桢楠幼苗的大规模培育。
上述一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其中，优选的，步骤（1）中所述的消毒方法为将清洁后的幼嫩叶置于消毒剂中浸泡2～5min，再用0.1％的升汞溶液消毒1～3min后，用无菌水冲洗5～8次，并用无菌滤纸擦干其表面水分；所述的消毒剂为pH值5.0～6.5、有效氯素浓度10～30mg/L的消毒剂。
上述一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其中，步骤（2）中所述的诱导培养基是指能促进植物外植体生成愈伤组织的植物培养基；优选的，所述的诱导培养基为改良MS母液+0.5-1.5mg/L的BA +0.1-0.5mg/L的NAA +0.005-0.015μg/L的油菜素内酯；通过优选，小叶桢楠外植体生成的愈伤组织细胞数量大，分化效果好。
其中，所述改良MS母液是指在MS培养基的基础上更改了部分组分和配比的培养基；所述的更改包括：调整MS培养基中KNO3的浓度为1500mg/L，调整NH4NO3的浓度为550mg/L，调整蔗糖的浓度为25g/L ，调整琼脂的浓度为7g/L，调整pH值为6.0；添加800mg/L的NaH2PO4和1.4mg/L的泛酸钙；改良后的MS培养基更适合对小叶桢楠的组织培养，能提高小叶桢楠的抗病性。
其中，优选的，步骤（2）愈伤组织的培养条件为：在20～25℃条件下，暗培养3～7天后，再转为光培养7-10d，所述光培养的光照强度1800～2400lx，光照时间11～12h/d；优选的培养条件有利于小叶桢楠愈伤组织的生成。
上述一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其中，步骤（3）中所述的芽诱导培养基是指能促进愈伤组织分化生成芽的植物培养基；优选的，所述的芽诱导培养基为改良MS母液+1.5-2.5mg/L的BA +0.8-1.5mg/L的NAA+0.003-0.006μg/L异戊烯腺嘌呤+0.005-0.015μg/L的油菜素内酯；通过优选，分化生成的组培芽数量多，速度快，长势好，抗病性好。
其中，优选的，步骤（3）芽诱导的培养条件为：光照条件下培养温度为22-25℃，非光照条件下培养温度为12-18℃，光照强度为1000-1400Lux，光照时间为8-10h/d；培养时间为18-22d；利用光照和温度对植物细胞生长和激素合成的影响，通过改变培养温度和光照条件，有利于芽的分化，能增加细胞壁厚度，提高组培芽的成活率和抗病能力。
上述一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其中，步骤（4）中所述的增殖培养基是指能使芽丛或带腋芽茎段快速增殖并生成芽苗的植物培养基；优选的，所述的增殖培养基为改良MS母液+1.0-2.0mg/L的BA +1.0-1.8mg/L的NAA+0.01-0.015μg/L异戊烯腺嘌呤+0.01-0.025μg/L的油菜素内酯；通过优选的培养基组分，能使芽丛或带腋芽茎段快速增殖并生成芽苗，速度快，长势好，抗病性好。
上述一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其中，步骤（5）中所述的生根诱导培养基是指能促进芽苗分化生成根的植物培养基；优选的，所述的生根培养基为改良MS母液+1.8-2.5mg/L的BA +1.5-2.5mg/L的NAA；通过优选，分化生成的根数量多，直径大。
其中，优选的，步骤（5）生根培养的培养条件为：光照条件下培养温度为25-28℃，非光照条件下培养温度为18-23℃，光照强度为2200-3000Lux，光照时间为11-12h/d；培养时间为8-12d；利用光照和温度对植物细胞生长和激素合成的影响，通过改变培养温度和光照条件，有利于根的分化，能增加细胞壁厚度，提高组培苗的成活率和抗病能力。
上述一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其中，步骤（6）所述的炼苗为当组培苗高度达到3.0cm以上，根长达1.0～1.5cm时，将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为10～15d，采用自然散射光，光照强度控制在6000～8000Lx，环境温度为24～30℃，避免强光直射和高温灼伤组培苗。
其中，步骤（6）中所述的基质是指适合小叶桢楠幼苗生长的土壤；优选的，所述的基质包括草炭土、草木灰和沙土；最优选的，所述基质中草炭土、草木灰、沙土的质量比为3-5︰1︰1-3；通过优选，基质更利于小叶桢楠幼苗的根系生长，幼苗更壮硕，能提高组培苗的成活率。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明育苗方法通过针对性调整组织培养过程中的培养基的组成，更有利于小叶桢楠植物细胞的生长和分化，从而使小叶桢楠的组培苗更壮硕，抗病性和成活率显著增强。
2、本发明育苗方法通过针对性的调整组织培养过程中的培养温度和光照条件，更有利于小叶桢楠植物细胞的生长和分化，从而使小叶桢楠的组培苗更壮硕，抗病性和成活率显著增强。
3、本发明育苗方法育苗周期短，数量大，小叶桢楠幼苗的成活率高，抗病性强，适合小叶桢楠幼苗的大规模培育。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式中所使用的改良MS母液均是指在MS培养基的基础上更改了部分组分和配比的培养基；所述的更改包括：调整MS培养基中KNO3的浓度为1500mg/L，调整NH4NO3的浓度为550mg/L，调整蔗糖的浓度为25g/L ，调整琼脂的浓度为7g/L，调整pH值为6.0；添加800mg/L的NaH2PO4和1.4mg/L的泛酸钙。
实施例1
（1）外植体的选择和处理：选取无病虫害野生植株的当年枝条上的幼嫩叶，将清洁后的幼嫩叶置于消毒剂中浸泡3min，再用0.1％的升汞溶液消毒2min后，用无菌水冲洗6次，并用无菌滤纸擦干其表面水分；消毒后切成切割成大小为0.5cm*0.5cm的方块，选取叶片部位带有叶缘的方块为作为培养的外植体；述的消毒剂为pH值6.0、有效氯素浓度20mg/L的消毒剂；
（2）愈伤组织的培养：将步骤（1）的外植体接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，得到愈伤组织；所述的诱导培养基为改良MS母液+1.0mg/L的BA +0.3NAA +0.01μg/L的油菜素内酯；愈伤组织的培养条件为：在22℃条件下，暗培养4天后，再转为光培养8d，所述光培养的光照强度2100lx，光照时间12h/d；
（3）芽诱导培养：将步骤（2）培养得到的愈伤组织接入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得到组培芽；所述的芽诱导培养基为改良MS母液+2.0mg/L的BA +1.2mg/L的NAA+0.003μg/L异戊烯腺嘌呤+0.015μg/L的油菜素内酯；芽诱导的培养条件为：光照条件下培养温度为23℃，非光照条件下培养温度为15℃，光照强度为1200Lux，光照时间为9h/d；
（4）增殖培养：将步骤（3）的组培芽切割成芽丛或带腋芽茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，得到芽苗；每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，继代培养代数控制在10代内，培养室的温度控制在23℃±2℃，光照强度为1400lx，光照时间为每天11h；所述的增殖培养基为改良MS母液+1.5mg/L的BA +1.4mg/L的NAA+0.012μg/L异戊烯腺嘌呤+0.018μg/L的油菜素内酯；
（5）生根培养：将步骤（4）的芽苗接入生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；所述的生根培养基为改良MS母液+2.2mg/L的BA +2.0mg/L的NAA；生根培养的培养条件为：光照条件下培养温度为27℃，非光照条件下培养温度为20℃，光照强度为2700Lux，光照时间为12h/d；
（6）移栽炼苗：当组培苗高度达到3.0cm以上，根长达1.0cm时，将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为13d，采用自然散射光，光照强度控制在7000Lx，环境温度为28℃，炼苗完成后得到小叶桢楠幼苗。
实施例2
（（1）外植体的选择和处理：选取无病虫害野生植株的当年枝条上的幼嫩叶，将清洁后的幼嫩叶置于消毒剂中浸泡2min，再用0.1％的升汞溶液消毒3min后，用无菌水冲洗8次，并用无菌滤纸擦干其表面水分；消毒后切成切割成大小为0.5cm*0.5cm的方块，选取叶片部位带有叶肉的方块为作为培养的外植体；述的消毒剂为pH值6.5、有效氯素浓度30mg/L的消毒剂；
（2）愈伤组织的培养：将步骤（1）的外植体接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，得到愈伤组织；所述的诱导培养基为改良MS母液+1.5mg/L的BA +0.1mg/L的NAA +0.005μg/L的油菜素内酯；愈伤组织的培养条件为：在25℃条件下，暗培养3天后，再转为光培养7d，所述光培养的光照强度1800lx，光照时间12h/d；
（3）芽诱导培养：将步骤（2）培养得到的愈伤组织接入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得到组培芽；所述的芽诱导培养基为改良MS母液+2.5mg/L的BA +0.8mg/L的NAA+0.003μg/L异戊烯腺嘌呤+0.005μg/L的油菜素内酯；芽诱导的培养条件为：光照条件下培养温度为25℃，非光照条件下培养温度为12℃，光照强度为1400Lux，光照时间为10h/d；
（4）增殖培养：将步骤（3）的组培芽切割成芽丛或带腋芽茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，得到芽苗；每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，继代培养代数控制在10代内，培养室的温度控制在23℃±2℃，光照强度为1500lx，光照时间为每天12h；所述的增殖培养基为改良MS母液+2.0mg/L的BA +1.0mg/L的NAA+0.015μg/L异戊烯腺嘌呤+0.025μg/L的油菜素内酯；
（5）生根培养：将步骤（4）的芽苗接入生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；所述的生根培养基为改良MS母液+2.5mg/L的BA +1.5mg/L的NAA；生根培养的培养条件为：光照条件下培养温度为28℃，非光照条件下培养温度为23℃，光照强度为3000Lux，光照时间为11h/d；
（6）移栽炼苗：当组培苗高度达到3.0cm以上，根长达1.5cm时，将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为15d，采用自然散射光，光照强度控制在8000Lx，环境温度为24℃，炼苗完成后得到小叶桢楠幼苗。
实施例3
（1）外植体的选择和处理：选取无病虫害野生植株的当年枝条上的幼嫩叶，将清洁后的幼嫩叶置于消毒剂中浸泡2min，再用0.1％的升汞溶液消毒3min后，用无菌水冲洗5次，并用无菌滤纸擦干其表面水分；消毒后切成切割成大小为0.5cm*0.5cm的方块，选取叶片部位带有叶脉的方块为作为培养的外植体；述的消毒剂为pH值5.0、有效氯素浓度10mg/L的消毒剂；
（2）愈伤组织的培养：将步骤（1）的外植体接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，得到愈伤组织；所述的诱导培养基为改良MS母液+1.5mg/L的BA +0.1mg/L的NAA +0.015μg/L的油菜素内酯；愈伤组织的培养条件为：在25℃条件下，暗培养3天后，再转为光培养10d，所述光培养的光照强度2400lx，光照时间11h/d；
（3）芽诱导培养：将步骤（2）培养得到的愈伤组织接入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得到组培芽；所述的芽诱导培养基为改良MS母液+1.5mg/L的BA +1.5mg/L的NAA+0.006μg/L异戊烯腺嘌呤+0.005μg/L的油菜素内酯；芽诱导的培养条件为：光照条件下培养温度为22℃，非光照条件下培养温度为18℃，光照强度为1400Lux，光照时间为8h/d；
（4）增殖培养：将步骤（3）的组培芽切割成芽丛或带腋芽茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，得到芽苗；每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，继代培养代数控制在10代内，培养室的温度控制在23℃±2℃，光照强度为1500lx，光照时间为每天10～12h；所述的增殖培养基为改良MS母液+12.0mg/L的BA +1.0mg/L的NAA+0.015μg/L异戊烯腺嘌呤+0.025μg/L的油菜素内酯；
（5）生根培养：将步骤（4）的芽苗接入生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；所述的生根培养基为改良MS母液+1.8mg/L的BA +1.5mg/L的NAA；生根培养的培养条件为：光照条件下培养温度为28℃，非光照条件下培养温度为23℃，光照强度为2200Lux，光照时间为11h/d；
（6）移栽炼苗：当组培苗高度达到3.0cm以上，根长达1.5cm时，将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为15d，采用自然散射光，光照强度控制在8000Lx，环境温度为24℃，炼苗完成后得到小叶桢楠幼苗。
对比例1
育苗方法与实施例1相比，区别在于，组织培养过程中的增殖培养基中添加的异戊烯腺嘌呤超过本发明限定范围，所述的增殖培养基中异戊烯腺嘌呤的添加量为0.02μg/L，其余步骤和参数均相同。
对比例2
与实施例1相比，区别在于，组织培养过程中的诱导培养基中添加的油菜素内酯过少，添加量为 0.003μg/L，其余步骤和参数均相同。
对比例3
与实施例1相比，区别在于，组织培养过程中的芽诱导培养基中添加的油菜素内酯过量，为0.002μg/L，其余步骤和参数均相同。
对比例4
与实施例1相比，区别在于，组织培养过程中的培养基中使用的MS未进行改良，其余步骤和参数均相同。
对比例5
与实施例1相比，区别在于，组织培养过程中的培养基中使用的MS改良配方与本发明不同（KNO3的浓度为1800mg/L， NH4NO3的浓度为700mg/L，调整蔗糖的浓度为25g/L ，调整琼脂的浓度为7g/L，调整pH值为6.0， 1000mg/L的NaH2PO4和1.4mg/L的泛酸钙），其余步骤和参数均相同。
将上述实施例1-3和对比例1-5的培育得到的小叶桢楠幼苗，随机测试其中20株幼苗的株高和直径，计算平均值，并移栽到同等条件的林地中，统计成活率和得病率（每组500株，时间为1年），结果如下：
通过以上数据可知：本发明实施例1-3培育得到的小叶桢楠幼苗得病率低，成活率高；尤其是实施例1，为最佳实施方案，得到的小叶桢楠幼苗品质最好；对比例1-4中在组织培养过程中，没在本发明规定的条件范围内，导致得到小叶桢楠幼苗品质显著降低，尤其是抗病性和成活率显著降低。
Claims (5)
1.一种小叶桢楠组织培养育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和处理：选取无病虫害野生植株的当年枝条上的幼嫩叶，消毒后切割成大小为0.5cm*0.5cm的方块，选取叶片部位带有叶缘、叶肉、叶脉或叶基部的方块为作为培养的外植体；
(2)愈伤组织的培养：将步骤(1)的外植体接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，得到愈伤组织；所述的诱导培养基为改良MS母液+0.5-1.5mg/L的BA+0.1-0.5mg/L的NAA+0.005-0.015μg/L的油菜素内酯；
(3)芽诱导培养：将步骤(2)培养得到的愈伤组织接入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，得到组培芽；所述的芽诱导培养基为改良MS母液+1.5-2.5mg/L的BA+0.8-1.5mg/L的NAA+0.003-0.006μg/L异戊烯腺嘌呤+0.005-0.015μg/L的油菜素内酯；
(4)增殖培养：将步骤(3)的组培芽切割成芽丛或带腋芽茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，得到芽苗；每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，继代培养代数控制在10代内，培养室的温度控制在23℃±2℃，光照强度为1300～1500lx，光照时间为每天10～12h；所述的增殖培养基为改良MS母液+1.0-2.0mg/L的BA+1.0-1.8mg/L的NAA+0.01-0.015μg/L异戊烯腺嘌呤+0.01-0.025μg/L的油菜素内酯；
(5)生根培养：将步骤(4)的芽苗接入生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；所述的生根培养基为改良MS母液+1.8-2.5mg/L的BA+1.5-2.5mg/L的NAA；
(6)移栽炼苗：将步骤(5)的组培苗除去培养基后移栽入基质中，进行炼苗，炼苗完成后得到小叶桢楠幼苗；
所述改良MS母液是指在MS培养基的基础上更改了部分组分和配比的培养基；所述的更改包括：调整MS培养基中KNO3的浓度为1500mg/L，调整NH4NO3的浓度为550mg/L，调整蔗糖的浓度为25g/L，调整琼脂的浓度为7g/L，调整pH值为6.0；添加800mg/L的NaH2PO4和1.4mg/L的泛酸钙。
2.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒方法为将清洁后的幼嫩叶置于消毒剂中浸泡2～5min，再用0.1％的升汞溶液消毒1～3min后，用无菌水冲洗5～8次，并用无菌滤纸擦干其表面水分；所述的消毒剂为pH值5.0～6.5、有效氯素浓度10～30mg/L的消毒剂。
3.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(2)愈伤组织的培养条件为：在20～25℃条件下，暗培养3～7天后，再转为光培养7-10d，所述光培养的光照强度1800～2400lx，光照时间11～12h/d。
4.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(3)芽诱导的培养条件为：光照条件下培养温度为22-25℃，非光照条件下培养温度为12-18℃，光照强度为1000-1400Lux，光照时间为8-10h/d。
5.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(5)生根培养的培养条件为：光照条件下培养温度为25-28℃，非光照条件下培养温度为18-23℃，光照强度为2200-3000Lux，光照时间为11-12h/d。
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| CN202110116374.XA CN112772416B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 一种小叶桢楠的组织培养育苗方法 |
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