CN108243946A - 睡莲人工杂交育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了睡莲人工杂交育种方法。本发明所提供的睡莲人工杂交育种方法，包括如下步骤：(1)花粉采集；(2)柱头黏液的采集；(3)花粉在柱头黏液中的萌发；(4)杂交亲本选择；(5)人工授粉。本发明所提供的睡莲人工杂交育种方法利用柱头黏液量大可分离的特点，前期通过花粉在柱头黏液中的培养筛选适宜亲本能够避免盲目杂交授粉带来的巨大工作量，利用睡莲花期长，不存在父母本花期不遇现象，在田间对父本进行套袋，杂交时现采集花粉，避免花粉保存带来的花粉生活力的降低，这种睡莲杂交育种方法对于减轻育种工作强度，提高育种工作效率，加快睡莲新品种选育进程具有重要意义。

Description

睡莲人工杂交育种方法

技术领域

本发明涉及植物杂交育种领域，特别涉及睡莲人工杂交育种方法。

背景技术

睡莲是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)多年生水生宿根草本花卉。睡莲花色丰富、姿态优美、花期长，具有很高的观赏价值。睡莲还有多种其它重要用途，可以吸收水体中一些类似银、铅、苯酚等有毒物质，对水体具有净化与修复功能，在水体净化、城市绿化和景观美化中扮演着非常重要的角色；全株可做绿肥，根茎可入药，花可作茶用等。

根据对生存温度条件要求的不同，把睡莲区分为耐寒睡莲(Hardy waterlily)和热带睡莲(Tropical waterlily)两大类。耐寒睡莲因耐寒性强，在北方部分地区可露地越冬，在园林应用中具有重要的价值，但其较热带睡莲挺水幅度小，花色不丰富，缺乏蓝色、紫色品种，花型以单瓣为主，影响了其观赏价值，从而吸引了越来越多的育种学家从事耐寒睡莲品种改良工作。

在我国，对睡莲的关注程度远不如荷花，多年来仅停留在对睡莲的引种、收集和扩繁阶段，育种工作则相对落后。杂交育种是观赏植物新品种培育的有效途径，但种间或品种间存在的受精障碍严重影响杂交效率。盲目杂交增加了杂交授粉的工作量，前期亲本的筛选可以减少不必要的工作量。睡莲的柱头成凹入杯状柱头盘，大部分睡莲品种在开花第一天能够分泌大量柱头黏液于柱头盘中，易从柱头盘中采集。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了一种睡莲高效人工杂交育种方法。

本发明所提供的睡莲人工杂交育种方法，包括如下步骤：

(1)花粉采集：在大蕾期采集父本的花药，将所述花药干燥至花药开裂散粉，收集花粉；

(2)柱头黏液的采集：在花蕾期，对母本的花朵进行套袋，待母本的花朵开放第1天取母本柱头黏液；

(3)花粉在柱头黏液中的萌发：将上述步骤(1)收集的花粉散落在步骤(2)的母本柱头黏液中，置于25℃～30℃培养箱中进行暗培养，2h～4h后在显微镜下观察拍照，统计花粉萌发率，以花粉管伸出超过花粉粒直径时为萌发标准；

(4)杂交亲本选择：筛选步骤(3)中萌发率≥20％且花粉管伸长正常的组合作为杂交授粉的亲本组合；

(5)人工授粉：对所述步骤(3)筛选出的亲本组合进行人工授粉，收集杂交种子。

所述步骤(1)中所述采集的时间为开花前两天的早上8时～10时。

所述干燥为自然风干。

所述步骤(5)中人工授粉的方法为：在所述亲本花朵开放之前，挑选发育时期一致的花蕾，用硫酸纸袋套袋，至母本花朵开放第1天，柱头分泌粘液时，采集套袋父本的花粉放入母本的柱头黏液中进行人工授粉。

所述步骤(5)中人工授粉后还包括授粉后的母本入水发育，等待果实成熟，收集杂交种子的步骤。

所述收集杂交种子包括如下步骤：将装有成熟果实的网袋收起，内部的硫酸纸袋起到防虫的作用；将硫酸纸中的种子轻轻沾水使其洒落水中，以避免其他杂质一起落入盆中影响种子清洗；用纱布轻轻揉搓种子，去除种子外的膜囊，播种，或将种子保存于盛有蒸馏水的5ml离心管中，置于0℃～4℃冰箱中保存，每隔2周～3周更换一次水。

所述步骤(2)中所述母本柱头黏液是用2ml～5ml的针管吸取，放入离心管中，并置于冰盒中带回实验室，用于花粉萌发实验。

所述步骤(3)中还包括如下步骤：将步骤(2)的母本柱头黏液滴于凹槽载玻片上，每个品种的柱头黏液各滴3～4个凹槽，用解剖针将所述步骤(1)采集的花粉均匀的散落在黏液中，盖上盖玻片，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25℃～30℃培养箱中进行暗培养，2h～4h后在显微镜下观察拍照，每个凹槽观察不少于6个视野，统计花粉萌发率，以花粉管伸出超过花粉粒直径时为萌发标准。

所述睡莲人工杂交育种方法在睡莲杂交育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的睡莲高效人工杂交育种方法利用柱头黏液量大可分离的特点，前期通过花粉在柱头黏液中的培养筛选适宜亲本能够避免盲目杂交授粉带来的巨大工作量，利用睡莲花期长，不存在父母本花期不遇现象，在田间对父本进行套袋，杂交时现采集花粉，避免花粉保存带来的花粉生活力的降低，这种睡莲杂交育种方法对于减轻育种工作强度，提高育种工作效率，加快睡莲新品种选育进程具有重要意义。

附图说明

图1为热带睡莲‘蓝美人’的花粉在耐寒睡莲‘小兄弟’柱头黏液中的正常萌发。

图2为‘莹宝石’作为母本和‘蓝美人’作为父本获得的杂交种子。

具体实施方式

实施例1、睡莲人工杂交育种

材料：本实施例所用睡莲品种有：

热带睡莲‘蓝美人’、热带睡莲‘马丁廉基夫人’、热带睡莲‘小兄弟’、耐寒睡莲‘莹宝石’、耐寒睡莲‘玫瑰’，均购自青岛泓莹集团。

本实施例的睡莲人工杂交育种，包括如下步骤：

1.花粉采集：选择无风的天气，于大蕾期(开花前2天)的早上8～10时采集上述热带睡莲‘蓝美人’、热带睡莲‘马丁廉基夫人’、热带睡莲‘小兄弟’和耐寒睡莲‘玫瑰’这4个睡莲品种的花药，于室内阴凉处自然风干至花药开裂散粉，收集花粉用于花粉生活力的测定。花粉生活力测定的方法如下：采用TTC染色法对所采集的4个睡莲品种的花粉进行花粉生活力测定。用解剖针将花粉均匀的散落在2mg/ml TTC(2，3，5－三苯基氯化四氮唑)溶液中，盖上盖玻片，置于30℃培养箱中进行暗培养，0.5h后在显微镜下观察拍照，每个品种3个凹槽，每个凹槽观察不少于6个视野，凡是染成红色的花粉，其生活力较强，淡红色次之，无色为不具活力的花粉或不育花粉，计算花粉的染色率。

染色率(％)＝(红色花粉的数+淡红色花粉数)/观察花粉总数×100％

选择花粉TTC染色率超过10％的品种作为父本，进行花粉在柱头黏液中的萌发试验。结果如表1所示，4个睡莲品种中有2个睡莲品种达到要求，分别是热带睡莲‘蓝美人’和耐寒睡莲‘玫瑰’。

表1四个睡莲品种花粉TTC染色结果

2.柱头黏液的采集：在花蕾期，对耐寒睡莲‘莹宝石’、耐寒睡莲‘玫瑰’、热带睡莲‘蓝美人’、热带睡莲‘马丁廉基夫人’和热带睡莲‘小兄弟’的花朵用硫酸纸袋套袋，防止花朵开放时外来花粉污染柱头，待花朵开放第1天于上午8～10时用2ml的针管吸取柱头黏液放入离心管中，放入冰盒中带回实验室，用于花粉萌发实验。

3.花粉在柱头黏液中的萌发：将收集的柱头黏液滴2滴于凹槽载玻片上，每个品种的柱头黏液各滴3个凹槽，用解剖针将步骤1筛选的2个品种热带睡莲‘蓝美人’、耐寒睡莲‘玫瑰’的花粉分别均匀的散落在黏液中，盖上盖玻片，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于30℃培养箱中进行暗培养，2h后在显微镜下观察拍照，每个凹槽观察不少于6个视野，统计花粉萌发率，以花粉管伸出超过花粉粒直径时为发芽标准。

萌发率(％)＝(花粉萌发个数/每个视野中总的花粉数)*100。

结果：

(1)热带睡莲‘蓝美人’(父本)的花粉在不同母本柱头黏液中的萌发率如表2和图1所示。图1为热带睡莲‘蓝美人’的花粉在耐寒睡莲‘小兄弟’柱头黏液中的正常萌发图。

表2热带睡莲‘蓝美人’花粉在不同母本柱头黏液中的萌发率

(2)耐寒睡莲‘玫瑰’(父本)花粉在不同母本柱头黏液中的萌发率如表3所示。

表3耐寒睡莲‘玫瑰’花粉在不同母本柱头黏液中的萌发率

4.杂交亲本选择：筛选步骤3中萌发率≥20％且花粉管伸长正常的组合作为杂交授粉的亲本组合，分别为马丁廉基夫人’(母本)‘ב蓝美人’(父本)、‘小兄弟’(母本)ב蓝美人’(父本)、‘莹宝石’(母本)ב蓝美人’(父本)。

5.授粉：在花朵开放之前，挑选步骤4中筛选出来的‘马丁廉基夫人’、‘蓝美人’、‘小兄弟和‘莹宝石’发育时期一致的花蕾，用硫酸纸袋套袋，因睡莲品种具有雌蕊先于雄蕊成熟，故可省略去雄操作，至母本花朵开放第1天，柱头分泌粘液时，用镊子采集套袋父本热带睡莲‘蓝美人’的花粉放入母本的柱头黏液中，轻微搅拌，授粉后用硫酸纸袋给母本套袋，然后将系有小块塑料泡沫的网状袋套在硫酸纸外，在塑料泡沫上用防水记号笔写明父母本品种名称和授粉日期。每个授粉组合授粉30朵花。授粉成功的母本会在花朵开放3～4d后沉入水底，果实逐渐膨大，授粉失败的母本花朵则会在水中腐烂。热带睡莲果实成熟较早，一般需要25d左右，耐寒睡莲果实成熟较晚，需要30d左右。

结果：不同杂交组合的子房膨大率和结实率统计结果如表4所示。

表4不同杂交组合的子房膨大率和结实率统计

备注：子房膨大率(％)＝(子房膨大数/授粉花朵数)*100；结实率(％)＝(结实花朵数/授粉花朵数)*100

由表4的结果可见，筛选出的3个杂交组合均有较高的杂交亲和性，均获得了杂交种子。

6.种子采收：‘马丁廉基夫人’ב蓝美人’、‘小兄弟’ב蓝美人’于杂交后25d，‘莹宝石’ב蓝美人’于杂交后30d，将装有果实的网袋收起，内部的硫酸纸袋可以起到防虫的作用。将硫酸纸中的种子轻轻沾水使其洒落水中，可避免其他杂质一起落入盆中影响种子清洗。用纱布轻轻揉搓种子，去除种子外的膜囊(图2为‘莹宝石’作为母本、‘蓝美人’作为父本获得的杂交种子)，播种，或将种子保存于盛有蒸馏水的5ml离心管中，置于4℃冰箱中保存，每隔2周更换一次水。筛选的3个杂交组合均得到了杂交种子，说明该睡莲杂交育种方法非常有效，可以推广应用。

以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

实施例2、睡莲人工杂交育种

材料：本实施例所用睡莲品种与实施例1相同。

本实施例的睡莲人工杂交育种，包括如下步骤：

1.花粉采集：选择无风的天气，于大蕾期(开花前2天)的早上8～10时采集上述热带睡莲‘蓝美人’、热带睡莲‘马丁廉基夫人’、热带睡莲‘小兄弟’和耐寒睡莲‘玫瑰’这4个睡莲品种的花药，于室内阴凉处自然风干至花药开裂散粉，收集花粉用于花粉生活力的测定。花粉生活力测定的方法如下：采用TTC染色法对所采集的4个睡莲品种的花粉进行花粉生活力测定。用解剖针将花粉均匀的散落在5mg/ml TTC(2，3，5－三苯基氯化四氮唑)溶液中，盖上盖玻片，置于35℃培养箱中进行暗培养，1h后在显微镜下观察拍照，每个品种4个凹槽，每个凹槽观察不少于6个视野，凡是染成红色的花粉，其生活力较强，淡红色次之，无色为不具活力的花粉或不育花粉，计算花粉的染色率。

染色率(％)＝(红色花粉的数+淡红色花粉数)/观察花粉总数×100％

选择花粉TTC染色率超过10％的品种作为父本，进行花粉在柱头黏液中的萌发试验。结果与实施例1无显著差异，4个睡莲品种中有2个睡莲品种达到要求，分别是热带睡莲‘蓝美人’和耐寒睡莲‘玫瑰’。

2.柱头黏液的采集：在花蕾期，对耐寒睡莲‘莹宝石’、耐寒睡莲‘玫瑰’、热带睡莲‘蓝美人’、热带睡莲‘马丁廉基夫人’和热带睡莲‘小兄弟’的花朵用硫酸纸袋套袋，防止花朵开放时外来花粉污染柱头，待花朵开放第1天于上午8～10时用5ml的针管吸取柱头黏液放入离心管中，放入冰盒中带回实验室，用于花粉萌发实验。

3.花粉在柱头黏液中的萌发：将收集的柱头黏液滴2滴于凹槽载玻片上，每个品种的柱头黏液各滴4个凹槽，用解剖针将步骤1筛选的2个品种热带睡莲‘蓝美人’、耐寒睡莲‘玫瑰’的花粉分别均匀的散落在黏液中，盖上盖玻片，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25℃培养箱中进行暗培养，4h后在显微镜下观察拍照，每个凹槽观察不少于6个视野，统计花粉萌发率，以花粉管伸出超过花粉粒直径时为发芽标准。

萌发率(％)＝(花粉萌发个数/每个视野中总的花粉数)*100。

结果：热带睡莲‘蓝美人’花粉在不同母本柱头黏液中的萌发率与实施例1无显著差异；耐寒睡莲‘玫瑰’(父本)花粉在不同母本柱头黏液中的萌发率与实施例1无显著差异。

4.杂交亲本选择：与实施例1相同。

5.授粉：与实施例1相同。

结果：不同杂交组合的子房膨大率和结实率统计结果与实施例1无显著差异。

6.种子采收：‘马丁廉基夫人’ב蓝美人’、‘小兄弟’ב蓝美人’于杂交后25d，‘莹宝石’ב蓝美人’于杂交后30d，将装有果实的网袋收起，内部的硫酸纸袋可以起到防虫的作用。将硫酸纸中的种子轻轻沾水使其洒落水中，可避免其他杂质一起落入盆中影响种子清洗。用纱布轻轻揉搓种子，去除种子外的膜囊，播种，或将种子保存于盛有蒸馏水的5ml离心管中，置于0℃冰箱中保存，每隔3周更换一次水。筛选的3个杂交组合均得到了杂交种子，说明该睡莲杂交育种方法非常有效，可以推广应用。

Claims (9)

1.睡莲人工杂交育种方法，包括如下步骤：

(1)花粉采集：在大蕾期采集父本的花药，将所述花药干燥至花药开裂散粉，收集花粉；

(2)柱头黏液的采集：在花蕾期，对母本的花朵进行套袋，待母本的花朵开放第1天取母本柱头黏液；

(3)花粉在柱头黏液中的萌发：将上述步骤(1)收集的花粉散落在步骤(2)的母本柱头黏液中，置于25℃～30℃培养箱中进行暗培养，2h～4h后在显微镜下观察拍照，统计花粉萌发率，以花粉管伸出超过花粉粒直径时为萌发标准；

(4)杂交亲本选择：筛选步骤(3)中萌发率≥20％且花粉管伸长正常的组合作为杂交授粉的亲本组合；

(5)人工授粉：对所述步骤(3)筛选出的亲本组合进行人工授粉，收集杂交种子。

2.根据权利要求1所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述采集的时间为开花前两天的早上8时～10时。

3.根据权利要求1或2所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述干燥为自然风干。

4.根据权利要求1所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述步骤(5)中人工授粉的方法为：在所述亲本花朵开放之前，挑选发育时期一致的花蕾，用硫酸纸袋套袋，至母本花朵开放第1天，柱头分泌粘液时，采集套袋父本的花粉放入母本的柱头黏液中进行人工授粉。

5.根据权利要求4所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述步骤(5)中人工授粉后还包括授粉后的母本入水发育，等待果实成熟，收集杂交种子的步骤。

6.根据权利要求5所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述收集杂交种子包括如下步骤：将装有成熟果实的网袋收起，内部的硫酸纸袋起到防虫的作用；将硫酸纸中的种子轻轻沾水使其洒落水中，以避免其他杂质一起落入盆中影响种子清洗；用纱布轻轻揉搓种子，去除种子外的膜囊，播种，或将种子保存于盛有蒸馏水的5ml离心管中，置于0℃～4℃冰箱中保存，每隔2周～3周更换一次水。

7.根据权利要求1所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述母本柱头黏液是用2ml～5ml的针管吸取，放入离心管中，并置于冰盒中带回实验室，用于花粉萌发实验。

8.根据权利要求1所述的睡莲人工杂交育种方法，其特征在于：所述步骤(3)中还包括如下步骤：将步骤(2)的母本柱头黏液滴于凹槽载玻片上，每个品种的柱头黏液各滴3～4个凹槽，用解剖针将所述步骤(1)采集的花粉均匀的散落在黏液中，盖上盖玻片，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25℃～30℃培养箱中进行暗培养，2h～4h后在显微镜下观察拍照，每个凹槽观察不少于6个视野，统计花粉萌发率，以花粉管伸出超过花粉粒直径时为萌发标准。

9.权利要求1-8中任一所述的睡莲人工杂交育种方法在睡莲杂交育种中的应用。