CN106508668A - 一种青蒿可重复进行的定向杂交育种制种方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明供了一种可反复进行多次的全新的青蒿杂交育种制种方法。具体为：1）亲本植株的选择、培育和保存；2）诱导开花；3）授粉杂交；4）收获全同胞种子；本发明提供的方法，具有①让育种制种可多次、反复进行，不受一年仅一次及季节约束。②选择（控制）亲本，人为定向育种，使不同优良性状可以定向集结于子代，尤其高品质、高产能和耐逆性等性状的结合③获得遗传性状一致的青蒿全同胞家系子代种子（材料），制种环节则可提高生产用种纯度。④让青蒿植株的枝条选择性开花杂交，其余株体（枝条）继续存活，单一植株能被持续育种利用，优质资源在利用的同时也得以保存。

Description

一种青蒿可重复进行的定向杂交育种制种方法及应用

技术领域

本发明涉及一种青蒿繁殖方法，更具体的说涉及一种青蒿可持续定向杂交育种制种方法及应用。

技术背景

青蒿(artemisia annuaL.)，又名黄花蒿，为菊科艾属一年生草本植物，传统中药，具有清热解暑、除蒸、截疟的作用，其叶片及花蕾提取青蒿素，为青蒿素类药物的唯一商用原料来源。青蒿株高100-400厘米，全株具有较强的挥发油气味。茎直立，具纵条纹，多分枝，光滑无毛。基生叶平铺地面，开花时凋萎；茎生叶互生，幼时绿色，老时变为黄褐色，无毛，有短柄，向上渐无柄；叶片通常为一回羽状全裂，裂叶短细，有极小粉末状短柔毛，上面深绿色，下面淡绿色，具细小的毛或粉末状腺状斑点；叶轴两侧具窄翅；茎上部的叶向上逐渐细小呈条形。中、晚秋开小黄花，头状花序，细小(直径2-3mm)，球形，具细软短梗，由大约30朵小花聚合组成圆锥状；小花为管状花，黄色，外围为雌花，中间为两性花；瘦果，椭圆形。

青蒿广泛分布于世界及我国各地，但品质地域属性极强，世界上绝大多数地方的青蒿因品质低而无利用价值。我国是黄花蒿资源大国，尤其武陵山区的重庆、湖南、广西等地区，品质含量高、资源丰富而独特。为此，在这些地区，青蒿种植规模已超10万亩，为世界抗疟做出了不可替代的贡献，也为“中国中药”树立了良好形象。

青蒿栽培以种子繁殖为主。以重庆和广西为例，从10月下旬至l1月上旬种子采收至次年5月中旬前都可播种。种子发芽正常，说明无休眠期。但以2月中旬至3月中旬播种为最佳。该时期发芽率高，出苗整齐，4月上旬以后种子发芽力迅速递减。18～25℃是种子发芽的适宜温度。8月中旬至9月上旬为花蕾期。头状花序黄绿色，极多数，球形，长及宽约1.5mm，有短梗，排列成复总状或总状，常有条形苞叶，总苞片2～3层，外层狭矩圆形，内层椭圆形，花托长圆形，花筒状，外层雌性，内层两性。10月上旬左右形成果实，瘦果矩圆形，长不超过1mm，无毛。10月中、下旬，种子成熟，每克种子超过3万粒。商品叶采收生育期210-240天。

青蒿栽培历史尚短，育种研究、种质资源和品种积累等各方面都十分薄弱，远落后于一般农作物。青蒿为典型的异化授粉，自花(包括无性系的植株个体之间)不结实，种子为异质杂交而得。青蒿花器官极小，肉眼不能操作，因而人工育种困难。目前青蒿栽培用种，多直接采自于野生种质，或大田群体筛选。野生或大田筛选都为群体自然杂交，授粉混乱，子代品质(青蒿素含量)性状变异极大，农艺性状不稳定，这导致育种和品种资源保存的困难，优良性状因繁育制种过程而易迅速退化。同时，自然杂交要求亲本花期必须完全相同，而具有不同优良性状或来源于不同生态地域的种质的生长期往往差异较多，加之传粉空间距离的限制，优良性状聚结的机率小，选育种的工作效率低。种源现状，成为青蒿产业瓶颈。

青蒿是严格的短日照植物，通过短日照处理，可以诱导开花；而在长日照条件下，能够保持营养生长状态而长时间存活。所谓短日照植物，是指给与比临界暗期(criticaldark period)长的连续黑暗下的光周期时，花芽才能形成或促进花芽形成的植物；在自然界中，在日照比较短的季节里，花芽才能分化，例如菊花、水稻、牵牛花、苍耳、大豆等，都是属于短日照植物。即使日照较短，假如随后的暗期短于临界暗期，花芽仍不能形成，或即使给与足够的暗期，但在中途适当的时间进行短时间的光照(光中断)时，花芽也不能分化。光周期敏感的青蒿种质，当光周期约小于13.5h时，半月之内就会开花。

发明内容

长期以来青蒿育种制种都是采用群体自然杂交。群体自然杂交，不仅要求亲本花期相同，而且授粉混乱不可控而子代遗传性状不一致；同时，青蒿为一年生草本，株体存活仅一年，育种制种利用也仅一次(一年开花结实仅一次)，优质种质材料在育种制种后因衰老枯亡而难再留存。为克服这些问题，本发明可定向选择具有目标性状的青蒿植株作为亲本，基于青蒿短日照植物的特性，调控光周期控制青蒿开花，延续青蒿存活期，提供了一种可反复进行多次的全新的青蒿杂交育种制种方法。具体为：

1)亲本植株的选择、培育和保存。定向选择亲本材料(如高含量、高产能)，或实生苗或扦插苗，父本母本至少各培育一株。为避免自花不育，亲本材料要求具有一定异质性，即互不为同一无性系的个体。在青蒿植株第二次分枝前，全株置于强度500-5000Lx每天15-24h的光照环境中，抑制花芽分化，使其持久保持在营养生长状态。

2)诱导开花。在第二次分枝后任意时间(最好三级分枝后)，选生长健康的亲本各一株，将两植株整体或各自任一健康枝条，置于同一个封闭空间内，每天光照8-11h(保持黑暗16-13h)，诱导开花。诱导开花一般采用枝条而非整株，这是因为其余枝条仍可继续保持在原光照条件下维持营养生长状态，使亲本资源得以续存保持并可持续利用；同时，为确保错花期的种质材料间成功杂交，可多选枝条分别按时间序列(每隔2d)依次进行诱导开花。

3)授粉杂交。开花后，继续在封闭空间内(避免外来花粉)，将两个亲本花枝相互交叉、抖动，使彼此互相授粉，结实。

4)收获全同胞种子。待籽粒成熟后，按及时剪除枝条，收集种子。同一枝条的种子，属全同胞家系，记录下其父本母本。

一种专应用于青蒿枝条间杂交育种制种的专用装置，调控光照周期，并隔绝外来花粉。所述装置由暗室支撑架组成，支撑架由支撑座、支撑柱和支撑杆组成；支撑柱为垂直的柱体结构，下端固定连接在支撑座的上部，支撑杆的一端与支撑柱上下滑动连接，并可通过螺丝固定，另外一端固定在暗室的后部或底部；暗室由完全避光的材料制成，由室体、遮光盖)、枝条孔和遮光布组成；室体、遮光盖和遮光布密封后构成一个封闭的闭光空间。所述室体与遮光盖通过铰链转动连接，室体的两侧设置有用于青蒿枝条穿过的枝条孔，枝条孔的外侧设置用于封闭枝条孔的遮光布。

上述任一项所述的青蒿杂交育种制种方法在青蒿良种选育中的应用。

与青蒿传统育种、制种相比，本发明的有益技术效果是：本发明提供的方法，①选择青蒿植株的枝条，通过控制光周期诱导开花，让育种制种可多次、反复进行，不受一年仅一次及季节约束。②选择(控制)亲本，人为定向育种，使不同优良性状可以定向集结于子代，尤其高品质、高产能和耐逆性等性状的结合；同时，控制光周期诱导开花，扩大了杂交亲本选择范围，使自然条件下原本花期不同的种质之间的也可杂交，创新种质材料，提高育种效率，大大增加高品质且兼具多优良农艺性状的超级品种育成的可能性。③获得遗传性状一致的青蒿全同胞家系子代种子(材料)，制种环节则可提高生产用种纯度，减少青蒿原料中品质变异幅度，降低青蒿素加工环节生产成本。④让青蒿植株的枝条选择性开花杂交，其余株体(枝条)继续存活，单一植株能被持续育种利用，优质资源在利用的同时也得以保存。

说明书附图

图1青蒿可持续定向杂交育种制种的专用装置结构示意图1；

图2青蒿可持续定向杂交育种制种的专用装置结构示意图2；

图3青蒿定向杂交示意图；

1-1支撑座、1-2支撑柱，1-3支撑杆，2暗室，2-1室体，2-2遮光盖，2-3枝条孔，2-4遮光布。

具体实施方式

实施例1光周期对青蒿开花和生育进程的影响

青蒿试验材料：两种青蒿种质材料，晚熟的紫杆青蒿，早熟的绿杆青蒿。紫色茎杆种子采自重庆酉阳大田群体；绿色茎杆初采自广西阳朔野生群体，经西南大学试验农场2年驯化栽培。

1长日照对青蒿花芽分化抑制作用

长日照试验处理：试验在西南大学试验网室进行。用遮光材料在网室围建A、B两个分隔的光周期处理区，阻隔干扰光源。A区为对照，自然日照，每日光照时长大致11～13h；B区为长日照处理，除自然日照外，另加2000Lx人工光源，于每日15:00～24:00期间补照7h，使日照时长超16h。

分别取紫杆、绿杆种子，同时(1月20日)分别在A、B区播种育苗若干。青蒿幼苗在第一次分枝前(3月15日)，移植盆栽。每盆装土10kg,拌土基施15-15-15复合肥15g和150有机质，定植1株。A区、B区各分别放置紫杆、绿杆青蒿植株100盆。青蒿生长期间温度大致在15℃～30℃，相对湿度60％～90％，自然降雨并辅以灌溉。观察记录生育进程，结果见表1。

在青蒿植株出现第一级分枝(3月25日)、第二级分枝(5月1日)、第三级分枝(6月5日)时期，分别将A(B)区植株各取5盆(株)转移到B(A)区。观察记录转移植株生育进程，结果见表2。

表1光周期对青蒿生育进程的影响

在对照(A)区处于自然光照周期条件下的两种质青蒿虽花期相错，但都先后开花、结实、衰老枯死；而B区处于长日照(16h)处理的两种质青蒿不仅当年未开花，第二年依然未开花，青蒿持续维持营养生长状态，直到试验结束为止，历经600多天，生育期由一年生转为多年生。表明长日照抑制花芽分化，青蒿一直在长日照下，持久营养生长状态，这为青蒿种质、优良性状和品种的保存和利用提供了思路。

表2反映青蒿对光周期敏感有生育期限制。由A区转移到B接受长日照的植株中，转移时期不同而结果不同，第一级分枝期转移的植株不开花、不衰老枯死，第二级分枝期则部分枝条开花、枯死，而另一部分未开花、不衰老；第三级分枝期，则长日照已不再具有作用效果。说明长日照须在第二级分枝时期以前开始进行方能有效抑制花芽分化。由长日照转移到短日照(B转移到A)，各分枝时期都一致，青蒿现蕾、开花、结实与自然日照处理状态完全一致。

试验中还观察到，15℃-30℃、湿度60-90％是青蒿适宜的生长条件。在15℃-30℃温度范围内，偏高的温度利于青蒿生物量的增长，但偏低的温度有利于青蒿缓慢生长而维持持久的营养状态，即偏低温度更利于种质材料保存。

表2青蒿光周期的效应期

2短日照诱导花芽分化

选试验组1中B区(长日照下未花芽分化)的青蒿植株的枝条为材料，进行短日照诱导开花试验。10月开始分次用专用装置(见附图)遮光处理，同一株青蒿每次2-3枝，平行处理3-5株，遮光时间为17:00～8:00(黑暗15h，光照9h)。以同株未遮光枝条和未作处理植株为对照，观察枝条生育进程。结果见表3。试验表明，短日照(光照时长9h)能有效诱导花芽分化，遮光后，枝条15-25天后即出现花蕾，全部开花，完成生命周期并按期衰老枯死；但是，遮光枝条以外的同株体其余未遮光枝条以及主茎和根，与未处理植株一样，未见花蕾和花，持续处于营养生长状态(不衰败)。温度对花芽分化有一定影响，偏低的温度(第3次遮光)比偏高的温度(第1次遮光)蕾和花出现明显慢一些。不同种质对遮光(短日照)敏感性不同，响应速度也存差异。

表3枝条遮光(短日照)诱导开花试验结果

3临界光周期及光照强度的考察

选取试验组1中B区的部分青蒿植株(未开花、营养生长状态良好)，于10月3日(自然光照下绿杆青蒿花期已过而紫色青蒿进入始花期)，转移至温室。温室基础光照2000Lx12h，温度20℃～27℃，相对湿度大致60％～90％。

设置光照时长和强度2因素试验方案：温室分隔3个独立盆栽区，在2000Lx 12h基础上，分别采用人工点光源，增加光照时长0h、1h、2h，即光周期分别为12h、13h、14h；调节植株与点光源距离设置点光源的光照强度：5000Lx、2000Lx、500Lx、250Lx。观察植物花蕾、开花等生育进程，结果见表3。

结果表明这两青蒿种质的临界光周期大致都为13h。12h日照使青蒿重新开花，而≥14h日照则抑制青蒿花芽分化。抑制开花的长日照必须满足一定强度(500Lx～5000Lx)，但过强的光也会引起青蒿植株的老化和枯败。

表3临界光周期与光照强度的效果

实施例2种质材料保持方法对青蒿花粉活力及柱头可授性的影响

在实施例1研究基础上，利用青蒿植株为短作物光周期的生理特性，针对特定青蒿植株，选择同一品种的6株长势相近的植株，取任意植3株作为对照组，另外3植作为实验组。实验组采用在环境温度20-30℃,环境湿度60-80％，光照强度1000Lx,光照时长17h。青蒿植株保持种质材料，选择任意一株青蒿植株，在植株不开花保持100d、200d、300d、400d、500d、600d时，分别选择不同的枝条检测该植株花的花粉活力和柱头可授性，并在检测完成后，立即剪除该枝条，该植株的其他部分继续在原环境中生长。对照组在正常条件下种植，在正常花期检测花粉活力和柱头可授性。

花粉活力的检测为：将一个分支枝条置于同一封闭透明环境封闭中；每天光照两株青蒿枝条每天光照8-11h，保持黑暗16-13h，诱导枝条开花；本植株的其他部分继续在原保持环境中生长。于盛花期采集己完全开放的花序，然后将各自的半数花序放置于含有硅胶的干燥器中干燥2h后，再用毛笔将花粉刷落至白板纸上。将从新鲜花序上采集的鲜花粉和干燥花序上采集的干燥花粉分别分成9等份，采用联苯胺-甲萘酚染色法快速测定花粉的活力。

柱头可授性的测定为：在该枝条的盛花期，将开花后不同天数的青篙用解剖针将外轮小花和中央小花分类，然后将其完全浸泡在含联苯胺-过氧化氢反应液(1％联苯胺，3％过氧化氢，水的体积比例为4:11:22)的凹而载玻片中的部位.若柱头具有可授性，凹面载玻片周围的反应液则呈现蓝色并伴有气泡出现，如无气泡产生且未见蓝色，则柱头无可授花)，可通过比较其气泡量的多少和大小来衡量其可授性的强。本实验分别对青篙的边花(单性雌花)和中央小花(两性花)的柱头可授性进行了观察，每次3朵小花，重复3次，先测定出青篙小花从开花到谢花期间柱头可授性的变化，确定出小花开花后柱头可授性的高峰期；再在高峰期检测其柱头1d之内的可授性变化。

测定完花粉活力和柱头可授粉性后，立即切除该枝条。其他枝条任保持在原保持环境中继续生长。以便进行下一次检测。不同保持时间对花粉活力的影响见表4，柱头可授性结果见表5所示。

表4不同保持时间对花粉活力的影响

表5不同保持天数对柱头可授性的影响

注：+表示柱头具有可授粉性，++；表示柱头具有较强可授粉性；+++表示柱头具有强可授粉性。

表4、5显示，同一种质青蒿，在不同保存时间点上对选定枝条进行黑暗诱导的花，其有性繁殖特性，没有受到保存时间和诱导的影响。

实施例3青蒿杂交考察

如图1、2所示，本发明提供的应用于青蒿杂交授粉的专用装置，由暗室2支撑架组成，支撑架由支撑座1-1、支撑柱1-2和支撑杆1-3组成；支撑柱1-2为垂直的柱体结构，下端固定连接在支撑座1-1的上部，支撑杆1-3的一端与支撑柱1-2上下滑动连接，并可通过螺丝固定，另外一端固定在暗室2的后部或底部。暗室2由完全避光的材料制成，由室体2-1、遮光盖2-2、枝条孔2-3和遮光布2-4组成；室体2-1、遮光盖2-2和遮光布2-4密封后构成一个封闭的闭光空间。室体2-1与遮光盖2-2通过铰链转动连接，室体2-1的两侧设置有用于青蒿枝条穿过的枝条孔2-3，枝条孔2-3的外侧设置用于封闭枝条孔2-3的遮光布2-4。

在使用时，分别将两株将需要进行杂交的从两个枝条孔2-3插入暗室2中，并用遮光布2-4密封枝条孔2-3。将整株青蒿至于原环境中，根据光照和避光的需要开关遮光盖2-2，控制对青蒿枝条的光照，促使该特定枝条花枝分化，开花杂交。

将实施例1保持在长日照B区的青蒿取两株，分别在保存300d和500d时选定生长状态良好的枝条进行诱导开花和杂交，采用本专利提供的特定装置控制光照，暗室2内的枝条每日光照时长10h,光照强度2000Lx。暗室内的青蒿在两周出现花蕾，再两周后开花，经授粉，在花凋谢1个月后镜检确定结籽。将上述两株青蒿植株制备的两组青蒿种子进行播种试验，证明在300d和500d条件下制作的种子发芽率与普通青蒿种子无差别。

Claims (6)

1.一种青蒿可重复进行的定向杂交育种制种方法，其特征在于：选定具有优良目标性状的青蒿单株为亲本材料，在青蒿植株第二次分枝前，全株置于强度500-5000Lx每天14-24h的光照环境中，抑制花芽分化，使其保持在营养生长状态；将两株青蒿亲本植株各选一健康枝条，置于同一个封闭空间内，每天进行13-16h黑暗诱导，使开花并有性杂交。

2.根据权利要求1所述的青蒿可重复进行的定向杂交育种制种方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）在第二次分枝后任意时间，将两株需要进行有性杂交的青蒿植株上的选定枝条置于同一封闭透明环境中；

2）对步骤1）中置于封闭环境中的选定枝条每天光照两株青蒿枝条每天光照8-11h，保持黑暗16-13h，诱导枝条开花、授粉、结籽；

3）在封闭环境中的两株青蒿枝条结籽成熟后，及时剪除枝条，收集种子；

4）青蒿植株的整株（其余枝条）继续保持在原光照环境中，依然维持营养生长状态不衰老；

按1）～3）的方法重复进行，可反复多次育种或制种。

3.一种应用于青蒿可重复进行的定向杂交育种制种的专用装置，其特征在于：所述装置由暗室（2）支撑架组成，支撑架由支撑座（1-1）、支撑柱（1-2）和支撑杆（1-3）组成；支撑柱（1-2）为垂直的柱体结构，下端固定连接在支撑座（1-1）的上部，支撑杆(1-3)的一端与支撑柱(1-2)上下滑动连接，并可通过螺丝固定，另外一端固定在暗室（2）的后部或底部；暗室(2)由完全避光的材料制成，由室体(2-1)、遮光盖(2-2)、枝条孔(2-3)和遮光布(2-4)组成；室体(2-1)、遮光盖(2-2)和遮光布(2-4)密封后构成一个封闭的闭光空间。

4.根据权利要求3所述的应用于用于青蒿可重复进行的定向杂交育种制种的专用装置，其特征在于：所述室体(2-1)与遮光盖(2-2)通过铰链转动连接，室体(2-1)的两侧设置有用于青蒿枝条穿过的枝条孔(2-3)，枝条孔（2-3）的外侧设置用于封闭枝条孔（2-3）的遮光布（2-4）。

5.权利要求1、2青蒿枝条诱导开花杂交的方法，也可以在青蒿整株间进行。

6.权利要求1～5任一项所述的方法在青蒿杂交良种选育、制种中的应用。