CN104255502A - 一种虎杖组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及通过植物组织培养技术的植物再生，具体为一种虎杖组织培养快速繁殖的方法。该方法包括以下步骤：（1）外植体的选取与灭菌，选取健壮、无病虫害的野生虎杖带腋芽幼嫩枝条作为外植体，并对其进行消毒处理；（2）不定芽的诱导，将步骤（1）中的外植体切成长2-3cm的单芽茎段，分别接种于诱导培养基中进行诱导培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h；（3）不定芽的继代培养等步骤。本发明中所述的方法快速、高效、成本低，移栽成活率高，便于推广，遗传稳定性好，缩短了虎杖的育苗周期，为今后进行工业化生产提供了可靠地来源和物质基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及通过植物组织培养技术的植物再生，具体为一种虎杖组织培养快速繁殖的方法。
背景技术
虎杖为蓼科虎杖属多年生草本植物根状茎粗壮，横走。茎直立，高1-2米，粗壮，空心，具明显的纵棱，具小突起，无毛，散生红色或紫红斑点。叶宽卵形或卵状椭圆形，长5-12厘米，宽4-9厘米，近革质，顶端渐尖，基部宽楔形、截形或近圆形，边缘全缘，疏生小突起，两面无毛，沿叶脉具小突起；叶柄长1-2厘米，具小突起；托叶鞘膜质，偏斜，长3-5毫米，褐色，具纵脉，无毛，顶端截形，无缘毛，常破裂，早落。花单性，雌雄异株，花序圆锥状，长3-8厘米，腋生；苞片漏斗状，长1.5-2毫米，顶端渐尖，无缘毛，每苞内具2-4花；花梗长2-4毫米，中下部具关节；花被5深裂，淡绿色，雄花花被片具绿色中脉，无翅，雄蕊8,比花被长；雌花花被片外面3片背部具翅，果时增大，翅扩展下延，花柱3,柱头流苏状。瘦果卵形，具3棱，长4-5毫米，黑褐色，有光泽，包于宿存花被内。花期8-9月，果期9-10月。产陕西南部、甘肃南部、华东、华中、华南、四川、云南及贵州；生山坡灌丛、山谷、路旁、田边湿地，海拔140-2000米。朝鲜、日本也有。根状茎供药用，有活血、散瘀、通经、镇咳等功效。
虎杖根茎富含虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄酚、大黄酸槲皮素、槲皮素-3-阿拉伯糖甙、槲皮素-3-半乳糖甙等，其提取物广泛用于医药、保健品、化妆品等黄页，国际市场需求空间很大。而据统计提取1吨白藜芦醇需要消耗500吨虎杖原料，但白藜芦醇在植物体内含量普遍较低。
多年来，虎杖主要靠野外采挖。据统计，虎杖再生量为9.8*106kg/年，其可持续采挖量为4.95*106kg/年，市场需求量为6.0*106kg/年。因此，虎杖的野生资源已面临过度采挖的局面。长期的掠夺式地采挖还会加快野生资源的灭绝速度。虎杖以根状茎入药，目前虽有人工种植，但虎杖主要靠根茎繁殖和种子繁殖，而根茎繁殖，易造成根的生长量和采挖量降低；种子繁殖，据野外观察虎杖种子很少成熟发芽成苗。因此，为保证药用植物的可持续利用，利用植物组织培养技术，能迅速缓解我国传统医学当今中草药虎杖资源短缺问题，且占用空间小。采用植物组织培养技术，可以有效快速提高虎杖的繁殖速度和质量，实现虎杖优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虎杖组织培养快速繁殖的方法，它能够快速繁殖出大量适合移栽的优质虎杖种苗，以满足生产需要，为虎杖人工种植提供一条新的途径。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种虎杖组织培养快速繁殖的方法，该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选取与灭菌
选取健壮、无病虫害的野生虎杖带腋芽幼嫩枝条作为外植体，并对其进行消毒处理，消毒步骤如下：
1)对材料进行流水冲洗，洗净杂质后，用流水冲洗2-3h；
2)在超净工作台中先用质量浓度为75％的酒精浸泡30s，然后用无菌水清洗3-5遍；
3)用质量百分含量为0.1％的HgCl2处理5-6min，然后用无菌水洗冲5-6次；
4)用无菌滤纸吸干水分备用。
(2)不定芽的诱导
将步骤(1)中外植体切成带芽茎段(长2-3cm)，分别接种于诱导培养基中进行诱导培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS培养基中含0.2-2.5mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA及1.0-5.0mg/L的VC,30g/L蔗糖，6-7g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.2。
(3)不定芽的继代培养
将步骤(2)中培养出的不定芽接种于继代培养基继续继代培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS培养基中含0.1-1.0mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的IAA及0.1-0.5mg/L的KT,30g/L蔗糖，6-7g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.2。
(4)生根培养
将步骤(3)中的不定芽剪切成含有2-3个节且带顶芽的茎段接种于生根培养基中。培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。10d后开始长根，30d后长出大量根。其中生根培养基为MS培养基，该培养基中含0.3-0.5mg/L的IBA和0.2-0.6mg/L的NAA，30g/L蔗糖，6-7g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.2。
(5)驯化炼苗
带步骤(4)中生根苗植株长至约4-6cm、生根条数达5-6条，且长度为3-4cm时，将其移至自然条件下炼苗2d，2d后将其盖打开继续炼苗4-5d，备用；
(6)试管苗的移栽
将步骤(5)中驯化好的虎杖植株将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基。用800倍50％的多菌灵可湿性粉剂浸泡2-3h，稍晾干根部水分即可进行移栽，移栽入经高温消毒过的营养土、自然土壤和蛭石体积比0.1-1:1-2:0.5-1的混合基质的营养钵并置于温室中。并随时注意保湿，20d后将其直接移栽至大田中。本发明中所述培养基及专业术语：
(1)MS基本培养基为(单位为mg/L)：MS(Murashige and Skoog，1962)包括大量元素(硝酸铵1650，硝酸钾1900，二水氯化钙440，七水硫酸镁370，磷酸二氢170)可配成20倍母液，取母液50ml/L；微量元素(一水硫酸锰22.3，七水硫酸锌8.6，六水氯化钴0.025，无水硫酸铜0.025，硼酸6.2，二水钼酸钠0.25，碘化钾0.83)配成母液200倍，取母液5ml/L；铁盐(七水硫酸亚铁28.7，乙二胺四乙酸二钠37.3)配成母液200倍，取母液5ml/L；有机(烟酸0.5，烟酸吡哆醇0.5，盐酸硫胺素0.1，甘氨酸2.0)配成母液200倍，取母液5ml/L，另加肌醇0.1g，蔗糖30g，固体培养基加琼脂粉6.5g，本发明中1/2MS固体培养基是大量元素减半，其余不变，pH值为5.8-6.5。
(2)本发明中所述激素为6-BA(6-苄基氨基腺嘌呤)，NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，KT(激动素)，IBA(吲哚丁酸)。
(3)本发明所涉及公式的测定方法：
1)不定芽诱导率(％)＝不定芽发芽数/接种外植体数*100％；
2)不定芽增值率(％)＝(分化的不定芽数-接种数)/接种数*100％；
3)不定芽增值倍数＝不定芽发芽数/接种不定芽数；
4)生根率(％)＝出根条数/接种外植体数*100％；
5)移栽成活率(％)＝(移栽试管苗数-死亡试管苗数)/移栽试管苗数*100％。
本发明的积极效果体现在：
(1)本发明中所述的方法快速、高效、成本低，移栽成活率高，便于推广，遗传稳定性好，缩短了虎杖的育苗周期，为今后进行工业化生产提供了可靠地来源和物质基础。
(2)通过芽的繁殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性，有利于虎杖优良品种的选育。
(3)本发明中通过芽的繁殖，不需要经过愈伤组织组织阶段，且诱导出的不定芽不需要经过壮苗阶段，大大缩短了虎杖的育苗周期，节约了人力，物力，财力等。
(4)采用本发明所述的培养方法，不定芽的诱导率可达98.5％以上，增值率为99％以上，增值倍数可达6-9倍，生根率为99.5％，平均长度可达3-4cm，生根条数为5-6条，移栽成活率可达98％以上。
具体实施例
实施例1：
(1)外植体的选取与灭菌
选取健壮、无病虫害的野生虎杖带腋芽幼嫩枝条作为外植体，并对其进行消毒处理，消毒步骤如下：对材料进行流水冲洗，洗净杂质后，用流水冲洗2-3h；在超净工作台中先用75％酒精浸泡30s，无菌水清洗3-5遍；用质量百分含量为0.1％HgCl2处理5-6min，无菌水洗冲5-6次；用无菌滤纸吸干水分备用。
(2)不定芽的诱导
将步骤(1)中外植体切成带芽茎段(长2-3cm)，分别接种于诱导培养基中进行诱导培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+VC 3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH值为5.8-6.2。
(3)不定芽的继代培养
将步骤(2)中培养出的不定芽接种于继代培养基继续继代培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0.8g/L+IAA0.4mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH值为5.8-6.2。
(4)生根培养
将步骤(3)中的不定芽剪切成含有2-3个节且带顶芽的茎段接种于生根培养基中。培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。10d后开始长根，30d后长出大量根。其中生根培养基为1/2MS培养基中+IBA0.4mg/L+NAA0.4mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.2。
(5)驯化炼苗
将步骤(4)中生根苗植株长至约4-6cm、生根条数达5-6条，且长度为3-4cm时，将其移至自然条件下炼苗2d，2d后将其盖打开继续炼苗4-5d，备用；
(6)试管苗的移栽
将步骤(5)中驯化好的虎杖植株将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基。用800倍50％的多菌灵可湿性粉剂浸泡2-3h，稍晾干根部水分即可进行移栽，移栽入经高温消毒过的营养土、自然土壤和蛭石体积比1:2:0.5的混合基质的营养钵并置于温室中。并随时注意保湿，20d后将其直接移栽至大田中。
实施例2：
(1)外植体的选取与灭菌
选取健壮、无病虫害的野生虎杖带腋芽幼嫩枝条作为外植体，并对其进行消毒处理，消毒步骤如下：对材料进行流水冲洗，洗净杂质后，用流水冲洗2-3h；在超净工作台中先用75％酒精浸泡30s，无菌水清洗3-5遍；用0.1％HgCl2处理5-6min，无菌水洗冲5-6次；用无菌滤纸吸干水分备用。
(2)不定芽的诱导
将步骤(1)中外植体切成带芽茎段(长2-3cm)，分别接种于诱导培养基中进行诱导培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS基本培养基+6-BA2.5mg/L+NAA 0.5mg/L+VC 3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH值为5.8-6.2。
(3)不定芽的继代培养
将步骤(2)中培养出的不定芽接种于继代培养基继续继代培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0.8g/L+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH值为5.8-6.2。
(4)生根培养
将步骤(3)中的不定芽剪切成含有2-3个节且带顶芽的茎段接种于生根培养基中。培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。10d后开始长根，30d后长出大量根。其中生根培养基为1/2MS培养基中+IBA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.2。
(5)驯化炼苗
带步骤(4)中生根苗植株长至约4-6cm、生根条数达5-6条，且长度为3-4cm时，将其移至自然条件下炼苗2d，2d后将其盖打开继续炼苗4-5d，备用；
(6)试管苗的移栽
将步骤(5)中驯化好的虎杖植株将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基。用800倍50％的多菌灵可湿性粉剂浸泡2-3h，稍晾干根部水分即可进行移栽，移栽入经高温消毒过的营养土、自然土壤和蛭石体积比0.5:1:0.5的混合基质的营养钵并置于温室中。并随时注意保湿，20d后将其直接移栽至大田中。
实施例3：
(1)外植体的选取与灭菌
选取健壮、无病虫害的野生虎杖带腋芽幼嫩枝条作为外植体，并对其进行消毒处理，消毒步骤如下：对材料进行流水冲洗，洗净杂质后，用流水冲洗2-3h；在超净工作台中先用75％酒精浸泡30s，无菌水清洗3-5遍；用0.1％HgCl2处理5-6min，无菌水洗冲5-6次；用无菌滤纸吸干水分备用。
(2)不定芽的诱导
将步骤(1)中外植体切成带芽茎段(长2-3cm)，分别接种于诱导培养基中进行诱导培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS基本培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+VC 3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH值为5.8-6.2。
(3)不定芽的继代培养
将步骤(2)中培养出的不定芽接种于继代培养基继续继代培养，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。7天后长出白色芽点，25d后形成不定芽。其中诱导培养基为MS基本培养基+6-BA0.5g/L+IAA0.3mg/L+KT0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH值为5.8-6.2。
(4)生根培养
将步骤(3)中的不定芽剪切成含有2-3个节且带顶芽的茎段接种于生根培养基中。培养条件：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h。10d后开始长根，30d后长出大量根。其中生根培养基为1/2MS培养基中+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，PH值为5.8-6.2。
(5)驯化炼苗
带步骤(4)中生根苗植株长至约4-6cm、生根条数达5-6条，且长度为3-4cm时，将其移至自然条件下炼苗2d，2d后将其盖打开继续炼苗4-5d，备用；
(6)试管苗的移栽
将步骤(5)中驯化好的虎杖植株将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基。用800倍50％的多菌灵可湿性粉剂浸泡2-3h，稍晾干根部水分即可进行移栽，移栽入经高温消毒过的营养土、自然土壤和蛭石体积比1:2:1的混合基质的营养钵并置于温室中。并随时注意保湿，20d后将其直接移栽至大田中。
采用本发明中实施例1至实施例3中培养方法培养的虎杖组培苗，不定芽的诱导率可达98.5％以上，增值率为99％以上，增值倍数可达6-9倍，生根率为99.5％，平均长度可达3-4cm，生根条数为5-6条，移栽成活率可达98％以上。
对比例1：
虎杖组织培养快速繁殖的方法步骤同实施例1-3中的培养步骤及其培养条件，仅改变步骤(2)中各激素及VC的含量中所添加的物质，测定其不同激素水平对虎杖外植体的诱导不定芽的诱导率。测定结果如下表：
备注：上述实验设计的基本培养基均为MS基本固体培养基。
由上表可知：各因素对虎杖外植体诱导不定芽的影响由大到小为6-BA、NAA、VC,其中6-BA和NAA对其虎杖外植体诱导不定芽有显著影响。此实验确定了该条件下的最佳激素配比：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+VC3.0g/L.
对比例2：
虎杖组织培养快速繁殖的方法步骤同实施例1-3中的培养步骤及其培养条件，仅改变步骤(3)中各激素中添加的物质，测定其不同激素水平对虎杖不定芽增值效果的影响。测定结果如下：
备注：上述实验设计的基本培养基均为MS基本固体培养基。
由上表可知：各因素对虎杖不定芽增值效果的影响由大到小依次为：6-BA、KT、IAA，其中6-BA和KT对其虎杖不定芽增值效果有显著影响。此实验确定了该实验条件下的最佳激素配比为MS+6-BA 0.8mg/L+IAA0.4mg/L+KT0.5mg/L。
对比例3：
虎杖组织培养快速繁殖的方法步骤同实施例1-3中的培养步骤及培养条件，仅改变步骤(4)中各激素中添加的物质，测定其不同激素水平对虎杖组培苗生根的影响。测定结果如下：
备注：(1)上述实验设计的基本培养基均为1/2MS基本固体培养基。
(2)表中数据为五个重复的平均数。
由上表可知：各因素对虎杖组培苗生根率的影响，在以上两种激素对虎杖组培苗生根都有一定的影响，这两种激素水平下最优激素配比为1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L。在此条件下生根率可达99.62％，生根条数可达6.87条，根平均长度可达4.36cm。
对比例4
虎杖组织培养快速繁殖的方法步骤同实施例1-3中培养步骤及其培养条件，仅改变步骤(6)中移栽基质中添加的物质，测定其不同激素水平对虎杖组培苗生根的影响。测定结果如下：
由以上表可知：通过正交数据分析，以上各因素对虎杖组培苗移栽成活率都有影响，其影响由大到小依次为营养土、自然土壤、蛭石，其中营养土和自然土壤对其虎杖组培苗移栽成活率有显著影响，其最佳配比为营养土：自然土壤：蛭石＝1:2:1，此条件下其移栽成活率可达98％以上。
Claims (7)
1.一种虎杖组织培养快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）外植体的选取与灭菌
选取健壮、无病虫害的野生虎杖带腋芽幼嫩枝条作为外植体，并对其进行消毒处理；
（2）不定芽的诱导
将步骤（1）中的外植体切成长2-3cm的单芽茎段，分别接种于诱导培养基中进行诱导培养为不定芽，培养条件为：温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h；
（3）不定芽的继代培养
经过步骤（2）诱导的不定芽接种于继代培养基中，继续继代培养，培养条件同步骤（2）；
（4）诱导生根
经过继代培养后的虎杖不定芽长至4-6cm后，将其直接诱导生根，将步骤（3）中的不定芽剪切成含有2-3个节且带顶芽的茎段接种于生根培养基中，培养条件：温度为25±2℃，光照强度1600-2000 lux，光照时间14-16h；
（5）驯化
带步骤（4）中生根苗植株长至4-6cm、生根条数达5-6条，且根长度为3-4cm时，将其移至自然条件下炼苗2d，2d后将其盖打开继续炼苗4-5d，备用；
（6）试管苗的移栽
将步骤（5）中驯化好的虎杖植株将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基；用800倍质量百分含量为50%的多菌灵可湿性粉剂浸泡2-3h，稍晾干根部水分即可进行移栽，移栽入经高温消毒过的营养土、自然土壤和蛭石体积比0.1-1:1-2:0.5-1的混合基质的营养钵并置于温室中，并随时注意保湿，20d后将其直接移栽至大田中。
2.根据权利要求1中所述的虎杖组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中其消毒处理的具体步骤如下：
（1）对材料进行流水冲洗，洗净杂质后，用流水冲洗2-3h；
（2）在超净工作台中先用75%酒精浸泡30s，无菌水清洗3-5遍；
（3）用0.1% HgCl2处理5-6min，无菌水洗冲5-6次；
（4）用无菌滤纸吸干水分备用。
3.根据权利要求1中所述的虎杖组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：所述的步骤（2）中其不定芽的诱导培养基为MS+6-BA0.2-2.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+VC 1.0-5.0 mg/L，另加6-7g琼脂粉，30g蔗糖，pH值为5.8-6.2，其中VC添加的作用是防止虎杖不定芽的褐化。
4.根据权利要求1中所述的虎杖组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：所述的步骤（3）中其不定芽的继代增殖培养基为MS+6-BA0.1-1.0mg/L+IAA0.1-0.5mg/L+KT0.1-0.5mg/L，另加6-7g琼脂粉，30g蔗糖，pH值为5.8-6.2。
5.根据权利要求1中所述的虎杖组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：所述的步骤（4）中其生根培养基为1/2MS+IBA0.3-0.5mg/L+NAA0.2-0.6mg/L，另加6-7g琼脂粉，30g蔗糖，pH值为5.8-6.2。
6.根据权利要求1中所述的虎杖组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（5）中揭盖驯化时要随时注意保湿，以免其缺水死亡。
7.根据权利要求1中所述的虎杖组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（6）中其混合基质中营养土、自然土壤和蛭石体积比为0.1-1:1-2:0.5-1。
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