CN102083976B - 宛氏拟青霉的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法。本发明的检测方法是使用由下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的鉴定，(a)序列号1～4和22～33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或其互补序列，(b)由序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。

Description

宛氏拟青霉的检测方法
技术领域
本发明涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法。
背景技术
宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)是自然界分布广泛的不完全真菌。宛氏拟青霉在其生长周期中形成由双重细胞壁组成的被称为厚垣孢子的无性孢子。已知宛氏拟青霉的厚垣孢子抗压性能极高，即使在杀灭一般真菌的热和试剂的杀菌条件下也可以生存、增殖，是霉菌产生的原因所在。因此，宛氏拟青霉在食品工业和化妆品工业中被视作危害菌而受到重视。为此，在确立防腐、防霉的体制中，宛氏拟青霉的检测、鉴定是极为重要的。
宛氏拟青霉的检测和鉴定法都以通过培养进行形态学上的种分类为主。由于该方法需要持续培养至发生形态学特征，即使最短也需要14天以上的长时间。此外，由于形态学上的鉴定需要极高的专业性，有根据不同鉴定人鉴定的结果不同的危险性，因而存在鉴定结果的可靠性的问题。因此，需要确立一种解决了快速性和可靠性问题的检测、鉴定方法。
作为快速并且可靠性高的菌类检测方法，已知有将基因的特定碱基序列作为目的的扩增法(例如PCR法和LAMP法)(例如，日本特表平11-505728号公报、日本特开2006-61152号公报、日本特开2006-304763号公报、以及日本特开2007-174903号公报)。然而，这些现有技术中并没有阐明宛氏拟青霉的特异性基因区域。因此，存在难以特异性并且迅速地检测宛氏拟青霉的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性、简便且迅速地检测在食品工业和化妆品工业等中被视作危害菌的宛氏拟青霉的方法。此外，本发明的目的还在于提供能够适用于该方法的DNA、引物组、寡核苷酸以及检测试剂盒。
如上所述难以检测出宛氏拟青霉的原因之一在于，使用现有公知引物用PCR法可能得出假阳性或者假阴性的结果。本发明人认为其原因在于，目前的宛氏拟青霉的基因数据库较弱，不能正确地知道宛氏拟青霉的按种保存的基因区域，因而难以设计用于特异性且迅速地检测、识别宛氏拟青霉的高灵敏度的引物等。
鉴于上述问题，本发明人对于可以特异性检测、识别宛氏拟青霉的新的DNA区域进行了潜心研究。其结果发现：在宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因中存在着一个区域，该区域是具有能够明显区别于其它菌类有的特异性碱基序列的区域(以下，也称为“可变区”)。此外，还发现以该可变区作为靶点，就能够对上述宛氏拟青霉进行特异性且迅速地检测。基于上述认识从而完成了本发明。
本发明涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法。其特征在于，使用以下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸，对宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)进行鉴定。
(a)序列号1～4和22～33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或其互补序列；
(b)由序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列中1个或多个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。
此外，本发明还涉及用于宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测的上述(a)或(b)的碱基序列表示的DNA。
此外，本发明还涉及一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸，其能够和上述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸进行杂交，并且能够作为用于特异性检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的核酸探针或者核酸引物发挥功能。
此外，本发明还涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸对或寡核苷酸组，该寡核苷酸对或寡核苷酸组由选自下述(c)和(d)的寡核苷酸对、下述(e)和(f)的寡核苷酸对、下述(e)和(g)的寡核苷酸对以及下述(e)、(f)和(g)的寡核苷酸组中的至少1对或1组表示；
(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(e)由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(f)由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(g)由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
此外，本发明还涉及含有上述寡核苷酸对或寡核苷酸组的宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测试剂盒。
此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物：
由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号12中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号14中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及
由序列号15中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物：
由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号12中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及
由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物：
由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号18中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号20中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及
由序列号21中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物：
由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、
由序列号18中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及
由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
另外，本发明还涉及一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测试剂盒，其含有：
在上述LAMP法检测中使用的任一引物组、DNA聚合酶、包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP的dNTP。
根据本发明，可以提供一种特异性、简便且迅速地检测在食品工业和化妆品工业等中被视作危害菌的宛氏拟青霉。此外，根据本发明，还可以提供能够适用于该方法的DNA、引物组、寡核苷酸以及检测试剂盒。
附图说明
图1：表示由本发明引物组1的引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株的β-微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系的图。
图2：表示由本发明引物组2的引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株和IFM40915菌株的β-微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系的图。
图3：在实施例1中使用本发明的(c)和(d)的寡核苷酸的PCR产物的电泳图。
图4：在实施例1中使用本发明的(c)和(d)的寡核苷酸的PCR产物的电泳图。
图5：表示实施例2中利用实时浊度法检测宛氏拟青霉的检测灵敏度的图。1表示使用来自Paecilomyces variotii IFM40913菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自Paecilomyces variotiiIFM40915菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，4表示使用来自Byssochlamys nivea IFM51244菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，5表示使用来自Hamigera avellanea IFM42323菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自Talaromyces luteus IFM53242菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
图6：图6(a)和图6(b)是表示实施例3中利利用实时浊度法检测宛氏拟青霉的检测灵敏度的图。在图6(a)中，1表示使用来自Paecilomyces variotii IFM40913菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自Paecilomyces variotii IFM40915菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，3表示使用来自Byssochlamys fluva IFM48421菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自Neosartoryaficheri IFM46945菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，8表示使用来自Neosartorya spinosa IFM46967菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。在图6(b)中，9表示使用来自Neosartorya glabra IFM46949菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，10表示使用来自Neosartoryahiratsukae IFM47036菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，11表示使用来自Alterraria alternate IFM41348菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，12表示使用来自Aureobasidium pullulans IFM41409菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，14表示使用来自Fusariumoxysporum IFM50002菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，15表示使用来自Trichoderma viride IFM40938菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
图7：在实施例4中使用本发明的(e)～(g)的寡核苷酸的PCR产物的电泳图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明是利用宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的β-微管蛋白基因的特定部分碱基序列、即由宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因序列中存在的宛氏拟青霉的特异性区域(可变区)的碱基序列表示的核酸，来进行宛氏拟青霉的鉴定，对宛氏拟青霉进行特异性识别、检测的方法。在此，“可变区”是指β-微管蛋白基因中易于积累碱基突变的区域，该区域的碱基序列与其它真菌之间差别较大。本发明中的“宛氏拟青霉”属于线状不完全菌类的拟青霉属(Paecilomyces)。此外，“β-微管蛋白”是指构成微管的蛋白质，“β-微管蛋白基因”是指编码β-微管蛋白的基因。
在本发明的宛氏拟青霉的检测方法中，使用由下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸，对宛氏拟青霉进行鉴定。
(a)序列号1～4和22～33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或其互补序列；
(b)由序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。
由于由上述(a)或(b)的碱基序列表示的β-微管蛋白基因的可变区是宛氏拟青霉固有的碱基序列，与其它通常菌类的可变区有明显区别。因此，根据本发明的宛氏拟青霉的检测方法，可以特异性且迅速地检测宛氏拟青霉。此外，由上述(a)或(b)的碱基序列表示的DNA也能够用于宛氏拟青霉的检测。
基于序列号1和2，对宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的部分碱基序列进行说明。另外，由序列号1表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM40913菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列，由序列号2表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM40915菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。此外，将由序列号1和2表示的宛氏拟青霉IFM40913菌株和IFM40915菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列的一部分比较并记载在图2中。本发明人发现：在由序列号1和2表示的碱基序列中的50位～100位的区域以及280位～340位的区域，真菌之间的碱基序列的保守性特别低，并且各菌种具有固有的碱基序列。本发明将上述β-微管蛋白基因的部分碱基序列作为靶点。
此外，基于序列号3～4和22～33，对宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的部分碱基序列进行说明。
由序列号3表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉EU037073菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号4表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM50293菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号22表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC4855菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号23表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM52147菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号24表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM52145菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号25表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM51028菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号26表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM51195菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号27表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM55619菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号28表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC5479菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号29表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM51027菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号30表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC31967菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号31表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC31685菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号32表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉SUM3339菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
由序列号33表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM50294菌株的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
本发明人发现：上述β-微管蛋白基因的部分碱基序列也同样，真菌之间的碱基序列的保守性特别低，各菌种具有固有的碱基序列。本发明将上述β-微管蛋白基因的部分碱基序列作为靶点。
在本发明的检测方法中使用的由宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的部分碱基序列(可变区的碱基序列)表示的核酸是由序列号1～4和22～33的任意一个中所记载的碱基序列或其互补序列表示的核酸。
序列号1～4和22～33中记载的碱基序列及其互补序列是分别从宛氏拟青霉的IFM40913菌株、IFM40915菌株、EU037073菌株、IFM50293菌株、NBRC4855菌株、IFM52147菌株、IFM52145菌株、IFM51028菌株、IFM51195菌株、IFM55619菌株、NBRC5479菌株、IFM51027菌株、NBRC31967菌株、NBRC31685菌株、SUM3339菌株以及IFM50294菌株中分离、鉴定的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列。由于上述序列在宛氏拟青霉中的同源性非常高，而且与宛氏拟青霉以外的菌类的同源性低，因而，通过确认被检体是否具有上述碱基序列就可以特异性识别、鉴定宛氏拟青霉。
此外，即使使用由在序列号1～4和22～33中记载的碱基序列中1个或多个碱基缺失、置换或者附加后的碱基序列或其互补序列表示的核酸，也同样地可以特异性识别、鉴定宛氏拟青霉。
(以下，将序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列以及由序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列中1个或多个碱基缺失、置换或者附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列统称为“本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列”。)
作为使用由上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列表示的核酸进行鉴定宛氏拟青霉的方法，没有特别限制，可以用测序法、杂交法、PCR法、LAMP法等通常使用的遗传工程学的方法进行。
在本发明的检测方法中，对于使用由上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列表示的核酸进行的宛氏拟青霉鉴定，优选确定被检体β-微管蛋白基因的碱基序列，并确认在该基因的碱基序列中是否含有上述(a)或(b)中记载的核酸的碱基序列。即，本发明的检测方法是对被检体所具有的β-微管蛋白基因的碱基序列进行解析、确定，并将已确定的碱基序列与本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列进行比较，基于其一致或差别来进行宛氏拟青霉的鉴定。
作为解析、确定碱基序列的方法，没有特别限定，可以使用通常进行的RNA或DNA测序的方法。
具体而言，可以列举出Maxam-Gilbert法、桑格法(Sanger method)等电泳法，质量分析法，杂交法等。在桑格法中，可以列举用放射性标记法、荧光标记法等来标记引物或者终止子的方法。
在本发明中，为了使用由上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列表示的核酸进行宛氏拟青霉的鉴定检测，可以使用能够与由本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列表示的核酸进行杂交、并且作为核酸探针或者核酸引物发挥功能的检测用寡核苷酸。
本发明的检测用寡核苷酸只要是能够用于检测宛氏拟青霉的寡核苷酸即可。即，可以是用于宛氏拟青霉检测的能够作为核酸引物或核酸探针使用的寡核苷酸、在严格条件下能够与宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因杂交的寡核苷酸。另外，在此作为“严格的条件”，例如可以列举出Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook，David W.Russell.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress]所记载的方法，例如，使含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH值7.0)，0.5％SDS，5×Denhardt’s溶液以及100mg/mL鲱鱼精DNA溶液与探针在65℃下保温8～16小时进行杂交的条件。
作为本发明的上述检测用寡核苷酸，更优选作为由上述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸中的区域的、由序列号5～21中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸。此外，本发明的检测用寡核苷酸也可以是由与序列号5～21中任意一个所记载的碱基序列具有70％以上同源性的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸，进一步优选同源性为80％以上的寡核苷酸，进一步优选同源性为85％以上的寡核苷酸，更进一步优选同源性为90％以上的寡核苷酸，特别优选同源性为95％以上的寡核苷酸。此外，可以用于本发明的检测用寡核苷酸中还包括以下寡核苷酸：由序列号5～21中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列中1个或多个、优选为1～5个、更优选为1～4个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个、特别优选为1个碱基的缺失、插入或置换等突变、或修饰而成的碱基序列表示的寡核苷酸。此外，也可以在序列后5～21中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列上附加上适当的碱基序列。
关于碱基序列的同源性，按照Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)等计算得到。具体而言，可以使用基因信息处理软件Genetyx-Win(Software开发制作)的同源解析(Search homology)程序，将参数Unit size to compare(ktup)设定为2进行解析来算出。
上述检测用寡核苷酸的键合方式不仅可以是天然核酸中存在的磷酸二酯键，还可以是例如氨基磷酸酯键(phosphoroamidate bond)、硫代磷酸酯键等。
本发明的检测用寡核苷酸可以用作核酸引物和核酸探针。核酸探针可以通过标记物来标记上述寡核苷酸从而进行制备。作为上述标记物没有特别限制，可以使用放射性物质、酶、荧光物质、发光物质、抗原、半抗原、酶底物、不溶性载体等通常使用的标记物。标记方法可以是末端标记，也可以是在序列中间标记，还可以对糖、磷酸基、碱基部分进行标记。所涉及的标记的检测方法，可以列举例如在用放射性同位素标记核酸探针时使用的放射自显影法等、在用荧光物质标记时使用的荧光显微镜等、在用化学发光物质标记时使用的感光薄膜解析或使用CCD照相机的数码解析等。
此外，上述寡核苷酸可以与固相载体结合作为捕捉探针使用。该情况下，可以联合捕捉探针和标记核酸探针组合来进行夹心杂交(sandwich assay)，也可以对目的核酸进行标记、捕捉。
在本发明的检测法中，为了鉴定、检测宛氏拟青霉，优选使用寡核苷酸作为核酸探针来进行杂交，所述寡核苷酸是由序列号5～21中任意一个所记载的碱基序列号其互补序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列具有70％以上同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸，进一步优选使用由序列号5～21中任意一个所记载的碱基序列表示的寡核苷酸。
为了检测被检体中的宛氏拟青霉，可以将由序列号5～21中任意一个所记载的碱基序列号其互补序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列具有70％以上同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸标记，作为核酸探针，使得到的核酸探针与DNA或RNA杂交，再利用适当的检测法对已杂交的探针的标记进行检测。上述核酸探针由于和宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因可变区的一部分特异性杂交，因而可以迅速并且简便地检测被检体中的宛氏拟青霉。作为测定已与DNA或RNA杂交的核酸探针的标记的方法，可以使用通常的方法(FISH法、点杂法(dot blot法)、DNA杂交(southern blot)、RNA杂交(northern blot)等)。
此外，在本发明的检测方法中，为了使用由上述本发明的β-微管蛋白基因可变区的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉的鉴定，优选对含有该碱基序列的全部或一部分区域的DNA片段进行扩增，确认有无扩增产物。作为对含有该区域的DNA片段进行扩增的方法，没有特别限制，可以使用PCR(Polymerase Chain Reaction)法、LCR(LigaseChain Reaction)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification)法、RCA(Rolling-circleAmplification)法、LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification)法等通常的方法。但是，在本发明中，优选使用PCR法或LAMP法。
在本发明中，对于利用PCR法进行扩增反应从而进行宛氏拟青霉检测的情况进行了说明。
作为由本发明的上述检测用寡核苷酸组成的引物，优选能够与以下区域进行杂交的寡核苷酸，所述区域是选自上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列的区域并且满足以下4个条件：(1)含有宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约为30％～80％，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm(熔解温度：melting temperature)值大约为55℃～65℃。
在上述(1)中“宛氏拟青霉所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区中，不同种之间的碱基序列的保守性特别低(即，宛氏拟青霉的特异性特别高)，宛氏拟青霉所固有的碱基序列中以大约10个碱基连续出现的区域。此外，上述(3)中“寡核苷酸的自退火的可能性低”是指从引物的碱基序列预测引物之间不会互相结合。
作为本发明的检测用寡核苷酸的碱基数，没有特别限定，但优选为13个碱基～30个碱基，更优选为18个碱基～23个碱基。杂交时的寡核苷酸的Tm值优选为在55℃～65℃的范围内，更优选为在59℃～62℃的范围内。寡核苷酸的GC含量优选为30％～80％，更优选为45％～65％，最优选为55％左右。
此外，在使用由序列号1或2记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或其互补序列、或者该碱基序列或其互补序列中的1个或多个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉的鉴定的情况下，优选对作为序列1或2中记载的碱基序列的一部分的该碱基序列的50～100位和/或280～340位的碱基序列的全部或一部分进行扩增，或者对该碱基序列中的1个或多个碱基缺失、置换或附加后的碱基序列的全部或一部分进行扩增。该情况下，作为寡核苷酸的碱基数，没有特别限定，但优选为13个碱基～30个碱基，更优选为18个碱基～23个碱基。
为了利用PCR法进行扩增反应来检测宛氏拟青霉，优选将下述(c)或(d)的寡核苷酸作用核酸引物，进一步优选使用由优选序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸以及由优选序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸。
(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
另外，本发明的宛氏拟青霉检测用寡核苷酸对是由上述(c)的寡核苷酸和上述(d)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对。
由序列号5和序列号6表示的寡核苷酸存在于宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因区域，是具有和可变区的一部分碱基序列或其互补序列相同的碱基序列的寡核苷酸。上述寡核苷酸可以和宛氏拟青霉的DNA的一部分特异性杂交。
由上述(c)和(d)表示的寡核苷酸分别对应于序列号1中记载的碱基序列中的第64位～第85位、第306位～第325位的区域。因此，通过使上述寡核苷酸与宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因杂交，可以特异性检测宛氏拟青霉。
此外，在本发明中，为了利用PCR法进行扩增反应来检测宛氏拟青霉，优选将下述(e)的寡核苷酸、以及(f)的寡核苷酸以及/或者(g)的寡核苷酸用作核酸引物，进一步优选使用由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、以及由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸以及/或者由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸，特别优选使用由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸和由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸。
(e)由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(f)由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(g)由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70％以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
此外，本发明的宛氏拟青霉检测用寡核苷酸对(寡核苷酸组)是由上述(e)的寡核苷酸和上述(f)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对、由上述(e)的寡核苷酸和上述(g)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对、以及由上述(e)的寡核苷酸和上述(f)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对和上述(g)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对。
由序列号7、序列号8和序列号9表示的寡核苷酸存在于宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因区域，是具有和可变区的一部分碱基序列或其互补序列相同的碱基序列的寡核苷酸。上述寡核苷酸可以和宛氏拟青霉的DNA的一部分特异性杂交。
以上述(e)和(f)表示的寡核苷酸分别对应于序列号22中记载的碱基序列中的第98位～第116位、第266位～第285位的区域。由上述(e)和(g)表示的寡核苷酸分别对应于序列号28中记载的碱基序列中的第92位～第110位、第261位～第280位的区域。因此，通过使上述寡核苷酸与宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因进行杂交，可以特异性检测宛氏拟青霉。
本发明中的PCR反应的条件，只要可以将目的DNA片段扩增至可以检测的程度，则没有特别的限制。作为PCR的反应条件的优选的一个例子，例如，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95～98℃下进行10～60秒，引物组与单链DNA杂交的退火反应在约59℃下进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72℃下进行约60秒，以此为一次循环，进行约30～35次循环。
在本发明中，可以采用通常的方法对利用PCR法扩增后的基因片段进行确认。例如可以列举出在基因扩增反应时将用放射性物质等标记过的核苷酸加入的方法，将PCR反应产物进行电泳以确认是否具有与已扩增的基因产物的大小相对应的条带的方法，解读PCR反应产物的碱基序列的方法，在已扩增的DNA双链之间加入荧光物质使其发光的方法等，但本发明并不限定于这些方法。在本发明中，优选在基因扩增处理后进行电泳，确认是否具有与已扩增的基因的大小相对应的条带的方法。
在被检测体中含有宛氏拟青霉的情况下，将本发明的寡核苷酸对作为引物组使用进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，确认出这些菌类的特异性DNA片段的扩增。具体而言，用上述(c)和(d)的寡核苷酸作为核酸引物时，可以确认约250bp的DNA片段的扩增；用上述(e)的寡核苷酸、以及(f)的寡核苷酸以及/或者(g)的寡核苷酸作为核酸引物时，可以确认约200bp的DNA片段的扩增。通过进行这些操作，可以确认被检测体是否含有宛氏拟青霉。
在本发明中，在利用LAMP法使含有可变区的DNA片段扩增的情况下，由于不需要周期性的温度变化控制，可以在恒温下进行互补链合成反应。因此，可以简便且迅速检测出检测体中所含有的特定的菌类。
LAMP法是不需要周期性温度变化控制的环介导等温扩增法(国际公开第00/28082号小册子)，通过使引物的3’侧与作为模板的核酸退火成为互补链合成的起点，同时使退火的引物与此时形成的环状结构结合，从而可以在等温下进行互补链合成反应。在该LAMP法中，至少需要4个识别作为模板的核酸的6个碱基序列区域的引物。这些引物由于通常被设计成其3’侧与作为模板的核酸退火，可以重复进行基于碱基序列的互补结合的检查机制，从而可以进行高灵敏度且高特异性的核酸扩增反应。
LAMP法所用的引物识别的6个碱基序列区域，从作为模板的核酸的5’侧顺次叫做F3、F2、F1，从3’侧顺次叫做B3c、B2c、B1c，此外，F1、F2、F3的互补碱基序列分别叫做F1c、F2c、F3c，B1c、B2c、B3c的互补碱基序列分别叫做B1、B2、B3。
上述6个碱基序列区域可以用以下方法选择，但是本发明并不限于此。
对作为检测对象的菌种基因的碱基序列进行比对(alignment)，使用Primer Explorer V4(荣研化学HP)等软件，设计多个引物。合成这些引物，实际进行LAMP反应，采用可以特异性检测宛氏拟青霉的引物。
详细地说，
1.使用Clustal X等比对软件，制作作为检测对象的菌种的目的区域的碱基序列的信息的比对档案。
2.基于比对档案中的信息，使用Primer Explorer V4(荣研化学HP)来设计引物。
3.从所设计的引物组的候补中，选择稳定地(难形成dimer结构)、延伸方向的前端含有较多突变(菌种的特异性突变)的引物组。特别是内引物的延伸方向上含有较多突变的话可以与相近菌种区别的可能性越高。无法进行引物组候补的情况下，将引物设计成其Tm值和引物的碱基数的设定具有较宽的范围。
4.实际使用所选择的引物组进行试验，确认有效性。确认有效性后，设计环状引物，从而缩短反应时间。
LAMP法所用的引物设计，首先，从目的区域的碱基序列确定上述6个碱基序列区域，其后，设计下述的内引物F和B以及外引物F和B。
LAMP法所用的“内引物”是指，识别目的碱基序列上的特定核苷酸序列区域，且在3’侧具有提供合成起点的碱基序列，同时在5’侧具有相对于以此引物为起点的核酸合成反应产物的任意区域互补的碱基序列的寡核苷酸。其中，将含有在3’侧具有上述F2区域、并且在5’侧具有F1c区域的碱基序列的引物称为内引物F(以下，称为FIP)，将含有在3’侧具有上述B2区域、并且在5’侧具有B1c区域的碱基序列的引物称为内引物B(以下，称为BIP)。此内引物在F2区域和F1c区域之间，或者在B2区域和B1c区域之间，也可以具有碱基数为0～50的任意长度的碱基序列。
另一方面，“外引物”是指，具有识别目的碱基序列上的“某个特定的核苷酸碱基序列”且提供合成起点的碱基序列的寡核苷酸，该“某个特定的核苷酸碱基序列”存在于“某个特定核苷酸序列区域”(例如上述F2区域或者B2区域)的5’末端侧；可以列举出含有选自F3区域的碱基序列的引物以及含有选自B3区域的碱基序列的引物。此处，将含有选自F3区域的碱基序列的引物称为“外引物F”(以下，称为“F3引物”)，将含有选自B3区域的碱基序列的引物外称为“引物B”(以下，称为“B3引物”)。
这里，各个引物中的F是表示与目的碱基序列的反义链互补结合，并提供合成起点的引物；各个引物中的B是表示与目的碱基序列的正义链互补结合，并提供合成起点的引物。
在LAMP法中的核酸的扩增中，优选除了使用内引物和外引物以外，还使用环状引物(loop primer)(以下，称为“LF”、“LB”)。环状引物是指，在用LAMP法扩增的产物的同一条链上的互补序列互相退火形成环状时，在其3’侧含有与这个环内序列互补的碱基序列的引物(每一个对应构成双链的每条链)。即，是具有与哑铃结构的5’侧的环状结构的单链部分的碱基序列互补的碱基序列的引物。如果使用该引物，则由于增加了核酸合成的起点，就可以缩短反应时间和提高检测灵敏度(国际公开第02/24902号小册子)。
环状引物的碱基序列如果与上述哑铃结构的5’侧的环状结构的单链部分的碱基序列互补，就可以从目的区域的碱基序列或者其互补链中选择环状引物的碱基序列，也可以从其它碱基序列中选择。此外，环状引物可以是1种，也可以是2种。
如果利用上述至少4种以上的引物，对含目的区域的DNA片段进行扩增的话，就能使该DNA片段的量扩增至可以特异性且高效地检测出的量。因此，通过确认扩增产物的有无，可以检测出特定的菌种。
在LAMP法中可以使用的引物优选为15个碱基以上，进一步优选为20个碱基以上。此外，各引物可以是单一的碱基序列的寡核苷酸，也可以是多个碱基序列的寡核苷酸的混合物。
此外，在LAMP法中可以使用的外引物也可以用于使含目的区域的DNA片段扩增的PCR法中。在PCR法中，如果使用上述引物，将被检测体中的β-微管蛋白基因作为模板，并用耐热性DNA聚合酶进行PCR的话，则可以使目的DNA片段扩增。
接着，对于利用LAMP法检测宛氏拟青霉情况下优选使用的引物组进行说明。为了特异性检测宛氏拟青霉，更优选使用下述引物组(引物组1)。
用于检测宛氏拟青霉的引物组1
LPae1F3引物：ACGATCCTATAGGCAGACCA(序列号10)
LPae1B3引物：CCAGCGGCCTATTTATTGGT(序列号11)
LPae1FIP引物：CGTCTCTCTCGATTCCGTGTCGCCTTGACGGCTCTGGTGT(序列号12)
LPae1BIP引物：CTCCGACCTTCAGCTCGAGCGGAGCGTTCCTCTTGGGAT(序列号13)
为了检测宛氏拟青霉，优选除了上述引物以外还使用环状引物。作为环状引物，优选使用下述引物。
用于检测宛氏拟青霉的环状引物
LPae1LF引物：TCCCCAGATATCGTGTACTTAC(序列号14)
LPae1LB引物：ACTTCAACGAGGTAGTTGTTG(序列号15)
图1中表示上述引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株的β-微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系。
在本发明中，优选利用LAMP法使用下述引物组(引物组2)检测宛氏拟青霉。
用于检测宛氏拟青霉的引物组2
LPae2F3引物：CGATATCTGGGGATGCTTCG(序列号16)
LPae2B3引物：CGTCCATGGTACCAGGCT(序列号17)
LPae2FIP引物：ATGCGCTCGAGCTGAAGGTCCGGAATCGAGAGAGAGACGACT(序列号18)
LPae2BIP引物：TGATCCCAAGAGGAACGCCCCACGAGGAACGTACTTCTTGCC(序列号19)
为了检测宛氏拟青霉，优选除了上述引物以外还使用环状引物。作为环状引物，优选使用下述引物。
用于检测宛氏拟青霉的环状引物
LPae2LF引物：GGAGGAGCCATTGTAGCTAA(序列号20)
LPae2LB引物：GAGCTCACCAATAAATAGGCC(序列号21)
图2中表示上述引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株和IFM40915菌株的β-微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系。
本发明的用于检测宛氏拟青霉的引物组是在LAMP法检测中使用的引物组，其特征在于，含有以下引物：由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号12中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。上述引物组优选还含有由序列号14和序列号15中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
此外，本发明的其它用于检测宛氏拟青霉的引物组是在LAMP法检测中使用的引物组，其特征在于，含有以下引物：由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号18中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。上述引物组优选还含有由序列号20和序列号21中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
通过使用上述引物组，可以利用LAMP法特异性、迅速并且高灵敏度地对含有宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的目的区域的DNA片段进行扩增。因此，在该DNA片段的扩增被确认时，可以判断被检测体中存在宛氏拟青霉。
此外，作为本发明的用于检测宛氏拟青霉的寡核苷酸，其优选形式是，在从β-微管蛋白基因的碱基序列所选出的目的区域的5’侧，作为碱基序列区域选择F3、F2以及F1，从上述目的区域的3’侧，作为碱基序列区域选择B3c、B2c以及B1c，并且将上述B3c、B2c以及B1c的互补碱基序列分别作为B3、B2以及B1，将上述F3、F2以及F1的互补碱基序列分别作为F3c、F2c以及F1c时，由对应于下述(a’)～(f’)中任意一个的碱基序列表示。
(a’)在3’侧具有上述B2区域、且在5’侧具有上述B1c区域的碱基序列，
(b’)具有上述B3区域的碱基序列，
(c’)在3’侧具有上述F2区域、且在5’侧具有上述F1c区域的碱基序列，
(d’)具有上述F3区域的碱基序列，
(e’)具有与上述B1区域和上述B2区域之间的部分互补的序列的碱基序列，
(f’)具有与上述F1区域和上述F2区域之间的部分互补的序列的碱基序列。
本发明的寡核苷酸不仅可以作为LAMP法所用的引物，而且还可以作为PCR法等的引物、核酸检测用探针等使用。
用LAMP法扩增含有目的区域的DNA片段时所用的酶，只要是通常所用的则没有特别限制，优选为具有链置换活性的模板依赖性核酸合成酶。作为这样的酶，可以列举出Bst DNA聚合酶(大片段(largefragment))、Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，优选为Bst DNA聚合酶(大片段)。本发明中可以用的酶可以是从病毒或者细菌等纯化而成，也可以是利用基因重组技术制造而成。另外，这些酶也可以是经片段化或者氨基酸置换等改变而成。
利用LAMP法使含有目的区域的DNA片段扩增时的温度没有特别限制，优选为55～68℃、更优选为60～65℃。
可以采用通常的方法，对含有目的区域的DNA片段的扩增进行确认。在利用LAMP法使含有目的区域的DNA片段扩增的情况下，例如，也可以利用特异性识别已扩增的碱基序列的标记寡核苷酸作为探针进行杂交，用荧光嵌入燃料法(日本特开2001-242169号公报)检测，或者，将反应结束后的反应液直接在琼脂糖凝胶上进行电泳以检测器条带。在琼脂糖凝胶电泳中，LAMP扩增产物被检测出其碱基长度不同的众多条带呈阶梯(梯子)状。
此外，在LAMP法中，由于核酸的合成造成底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸离子与共存的镁离子反应生成焦磷酸镁。焦磷酸镁一旦生成，反应液就会出现肉眼可以确认程度的白色浑浊。以此白色浑浊为指标，用可以对反应结束后或反应中的浊度上升进行实时的光学观测的测定仪器进行检测。例如，用分光光度计确认400nm的吸光度的变化，就可以检测出核酸的扩增反应(国际公开第01/83817号小册子)。
在本发明中，为了使含有目的区域的DNA片段扩增所使用的引物，可以基于设计的序列进行化学合成，也可以从试剂生产商购买。具体而言，可以使用寡核苷酸合成装置来合成。此外，还可以使用在合成后利用吸附柱、高速液体层析或电泳法精制后的产物。此外，具有1个或多个碱基置换、缺失、插入或者附加后的碱基序列的寡核苷酸也可以使用公知的方法合成。
在本发明中，作为被使用的检测体没有特别限制，可以使用饮食品本身、饮食品的原材料、分离的菌体、培养的菌体等。
作为从被检测体制备DNA的方法，只要得到的DNA是可以进行宛氏拟青霉检测所需的充分纯度和量的话，则对此没有特别限制，可以使用未精制的状态，也可以经过分离、提取、浓缩、精制等前处理后再使用。例如，可以通过苯酚和氯仿提取进行精制，也可以使用市售的提取试剂盒进行精制后提高核酸纯度再使用。此外，还可以使用逆转录被检测体中的RNA所得到的DNA。
使用本发明的引物组含有目的区域的DNA片段进行扩增时，所必需的各种试剂类可以预先包装成为试剂盒。
例如，本发明的试剂盒含有：可以用于LAMP法的上述引物组(优选为以下引物组：含有由序列号10～13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组、含有由序列号10～15中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组、含有由序列号16～19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组、含有由序列号16～21中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组)、DNA聚合酶、包含dATP、dCTP、dGTP以及dTTP的dNTP。本发明的试剂盒优选含有：上述引物组、作为环状引物所必需的各种寡核苷酸(优选为由序列号7和8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物)、作为核酸合成底物的4种dNTP(dATP、dCTP、dGTP以及dTTP)、具有链置换活性的模板依赖性核酸合成酶等DNA聚合酶、以及提供给酶反应适合条件的缓冲液、作为辅助因子的盐类(镁盐或者锰盐等)、稳定酶或者模板的保护剂，进一步根据需要还含有检测反应产物所必需的试剂类。本发明的试剂盒也可以含有阳性对照(positive control)，其用来确认利用本发明的引物的LAMP反应是否正常进行。作为阳性对照，例如，可以列举出含有由本发明的方法所扩增的区域的DNA。
此外，本发明的宛氏拟青霉检测试剂盒含有寡核苷酸对或寡核苷酸组作为核酸引物，该寡核苷酸对或寡核苷酸组由选自上述(c)和(d)的寡核苷酸对、上述(e)和(f)的寡核苷酸对、上述(e)和(g)的寡核苷酸对、以及上述(e)、(f)和(g)的寡核苷酸对中的至少1对或1组表示。该试剂盒优选用于利用PCR法来检测宛氏拟青霉的方法中。本发明的试剂盒除了含有上述核酸引物以外，还根据需要含有标记检测物质、缓冲液、核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、酶底物(dNTP、rNTP等)等、菌类检测中通常所用的物质。本发明的试剂盒中也可以含有为了确认利用本发明的引物的PCR反应是否正常进行的阳性对照。作为阳性对照，例如，可以列举出含有由本发明的方法所扩增的区域的DNA。
根据本发明的方法，可以在约60～120分钟的短时间内进行从被检测体的制备工序到菌类的检测工序。
实施例
以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1利用PCR法确定宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的碱基序列
将供试菌放置在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基中，在25℃下暗处培养7天。使用Gen TorukunTM(Takara Bio(株)社生产)，从菌体中提取DNA。作为目的部位的PCR扩增，使用PuRe TaqTMReady-To-Go PCR Beads(GE Health Care UK LTD生产)，作为引物使用Bt2a(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’，序列号34)、Bt2b(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’，序列号35)(Glassand Donaldson，Appl Environ Microbiol 61：1323-1330，1995)。扩增条件为β-微管蛋白部分长度的变性温度为95℃，退火温度为59℃，延伸温度为72℃，实施35次循环。PCR产物使用Auto SegTM G-50(Amersham Pharmacia Biotech社生产)进行纯化。PCR产物使用BigDye(注册商标)terminator Ver.1.1(Applied Biosystems社生产)标记，以ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社生产)实施电泳。在从电泳时的荧光信号来确定碱基序列时，使用软件“ATGC Ver.4”(Genetyx社生产)。
(2)引物的制备
基于上述得到的宛氏拟青霉的β-微管蛋白序列、以同样方法确定的Hamigera avellanea、Talaromyces flavus、Talaromyces luteus、Talaromyces trachyspermus、Byssochlamys nivea、Byssochlamys fulva的β-微管蛋白序列以及各种菌类的公知的β-微管蛋白序列，使用DNA解析软件(Clustal W)进行比对解析，确定宛氏拟青霉的特异的碱基序列区域(序列号1～4和22～33)。从确定区域中3’末端侧的宛氏拟青霉的特异性特别高的区域，对满足如下4个条件的区域进行研究：(1)存在种固有的碱基序列的数个碱基，(2)GC含量大约为30％～80％，(3)自退火的可能性低，(4)Tm值大约为55℃～65℃左右。基于该碱基序列设计5组引物组，该引物组含有由序列号5和6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物，该引物是委托Sigma Aldrich Japan公司合成(脱盐纯化品，0.02μmol等级)并购入的。
(3)被检测体的制备
作为用于评价已设计的引物的有效性的真菌类，即宛氏拟青霉及其它耐热菌和一般霉菌，使用表1和表2中记载的菌。作为这些菌类，购入使用的是保管在千叶大学医学部真菌医学研究中心并利用IFM序号管理的菌类。
在最适条件下培养各菌体。培养条件为：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(商品名：Pearlcore马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社生产)，一般霉菌在25℃、耐热霉菌在30℃下培养7天。
表1：
  试样编号   菌种  菌株名(IFM)
  1   Paecilomyces varioti  IFM40913
  2   Paecilomyces varioti  IFM40915
  3   Byssochlamys fluva  IFM48421
  4   Byssochlamys fluva  IFM51213
  5   Byssochlamys nivea  IFM51244
  6   Byssochlamys nivea  IFM51245
  7   Hamigera avellanea  IFM42323
  8   Hamigera avellanea  IFM52241
  9   Talaromyces flavus  IFM42243
  10   Talaromyces flavus  IFM52233
  11   Talaromyces luteus  IFM53242
  12   Talaromyces luteus  IFM53241
  13   Talaromyces trachyspermus  IFM42247
  14   Talaromyces trachyspermus  IFM52252
  15   Talaromyces wortmannii  IFM52255
  16   Talaromyces wortmannii  IFM52262
表2：
  试样编号   菌种  菌株名(IFM)
  1   Paecilomyces varioti  IFM40913
  2   Paecilomyces varioti  IFM40915
  3   Byssochlamys nivea  IFM50292
  4   Neosartorya ficheri  IFM46945
  5   Neosartorya spinosa  IFM46967
  6   Neosartorya glabra  IFM46949
  7   Neosartorya hiratsukae  IFM47036
  8   Aspergillus fumigatus  A125
  9   Aspergillus niger  An25
  10   Aspergillus terreus  A229
  11   Aspergillus flavus  As17
  12   Emericella nidulans  As18
  13   Penicillium griseofulvum  IFM54313
  14   Penicillium citirinum  IFM54314
  15   Alternaria alternate  IFM41348
  16   Aureobasidium pullulans  IFM41409
  17   Chaetomium globosum  IFM40869
  18   Fusarium oxysporum  IFM50002
  19   Trichoderma viride  IFM40938
  20   Cladosporium cradosporioides  IFM41450
(4)基因组DNA的制备
使用铂环从琼脂培养基中回收各菌体。
使用基因组DNA制备用试剂盒(Applied Biosystems社生产，PrepMan ultra(商品名称))，由回收的菌体制备基因组DNA溶液。DNA溶液的浓度制备为50ng/μl。
(5)PCR反应
将1μl上述制备的基因组DNA作为DNA模板，与13μl Pre Mix Taq(商品名称，Takara Bio社生产)、10μl无菌蒸馏水混合，加入0.5μl由序列号5记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(Pae1F引物)等正向引物(20pmol/μl)和0.5μl由序列号6记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(Pae1R引物)等反向引物(20pmol/μl)，制备25μl的PCR反应液。
对于PCR反应液，使用自动基因扩增装置热循环仪DICE(TakaraBio)进行基因扩增处理。PCR反应条件为：(i)98℃、10秒的热变性反应，(ii)63℃、1分钟的退火反应和(iii)72℃、1分钟的延伸反应，以此为1次循环，进行30次循环。
(6)扩增的基因片段的确认
PCR反应后，从PCR反应液分取10μl，以2％的琼脂糖凝胶进行电泳，用SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(Invitrogen)将DNA染色后，通过紫外线下荧光的检测来确认扩增DNA片段的有无。其结果是，在使用5组已设计的引物组中、由序列号5和6记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物组的情况下，在含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，确认了基因片段的扩增与从已设计的引物组预期的大小相同。另一方面，在不含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，不能确认基因片段的扩增。在使用由序列号5和6记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物组时的琼脂糖凝胶的电泳图在图3和图4中表示。另外，图3表示表1所示的菌类的试样的电泳图，图4表示表2所示的菌类的试样的电泳图。图中的编号表示使用从表记载的相应试样编号的试样中提取的DNA而进行反应的样品。
其结果是，在含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，确认了250bp左右的基因片段的扩增。另一方面，在不含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，不能确认基因片段的扩增。
从以上结果可知，通过使用序列号5和6记载的本发明的寡核苷酸，可以特异性检测宛氏拟青霉。此外可知，基于本发明的β-微观蛋白基因的可变区的碱基序列，可以容易地设计能够用于特异性检测宛氏拟青霉的作为核酸探针或核酸引物发挥功能的宛氏拟青霉检测用寡核苷酸。
实施例2利用LAMP法检测宛氏拟青霉
(1)引物的设计和合成
基于上述实施例1中特定的宛氏拟青霉的特异性碱基序列区域(序列号1～4和22～33)，设计由序列号10～15记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物，委托E Genome order(株式会社富士通systemsolution，序列号10和11，5pmol等级；序列号12和13，40pmol等级；序列号14和15，20pmol等级，全部是柱纯化品)合成并购入。
(2)被检测体的制备
作为用于评价已设计的引物的有效性的真菌类，即宛氏拟青霉及其它耐热菌，使用表3中表示的菌类。作为这些菌类，购入使用的是保管在千叶大学医学部真菌医学研究中心并利用IFM序号管理的菌类。
在最适条件下培养各菌体。培养条件为：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(商品名：Pearlcore马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社生产)，30℃下培养7天。
表3：
  试样编号   菌种  菌株名(IFM)
  1   Paecilomyces varioti  IFM40913
  2   Paecilomyces varioti  IFM40915
  3   Byssochlamys fluva  IFM48421
  4   Byssochlamys nivea  IFM51244
  5   Hamigera avellanea  IFM42323
  6   Talaromyces flavus  IFM42243
  7   Talaromyces luteus  IFM53242
  8   Talaromyces wortmannii  IFM52255
(3)基因组DNA的制备
使用铂环从琼脂培养基中回收各菌体。
使用基因组DNA制备用试剂盒(商品名称：PrepMan ultra，AppliedBiosystems社生产)，由菌体制备基因组DNA溶液。具体而言，从各培养基收集多个菌落，并将菌体悬浮在试剂盒中附带的200μl试剂中，以100℃、10分钟的加热处理使菌体溶解，以14800rpm离心分离5分钟之后，收集上层清液。将得到的基因组DNA溶液的浓度调整为50ng/μl。将该基因组DNA溶液作为模板DNA，用于下述的LAMP反应。
(4)用于LAMP反应的反应液的制备
将12.5μl 2×Reaction Mix(40mM的Tris-HCl(pH值8.8)、20mMKCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2％Tween20、1.6M Betaine、2.8mM dNTPs，荣研化学株式会社，Loopamp DNA扩增试剂盒)、1μl由序列号10记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae1F3引物：5pmol/μl)、1μl由序列号11记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae1B3引物：5pmol/μl)、1μl由序列号12记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae1FIP引物：40pmol/μl)、1μl由序列号13记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae1BIP引物：40pmol/μl)、1μl由序列号14记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae1LF环状引物：20pmol/μl)、1μl由序列号15记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae1LB环状引物：20pmol/μl)、1μlBst DNA Polymerase(8U/25μL，荣研化学株式会社生产)和1μl上述制备的模板DNA混合，添加蒸馏水成为总量为25μl的反应液。
(5)LAMP反应
使用实时浊度测定装置Loopamp RT-160C(荣研化学株式会社生产)，以63±2℃对上述制备的反应液进行60分钟的DNA扩增反应。同时测定反应液的浊度(波长：400nm)。
(6)DNA扩增确认
通过反应液的浊度是否上升来判断DNA扩增的有无。反应液的浊度的测定结果在图5中表示。
其结果是，仅在以宛氏拟青霉的基因组DNA作为模板的体系中，确认反应开始后23分钟左右浊度上升，即确认了DNA的合成·扩增反应。
另一方面，在使用其它菌类的基因组DNA的体系中，反应开始后直至40分钟之间，不能确认反应液的浊度的上升。另外，反应开始后45分钟左右，即使在使用宛氏拟青霉以外的基因组DNA的体系中也观察到反应液的浊度上升，但是认为这是由于引物之间随时间发生非特异性反应所致，或者是随着反应时间延长，少数引物在目的以外的部分反应所致。
实施例3利用LAMP法检测宛氏拟青霉
(1)引物的设计和合成
基于上述实施例1中特定的宛氏拟青霉的特异性碱基序列区域(序列号1～4和22～33)，设计由序列号16～21记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物，委托E Genome order(株式会社富士通systemsolution，序列号16和17，5pmol等级；序列号18和19，40pmol等级；序列号20和21，20pmol等级，全部是柱纯化品)合成并购入。
(2)被检测体的制备
作为用于评价已设计的引物的有效性的真菌类，即宛氏拟青霉及其它耐热菌以及一般霉菌，使用表4中表示的菌类。作为这些菌类，购入使用的是保管在千叶大学医学部真菌医学研究中心并利用IFM序号管理的菌类。
在最适条件下培养各菌体。培养条件为：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(商品名：Pearlcore马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社生产)，一般霉菌在25℃、耐热霉菌在30℃下培养7天。
表4：
  试样编号   菌种  菌株名(IFM)
  1   Paecilomyces varioti  IFM40913
  2   Paecilomyces varioti  IFM40915
  3   Byssochlamys fluva  IFM48421
  4   Hamigera avellanea  IFM42323
  5   Penicillium griseofulvum  IFM54313
  6   Penicillium citirinum  IFM54314
  7   Neosartorya ficheri  IFM46945
  8   Neosartorya spinosa  IFM46967
  9   Neosartorya glabra  IFM46949
  10   Neosartorya hiratsukae  IFM47036
  11   Alterraria alternate  IFM41348
  12   Aureobasidium pullulans  IFM41409
  13   Chaetomium globosum  IFM40869
  14   Fusarium oxysporum  IFM50002
  15   Trichoderma viride  IFM40938
  16   Cladosporium cradosporioides  IFM41450
(3)基因组DNA的制备
使用铂环从琼脂培养基中回收各菌体。
使用基因组DNA制备用试剂盒(商品名称：PrepMan ultra，AppliedBiosystems社生产)，由菌体制备基因组DNA溶液。具体而言，从各培养基收集多个菌落，并将菌体悬浮在试剂盒中附带的200μl试剂中，以100℃、10分钟的加热处理使菌体溶解，以14800rpm离心分离5分钟之后，收集上层清液。将得到的基因组DNA溶液的浓度调整为50ng/μl。将该基因组DNA溶液作为模板DNA，用于下述的LAMP反应。
(4)用于LAMP反应的反应液的制备
将12.5μl 2×Reaction Mix(40mM的Tris-HCl(pH值8.8)、20mMKCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2％Tween20、1.6MBetaine、2.8mM dNTPs，荣研化学株式会社，Loopamp DNA扩增试剂盒)、1μl由序列号16记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae2F3引物：5pmol/μl)、1μl由序列号17记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae2B3引物：5pmol/μl)、1μl由序列号18记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae2FIP引物：40pmol/μl)、1μl由序列号19记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae2BIP引物：40pmol/μl)、1μl由序列号20记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae2LF环状引物：20pmol/μl)、1μl由序列号21记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(LPae2LB环状引物：20pmol/μl)、1μl Bst DNA Polymerase(8U/25μL，荣研化学株式会社生产)和1μl上述制备的模板DNA混合，添加蒸馏水形成总量为25μl的反应液。
(5)LAMP反应
使用实时浊度测定装置Loopamp RT-160C(荣研化学株式会社生产)，以63±2℃对上述制备的反应液进行60分钟的DNA扩增反应。同时测定反应液的浊度(波长：400nm)。
(6)DNA扩增确认
通过反应液的浊度是否上升来判断DNA扩增的有无。反应液的浊度的测定结果在图6中表示。
其结果是，仅在以宛氏拟青霉的基因组DNA作为模板的体系中，确认反应开始后20分钟左右浊度上升，即确认了DNA的合成·扩增反应。
另一方面，在使用其它菌类的基因组DNA的体系中，反应开始后直至50分钟之间，不能确认反应液的浊度的上升。另外，反应开始后60分钟左右，即使在使用宛氏拟青霉以外的基因组DNA的体系中也观察到反应液的浊度上升，但是认为这是由于引物之间随时间发生非特异性反应所致，或者是随着反应时间延长，少数引物在目的以外的部分反应所致。
实施例4利用PCR法检测宛氏拟青霉
(1)引物的制备
从在上述实施例1中特定的宛氏拟青霉的特异性碱基序列区域(序列号1～4和22～33)中3’末端侧的宛氏拟青霉的特异性特别高的区域，对满足如下4个条件的区域进行研究：(1)存在种固有的碱基序列的数个碱基，(2)GC含量大约为30％～80％，(3)自退火的可能性低，(4)Tm值大约为55℃～65℃左右。基于该碱基序列设计5组引物组，该引物组含有由序列号7～9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物，该引物是委托Sigma Aldrich Japan公司合成(脱盐纯化品，0.02μmol等级)并购入的。
(2)被检测体的制备
作为用于评价已设计的引物的有效性的真菌类，即宛氏拟青霉和其它耐热菌，使用表5中记载的菌。作为这些菌类，购入使用的是保管在千叶大学医学部真菌医学研究中心并利用IFM序号管理的菌类。
在最适条件下培养各菌体。培养条件为：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(商品名：Pearlcore马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社生产)，30℃下培养7天。
表5：
  试样编号   菌种   学名
  1   NBRC4855   Pae.variotii
  2   NBRC7563   Pae.variotii
  3   NBRC5479   Pae.variotii
  4   NBRC31685   Pae.variotii
  5   IFM48421   B.fluva
  6   IFM51213   B.fluva
  7   IFM51244   B.nivea
  8   IFM51245   B.nivea
  9   IFM42323   H.avellanea
  10   IFM52241   H.avellanea
  11   IFM42243   T flavus
  12   IFM53242   T.luteus
  13   IFM42247   T.trachysperumus
  14   IFM52252   T.wortmannii
  15   IFM53622(T)   T.ebumeus
(3)基因组DNA的制备
使用铂环从琼脂培养基中回收各菌体。
使用基因组DNA制备用试剂盒(Applied Biosystems社生产，PrepMan ultra(商品名称))，由回收的菌体制备基因组DNA溶液。将DNA溶液的浓度调整为50ng/μl。
(4)PCR反应
将1μl上述制备的基因组DNA作为DNA模板，与15μl Pre Mix Taq(商品名称，Takara Bio社生产)、11μl无菌蒸馏水混合，加入1μl由序列号7记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(Pae4F引物，20pmol/μd)、1μl由序列号8记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(Pae4R-1引物，20pmol/μl)以及1μl由序列号9记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物(Pae1R-2引物，20pmol/μl)，制备30μl的PCR反应液。对于其它4组引物组，也以同样的方式制备PCR反应液。
对于PCR反应液，使用自动基因扩增装置热循环仪DICE(TakaraBio)进行基因扩增处理。PCR反应条件为：(i)95℃、1分钟的热变性反应，(ii)59℃、1分钟的退火反应和(iii)72℃、1分钟的延伸反应，以此为1次循环，进行35次循环。
(5)扩增的基因片段的确认
PCR反应后，从PCR反应液分取2.5μl，以2％琼脂糖凝胶进行电泳，用SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(Invitrogen)将DNA染色后，通过紫外线下荧光的检测来确认扩增DNA片段的有无。其结果是，在使用5组引物组中由序列号7～9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物组的情况下，在含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，确认了基因片段的扩增与已设计的引物组所预期的大小相同。另一方面，在不含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，不能确认基因片段的扩增。使用由序列号7～9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物组时的琼脂糖凝胶的电泳图在图7中表示。图中的编号表示使用从表记载的相应试样编号的试样中提取的DNA而进行反应的样品。
其结果是，在含有宛氏拟青霉的基因组DNA的试样中，确认了200bp左右的基因片段的扩增。另一方面，在不含有上述宛氏拟青霉菌株的基因组DNA的试样中，不能确认基因片段的扩增。
从以上结果可知，通过使用本发明的寡核苷酸，可以特异性检测宛氏拟青霉。此外可知，基于本发明的β-微观蛋白基因的可变区的碱基序列，可以容易地设计能够用于特异性检测宛氏拟青霉的作为核酸探针或核酸引物发挥功能的宛氏拟青霉检测用寡核苷酸。
从实施例1～4的结果可知，根据本发明的方法，可以简便、迅速并且特异性检测宛氏拟青霉。
产业上利用的可能性
根据本发明的宛氏拟青霉的检测方法，可以提供特异性、简便且迅速地检测宛氏拟青霉的方法。因此，本发明的宛氏拟青霉的检测方法可以用于在食品工业和化妆品工业等中被视作危害菌的宛氏拟青霉的检测中。
尽管将本发明与其实施方式一起进行说明，但除非特别指定，本发明并不限于说明的任意详细部分，而且，可以在不违反所附的权利要求所示的发明精神和范围的情况下进行广泛的解释。
Figure IPA00001287680500011
Figure IPA00001287680500021
Figure IPA00001287680500031
Figure IPA00001287680500041
Figure IPA00001287680500051
Figure IPA00001287680500061
Figure IPA00001287680500071
Figure IPA00001287680500081
Figure IPA00001287680500091
Figure IPA00001287680500101
Figure IPA00001287680500131
Figure IPA00001287680500141
Figure IPA00001287680500151

Claims (3)

1.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法，其特征在于，
为了使用由下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的鉴定，通过将下述(c)和(d)的寡核苷酸用作核酸引物进行聚合酶链反应法，对被检测体的β-微管蛋白基因的碱基序列的全部或一部分进行扩增，确认有无扩增产物，判断确认有扩增产物的被检测体中存在宛氏拟青霉，
(a)序列号1～4和22～33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的碱基序列或其互补序列，
(b)由序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列中的1～3个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列，
(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列中的1个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列中的1个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
2.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸对，是在利用聚合酶链反应法检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的下述(c)和(d)的寡核苷酸对，
(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列中的1个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，
(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列中的1个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
3.一种宛氏拟青霉(paecilomyces variotii)检测试剂盒，含有权利要求2所述的寡核苷酸。
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