KR102428279B1 - 치료 효율 모니터링을 위한 16S rRNA 기반 결핵 분자진단 방법 및 그 응용 - Google Patents

치료 효율 모니터링을 위한 16S rRNA 기반 결핵 분자진단 방법 및 그 응용 Download PDF

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장연희
황다솜
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Abstract

본 발명은 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단을 포함하는 결핵 치료효율 모니터링용 키트, 그 방법 및 그에 사용되는 프라이머 및 포로브에 관한 것으로, 본 발명은 치료를 시작한 결핵환자의 객담에서 결핵균이 발현하는 16S rRNA 유전자 발현 양상을 확인하여 결핵 치료효율 모니터링이 가능하다.

Description

치료 효율 모니터링을 위한 16S rRNA 기반 결핵 분자진단 방법 및 그 응용{16S rRNA-based Tuberculosis Molecular Diagnosis Method for Monitoring Treatment Efficiency and Its Application}
본 발명은 결핵균 16S rRNA를 기반으로 역전사 정량적 중합효소연쇄반응을 이용한 결핵 치료효율 모니터링 분자진단 키트에 관한 것이다.
결핵(Tuberculosis, TB)은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)에 의해 발생하며 공기중으로 전파되는 호흡기 감염병이다. 전 세계적으로 연간 1,000만 명의 환자가 발생하고, 140만 명이 사망하는 높은 발생률 및 사망률을 보이는 전염성 질환이다(WHO, 2019년 기준).
우리나라의 경우, 지난 수년간 매년 23,000~35,000명 정도의 환자가 지속적으로 발생하고 있으며, 질병관리본부에 따르면, 2019년 한 해 23,821명의 환자가 발생하였으며, 2018년 한 해 1,800명이 결핵으로 사망한 것으로 나타났다. 과거에 비해 국내 결핵 발생률 및 사망률이 많이 감소하였으나, 2019년 기준 연간 발생률은 인구 10만 명당 46.4명으로 경제개발협력기구(OECD) 가입국(35개국 비교) 중 가장 높은 결핵발생률을 보이고 있다(표 1).
연도 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019
전체
신환자수 36,305 39,557 39,545 36,089 34,869 32,181 30,892 28,161 26,433 23,821
신환자율 (72.8) (78.9) (78.5) (71.4) (68.7) (63.2) (60.4) (55.0) (51.5) (46.4)
폐결핵
신환자수 28,176 30,100 31,075 28,720 27,906 25,550 24,696 22,314 20,883 18,765
신환자율 (56.5) (60.1) (61.7) (56.8) (55.0) (50.1) (48.3) (43.6) (40.7) (36.6)
(도말양성)
신환자수 10,776 11,714 12,137 11,100 10,446 9,309 8,812 7,701 7,330 6,497
신환자율 (21.6) (23.4) (24.1) (22.0) (20.6) (18.3) (17.2) (15.0) (14.3) (12.7)
폐외결핵
신환자수 8,129 9,457 8,470 7,369 6,963 6,631 6,196 5,847 5,550 5,056
신환자율 (16.3) (18.9) (16.8) (14.6) (13.7) (13.0) (12.1) (11.4) (10.8) (9.8)
표 1은 연도별 신고 결핵 신환자수 및 율 (2010-2019) 단위: 명(명/인구 10만 명)
전체 폐결핵 환자에서 도말 양성률은 30% 미만으로 나타남(표 1). 공기중으로 감염되는 특성에 따라 감염병의 관리와 결핵 전파 방지를 위해 신속하고 정확한 진단이 중요하다.
결핵 확진을 위해 도말검사, 배양검사, 그리고 분자진단검사가 사용되고 있다(표 2).
검사법 민감도 특이도 장점 단점
도말검사 25-80% 95-100% 신속 검사가 가능함 민감도가 낮음, 죽은 균도 검출함
배양검사 80-85% 100% 결핵 확진이 가능함 균 배양이 오래걸림 (3-6주)
분자진단검사 90-100% 90-100% 높은 민감도와 특이도 검사가 가능함 고가의 장비와 고급 인력이 필요함,
DNA 기반 검사는 죽은 균도 검출함
표 2는 결핵 확진에 사용되는 검사 방법 현황
도말검사는 객담 내 존재하는 항산균을 염색하여 현미경으로 관찰하는 검사이다. 이 검사의 경우 배양검사에 비해 민감도가 25-80%로 낮고 비결핵 항산균이나 죽은 결핵균도 검출 할 수 있어 임상적 해석에 주의를 요한다. 또한, 현미경 검사가 시행되는 만큼 검사자의 업무량이 높고 숙련도에 따라 쉽게 영향을 받을 수 있다.
배양검사는 결핵 확진에 있어 가장 주요한 검사이지만 배양 여부를 확인하기 위해 3-6주의 검사시간이 소요된다.
액체배지 배양법은 고체배지에 비해 배양 속도가 빠르나 비결핵 항산균과 상재균 등에 의한 오염 가능성이 높고, 결핵균이 고체배지에서만 자라는 경우도 있으므로 액체배지와 고체배지를 동시에 진행해야한다.
소아 환자의 경우 미생물학적 검사에 의한 확진률이 40% 이하로 민감도가 낮아진다. 또한, 비결핵 항산균 배양 비율이 증가하고 있으므로 추가적인 실험을 통해 결핵균과 비결핵 항산균 구별이 필요하다.
도말검사와 배양검사의 한계점을 극복하기 위해 핵산증폭검사(polymerase chain reaction, PCR)와 같은 분자진단검사가 보조적으로 시행되고 있다. 분자진단검사는 각 균에만 특이하게 존재하는 염기서열을 증폭하여 확인하는 검사로 민감도와 특이도가 90-100%로 매우 높다.
하지만, 도말 음성 객담에서 결핵균 핵산증폭검사의 민감도는 68-75%로 상대적으로 낮다. 검체 전처리 및 핵산 추출 과정부터 결과 도출 시간까지 2-3시간이 소요되며 검사 키트의 제조자 및 종류에 따라 민감도와 특이도에 차이가 있을 수 있다. 또한, 신속검사법에 많이 사용이 되고 있는 DNA 증폭 PCR법은 살아있는 균이나 항결핵제 처방에 의해 죽은 균이 모두 증폭되므로, 환자의 치료효과를 모니터링하기 어렵다.
결핵의 주된 치료법은 리팜핀, 이소니아지드, 피라진아미드, 에탐부톨 등의 1차 약제를 2 ∼ 6개월간 장기 치료하고 1차 약제가 듣지 않으면 2차 약제인 오플로삭신, 가나마이신 같은 2차 약제를 이용하는 화학요법을 사용한다. 따라서 이와 같은 약제에 내성을 갖는 결핵균의 발생은 치료가 매우 어려워진다.
특히 항결핵 효과가 가장 높은 리팜핀과 이소니아지드 두 약제 모두에 내성을 갖는 다제내성 결핵균 (multidrug resistant TB, MDR-TB)은 결핵치료에 매우 위협적인 존재로 WHO에 따르면 2019년에 전세계적으로 206,090명의 MDR-TB 환자가 발생했으며, 이는 2018년도(186,883명)에 비해 10% 증가한 수치이다.
주요 1차 약제만 아니라 주요 2차 약제에까지 내성을 보이는 광범위내성결핵균 (Extensively drug resistant TB, XDR-TB) 또한 점차 증가하는 경향을 보이고 있어 결핵 관리에 어려움이 있다.
1960년대 RMP이 개발된 이후로 불소화퀴놀론(이하 퀴놀론) 제제 이외에는 결핵 환자의 치료 기간을 더욱 짧게 단축시킬 수 있는 새로운 항결핵제가 개발되지 못하고 있는 실정이다.
또한 오늘날 심각한 문제가 되고 있는 다제내성 결핵을 치료하기 위해서는 새로운 항결핵제 개발이 절실하다. 하지만, 신약 또는 새로운 제재의 개발을 위해서는 약제의 효능을 확인하기 위한 과정이 필수적이나, 결핵균의 복잡한 대사 기전에 대한 지식 부족이나 확인 방법의 어려움이 심각한 문제가 되고 있다. 따라서 보다 빠르고 간편한 방법에 의해 항결핵제를 스크리닝할 수 있는 방법이 개발된다면, 신약 또는 신제재의 개발 뿐 아니라 기존 항결핵제의 품질관리에도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한 항결핵제에 내성을 갖는 결핵은 치료에 잘 반응하지 않으므로 약제를 복용함에도 불구하고 계속 결핵균을 배출하여 내성 결핵균의 전염원이 될 수 있다. 따라서 약제내성결핵의 신속한 발견 및 적절한 치료가 필수적이고, 환자의 항결핵약물에 대한 반응을 모니터링하는 것이 매우 중요하다.
현재 항결핵제 치료효과를 판정하기 위해서는 일반적으로 치료시작 후 2개월째에 환자의 객담을 채취하여 결핵균을 배양해야 한다. 그러나 천천히 자라는 결핵균의 특성상 배양 후 3~6주가 경과해야 치료효과를 판정할 수 있기 때문에 결과가 나오는 시점이 환자치료 시작 후 3개월이 지난 후가 되게 된다.
이와 같이 환자의 객담검체로부터 직접 신속하게 항결핵치료제의 효과를 판정할 수 있는 새로운 검사법은 치료에 잘 반응하지 않는 항결핵제에 내성을 보이는 결핵환자에게 적절한 항결핵제를 처방할 수 있도록 도움을 줄 수 있으며 치료가 완료된 환자의 불필요한 입원기간을 단축시킬 수 있다.
따라서 치료효율 모니터링을 신속하고 정확하게 평가할 수 있는 RNA 기반 분자진단 검사법의 개발이 필요하다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 제10-2013-0101295호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 결핵균의 사멸여부를 정량적으로 확인할 수 있는 결핵 치료효율 모니터링이 가능한 분자진단 검사법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분자 진단 검사법에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자 진단 검사용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단을 포함하는 결핵 치료효율 모니터링용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서,
결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단은 서열번호 1 및 3의 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에서,
상기 키트는 서열번호 2의 프로브를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단을 유효성분으로 포함하는 결핵 치료효율 모니터링용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서,
결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단은 서열번호 1 및 3의 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에서,
상기 조성물은 서열번호 2의 프로브를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 샘플에서 결핵균이 발현하는 16S rRNA 유전자 발현 양상을 확인하는 단계를 포함하는 결핵 치료 효율 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 항결핵제에 의한 결핵균 감소여부를 확인하여 치료효과를 평가하기 위해 샘플로부터 살아있는 결핵균을 측정하기 위한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서,
상기 샘플은 객담인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 방법은 샘플로부터 분리된 전체 RNA에 16S rRNA 특이적인 프라이머쌍을 첨가하여 실시간 역전사 중합효소 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서,
상기 16S rRNA 특이적인 프라이머쌍은 서열번호 1 및 3에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 RNA 추출 상태는 내부 대조군으로 이용된 GAPDH 유전자의 Cq 값을 이용하여 확인하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 실시간 역전사 중합효소 반응에 서열번호 2에 기재된 프로브를 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 3에 기재된 결핵제 치료 효율 모니터링을 위한 16S rRNA 기반 결핵 분자진단용 프라이머쌍을 제공한다.
또 본 발명은 서열번호 2에 기재된 결핵제 치료 효율 모니터링을 위한 16S rRNA 기반 결핵 분자진단용 프로브를 제공한다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열(16S rRNA, GAPDH)은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 상기 표지 물질은 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다.
표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 RT-PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam& Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.
표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 16S rRNA 및 human GAPDH 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.
본 발명에 적용되는 RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다. mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 방사성 측정 방법은 RT-PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 PCR 장치의 형광 측정기에서 본 발명의 유전자들의 mRNA 발현 수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현 정도를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 치료효율 모니터링 분자진단 키트일 수 있다.
역전사 중합효소반응 키트는 상기 본 발명의 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 마커 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있다.
그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소) 을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머는, 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이임. 프라이머는 DNA합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함힌다.
용어 "실시간 역전사 중합효소 반응 (realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA (cDNA) 로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형 (template)으로 하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.
여기서 "Cq" 값은 quantification cycle로서 통계적 유의성(측정 가능한 PCR cycle number)을 보여주는 값인 threshold와 접점을 나타내는 형광신호에서의 cycle을 의미한다. Cq값은 타깃의 최초 양을 반영하는데 사용된다. 검체 안의 타깃양이 감소할수록 cycle 수가 점차적으로 증가한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 치료를 시작한 결핵환자의 객담에서 결핵균이 발현하는 16S rRNA 유전자 발현 양상을 확인하여 결핵 치료효율 모니터링이 가능하다.
도 1은 본 발명의 요약도,
도 2는 본 발명의 실험 및 분석 진행한 검체 수,
도 3은 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 및 human GAPDH 검출을 위해 제작한 프라이머 프로브 염기 서열,
도 4는 CFU 농도에 따른 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 마커의 Cq값 범위,
도 5는 CFU 농도에 따른 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 마커의 Cq 변화량,
도 6은 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 마커 Cq값과 CFU 농도의 상관관계,
도 7은 GAPDH 30 이상 검체들의 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 마커 Cq값,
도 8은 GAPDH 30 이상 검체를 제외한 CFU 농도에 따른 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 마커의 Cq 변화량, 및
도 9는 GAPDH 30 이상 검체를 제외한 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 마커 Cq값과 CFU 농도의 상관관계
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하면서 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 재료
결핵균 감소여부를 확인하여 치료효과 모니터링 마커의 유효성을 평가하기 위해 결핵환자의 치료시작 전, 치료시작 후 객담으로부터 살아있는 결핵균을 측정하고자 환자의 항결핵제 투여 전 객담과 투여 시작 후 1일, 2일, 5일, 7일, 10일, 13일, 14일의 객담을 수집 하였다(EBA0, EBA1, EBA2, EBA5, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14).
총 80명의 환자가 모집되었고, 객담 10ml 중 5ml은 집락형성단위(colony forming unit, CFU)를 확인하기 위해 결핵연구원에서 사용되었다.
CFU 확인 후 잔여 검체는 trizol에 처리 후 연세대학교로 이송하여 RNA assay (16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl)에 이용되었다.
한 환자당 8개의 객담 검체가 발생하기 때문에 총 640개의 검체가 되어야 하지만, 중도 탈락 및 객담양 부족으로 인해 RNA assay를 수행하지 못한 경우도 있어 RNA assay에 사용된 검체는 544개이다(표 3).
544개의 검체 중 RNA assay 결과와 CFU 결과를 비교 분석 하기위해 두 결과가 모두 존재하는 490개 검체를 사용하여 분석에 이용하였다.
검체 번호 RNA assay 수행 검체 수 RNA assay 수행하지 못한 검체
1 SC001 7 EBA10
2 SC002 4 EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
3 SC003 4 EBA1, EBA7. EBA13, EBA14
4 SC004 7 EBA5
5 SC005 8
6 SC006 7 EBA0
7 SN001 8
8 SK001 8
9 SV001 3 EBA0, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
10 SB001 1 EBA1, EBA2, EBA5, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
11 SB002 8
12 SI001 8
13 SU001 6 EBA5, EBA13
14 SU002 8
15 SA001 8
16 SI002 5 EBA0, EBA1, EBA2
17 SI003 7 EBA13
18 SU003 8
19 SI004 8
20 SG001 8
21 SV003 5 EBA0, EBA13, EBA14
22 SU005 2 EBA2, EBA5, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
23 SI005 8
24 SG002 8
25 SB003 6 EBA1, EBA13
26 SI006 8
27 SX001 4 EBA0, EBA2, EBA7, EBA13
28 SP001 7 EBA0
29 SC008 2 EBA0, EBA1, EBA2, EBA10, EBA13, EBA14
30 SG003 8
31 SP002 7 EBA14
32 SB004 6 EBA0, EBA1
33 SY001 8
34 SB005 8
35 SI007 8
36 SY002 8
37 SC009 6 EBA13, EBA14
38 SI008 8
39 SY004 8
40 SY005 8
41 SB006 7 EBA1
42 SI009 8
43 SY006 8
44 SB007 7 EBA10
45 SC010 7 EBA14
46 SV004 8
47 SC011 7 EBA0
48 SY008 8
49 SX002 0 EBA0, EBA1, EBA2, EBA5, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
50 SK002 8
51 SK003 8
52 SK004 8
53 SU006 8
54 SB008 7 EBA10
55 SB009 8
56 SQ001 5 EBA1, EBA7, EBA13
57 SQ002 8
58 SP003 8
59 SD001 8
60 SI010 8
61 SD002 8
62 SU007 8
63 SK006 7 EBA2
64 SY009 8
65 SY010 8
66 SC012 8
67 SY011 4 EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
68 SU008 8
69 SQ003 1 EBA0, EBA1, EBA2, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
70 SD003 8
71 SQ004 5 EBA10, EBA13, EBA14
72 SQ005 7 EBA13
73 SA002 6 EBA13, EBA14
74 SI013 3 EBA5, EBA7, EBA10, EBA13, EBA14
75 SK007 8
76 SD005 8
77 SY012 8
78 SQ006 8
79 SK008 8
80 SD006 7 EBA10
표 3은 수집된 검체
실시예 2 : 객담 검체에서 Total RNA 분리
전처리된 객담검체를 trizol용액에 넣어 bead-beating 후 chloroform, isopropanol 을 이용해 RNA를 분리하여 정량하였다.
실시예 3 : 분리된 total RNA로부터 cDNA 제작 및 Real-time PCR 수행
i.cDNA 합성
분리된 total RNA 1.5~4.5ug, Specific primer pool (16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl, GAPDH) 0.625 ug, dNTP (Intron)를 부피 14㎕ 되도록 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI) 에서 65℃ 5분간 반응시킨 후 얼음에 1분간 반응시켰다.
5X buffer (invitrogen), 0.1M DTT (Invitrogen), SuperScript III 역전사 중합효소 (Invitrogen) 200 units 을 첨가하고 denatured RNA 혼합액에 최종부피를 20㎕ 가 되도록 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI) 에서 55℃ 50분 - 70℃ 15분 반응 시켜 cDNA를 합성하였다.
ii.qPCR 수행
Real time PCR 반응물의 조성은 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (TOYOBO) 10㎕와 Forward / Reverse Primer 10pmole과 probe 5pmole을 넣어주고 합성한 cDNA를 15ug 넣고 최종 부피가 20㎕ 되도록 Ultra pure water 를 넣어 섞어주였다.
각각의 프라이머와 프로브 염기서열은 표 4 및 도 3에 기재되어 있다.
Real time PCR 반응은 CFX96 (Biorad) 를 이용하였으며 반응 온도 조건은 다음과 같다. 95℃ 2분 후 95℃ 3초 - 60℃ 30초를 40회 반복하여 수행하였다. Annealing 과정 (60℃ 30초)이 한번 수행될 때마다 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 횟수 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
서열번호 Target gene Primer and
TaqMan probe 		Primer's and TaqMan probe's sequence (5'→3')
1 16S rRNA Forward AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG
2 Probe FAM-AG GAC CAC GGG ATG CAT GTC TTG-BHQ1
3 Reverse GGC TCA TCC CAC ACC GCT AAA G
4 rpoB Forward GGT CGC TAT AAG GTC AAC AAG AAG
5 Probe FAM-CAT GTC GGC GAG CCC ATC ACG TCG-BHQ1
6 Reverse ACC CTC GTG CAA GCG GAC CAG
7 85B Forward CTT CTA CAG CGA CTG GTA CAG C
8 Probe FAM-CC GCA ATG GTT GTC CGC CAA CAG GGC-BHQ1
9 Reverse CAT CGA CAA GCC GAT TGC AG
10 Esat-6 Forward GGA GGC GTA CCA GGG TGT
11 Probe FAM-CCA GCA AAA ATG GGA CGC CAC GGC TAC C-BHQ1
12 Reverse GTT CTG CAG CGC GTT GTT
13 Icl Forward CCC GTT CGC CGA CTT GAT C
14 Probe FAM-CCG CCC GGC AGT TCT CCG AGG C-BHQ1
15 Reverse CGG GTA CTC CGC CTT GAC C
16 GAPDH Forward CCA TCT TCC AGG AGC GAG ATC C
17 Probe FAM-TCC ACG ACG TAC TCA GCG CCA GCA-BHQ1
18 Reverse ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTG
표 4는 본 발명에 사용된 프라이머/프로브 염기서열을 나타낸 표.
실시예 4 : 결과 확인 및 표적 유전자의 발현 확인
Endogenous control로 이용된 GAPDH 유전자의 Cq 값을 이용하여 RNA 추출 상태를 확인하였다. GAPDH Cq값이 30 이상일 경우, 객담 양이 충분하지 않았거나 RNA 추출과정의 이상으로 간주하여 환자의 상태를 정확히 대변하지 못하는 것으로 사료된다.
16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 유전자의 Cq 값을 결핵연구원에서 수행한 CFU 값과 비교하여 CFU변화에 따른 16S rRNA, rpoB, 85B, esat-6, icl 유전자 발현 양상을 확인하였다.
상기 실시예를 통하여, 5가지 RNA marker들 중에서 16s rRNA가 낮은 CFU 농도에서도 가장 민감하게 측정되었으며, CFU 농도 변화에 따라 16s rRNA Cq 또한 단계적으로 변화하는 것을 확인할 수 있었다.
GAPDH는 human housekeeping gene으로 분석에 사용된 검체의 양을 대변하는 한편, RNA추출 과정의 이상 유무를 확인하는 유전자이다.
GAPDH Cq값이 30이상으로 높게 나타나는 검체의 경우, 5가지 RNA marker에서 또한 Cq값이 높아지는 현상이 보였다.
위 결과들을 미루어 보아 GAPDH Cq값이 30 이상으로 나온 검체들을 제외하고 재분석 하였을 때 CFU 농도와 RNA marker 사이에서 통계학적으로 더 유의한 차이와 상관관계가 나타났다.
5가지 RNA marker들 중에서 16s rRNA가 가장 CFU 농도에 따른 발현 분포차이가 유의하게 나타났으며, 상관관계 또한 가장 높게 나타났다.
또한, 낮은 CFU 농도에서도 가장 민감하게 측정 되었으며, CFU 농도 변화에 따라 16s rRNA Cq 또한 단계적으로 변화하는 것을 확인할 수 있었다.
<110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS <120> 16S rRNA-based Tuberculosis Molecular Diagnosis Method for Monitoring Treatment Efficiency and Its Application <130> P21-0016HS <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aactgggtct aataccggat agg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 2 aggaccacgg gatgcatgtc ttg 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ggctcatccc acaccgctaa ag 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggtcgctata aggtcaacaa gaag 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 5 catgtcggcg agcccatcac gtcg 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 accctcgtgc aagcggacca g 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cttctacagc gactggtaca gc 22 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 8 ccgcaatggt tgtccgccaa cagggc 26 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 catcgacaag ccgattgcag 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggaggcgtac cagggtgt 18 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 11 ccagcaaaaa tgggacgcca cggctacc 28 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gttctgcagc gcgttgtt 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cccgttcgcc gacttgatc 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 14 ccgcccggca gttctccgag gc 22 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 cgggtactcc gccttgacc 19 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ccatcttcca ggagcgagat cc 22 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 17 tccacgacgt actcagcgcc agca 24 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 atggtggtga agacgccagt g 21

Claims (15)

  1. 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단을 포함하고,
    여기서, 상기 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단은 서열번호 1 및 3의 프라이머, 및 서열번호 2의 프로브인 것을 특징으로 하는 결핵 치료효율 모니터링용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단을 포함하고,
    여기서, 상기 결핵균 16S rRNA를 증폭할 수 있는 수단은 서열번호 1 및 3의 프라이머, 및 서열번호 2의 프로브인 것을 특징으로 하는 결핵 치료효율 모니터링용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 샘플에서 결핵균이 발현하는 16S rRNA 유전자 발현 양상을 확인하는 단계를 포함하고,
    항결핵제에 의한 결핵균 감소여부를 확인하여 치료효과를 평가하기 위해 샘플로부터 살아있는 결핵균을 측정하기 위한 것을 특징으로 하며,
    상기 샘플로부터 분리된 전체 RNA에 16S rRNA 특이적인 프라이머쌍을 첨가하여 실시간 역전사 중합효소 반응을 수행하는 단계를 포함하며,
    상기 16S rRNA 특이적인 프라이머쌍은 서열번호 1 및 3에 기재된 프라이머이며,
    상기 실시간 역전사 중합효소 반응에 서열번호 2에 기재된 프로브를 첨가하는 것을 특징으로 하는 결핵 치료 효율 모니터링 방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 샘플은 객담인 것을 특징으로 하는 결핵 치료 효율 모니터링 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서, 상기 RNA 추출 상태는 내부 대조군으로 이용된 GAPDH 유전자의 Cq 값을 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 결핵 치료 효율 모니터링 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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