CN108085418A - 一种用于快速检测登革病毒的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于快速检测登革病毒的引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测登革病毒的引物组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域。本发明将重组酶‑多聚酶的核酸扩增技术与荧光检测技术相结合，除了可做为病毒感染检测之外，还可同时进行病毒型别鉴定，且专一性高，不会与其他黄病毒属病毒产生交叉反应，本发明提供一个简单、快速、不须昂贵设备即可现场进行登革热的筛检方式，具有高灵敏度、特异性的特点，适用于即时快速诊断，可提供防疫第一线的快速检测，并且可细分登革热的型态，以提供医疗确诊。

Description

一种用于快速检测登革病毒的引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于快速检测登革病毒的引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
登革热(dengue)是登革病毒经蚊媒传播引起的急性虫媒传染病。登革依据不同的血清型病毒，分为I、II、III、IV四种型别，而每一型都具有能感染致病的能力。全球登革热的好发地区主要集中在热带、亚热带等有埃及斑蚊和白线斑蚊分布的国家，但随着全球化发展逐渐便利，各国之间相互流通及往返也趋于频繁。自1980年代之后，登革热也开始有向各国蔓延的趋势，登革热病毒广泛分布在北纬25度与南纬25度间，至1980年为止，全球亚热带地区，有活动性登革热病毒传播的国家多达61个，涵盖总人口约有15亿之多。1990年，Halstead 学者于其研究报告中指出：从1970至1980年代，每年约有25万人感染出血性登革热。典型登革热的潜伏期约为3至8天(最长可达14天)，其症状会有突发性的高烧(≥38℃)、头痛、后眼窝痛、肌肉痛、关节痛及出疹等现象，偶然病者会恶化至登革出血热，并进一步出血、休克，甚至死亡；然而，若是先后感染不同型别的登革病毒，导致较严重的临床症状的机率更高，如果没有及时就医或治疗，死亡率高达20～50％。病人发病前一天至发病后5天的这段期间，称为「可感染期」，或称为「病毒血症期」，如果感染者在这个时期被斑蚊叮咬，那么这只斑蚊将感染登革病毒，当它再叮咬其他人时，就会把体内的登革病毒传染给另一个人。因此，早期筛检血清中登革热病毒及鉴定病毒型别，对感染者的照护与传染病的监控皆非常重要。
目前，检验登革病毒感染常用的方法是以ELISA法或侧流免疫层析技术 (LateralImmunochromatographic Test，ICT)检测登革病毒的IgM与IgG抗体或 non-structuralprotein1(NS1)病毒抗原。但其灵敏度(21-99％)与专一性(77％-98％) 不佳，所检测的抗原或抗体无法与其他黄病毒属(Flavivirus)区别，且不具有感染早期(<5天)检测及病毒分型的功能。登革病毒的分子检验主要是以RT-PCR 法，检测血清中的病毒核酸，此法虽然专一性与灵敏度高，但是检测时间需要至少60-90min，且需要复杂仪器，并不适用于定点照护检测(point-of-care test，POCT) 使用。因此，亟需研发一种能够快速准确、简易、无须贵重仪器、可用于现场快速检测登革病毒的试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够快速准确、简易、无须贵重仪器、可用于快速检测登革病毒的引物组、试剂盒及检测方法。
本发明采用重组酶-多聚酶的核酸扩增技术与荧光检测技术，可提供防疫第一线的快速检测，并且可细分登革热的型态，以提供医疗确诊，并且专一性高，不会与其他黄病毒属病毒产生交叉反应，具有高灵敏度和特异性的特点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
根据本发明一个方面，提供了一种用于快速检测登革病毒的引物组，所述引物组在适宜的引物浓度条件下，可以互不影响的在一次扩增中同时检测登革病毒I、 II、III、IV型。
具体的，所述引物组为一套登革病毒特征性引物组，一套引物组由五对引物组成，每对引物包括两个引物，一个引物为正向引物，一个为反向引物，序列分别为：
引物对一：
正向引物：CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGCGT；
反向引物：GCGTACCGCGCGTCGACTTACCCCGTAACA
CTTTGATCGCTCCATTCTTC；
引物对二：
正向引物：CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGCGT；
反向引物：GGAACGCCATCACTGTTGGAATCAGCATAA；
引物对三：
正向引物：GTGCCTCAAGAGCATGGAATGTGTGGGAGG；
反向引物：GTTGGGTGTAGACCTCTCGGAGTTTCAGCC；
引物对四：
正向引物：CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGCGT；
反向引物：GGACTCGCAAAAACGTGATGAATGCTAGCA；
引物对五：
正向引物：GACCTGGTATGTTCTCCTCAGACTGAGGG；
反向引物：TCCACTAACCAGTCAGCGTCAGAGCCCAG。
所述引物是发明人参考NCBI基因数据库的病原基因序列，及TwistDxinstruction manual和Primer-BLAST引物设计原则，设计和合成的多条引物。在设计过程中，不仅考虑到了要避免引物二聚体、发卡结构的形成，还考虑到了不同目标基因在一个反应体系中共扩增的问题。引物筛选实验表明，所述引物特异性强、扩增效率高，可有效、快速地检测登革病毒I、II、III、IV型。
根据本发明另一个方面，提供了一种含有上述引物组的用于快速检测登革病毒的试剂盒。
优选地，所述试剂盒用于登革病毒I、II、III和IV型的检测。
进一步地，所述试剂盒还包括重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白、反转录酶、缓冲溶液和荧光染料。
优选地，所述重组酶为T4uvsX/uvsY，所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4gp32，所述反转录酶为Transcriptor；
所述缓冲溶液包含Tris-HCl缓冲液、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶和Carbowax20M；
所述荧光染料为SYBR-Green。
优选地，所述溶液包含pH7.9 50mM Tris-HCl缓冲液、100mM乙酸钾、 14mM乙酸镁、2mM二硫苏糖醇、200uM dNTPs、3mM ATP、50mM磷酸肌酸、 100ng/μL肌酸激酶和5％Carbowax20M。
进一步地，所述试剂盒还包括ddH2O。
根据本发明又一个方面，提供了一种利用上述试剂盒检测呼吸道感染病原的方法，所述方法为重组酶聚合酶扩增法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品的RNA作为检测模板；
(2)对所述检测模板进行反转录得到cDNA，并且同时进行扩增得到扩增DNA 序列；
(3)对所述扩增DNA序列进行荧光检测得到溶解曲线Tm值。
(4)根据溶解曲线Tm值判断检测结果。
优选地，步骤(1)中所述样品为人体血清样本。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明将重组酶-多聚酶的核酸扩增技术与荧光检测技术相结合，除了可做为病毒感染检测之外，还可同时进行病毒型别鉴定，且专一性高，不会与其他黄病毒属病毒产生交叉反应；
2、本发明提供一个简单、快速、不须昂贵设备即可现场进行登革热的筛检方式，具有高灵敏度、特异性的特点，适用于即时快速诊断，可提供防疫第一线的快速检测，并且可细分登革热的型态，以提供医疗确诊。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为采用本发明所述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增检测登革病毒(阴性对照)的结果图。图中：NC为阴性对照(Negative Control)。
图2为采用本发明所述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增检测登革病毒I型的结果图。图中：NC为阴性对照(Negative Control)；DV1为登革病毒I型。
图3为采用本发明所述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增检测登革病毒II-IV 型的结果图。图中：NC为阴性对照(Negative Control)；DV2为登革病毒II型； DV3为登革病毒III型；DV4登革病毒IV型。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。以下实施例中试剂均为商购产品，所用引物在上海生工生物科技有限公司合成。
实施例1：用于检测登革病毒的引物组的制备
1、引物设计
根据NCBI基因数据库的呼吸道感染病原基因序列，参考TwistDx instruction manual和Primer-BLAST引物设计原则，设计引物。引物长度约为30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出一套灵敏度高且特异性好的引物组用于本发明，该引物组由表 1中SEQ ID NO：1-10所示碱基序列组成。
表1
2、引物合成
按照表1中SEQ ID NO：1-10所示碱基序列，进行引物序列合成。
实施例2：用于检测登革病毒的试剂盒的组建
组建用于检测登革病毒的试剂盒，使其包含下述组分：
(1)表1中所述上游引物和下游引物；
(2)重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白和反转录酶，其中，所述重组酶为T4 uvsX/uvsY，所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4gp32，所述反转录酶为Transcriptor(Roche)；
(3)缓冲溶液和荧光染料，其中，所述缓冲溶液含有下述组分：50mM Tris-HCl 缓冲液、100mM乙酸钾、14mM乙酸镁、2mM二硫苏糖醇、200uM dNTPs、3mM ATP、50mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶、5％Carbowax20M，其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9，所述荧光染料为SYBR-Green，用于对扩增核酸进行荧光检测。
实施例3：检测临床样本的登革病毒
采用实施例2所述试剂盒检测登革病毒，检测方法为重组酶聚合酶恒温基因扩增法，具体步骤如下：
1、临床样本准备
收集人体血清样本，收集条件为：经实验室检查(培养法或分子生物学检查法) 后确认为具有登革病毒的阳性临床样本(57例)，及经检查后确认为无登革病毒感染的阴性临床样本(30例)。所收集之剩余样本将先以95℃加热10分钟去活性，以避免运送过程有传染疑虑。临床样本置于-80℃保存。
2、临床样本的核酸提取
本实施例采用Viral Nucleic Acid提取试剂盒或自动化样本核酸提取仪，进行临床样本的核酸提取。
3、反应体系配置
按照如下各项比例配置反应体系：
4、震荡混匀步骤3制得的反应体系后，样本于42℃恒温反应20min，进行RPA 扩增。
5、加入荧光染料SYBR-Green对扩增的DNA序列进行荧光检测得到溶解曲线Tm值。
6、根据溶解曲线Tm值判断检测结果。
7、结果判读
采用本发明所设计的引物组进行登革病毒(阴性对照)、登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型和登革病毒IV型检测。
采用本发明所设计的引物组进行登革病毒(阴性对照)检测的结果见图1 和表2。
表2
No. Sample Tm IC
l NC 93 93
注：Tm为DNA双链解链50％的温度，IC为内质控(Internal Control)
由图1和表2可知，经实验室鉴定的阴性对照样本(NC)生成的溶解曲线在Tm 值＝93℃出现单一的特异性峰。
采用本发明所设计的引物组进行登革病毒I型检测的结果见图2和表3。
表3
No. Sample Tm IC
l NC 93 93
2 DV1 88 93
注：Tm为DNA双链解链50％的温度，IC为内质控(Internal Control)
由图2和表3可知，经实验室鉴定的阳性登革病毒样本(DV1)生成的溶解曲线在Tm值＝88℃出现单一的特异性峰。
采用本发明所设计的引物组进行登革病毒II型、登革病毒III型和登革病毒IV型检测的结果见图3和表4。
表4
No. Sample Tm IC
1 NC 93 93
2 DV2 86，88 93
3 DV3 85 93
4 DV4 87 93
注：Tm为DNA双链解链50％的温度，IC为内质控(Internal Control)
由图3和表4可知，经实验室鉴定的阳性登革病毒样本(DV2)生成的溶解曲线在Tm值＝86℃和Tm值＝88℃出现两个特异性峰，经实验室鉴定的阳性登革病毒样本(DV3)生成的溶解曲线在Tm值＝85℃出现单一的特异性峰，经实验室鉴定的阳性登革病毒样本(DV4)生成的溶解曲线在Tm值＝87℃出现单一的特异性峰。
登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型和登革病毒IV型的灵敏度和专一性检测结果见表5。
表5
由表5可知，本发明特异性强、灵敏度高，可有效、快速地对登革病毒进行检测，并同时进行病毒型别鉴定。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于快速检测登革病毒的引物组，其特征在于，所述引物组为一套登革病毒特征性引物组，一套引物组由五对引物组成，每对引物包括两个引物，一个引物为正向引物，一个为反向引物，序列分别为：
引物对一：
正向引物：CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGCGT；
反向引物：GCGTACCGCGCGTCGACTTACCCCGTAACA
CTTTGATCGCTCCATTCTTC；
引物对二：
正向引物：CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGCGT；
反向引物：GGAACGCCATCACTGTTGGAATCAGCATAA；
引物对三：
正向引物：GTGCCTCAAGAGCATGGAATGTGTGGGAGG；
反向引物：GTTGGGTGTAGACCTCTCGGAGTTTCAGCC；
引物对四：
正向引物：CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGCGT；
反向引物：GGACTCGCAAAAACGTGATGAATGCTAGCA；
引物对五：
正向引物：GACCTGGTATGTTCTCCTCAGACTGAGGG；
反向引物：TCCACTAACCAGTCAGCGTCAGAGCCCAG。
2.一种含有权利要求1所述引物组的用于快速检测登革病毒的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的用于快速检测登革病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于登革病毒I、II、III和IV型的检测。
4.根据权利要求3所述的用于现场检测登革病毒的试剂盒，其特征在于，还包括重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白、反转录酶、缓冲溶液和荧光染料。
5.根据权利要求4所述的用于快速检测登革病毒的试剂盒，其特征在于，所述重组酶为T4 uvsX/uvsY，所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4 gp32，所述反转录酶为Transcriptor；
所述缓冲溶液包含Tris-HCl缓冲液、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶和Carbowax20M；
所述荧光染料为SYBR-Green。
6.根据权利要求5所述的用于快速检测登革病毒的试剂盒，其特征在于，所述溶液包含pH7.9 50mM Tris-HCl缓冲液、100mM乙酸钾、14mM乙酸镁、2mM二硫苏糖醇、200uM dNTPs、3mM ATP、50mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5% Carbowax20M。
7.根据权利要求6所述的用于快速检测登革病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddH2O。
8.一种利用权利要求7所述试剂盒检测呼吸道感染病原的方法，其特征在于，所述方法为重组酶聚合酶扩增法，其包括以下步骤：
（1）提取待测样品的RNA作为检测模板；
（2）对所述检测模板进行反转录得到cDNA，并且同时进行扩增得到扩增DNA序列；
（3）对所述扩增DNA序列进行荧光检测得到溶解曲线Tm值；
（4）根据溶解曲线Tm值判断检测结果。
9.一种利用权利要求8所述试剂盒检测呼吸道感染病原的方法，其特征在于，步骤（1）中所述样品为人体血清样本。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180529

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