CN105177169B - 一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于包括如下步骤：(1)构建PCR反应体系，包括:待测样品；与所述待测样品中待测模板互补的正向引物和反向引物；荧光染料EvaGreen；及双热启动酶，包括HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶；(2)在所述PCR反应体系中，对所述待测模板进行PCR扩增，以形成双链DNA‑EvaGreen荧光染料复合物；(3)PCR扩增过程之中或之后，检测所述PCR反应体系的荧光值，以确定扩增产物的数量，从而确定待测模板的数量。本发明的定量PCR方法具有高精确度、高效率、高灵敏度、高特异性且价格低廉的特点。

Description

一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法
技术领域
本发明涉及一种定量PCR方法，尤其是一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。qPCR技术与常规PCR技术区别在于：常规的PCR操作繁琐，特异性差，PCR结束后还需琼脂糖凝胶电泳检测；而qPCR是反应过程中检测，无需后期电泳，因此qPCR具有操作简便、检测时间短、不易被污染、特异性高、重复性好、灵敏度高、分辨率高、检测范围广、定量精确、自动化程度高等优点。qPCR现在已经应用到临床疾病诊断、动物疾病诊断、食品安全、科学研究等领域。
qPCR的定量原理中的几个重要参数：基线(baseline)，阈值(threshold)和Ct值(Ct value)。一般来讲，前15个循环信号作为荧光本底信号，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，就是基线。荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值就是扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的PCR循环次数，所以是一个没有单位的参数。由于在PCR扩增的指数时期，DNA模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系(线性方程为Ct＝-KlogN0+B，其中N0是模板起始拷贝数)，所以成为定量的依据。
qPCR有染料法和探针法2种。染料法便宜、使用方便、通用性好，检测灵敏度高。探针法虽然特异性高，重复性好，但其费用昂贵，本底较高，检测结果很难判定实际的扩增特性。
目前用于qPCR的荧光染料有SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM，最为常见的是SYBR Green I。
EvaGreen是分子探针公司核心研发团队独立创办的Biotium公司的明星产品。经过美国环境安全检测，及艾姆斯检测安全无毒性。它是一种同时适用于实时PCR和高分辨率溶解曲线(HRM)分析的染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制(图1)，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度以下进行HRM分析。由于EvaGreen在光谱特性上类似于FAM以及SYBR Green I，因此这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。与SYBR Green I相比，EvaGreen对PCR的抑制性更小，更不容易产生非特异性扩增，产生的荧光信号强，安全无毒，更稳定等特点。
EvaGreen染料的结构信息在例如美国专利US7,776,567中有详细描述。
以往，荧光定量PCR试剂中的热启动酶往往只有一种，要么是抗体修饰，要么是化学修饰。抗体修饰的热启动酶起效快，可在反应初期被完全激活，发挥最大活性，但后力不足；而化学修饰的热启动酶则比较慢热，在高温变性过程中缓慢释放活性，从而保证始终特异的扩增。
双热启动酶结合了两者的优点，它由高端化学修饰HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰Anti Taq DNA聚合酶组成。在PCR反应初期，已被完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同被缓慢释放活性的HotStar Taq DNA聚合酶达到最佳酶活状态，保证PCR扩增的高效性；在后续PCR反应过程中，每经过一轮95℃条件下的变性，即可重新激活一部分HotStarTaq DNA聚合酶，弥补因热变性所导致的部分酶活损失。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。相对于单一的抗体封闭或者化学修饰的热启动酶，双热启动酶在荧光定量PCR反应全程均能实现稳定、灵敏和高效的扩增。
不管哪种定量方法，只有保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，才能确保检测灵敏度高，检测结果准确。在qPCR检测过程中经常会碰到非特异性扩增的问题，非特异性扩增就是扩增出了目的条带以外的条带，出现假阳性和高背景的结果。
综上所述，需要一种高效率、高灵敏度、高特异性且价格低廉的定量PCR方法，关于本发明的定量PCR方法，目前还未见有报道。
发明内容
本发明提供了一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，包括如下步骤：
(1)构建PCR反应体系，包括:
待测样品；
与所述待测样品中待测模板互补的正向引物和反向引物；
荧光染料EvaGreen；及
双热启动酶，包括：HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶；
(2)在所述PCR反应体系中，对所述待测模板进行PCR扩增，以形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物；
(3)PCR扩增过程之中或之后，检测所述PCR反应体系的荧光值，以确定扩增产物的数量，从而确定所述待测样品中所述待测模板的数量。
优选地，所述PCR反应体系中所述荧光染料EvaGreen的工作浓度为1～1.5mmol/L，所述双热启动酶中HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶以4比6的浓度比配比成5U/μL，20μL反应体系中HotStar Taq DNA聚合酶为0.4U，Anti Taq DNA聚合酶为0.6U。
优选地，所述PCR反应体系进一步包括：PCR缓冲液(由100mM的Tris-HCL pH8.3和500mM的KCL组成)，镁离子，由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成的dNTP溶液，PCR促进剂Tween20及无菌双蒸水。
优选地，所述PCR促进剂选自小牛血清白蛋白，Tween20，二硫苏糖醇，二甲基亚风(DMSO)，甘油，明胶或氯化四甲基铵(TMAC)。
优选地，所述检测PCR反应体系的程序包括如下步骤：
第一阶段：95℃预变性10min；
第二阶段：95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40cycles；
第三阶段：扩增产物溶解曲线信息采集，为95℃下反应15s，再60℃反应1min。
优选地，所述待测模板包括基因组DNA，质粒，或RT-PCR反应后的cDNA。
优选地，检测样本包括动物样品、食物、饲料、药物、体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制品或水。
优选地，所述PCR反应体系中各组分的比例范围为：每20μL所述PCR反应体系中含有10xBuffe 2μL；EvaGreen1.25mM；双热启动酶HotStar Taq DNA聚合酶为0.4U，Anti TaqDNA聚合酶为0.6U；PCR促进剂10x Tween202μL；基因组DNA 5～500ng，或者质粒1～25ng，或者RT-PCR反应后的cDNA 1～2μL；镁离子浓度为1.5～2.0mmol/L，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度各为0.1～0.2mmol/L；正向引物和反向引物各0.5～1μM。
工作原理及过程：使用与待测模板互补的正向引物和反向引物，在含有荧光染料EvaGreen和双热启动酶的PCR反应体系中，对模板进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，通过检测EvaGreen染料的荧光值，来确定扩增产物的有无和/或数量，从而确定待检测模板的存在与否和/或数量。
检测模板可以是基因组DNA，或者质粒，或者RT-PCR反应后的cDNA。检测样本可以是动物样品、食物、饲料、药物、体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制品或水。
检测试剂包括荧光染料EvaGreen和双热启动酶，EvaGreen能特异性地结合DNA双链而发出荧光信号，而不结合DNA链的EvaGreen染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。在单个试剂中包含两个热启动酶——化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶。两者通过互补缓释技术构成了独特的酶活自动调节系统，可以在更加宽广的范围内获得更高的扩增效率、灵敏度、特异性以及广泛的模板适应性。荧光染料EvaGreen的工作浓度为1～1.5mM，双热启动酶中化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶以4比6的比例配比成5U/μL，工作浓度为0.01～0.1U/μL。
其他组分还有PCR缓冲液、镁离子、dNTP溶液(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、正向引物、反向引物、PCR促进剂、无菌双蒸水。
PCR促进剂有小牛血清白蛋白、Tween20、二硫苏糖醇、二甲基亚风(DMSO)、甘油、明胶、氯化四甲基铵(TMAC)。首选小牛血清白蛋白，依次为Tween20、二硫苏糖醇。
反应体系以20μL计算，基因组5～500ng，或者质粒1～25ng，或者RT-PCR反应后的cDNA 1～2μL；镁离子浓度为1.5～2.0mmol/L，dNTP为各0.1～0.2mmol/L。
本发明的有益效果在于：提供高效率、高灵敏度、高特异性且价格低廉的定量PCR方法，使用荧光染料EvaGreen和双热启动酶，合适的镁离子浓度，能使扩增效率更高，很好地抑制非特异性扩增，避免假阳性和高背景的结果，溶解曲线能获得单一峰；荧光染料价格低廉，使用方便，通用性好，特异性强，适用于PCR技术；双酶结合使得扩增效率更高、更稳定，灵敏度非常高。本发明为分子生物学研究提供了一种新型的定量PCR方法。
可用本发明方法检测的模板的生物学样品没有特别限制。应理解，生物学样品是十分广泛的一个概念，可以是一个或多个细胞，也可以是样本或培养物(包括微生物)，甚至包括合成来源的样本。通常，生物样本可以是动物样品，包括人类样品如体液、固体样品如骨骼或组织。样品也可以是液态或固态食品或饲料及药物，如乳制品、蔬菜、肉类及肉制品、水等。样品可以来源于任何家养或野生动物，如有蹄类、熊类、鱼类、兔类、啮齿类等。
qPCR技术可应用到生命科学研究的各个领域，例如基因差异表达分析、SNP检测、基因突变检测、等位基因检测、临床诊断、转基因研究、药物开发等。
本发明的这些目的，特点，和优点将会在下面的具体实施方式，附图，和权利要求中详细的揭露。
附图说明
图1为EvaGreen“按要求释放”的全新机制示意图。
图2为β-globin模板浓度梯度扩增曲线示意图，显示了该方法的重复性好、灵敏度高。
图3为β-globin模板的量与Ct值呈线性关系示意图，显示了该方法的扩增效率好、精确度高。
图4为双热启动酶和单一热启动酶扩增灵敏度的比较结果示意图。
图5A-1为EvaGreen荧光染料测试的溶解曲线图。
图5A-2为EvaGreen荧光染料测试的扩增曲线图。
图5B-1为SYBR Green I荧光染料测试的溶解曲线图。
图5B-2为SYBR Green I荧光染料测试的扩增曲线图。
图5C-1为GelGreen I荧光染料测试的溶解曲线图。
图5C-2为GelGreen I荧光染料测试的扩增曲线图。
其中,图5A-1，5A-2，5B-1，5B-2，5C-1和5C-2显示了EvaGreen、SYBR Green I和GelGreen I三种荧光定量PCR法的特异性与重复性的比较结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。
qPCR反应程序有两步法、三步法等多种方法，常规的两步法如95℃变性，60℃退火及延伸；三步法如95℃变性，50℃退火及72℃延伸。具体用哪一种方法，需结合引物退火温度、酶的特性、具体实验方案进行选择。用本发明方法检测样品，其长度不超过500bp，一般选择100～300bp，最佳为150～200bp。
本发明实施中所用荧光染料EvaGreen购自上海开放生物科技有限公司；化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶购自上海吉泰远成生物科技有限公司；PCR缓冲液、镁离子、dNTP溶液、PCR促进剂均购自上海吉泰远成生物科技有限公司；正向引物、反向引物、基因合成均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本发明PCR反应体系中含有荧光染料EvaGreen和双热启动酶，能解决非特异性扩增、灵敏度低等难题，提供了一种新型的荧光定量PCR方法。
实施例1
在实时荧光定量PCR法中EvaGreen和双热启动酶体系重复性好、灵敏度和精确度高。
(1)构建含β-globin基因的质粒，扩增β-globin基因。
(2)引物合成：
正向引物：5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'
反向引物：5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'
(3)将质粒模板制备为3x106，3x105，3x104，3x103，3x102，3x101，3x100个分子的模板量，NTC为无底物对照，使用正向引物及反向引物连同含有EvaGreen和双热启动酶的PCR反应母液进行实时荧光定量PCR反应。
(4)PCR反应体系的建立，反应体系共20μL，参照下表添加各试剂。
表1 PCR反应体系
(5)qPCR反应
采用两步法PCR反应程序，
第一阶段：95℃预变性10min；
第二阶段：95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40cycles；
第三阶段：扩增产物溶解曲线信息采集阶段，为95℃15s，60℃1min。
(6)实验结果
结果如图2、图3所示。图2为β-globin质粒模板浓度梯度扩增曲线，极高的灵敏度可以检测到单个拷贝；2次重复误差小于0.5个Ct，尤其是Ct小于35的反应，重复误差小于0.2个Ct，显示了良好的重复性。图3为β-globin质粒模板的量与Ct值呈线性关系，斜率接近-3.3，扩增效率接近100％；R2>0.99，显示了很高的精确度。
实施例2
在实时荧光定量PCR法中双热启动酶体系灵敏度更强，扩增效率更高。
(1)构建含β-globin基因的质粒，扩增β-globin基因。
(2)引物合成同实施例1。
(3)将质粒模板制备为3x104，3x103，3x102，3x101，3x100个分子的模板量，分别用双热启动酶和单一热启动酶扩增，其他成分不变的体系中进行实时荧光定量PCR反应。
(4)PCR反应体系：热启动酶分别用双热启动酶、化学修饰的DNA聚合酶和抗体修饰的DNA聚合酶，其他成分同实施例1。
(5)qPCR反应同实施例1。
(6)实验结果
结果如图4所示。图4为双热启动酶和单一热启动酶比较，可以看到双热启动酶自动调节系统在检测不同浓度模板时，相对于单热启动酶的体系，检测Ct值更为靠前(约提前1～1.5个循环)，线性关系也更好，说明双酶自动调节系统扩增灵敏度更强，扩增效率更稳定。
实施例3
在实时荧光定量PCR法中EvaGreen具有更高的特异性，重复性也更好。
(1)制备待测DNA；按常规方法从人类血液中抽提DNA，扩增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因(UGT1A1)。
(2)引物合成：
正向引物：5'-ACCTCTAGTTACATAACCTGA-3'
反向引物：5'-AATAAACCCGACCTCACCAC-3'
(4)PCR反应体系：荧光染料分别用EvaGreen、SYBR Green I和GelGreen I，其他成分同实施例1。
(5)qPCR反应程序同实施例1。
(6)实验结果
本实施例选用本发明人曾经试验过的较难扩增的UGT1A1基因作为模板，同时采用了EvaGreen、SYBR Green I和GelGreen I三种双链DNA结合染料，对其特异性及重复性进行对比。如图5所示。图5A-1和5A-2为EvaGreen荧光染料测试结果，基线平滑，只有单一峰，4次不同模板梯度反应重复性好，线性关系也好。图5B-1，5B-2，5C-1和5C-2分别为SYBR GreenI和GelGreen I荧光染料测试结果，可以看出2种染料溶解曲线不是很好，有非特异产物，重复性也较差，尤其是GelGreen I荧光染料，测试结果最不理想。本实施例说明EvaGreen荧光染料的特异性、重复性高于SYBR Green I和GelGreen I荧光染料测。
以上所述只是本发明的优选实施方式，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。应理解，在阅读了本发明上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做若干改动或修改，这些改动或修改同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
通过上述实施例，本发明的目的已经被完全有效的达到了。熟悉该项技艺的人士应该明白本发明包括但不限于附图和上面具体实施方式中描述的内容。任何不偏离本发明的功能和结构原理的修改都将包括在权利要求书的范围中。

Claims (8)

1.一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建PCR反应体系，包括:
待测样品；
与所述待测样品中待测模板互补的正向引物和反向引物；
荧光染料EvaGreen；及双热启动酶，包括：HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶；
(2)在所述PCR反应体系中，对所述待测模板进行PCR扩增，以形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物；
(3)PCR扩增过程之中或之后，检测所述PCR反应体系的荧光值，以确定扩增产物的数量，从而确定所述待测样品中所述待测模板的数量。
2.根据权利要求1所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：所述PCR反应体系中所述荧光染料EvaGreen的工作浓度为1～1.5mmol/L，所述双热启动酶中HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶以4比6的浓度比配比成5U/μL，20μL反应体系中HotStar Taq DNA聚合酶为0.4U，Anti Taq DNA聚合酶为0.6U。
3.根据权利要求1所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：所述PCR反应体系进一步包括：PCR缓冲液(由100mM的Tris-HCL pH8.3和500mM的KCL组成)，镁离子，由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成的dNTP溶液，PCR促进剂及无菌双蒸水。
4.根据权利要求3所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：所述PCR促进剂选自小牛血清白蛋白，Tween20，二硫苏糖醇，二甲基亚风(DMSO)，甘油，明胶或氯化四甲基铵(TMAC)。
5.根据权利要求1-4所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：所述检测PCR反应体系的程序包括如下步骤：
第一阶段：95℃预变性10min；
第二阶段：95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40cycles；
第三阶段：扩增产物溶解曲线信息采集，为95℃下反应15s，再60℃反应1min。
6.根据权利要求3所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：所述PCR反应体系中各组分的比例范围为：每20μL所述PCR反应体系中含有10x缓冲液 2μL；EvaGreen1.25mM；双热启动酶HotStar Taq DNA聚合酶为0.4U，Anti Taq DNA聚合酶为0.6U；PCR促进剂10x Tween20 2μL；基因组DNA 5～500ng，或者质粒1～25ng，或者RT-PCR反应后的cDNA 1～2μL；镁离子浓度为1.5～2.0mmol/L，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度各为0.1～0.2mmol/L；正向引物和反向引物各0.5～1μM。
7.根据权利要求1所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：所述待测模板包括基因组DNA，质粒，或RT-PCR反应后的cDNA。
8.根据权利要求1所述的含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，其特征在于：检测样本包括食物、饲料、药物、体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制品或水。
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