CN111944916A - 用于粪便微生物检测的试剂及其在胃幽门螺旋杆菌检测的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于粪便微生物检测的试剂及其在胃幽门螺旋杆菌检测中的应用。本申请用于粪便微生物检测的试剂，能够准确有效的从提取自粪便样品的核酸样本中检出胃幽门螺旋杆菌，从而准确有效的判断粪便样品中是否含有胃幽门螺旋杆菌，避免了因粪便样品中蛋白活性受损造成的漏检或假阴性等问题，能够更好的满足临床使用需求。

Description

用于粪便微生物检测的试剂及其在胃幽门螺旋杆菌检测的 应用

技术领域

本申请涉及粪便微生物检测领域，特别是涉及一种用于粪便微生物检测的试剂及其在胃幽门螺旋杆菌检测中的应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌是一种寄生在人、猕猴、大鼠、猪、犬等动物的胃粘膜组织中的革兰氏阴性菌。研究显示，67％-80％的胃溃疡和95％的十二指肠溃疡都是幽门螺旋杆菌引起。幽门螺旋杆菌引起的疾病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等，感染率高达67％，最终导致的后果就是胃癌。幽门螺旋杆菌最可能的传播途径即口-口传播、粪-口传播、宠-人传播。一般认为，幽门螺旋杆菌感染的临床过程主要包括，幽门弯曲杆菌(Campylobacter，pylori)狗胃螺旋菌(Gastrospirillum canine，Gc)或幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)经口进入人体，然后到达胃粘膜，在此定居感染，经过数周或数月的繁殖后，引发慢性或浅表性胃炎，感染后数年或数十年会进一步发展为十二指肠溃疡、胃溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、慢性萎缩性胃炎等，而这些就是导致胃癌的最危险的因素。研究显示，幽门螺旋杆菌感染能够使患胃癌的风险增加2.7-12倍；如果没有幽门螺旋杆菌感染，可以减少至少35％-89％的胃癌病患。

目前，幽门螺旋杆菌的检测方法主要包括，幽门螺旋杆菌分离培养、活组织镜检、快速尿素酶试验、尿素呼气试验、尿氨排出试验、血清学试验等。其中，以粪便样品为检测对象的主要是金标尿素酶检测，其采用制备的抗体，以获取自粪便的抗原标本为检测对象，进行幽门螺旋杆菌检测。这种方法虽然可以在15分钟左右快速出结果；但是，检测灵敏度和检出效率严重依赖于抗体和抗原的活性，容易出现漏检或假阴性；例如长期放置或者经过其它有损蛋白活性的处理后，则难以通过抗体和抗原反应实现检测。另外，也有关于幽门螺旋杆菌多聚酶链反应的相关研究和报道；但是，这些方法都难以适用于粪便样品的检测。

因此，亟需研发一种适用于粪便样品中胃幽门螺旋杆菌检测的方法，以满足临床使用需求。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于粪便微生物检测的试剂及其在胃幽门螺旋杆菌检测中的应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了用于粪便微生物检测的试剂，包括上游引物和下游引物，上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，Seq ID No.1：5’-AAGGTAACACTTCTAACG-3’

Seq ID No.2：5’-TCTAACGCATGATTGATT-3’。

需要说明的是，本申请的试剂能够特异性的针对粪便样品中的胃幽门螺旋杆菌进行检测。本申请的检测对象是提取自粪便样品的核酸；原则上，这些核酸中包含来自于人的基因组信息，以及来自于粪便中的各种微生物的基因组信息。但是，具体的粪便核酸样本中含有哪些微生物的基因组信息，是不确定的；本申请的试剂能够用于确定或排除粪便核酸样本中是否含有胃幽门螺旋杆菌。从检测原理上来说，本申请是采用胃幽门螺旋杆菌的异性检测引物通过PCR扩增进行检测，现有技术中也有关于幽门螺杆菌PCR检测的相关研究，但是，现有的检测方案不能有效的对粪便核酸样本中的胃幽门螺旋杆菌进行检测。因此，本申请研发了一种新的能够特异性的针对粪便微生物中的胃幽门螺旋杆菌进行检测的试剂。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂还包括用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂。

本申请的一种实现方式中，用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂包括TBGreen Premix Ex Taq反应液和ROX参比染料。

需要说明的是，本申请将用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂组合在一起可以方便使用，从而便于胃幽门螺旋杆菌的检测；可以理解，用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂也可以通过市售购买获得。

本申请的第二方面公开了本申请用于粪便微生物检测的试剂在非诊断治疗目的的胃幽门螺旋杆菌检测中的应用。

本申请的第三方面公开了一种非诊断治疗目的的胃幽门螺旋杆菌的检测方法，包括采用本申请的用于粪便微生物检测的试剂，对获取自粪便样品的核酸样本进行染料法实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果判断粪便样品中是否含有胃幽门螺旋杆菌。

本申请的一种实现方式中，本申请的检测方法还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增结果进行融解曲线分析，融解曲线出峰单一则判断检测结果特异性强，出峰不单一则判断检测结果存在非特异性扩增或引物二聚体。

可以理解，本申请的试剂能够特异性的检测胃幽门螺旋杆菌，因此，只要有扩增曲线，就基本上可以判断粪便样品中含有胃幽门螺旋杆菌；通过融解曲线进行判断，只是为了进一步的确定扩增产物的特异性，可以根据需求选择使用。

本申请的一种实现方式中，本申请的检测方法还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，根据测序结果判断是否为胃幽门螺旋杆菌。

可以理解，测序是最直观的判断方法，测序结果与胃幽门螺旋杆菌一致，就可以直接准确的说明粪便样品中含有胃幽门螺旋杆菌。原则上，通过本申请的扩增曲线判断和融解曲线分析就可以准确的判断胃幽门螺旋杆菌，可以根据需求选择测序分析。

本申请的一种实现方式中，对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，具体包括将染料法实时荧光定量PCR扩增产物与载体连接，然后对重组载体进行测序。

需要说明的是，将PCR扩增产物重组到载体中再进行测序，主要是为了保障PCR扩增产物的稳定性，以便于后续测序的准确分析和判断；理论上也可以直接对PCR扩增产物进行测序，在此不作具体限定。

本申请的一种实现方式中，载体为T载体。可以理解，T载体是常规使用的质粒载体，不排除还可以采用其它载体。

本申请的一种实现方式中，根据测序结果判断是否为胃幽门螺旋杆菌，具体包括将测序结果用NCBI进行BLAST比对，根据比对结果判断是否为胃幽门螺旋杆菌。

本申请的有益效果在于：

本申请用于粪便微生物检测的试剂，能够准确有效的从提取自粪便样品的核酸样本中检出胃幽门螺旋杆菌，从而准确有效的判断粪便样品中是否含有胃幽门螺旋杆菌，避免了因粪便样品中蛋白活性受损造成的漏检或假阴性等问题，能够更好的满足临床使用需求。

附图说明

图1是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增曲线；

图2是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增融解曲线；

图3是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增产物测序结果的序列比对结果图；

图4是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增产物测序结果的BLAST比对结果图。

具体实施方式

临床使用中已经有多种幽门螺旋杆菌检测方法，并且，这些方法大都具有无创、特异和快速等优点。本申请的目的是在已经获取粪便样品的基础上，直接利用粪便样品进行快速的幽门螺旋杆菌检测，而无需再额外采用例如尿素呼气试验进行幽门螺旋杆菌检测。然而，现有的以粪便样品为检测对象的幽门螺旋杆菌检测方法容易出现漏检。

因此，本申请研发了一种新的能够特异性的针对粪便微生物中的幽门螺旋杆菌进行检测的试剂，其中包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物。

本申请的试剂能够准确有效的从粪便核酸样本中检测幽门螺旋杆菌，使用简单、方便，且只要粪便样品中含有幽门螺旋杆菌，无论其活性如何，都能够被检测出。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下可以省略，或者可以由其他试剂盒、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。以下实施例中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例

一、材料与方法

1.粪便核酸提取

本例采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒进行粪便核酸的提取，货号DP302-02，具体方法步骤参照该说明书。

本例提取了6份不同来源粪便的核酸样本，用于后续试验。

2.引物设计与合成

本例特别针对粪便微生物中的胃幽门螺旋杆菌设计特异性检测引物，设计的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计的引物序列如表1所示。

表1胃幽门螺旋杆菌特异性检测引物

引物名称	序列(5’→3’)	SeqIDNo.
			Hel-p-F	AAGGTAACACTTCTAACG	1
Hel-p-R	TCTAACGCATGATTGATT	2

3.粪便核酸样本检测

采用本例设计的胃幽门螺旋杆菌特异性检测引物，对提取的粪便核酸样本进行染料法实时荧光定量PCR扩增(QPCR)检测，并设置一个水阴性对照，QPCR反应体系如表2所示，QPCR反应条件如表3所示。

表2 QPCR反应体系

反应物名称	用量
		TB Green Premix Ex Taq(2×)	5.0μL
ROX	1.0μL
		10mM Hel-p-F	0.2μL
10mM Hel-p-R	0.2μL
		DNA模板	1.0μL
ddH<sub>2</sub>O	2.6μL
		总计	10μL

表3 QPCR反应条件

本例将所有核酸样本的QPCR产物纯化后连接T载体，并送金唯智测序公司进行测序，将测序结果用NCBI进行BLAST，分析QPCR产物的具体种属情况。其中，QPCR产物纯化采用康为世纪的DNA Clean-up Kit进行QPCR产物的纯化，货号CW2301M，具体方法步骤参照该说明书。T载体连接采用全式金的pEASY-T5 Cloning Kit进行连接转化，货号CT501，具体方法步骤参照该说明书。

二、结果与分析

1.染料法实时荧光定量PCR扩增结果

本例对6个核酸样本的QPCR检测结果如图1所示，结果显示，6个核酸样本都有检出胃幽门螺旋杆菌。并且，6个核酸样本QPCR的融解曲线如图2所示，可见，所有粪便核酸样本的QPCR融解曲线出峰单一，说明有按照预期特异性的扩增获得胃幽门螺旋杆菌靶标序列。

2.测序和序列比对结果

对6个核酸样本的QPCR产物进行测序，并采用NCBI进行BLAST比对，结果如图3和图4所示。图3为测序结果部分序列的比对结果，图4为BLAST比对结果。比对结果显示，6个核酸样本的QPCR产物都是胃幽门螺旋杆菌，与预期相符，说明本例设计的引物能成功的在粪便核酸样本中检测出胃幽门螺旋杆菌。

因此，本例设计的特异性检测引物能够作为针对粪便微生物中的胃幽门螺旋杆菌进行检测的试剂，采用本例的试剂，能够准确有效的从提取自粪便样品的核酸样本中检出胃幽门螺旋杆菌。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 壹宏（深圳）基因有限公司

<120> 用于粪便微生物检测的试剂及其在胃幽门螺旋杆菌检测的应用

<130> 20I30395

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaggtaacac ttctaacg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctaacgcat gattgatt 18

Claims (10)

1.一种用于粪便微生物检测的试剂，其特征在于：包括上游引物和下游引物，所述上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述下游引物为Seq ID No.2所示序列，

Seq ID No.1：5’-AAGGTAACACTTCTAACG-3’

Seq ID No.2：5’-TCTAACGCATGATTGATT-3’。

2.根据权利要求1所述的用于粪便微生物检测的试剂，其特征在于：还包括用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂。

3.根据权利要求2所述的用于粪便微生物检测的试剂，其特征在于：所述用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂包括TB Green Premix Ex Taq反应液和ROX参比染料。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于粪便微生物检测的试剂在非诊断治疗目的的胃幽门螺旋杆菌检测中的应用。

5.一种非诊断治疗目的的胃幽门螺旋杆菌的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的用于粪便微生物检测的试剂，对获取自粪便样品的核酸样本进行染料法实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果判断粪便样品中是否含有胃幽门螺旋杆菌。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增结果进行融解曲线分析，融解曲线出峰单一则判断检测结果特异性强，出峰不单一则判断检测结果存在非特异性扩增或引物二聚体。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，根据测序结果判断是否为胃幽门螺旋杆菌。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，具体包括将染料法实时荧光定量PCR扩增产物与载体连接，然后对重组载体进行测序。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述载体为T载体。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述根据测序结果判断是否为胃幽门螺旋杆菌，具体包括将测序结果用NCBI进行BLAST比对，根据比对结果判断是否为胃幽门螺旋杆菌。

Images